Summary
これは、肺の細胞外マトリックスからの3次元細胞培養の足場を作成するための方法です。無傷の肺は、三次元での細胞の増殖を支持することができるヒドロゲルに加工されます。
Abstract
ここでは、in vitroでの肺細胞培養のための複数の成分の細胞培養ヒドロゲルを確立するための方法を提示します。ブタ、ラット、またはマウスからのブロックの肺組織エン健康に始まり、組織は、灌流し、細胞破片を除去するために、後続の化学洗剤に浸漬されます。処理前と後の組織の組織学的比較は、二本鎖DNAとアルファガラクトシダーゼ染色の95％以上の除去を確認する細胞破片の大部分が除去される示唆しています。脱細胞化した後、組織を凍結乾燥し、次いで粉末にcryomilled。マトリックス粉末は、酸性ペプシン消化液中で48時間消化し、次いでプレゲル溶液を形成するために中和されます。プレゲル溶液のゲル化は、37℃でインキュベートすることによって誘導することができ、すぐに次の中和を使用するか、または2週間まで4℃で保存することができます。コーティングは、cのための非処理プレートにプレゲル溶液を用いて形成することができますエルアタッチメント。細胞は、細胞が足場を通って移動する、又はコーティング上に播種することができ、そこから形成されたゲルの表面にメッキ3D培養を達成するために自己集合の前プレゲルに懸濁することができます。提示戦略の変更は、ゲル化温度、強度、またはタンパク質断片の大きさに影響を与えることができます。ヒドロゲル形成超え、ヒドロゲルの剛性がゲニピンを用いて増加させることができます。
Protocol
| 溶液 | 無菌フィルター | 行き方 |
| DIH 2 O | はい | DIH 2 O;滅菌濾過 |
| 0.1％トリトンX-100溶液 | はい | ヒュームフードの下でDIH 2 O 100 mlに100μlのトリトンX 100ソリューションを追加し、溶解するまで撹拌します。 滅菌フィルター。 |
| 2％デオキシコール酸溶液 | はい | ヒュームフードの下で2グラムデオキシコール酸ナトリウム溶液を加え 100ミリリットルDIH 2 Oあたり、溶解するまで撹拌します。無菌フィルター |
| 1MのNaCl | はい | DIH 2 Oの1 Lに58.44グラムのNaClを追加します。溶解するまで撹拌します。 無菌フィルター |
| DNase溶液 | はい | 12,000を追加1 L DIH 2 O単位のDNアーゼ; 0.156グラムのMgSO 4を追加します。 （無水）、および0.222グラムのCaCl 2;溶解するまで撹拌します。無菌フィルター |
| PBS | はい | 、27.2グラムのNa 2 HPO 4・7H 2 O（二塩基性七水和物）を組み合わせ 80グラムのNaCl、および10 L DIH 2 Oで2グラムのKCl;溶解するまで撹拌します。 pHを7.4に調整します。無菌フィルター |
表1： 組織の脱細胞化のために必要なソリューション。脱細胞化プロセスのための上記の解決策を行います。 4℃で保存。約2.5 Lは1ブタの肺のために必要とされるであろう。
1.ヒドロゲル形成
- ブタ肺脱細胞化（参考文献9,10から適応）
- 心とVASCで、屠殺場から、 一括通常のブタの肺を入手そのままulature。
- 心臓にできるだけ近い血管系を切断し、心を離れて分析する組織ハサミやメスを使用し、残りの血管系は、灌流のために、後の工程で使用されます。
- 慎重にメスやハサミを使用して、気管、気管支、および血管系を周囲の結合組織を離れて解剖。
注：脱細胞化プロセスの有効性を妨げることが胸膜および無気肺または血管閉塞、大量の大きな切り傷や刺し傷なしで肺を選択することで、残りの手順のために使用するのに最適な肺を決定します。 - （廃棄することができる心、結合組織および削除肺葉）できるだけ気管に取り付けられた同じくらい気管支を残し次善の肺を切り取ります。気管や血管系に付着したまま1肺があるはずです。
注：必要であれば、組織学のためのセクションを保持します。 9 - Pにクランプまたは縫合糸で切断された気管支を閉じますrevent過剰逆流。
- （ 表1）を 、必要になるまで4℃で脱細胞化ソリューションをして冷蔵庫を準備します。
- ハンドポンプを使用して、肺動脈および気管の両方を介してDI水で肺組織を3回灌流、肺動脈に適合するようにカニューレ。最初のたびに血管系を灌流。血管系に約1 Lで始まり、1.5 L各灌流のための気管内に、しかし、細胞破片を除去されるより多くの液体は、システムに灌流することができます。
- トリトンX-100溶液で血管系および気管の両方を灌流。
- 4℃で24時間、トリトンX-100溶液中に肺組織を浸します。
- リンスするためにDI水で血管系および気管3回灌流。
- デオキシコール酸溶液を用いて血管系および気管の両方を灌流。
- 4℃で24時間、デオキシコール酸で組織切片を水没。
- リンスするためにDI水で血管系および気管3回灌流。
- NaCl溶液で血管系および気管の両方を灌流。
- 4℃で1時間濾過NaCl溶液中で組織を浸します。
- リンスするためにDI水で血管系および気管3回灌流。
- DNase溶液で血管系および気管の両方を灌流。
- 4°Cで1時間フィルタリングDNase溶液中で組織を水没。
- 血管系および気管PBSで5回の両方を灌流。
- 唯一の呼吸ゾーン（主に周辺領域）を残して、気道を行ってから顕著な軟骨組織、気管および（主にへそと肺の内側部分の周りに見られる）、直径が全て尿細管2ミリメートル以上を離れて解剖。
- 1インチのセクション以下に組織を解剖。組織の向きは、このステップのために重要ではありません。
- 過剰の液体を捨て、50mlのコニカルチューブに組織を配置します。 -80℃で組織を凍結します。
注：細胞の除去を確実にするために、組織学のためのセクションを保持し、携帯debrisの、所望の場合。我々は、H＆E、αガラクトシダーゼ、ピコグリーン、ヒドロキシプロリン、ニンヒドリン、アルシアンブルー、SDS-PAGE、および特徴付けする質量分析法を使用しています。 9
- 肺処理
- 脱細胞化肺組織を含む凍結したチューブから蓋を外します。
- チューブ開口部の上にろ紙を置き、ゴムバンドで固定します。
注：チューブおよび内容はまだ凍結するまでそれ以外の場合は-80℃に置く凍結保存してください。 - すべての過剰な液体は、メーカーの指示に従って凍結乾燥機を使用して、なくなるまで組織を凍結乾燥。ミルへの準備ができるまで-80℃で保管してください。
- 労働条件に絶縁し、内部コンポーネントを冷却するためにフリーザーミルに液体窒素を追加し始める前に。
- ミルチューブから磁気ミルバーを取り外し、底部をカバーするために組織を追加します。
- ミルバーを元に戻し、ゆるく充填された組織を追加します。ミルバーはまだ自由に移動する必要があります。
- ミルチューブを閉じ、ナンプラーフリーザーミルでCE。
- 最大充填ラインに液体窒素を充填します。
- フリーザーミル微粉末に全ての組織（約5分〜600分の衝突速度-1）、ステンレス鋼のインパクターを有するポリカーボネートシリンダーだけでなく、製造業者の指示に従ってフリーザーミルを用いてステンレス鋼製の端栓インチ使用直前まで-80℃で保管してください。
- ミクロ多孔質ゲルの形成（8 mg / mlで）（参考文献から適応9,11）
- （w / v）のために、室温で、一定の攪拌（液体のトップレベルでの流れを見ることができるはずです）の下で、M HClを0.01にペプシンの（w / v）の脱細胞化粉末と0.1％の1％を追加します。 48時間。
注：粉末は静的に帯電したので、粉末がチューブ壁から過剰を洗浄するための機会を提供した後、塩酸を加えています。 - 48時間消化した後、氷上で5分間溶液および試薬を配置します。
- 冷蔵10％を使用して（v / v）の0.1 MのNaOH、D 11.11パーセント（v / v）の10倍PBS（1倍濃度の溶液全体をもたらすために）、7.4の生理学的pHに消化されたタンパク質溶液をもたらします。
注：溶液が今までに1週間4℃で保存することができます。必要であればレオ9を使用してゲル化速度を実行します。
- （w / v）のために、室温で、一定の攪拌（液体のトップレベルでの流れを見ることができるはずです）の下で、M HClを0.01にペプシンの（w / v）の脱細胞化粉末と0.1％の1％を追加します。 48時間。
2.機械的強度を改善するためにヒドロゲルを架橋
- 1％、0.1％、および0.01％W / Vゲニピン架橋溶液の溶液を、10％DMSO中にゲニピン粉末の必要量を溶解することによって調製しました。
- 1時間ごとに溶液を15分間ボルテックス。
- 以前部1.3.4に組み立てられたECMヒドロゲル（96ウェルプレートの各ウェルに100μL）を覆うゲニピン溶液を加えます。
- 37℃で24時間架橋するために、各ECMハイドロゲルのままにしておきます。
- 洗浄液がもはや青になるまで、ECMハイドロゲルをPBSで3回リンスしません。架橋ヒドロゲルは、さらなる特性評価およびCEの準備ができているでしょうLL培養研究。
微多孔ジェル3.細胞培養
- 二次元のコーティング
- 1.3.3からの溶液を用いて、96ウェル非組織培養処理プレートの各ウェルにプレゲル溶液20μlを加えます。
- タンパク質吸着板できるように一晩4℃で冷蔵します。
- 吸引しプレゲル溶液を、PBSですすいでください。
- 継代細胞9。
- ウェルに10,000細胞/ cm 2で追加します。
- ウェルあたり100μlにメディアを増やして、37℃でインキュベートします。
- 三次元細胞培養9
- 1.3.3からの溶液を用いて、プレゲル溶液1,000,000細胞/ mlの濃度になるようにペレット化した細胞を再懸濁します。
- 迅速な3D細胞培養〜500μmの厚さのヒドロゲルを形成するために、96ウェルプレートの各ウェルにプレゲル細胞懸濁液の16μLを分注します。
- 30、37℃でインキュベートゲル分間が形成されます。
- 形成されたヒドロゲルの上部にメディアの100μlを添加して、37℃でインキュベートします。
- 可変剛性ゲル上で三次元細胞培養
- 96ウェルプレートの各ウェルにピペット、1.3.3からプレゲル溶液100μlの溶液を用いて。
- ゲルを形成するために37℃で30分間インキュベートします。
注：パート2からの架橋の手順は、ここで使用することができます。 - 継代細胞9。
- ウェルに10,000細胞/ cm 2で追加します。
- ウェルあたり100μlにメディアを増やして、37℃でインキュベートします。
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Representative Results
この方法を用いて、通常のブタ、ラット、およびマウスの肺（ 図1）からヒドロゲルを生産しています。処理された肺はそれぞれ5ミリグラム、40ミリグラム、およびECM粉末10gを推定与えます。プロセスの概要を図2に示されています。プロセス中の主な視覚化が含まれます：デオキシコール酸をすすいだ後、肺の白い外観を。プレゲル形成した後、溶液は不透明であるべきであり、4℃で保存した場合ソリューションは、数ヶ月のために、均一な表示されます。私たちは、プロセス（ 表2）を通じて、エラーの発生源を特定するために、基本的なトラブルシューティングの表が含まれています。ゲル化後、ヒドロゲルは、すぐに使用することができるか、または将来の使用のために保存しました。レオロジー試験は、ゲル化の90％以上が37°C（ 図3）に到達した後、最初の数分で起こることを確認します。形成されたヒドロゲルは、長いPBS中の期間が、細胞の付着およびproliferatio安定ですnが（ 図4）を変更することがあります。
このプロトコルは、ブタの肺のために書かれているが、スペースの制約は、豚の肺を脱細胞化する場合にのみ1の肺を使用するように私たちを制限します。私たちは、他の種のための両方の肺を脱細胞化するためにマイナーな修正を加えて、同じ手順を使用しています。ラットとマウスのために、肺はそのまま残すことができ、心臓を添付するが、結合組織はまだメスやハサミで除去しなければなりません。我々は、ラットとマウスのために無傷で添付心を維持し、代わりに肺動脈の右心室を通じてソリューションを灌流。気管の灌流は同じです。しかしながら、カニューレは、より小さい種のアクセスを容易にするために気管内に縫合することができます。
我々は、複数の細胞型、ヒト間葉系幹細胞、9マウス間葉系幹細胞、ヒト上皮細胞株（A549S）、ヒト初代微小血管エンドを追加しましたthelial細胞（HpuVECs）、および内および肺ECMハイドロゲルの表面上にヒト臍帯静脈上皮細胞（HUVEC）。私たちは、形成されたゲルの異種性質に関する問題に遭遇していません。私たちの前の仕事は、ブタのヒドロゲル中のαガラクトシダーゼの有意な減少を示しました。 9プレゲル溶液はまた、細胞接着を改善するために、4℃でコーティングとして使用することができます。肺ECMコーティングされた組織培養プレートに添加したときプレゲル溶液をHpuVEC付着および増殖を向上させます。コーティングされたウェルは、非処理ウェル（ 図5）と比較して有意に改善された細胞付着を示します。
ゲニピンを追加すると、ヒドロゲルの架橋を増加させます。 ECMの分解を減少させながら、この増加した架橋は、より生理的に適切な剛性を提供することができます。劣化の減少は、in vitroでのマイナーなものの、原因間の増加の接合に発生する可能性がありますタンパク質や細胞によるECMリモデリングに対するので、より抵抗。我々は、架橋ヒドロゲルの機械的特性を測定するためのレオメーターで周波数掃引を使用します。ヒドロゲルの剛性を直接中央値0.01％で、最も関連性の高い濃度（ 図6、図示していない天然の組織）とゲニピン濃度に相関することが見出されました。 MTTアッセイは、架橋ヒドロゲルの細胞の増殖および生存を定量しました。細胞増殖は、架橋ヒドロゲル（ 図7）に高くなります。これは、他の人から増加した剛性に増加した細胞の増殖をサポートしています。 12ゲニピン架橋時間または温度を変化させると、異なる架橋度をもたらすことができます。
図1：我々は、肺の画像脱細胞化しています。 decellulari後の（A）マウスの肺からの写真化と心削除、トリトンX-100は、洗い流さ後（B）ラット（C）豚、最初のすすぎの前に。それらは、それぞれ、約5ミリグラム、40ミリグラム、および肺ECM 10gを得ました。カニューレとの脱細胞化した後（D）マウスの肺と無傷の心は、まだ場所で縫合します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：方法の概要。これは、肺からのヒドロゲルを製造するための方法の概要です。圏ブタの肺の脱細胞化は、ECMタンパク質で構成されているだけで不透明な白色または半透明の組織を残す発生途中で始まります。次いで、残りの水を除去し、酸分解を最適化するために、表面積を大きくした後、組織を可溶化します。交流の中和idと生理学的レベルに塩を増やすには、ゲル化の準備ができてプレゲル溶液を作成します。溶液を37℃でハイドロゲルを形成した後、特性は、ゲルレオメータおよび走査型電子顕微鏡を用いて行われます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
温度ランピングの下でゲル化するための代表的なレオロジーデータ：図3。線形粘弾性範囲を決定する初期振幅掃引後、温度勾配は、ゲル化速度を決定するために使用しました。データは、平均+/-標準偏差として提示されます。 N = 4。
図4：長期安定性。イム室温で6ヶ月以上PBS中に保存されたブタの肺のECMハイドロゲルの年齢。
図5：HpuVECsの代謝アッセイ。無処理の組織培養プレート上で増殖させたヒト初代微小血管内皮細胞（HpuVECs）からMTT増殖データ。 1.3.3からプレゲル溶液を一晩冷蔵し、プレゲル肺ECMコーティングされたプレートを形成するためにすすぎ、プレートに添加しました。 HpuVECsはノンコートに比べECMコーティングされたプレート上で高いMTT活性を示した。* P <0.05、対照と比較しました。データは、平均±標準偏差群当たりn = 3です。
図6：拡張架橋のためのレオロジーデータ。ゲニピン架橋のためレオメトリデータ。 GENIの増加濃度の剛性が増加1％のゲニピンで高原にピン。データは、ゲニピンと架橋で倍の増加を示すように正規化されます。
図7;ゲニピン架橋ゲル上の細胞増殖。ゲニピン架橋ヒドロゲル上A549Sのための正規化されたMTTデータ。剛性の増加に見られる細胞増殖を増加させました。 P <0.05は、対照と比較しました。データは、平均±標準偏差です。群当たりn = 3。
| 問題 | 問題 | 解決 |
| 脱細胞化後も保持レッド/ピンクカラー | 効果のない脱細胞化 | 新しい肺からやり直し |
| 不完全な脱細胞化の領域を削除します</ TD> | ||
| 血管閉塞 | 新しい肺からやり直し | |
| 不完全な脱細胞化の領域を削除します | ||
| 重要な細胞の破片は保持します | 効果のない脱細胞化 | 新しい肺からやり直し |
| 不完全な脱細胞化の領域を削除します | ||
| 血管閉塞 | 新しい肺からやり直し | |
| 不完全な脱細胞化の領域を削除します | ||
| 無気肺 | 新しい肺からやり直し | |
| 不完全な脱細胞化の領域を削除します | ||
| 組織学的試料中に認められる膜の破壊 | 灌流中の血管の過加圧 | 灌流圧を下げます洗剤の |
| 大きな粒子は、製粉後に残ります | チューブでも多くの凍結乾燥材料 | 円筒研削で材料を削減 |
| 十分な長さのために粉砕されていません | 粉砕時間を増加させます | |
| プレゲル溶液はゲル化しません | 溶液のpHが高すぎます | pHが7.4を作ります |
| 新鮮な粉末とプレゲルソリューションを開始 | ||
| 溶液のpHが低すぎます | pHが7.4を作ります | |
| 新鮮な粉末とプレゲルソリューションを開始 | ||
| 消化された以上のECM | 新鮮な粉末とプレゲルソリューションを開始 | |
| 細胞は生存しません | 塩酸消化後に導入された微生物 | 新鮮な粉末を再び開始し、滅菌濾過した溶液を使用します |
| pHはOFF | 再びプレゲルソリューションを開始 | |
| pHが7.4を作ります | ||
| 細胞は、バースト | プレゲル溶液中の塩分を修正 |
表2：潜在的なエラーの原因を特定するためのトラブルシューティングガイド。
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Discussion
生物学の不可欠な側面の一つは、特定のタスクを実行する階層構造への分子の自己組織です。ラボで13は 、自己組織化は、このような塩濃度、pH、および消化時間など多くの要因に依存します。示されるように、自己組織化ハイドロゲルの形態で可溶化タンパク質は、生理的温度に戻るとき。形成されたヒドロゲルは、in vitroでの細胞付着及び増殖を促進することができます。
ECMからの生物物理学的シグナルに対する細胞応答は、ポリマーを用いて調査することはできません。生物物理学的信号に組織特異的細胞応答は、他の組織を使用して調査することができません。再生の研究者や臨床医は、脱細胞化された足場を使用すると、組織再生および創傷治癒を向上させると信じています。慢性肺疾患の患者は、臓器の可用性を向上させ、免疫原性を減少するための治療の改善を必要とします。臓器特異的、細胞のECM相互作用がなければなりませんさらに臓器生物学に研究しました。
肺細胞の細胞足場としてECMを使用すると、一貫性のある結果を示しています。 14,15病気のモデルから肺のスライスを使用すると、遠位肺で発見、病気のリニューアル16幹細胞または前駆細胞を奨励17,18と奇形腫の形成を防止するために、特別なニッチを必要とします。送達ビヒクルとして組織特異ECMを使用して、前駆細胞の再生効果を高めることができます。 ECMハイドロゲルは、細胞外マトリックスへの細胞反応を評価するためのより多くの適用可能な環境を確立します。
研究の大きな体は、細胞内シグナル伝達に関連する剛性を見て存在しています。ゲニピン架橋の我々の方法は、細胞の剛性のシグナル伝達ならびに細胞 - ECM成分の相互作用を可能にします。ヒドロゲルの剛性がECMの量とタンパク質の比で操作することができるが、ゲニピンの使用は、ECMのコンテンツの幾分独立ヒドロゲル剛性の変化を可能にします。 GENの調整epin濃度が最も密接に天然の肺組織6に似ているため、機械的特性の正確なチューニングを可能にすることができます。ゲニピンデータは本研究では、末梢肺からのハイドロゲルを用いて得られたことから、（5 PAから75 PAに）15倍の増加が認められました。末梢肺ヒドロゲルを1％のゲニピンを追加又は推定（全肺ヒドロゲルに0.01％を添加することによって、我々は、おおよその末梢肺組織の剛性を（データは示していない）を達成することができ、同じ方法を使用して脱細胞化した生検正常ラット肺組織のレオロジーデータに基づきます）。肺実質からなる末梢肺ECMを使用すると、7私たちの以前に発表された全肺ECMハイドロゲルの結果と比較してかなり柔らかめのゲルを作りました。したがってゲニピンに加えて、脱細胞化する肺組織の特定の領域を選択すると、劇的に剛性に影響を与えることができます。
一般的にperfusiで使用される追加のステップを含むことが、この方法を改善する機会がありますが、全肺組織の脱細胞化について。この方法は、正常な肺組織で使用されており、病気の肺の脱細胞化のための修正が必要な場合があります。我々はまだ、特定の疾患状態において、このプロセスを検討していません。我々は、屠殺場から一晩氷上で出荷された私たちの肺を得ます。この方法は、原因無気肺や血管閉塞に対する我々のプロセスの有効性を制限する可能性;しかし、我々はほとんど完全に脱細胞化されていない肺の領域を削除する必要がありません。新鮮な肺組織を取得する場合、私たちは、組織処理の任意の一時停止を防止するために、肺を取得する前に必要なソリューションのすべてを行うことをお勧めします。以前の研究では、生産をマトリックスに、最終滅菌工程として過酢酸を使用して19は、潜在的に脱細胞化組織のproregenerative改善効果、免疫細胞浸潤回生M1マクロファージ表現型を引き起こすことを見出しました。他の研究では、プロセスを完了するために他の界面活性剤を使用中に行ったが、それらappeaましたrは脱細胞化に、最終的に同じ影響でラボ特定の環境設定をすることができます。脱細胞化手順および消化ステップは、研究者の特定の用途に応じて最適化することができます。例えば、ゲル消化時間または中和する方法を変更することは、タンパク質組成物、機械的性質、またはゲル化速度を変更することができます。
ここで説明する方法の代替は、所望の実験成果に応じて複雑さのレベルを変えることができます。目標は、可能な限り無傷の基底膜を維持することであった場合、例えば、圧力制限された制御を有する灌流ポンプは、バリアの損傷を減少させることができます。 1の方が大きいの種について、無傷の両方の肺を維持するために利用できる実験室のセットアップを持っていた場合に加えて、脱細胞化プロセスは、有効性を改善することができます。逆に、乳鉢と乳棒で技術を研削手はミル（cryomill）を持っていないラボのために凍結乾燥した組織に適用することができます。私たちは、手のgrindinを期待しますより大きなフラグメントを生成するために、G、消化時間は、この場合に変更される必要があるかもしれないので、酸の消化のために利用可能な表面積を制限します。
代替案は、脱細胞化ステップとヒドロゲルの形成に限定されるものではありません。グルタルアルデヒドは、モデル系のために使用される生物学的ヒドロゲルの機械的強度を増加させる1つの可能な代替を提供する、ヒドロゲルのための架橋剤として使用されています。他のモデルシステムは、モデル3D in vitroでの足場としての肺切片を見てin vitroでの 3D培養系、またはそれ以上の一般的に無傷の脱細胞化肺が含まれます。 20は、我々はすでに、ポリマー骨格だけでなく、単一成分足場での作業から来る限界を記載しているが、それらは、ここに提示された手順と可能な選択肢として残ります。さらに、代替（例えばDNA単離など）脱細胞化の有効性を決定する方法、ゲル化（濁度アッセイを使用することができます）、および細胞付着aがありますND増殖（例えばCCK8の使用など）。私たちは、ここで説明する方法は、モデルの3D足場として使用するためのヒドロゲルを特徴付けるために十分以上であることがわかりました。
我々はここで説明する肺のECMヒドロゲルは、細胞 - ECM相互作用を研究するための効果的なプラットフォームを提供します。プレゲル溶液には、間葉系幹細胞の送達を助ける、ポリマー薬物担体のためのコーティングとしての可能性を有する、またはそれ自体薬物送達プラットフォームとして。本明細書に提示プロトコルは肺ECM由来汎用性のハイドロゲルを作成するための基本的な手順を提供します。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、無傷のブタの肺組織を供与するためのスミスフィールドファームを感謝したいと思います。我々はまた、私たちは、自社の機器を使用できるようにするための博士胡ヤン博士クリスティーナ唐とVCU形成外科部門に感謝したいと思います。ヒドロゲルおよび組織サンプルは、資金調達のフォームNIH-NCIがんセンターサポート助成金により、一部には、NIH-NINDSセンターコアグラント5 P30 NS047463からの資金提供により、部分的には、サポートされている解剖学と神経生物学顕微鏡施設のVCU科でSEMのために調製しましたP30のCA016059。 VCUナノテクノロジーコアキャラ施設（NCC）でのサンプルのSEM画像。この作品は、全米科学財団、CMMI 1351162によって賄われていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100g | Use in hood with eye protection and gloves. |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500g | None |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-500g | None |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | None |
| HCl | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | Use with eye protection and gloves. |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | Use with eye protection and gloves. |
| Genipin | Wako Chemicals | 078-03021 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| PBS 10x | Quality Biological | 119-069-151 | None |
| PBS | VWR | 45000-448 | None |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Hand pump | Fisher Scientific | 10-239-1 | N/A |
| Graduate Beaker | VitLab | 445941 | N/A |
| Cryomill | SPEX | 6700 | Use cryogloves and eye protection. |
| Lyophilizer | FTS FlexiDry | Use gloves. | |
| Rheometer | Discovery | HR-2 | Use gloves and eye protection. |
References
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