Summary
Ceci est une méthode pour créer un échafaudage trois dimensions de culture de cellules de la matrice extracellulaire pulmonaire. poumon Intact est transformé en hydrogels qui peuvent soutenir la croissance des cellules en trois dimensions.
Abstract
Nous présentons ici une méthode pour établir des composants multiples hydrogels de culture cellulaire pour la culture in vitro de cellules de poumon. En commençant par la santé en tissu bloc pulmonaire de porc, rat ou la souris, le tissu est perfusé et immergé dans les détergents chimiques ultérieures pour éliminer les débris cellulaires. comparaison histologique du tissu avant et après le traitement confirme l'élimination de plus de 95% de la coloration de l'ADN double brin et l'alpha-galactosidase suggère que la majorité des débris cellulaires sont éliminés. Après décellularisation, le tissu est lyophilisé, puis cryomilled en poudre. La poudre de matrice est digéré pendant 48 heures dans une solution de digestion de la pepsine acide, puis on neutralise pour former la solution de pré-gel. Gélification de la solution de pré-gel peut être induite par une incubation à 37 ° C et peut être utilisée immédiatement après la neutralisation ou stocké à 4 ° C pendant jusqu'à deux semaines. Les revêtements peuvent être formés en utilisant la solution de pré-gel sur une plaque non-traitée pour cattachement ell. Les cellules peuvent être mises en suspension dans le pré-gel avant de l'autoassemblage de réaliser une culture en 3D, plaquée sur la surface d'un gel formé à partir de laquelle les cellules peuvent migrer à travers l'échafaudage, ou plaquée sur les revêtements. Les modifications de la stratégie présentés peuvent avoir un impact température de gélification, la force ou la taille des fragments de protéines. Au-delà de la formation d'hydrogel, la rigidité d'hydrogel peut être augmentée en utilisant genipin.
Protocol
| Solution | Filtre stérile | instructions |
| Dih 2 O | Oui | Dih 2 O; filtré de manière stérile |
| Solution à 0,1% de Triton X-100 | Oui | Sous la hotte ajouter 100 pi de Triton-X 100 Solution 100 ml Dih 2 O et agiter jusqu'à dissolution; filtre stérile. |
| 2% de désoxycholate Solution | Oui | Sous la hotte ajouter la solution de désoxycholate de sodium 2 g par 100 ml Dih 2 O et agiter jusqu'à dissolution; filtre stérile |
| NaCl 1 M | Oui | Ajouter 58,44 g de NaCl à 1 L de Dih 2 O; agiter jusqu'à dissolution; filtre stérile |
| une solution de DNase | Oui | Ajouter 12.000des unités de DNase 1 L Dih 2 O; Ajouter 0,156 g MgSO 4 (Anhydre) et 0,222 g de CaCl 2; agiter jusqu'à dissolution; filtre stérile |
| PBS | Oui | Mélanger 27,2 g Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (de heptahydraté), 80 g de NaCl et 2 g de KCl avec 10 L Dih 2 O; agiter jusqu'à dissolution; ajuster le pH à 7,4; filtre stérile |
Tableau 1: Solutions requises pour décellularisation tissulaire. Faire les solutions ci-dessus pour le processus de décellularisation. Conserver à 4 ° C. Environ 2,5 L sera nécessaire pour un poumon porcin.
1. Formation Hydrogel
- Porcine Lung décellularisation (adapté des références 9,10)
- Obtenir un en bloc poumon porcin normal, d'un abattoir, avec le coeur et Vasculature intacte.
- Utilisez des ciseaux de tissu ou un scalpel pour disséquer le cœur, vasculature aussi près que possible au cœur de coupe, restant vasculature sera utilisé dans les étapes ultérieures pour perfusion.
- disséquer soigneusement l'écart du tissu conjonctif autour de la trachée, des bronches et du système vasculaire en utilisant un scalpel ou de ciseaux.
NOTE: Déterminer le meilleur poumon à utiliser pour le reste de la procédure en choisissant un poumon sans grandes coupures ou piqûres à travers la plèvre et de grandes quantités de atélectasie ou une occlusion vasculaire qui peuvent entraver l'efficacité du processus de décellularisation. - Coupez le poumon suboptimale laissant autant bronchus attachés à la trachée que possible (coeur, du tissu conjonctif et les lobes du poumon enlevé peuvent être éliminés). Il devrait y avoir un poumon restant attaché à la trachée et de la vascularisation.
NOTE: Maintenir les sections pour l'histologie, si désiré. 9 - Fermez les bronches déconnectées avec des pinces ou suture à pDisconnecteur excès revent.
- Préparer les solutions de décellularisation et réfrigérer à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire (tableau 1).
- L'utilisation d'une pompe à main canulée pour adapter l'artère pulmonaire, perfuser le tissu pulmonaire 3 fois avec de l'eau DI à la fois par l'artère pulmonaire et de la trachée. Perfuser vasculature premier à chaque fois. Commencer avec environ 1 L dans le système vasculaire et 1,5 L dans la trachée pour chaque perfusion, mais que les débris cellulaires sont éliminés plus liquide peut être perfusée à travers le système.
- Perfuser à la fois le système vasculaire et de la trachée avec du Triton X-100 solution.
- Immerger le tissu pulmonaire dans Triton X-100 solution pendant 24 heures à 4 ° C.
- Perfuse vascularisation et la trachée 3 fois avec de l'eau déminéralisée pour rincer.
- Perfuser à la fois du système vasculaire et de la trachée avec une solution de désoxycholate.
- Immerger les coupes de tissus en désoxycholate pendant 24 heures à 4 ° C.
- Perfuse vascularisation et la trachée 3 fois avec de l'eau déminéralisée pour rincer.
- Perfuser deux vascularisation et de la trachée avec une solution de NaCl.
- Immerger tissu dans une solution de NaCl filtrée pendant 1 h à 4 ° C.
- Perfuse vascularisation et la trachée 3 fois avec de l'eau déminéralisée pour rincer.
- Perfuser deux vascularisation et de la trachée avec une solution de DNase.
- Immerger le tissu dans une solution de DNase filtrée pendant 1 h à 4 ° C.
- Perfuser deux vascularisation et de la trachée 5 fois avec du PBS.
- Disséquer loin tissu cartilagineux notable, la trachée et les tubules 2 mm ou plus de diamètre (principalement trouvés autour du hile et des parties médianes des poumons) de mener des voies respiratoires, ne laissant que des zones respiratoires (principalement les zones périphériques).
- Disséquer les tissus en 1 sections pouces ou plus petits. Orientation du tissu n'a pas d'importance pour cette étape.
- Versez l'excès de tissu liquide et dans 50 ml tubes coniques. Congeler le tissu à -80 ° C.
NOTE: Retenir les sections pour l'histologie pour assurer l'élimination des cellules et debri cellulaires, si on le souhaite. Nous utilisons H & E, α-galactosidase, PicoGreen, hydroxyproline, ninhydrine, bleu, SDS-PAGE alcian, et la spectrométrie de masse pour caractériser. 9
- traitement du poumon
- Retirer les couvercles de tubes congelés contenant du tissu pulmonaire décellularisé.
- Placer le papier filtre sur l'ouverture du tube et le fixer avec une bande élastique.
NOTE: Tube et le contenu doivent encore être congelés placer autrement -80 ° C jusqu'à gelé. - Lyophiliser le tissu jusqu'à ce que tout excès de liquide a disparu, en utilisant un lyophilisateur selon les instructions du fabricant. Conserver à -80 ° C jusqu'au moment de l'usine.
- Avant de commencer ajouter de l'azote liquide à l'usine de congélation pour refroidir l'isolation et les composants internes à des conditions de travail.
- Retirer la barre de moulin magnétique du tube de moulin et ajouter le tissu pour couvrir le fond.
- Remplacer la barre de moulin et ajouter le tissu légèrement tassées. Le bar de l'usine doit encore se déplacer librement.
- Fermer le tube de moulin et plaCE dans l'usine de congélation.
- Remplir l'azote liquide à la ligne de remplissage max.
- Moulin à congélateur tous les tissus en poudre fine (environ 5 min, vitesse de ~ 600 min impaction -1), dans un cylindre de polycarbonate avec un impacteur en acier inoxydable, ainsi que inoxydable bouchons d'extrémité en acier à l' aide de l'usine de congélation selon les instructions du fabricant. Conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.
- Micro-poreux de formation de gel (8 mg / ml) (adapté de références 9,11)
- Ajouter 1% (p / v) de la poudre décellularisé et 0,1% (p / v) de pepsine à HCl 0,01 M, sous agitation constante (devrait être en mesure de voir couler au plus haut niveau de liquide), à la température ambiante, par 48 h.
NOTE: La poudre est chargée statiquement, afin d'ajouter l'HCl après que la poudre offre la possibilité de se laver l'excès sur les parois du tube. - Après digestion pendant 48 h, placer la solution et les réactifs sur la glace pendant 5 min.
- Réfrigérée en utilisant 10% de NaOH (v / v) de 0,1, und 11,11% (v / v) de 10x PBS (pour amener la solution entière à 1x la concentration), amener solution protéique à digestion pH physiologique de 7,4.
REMARQUE: La solution peut alors être stockée à 4 ° C pendant jusqu'à une semaine. Effectuer la cinétique de gélification à l' aide de rhéométrie 9 si on le souhaite.
- Ajouter 1% (p / v) de la poudre décellularisé et 0,1% (p / v) de pepsine à HCl 0,01 M, sous agitation constante (devrait être en mesure de voir couler au plus haut niveau de liquide), à la température ambiante, par 48 h.
2. La réticulation hydrogels pour améliorer la résistance mécanique
- Des solutions de 1%, 0,1% et 0,01% p / v solution génipine de réticulation ont été préparées en dissolvant la quantité nécessaire de poudre génipine dans 10% de DMSO.
- Vortexer la solution toutes les 15 minutes pendant 1 heure.
- Ajouter une solution genipin pour couvrir hydrogels ECM (100 pi pour chaque puits d'une plaque de 96 puits) qui ont déjà été assemblés en partie 1.3.4.
- Laissez chaque hydrogel ECM pour réticuler pendant 24 heures à 37 ° C.
- Rincer l'hydrogel ECM 3 fois avec du PBS jusqu'à ce que la solution de lavage est plus bleue. Le hydrogels réticulés seront alors prêts pour une caractérisation et CEétudes de culture ll.
3. Culture cellulaire avec microporeux Gel
- Revêtement bidimensionnelle
- En utilisant la solution de 1.3.3, ajouter 20 pi de solution de pré-gel dans chaque puits d'une plaque de culture de tissu à 96 puits non traitée.
- Réfrigérer pendant une nuit à 4 ° C pour permettre l'adsorption des protéines à l'assiette.
- solution Aspirer prégel et rincer avec du PBS.
- Cellules Passage 9.
- Ajouter 10.000 cellules / cm2 dans des puits.
- Augmenter les médias à 100 pi par puits et incuber à 37 ° C.
- Trois culture cellulaire tridimensionnelle 9
- En utilisant une solution de 1.3.3, resuspendre les cellules sédimentées à une concentration de 1.000.000 cellules / ml d'une solution de pré-gel.
- passer rapidement 16 pl de suspension prégel-cellulaire dans chaque puits d'une plaque à 96 puits, pour former un épais hydrogel ~ 500 um pour la culture cellulaire 3D.
- Incuber à 37 ° C pendant 30min pour le gel pour former.
- Ajouter 100 ul de milieu à haut de hydrogels formés et incuber à 37 ° C.
- Trois culture cellulaire dimensions sur des gels de raideur variable
- Utiliser une solution de 1.3.3, pipette 100 pi d'une solution de pré-gel dans chaque puits d'une plaque de 96 puits.
- Incuber à 37 ° C pendant 30 minutes pour le gel de se former.
Remarque: Cross-linking étapes de la partie 2 peuvent être utilisés ici. - Cellules Passage 9.
- Ajouter 10.000 cellules / cm2 dans des puits.
- Augmenter les médias à 100 pi par puits et incuber à 37 ° C.
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Representative Results
En utilisant cette méthode, nous avons produit des hydrogels de porc normale, rat, et les poumons de souris (Figure 1). poumons transformés fournissent environ 5 mg, 40 mg et 10 g de poudre ECM respectivement. Un aperçu du procédé est représenté sur la figure 2. visualisations clé au cours du processus comprennent: aspect blanc des poumons après le rinçage désoxycholate; après la formation de pré-gel, une solution doit être opaque et la solution doit apparaître homogène pendant des mois si elle est conservée à 4 ° C. Nous avons inclus un tableau de dépannage de base pour aider à identifier les sources d'erreur tout au long du processus (tableau 2). Après la gélification, les hydrogels peuvent être utilisées immédiatement ou stockées pour utilisation ultérieure. Le test rhéologique confirme que plus de 90% de la gélification se produit dans les premières minutes après avoir atteint 37 ° C (figure 3). hydrogels formées sont stables pendant de longues périodes dans PBS, mais l'attachement des cellules et proliferation peut changer (Figure 4).
Bien que ce protocole est écrit pour le poumon porcin, manque d'espace nous limitent à utiliser un seul poumon lorsque décellularisation poumons de porc. Nous avons utilisé la même procédure avec des modifications mineures à decellularize deux poumons pour d'autres espèces. Pour les rats et les souris, les poumons peuvent être laissées intactes et le cœur fixés, mais le tissu conjonctif doivent encore être enlevés avec un scalpel ou des ciseaux. Nous gardons le cœur intact et fixé pour les rats et les souris et perfuser les solutions à travers le ventricule droit à la place de l'artère pulmonaire. Perfusion de la trachée est toujours la même; cependant, la canule peut être suturée dans la trachée pour faciliter l'accès des espèces plus petites.
Nous avons ajouté plusieurs types de cellules, les cellules souches mésenchymateuses humaines, 9 cellules souches mésenchymateuses de souris, des lignées cellulaires epitheliales humaines (A549s), endo microvasculaires humaines primairesles cellules thelial (HpuVECs), et les cellules humaines de veine ombilicale (HUVEC), l'épithélium à l'intérieur et sur la surface des hydrogels ECM du poumon. Nous n'avons pas rencontré des problèmes en ce qui concerne la nature xénogénique des gels formés. Nos travaux antérieurs ont montré une réduction significative de α-galactosidase dans les hydrogels porcine. 9 La solution de pré-gel peut également être utilisé en tant que revêtement à 4 ° C afin d' améliorer la fixation des cellules. La solution de pré-gel permet d'améliorer l'attachement et la prolifération HpuVEC lorsqu'il est ajouté au poumon ECM plaques de culture de tissus enduits. Puits revêtus démontrent une amélioration significative par rapport à la fixation cellulaire des puits non traités (figure 5).
L'ajout d'un hydrogel augmente génipine réticulation. Cette réticulation accrue peut fournir une rigidité plus physiologiquement pertinente, tout en réduisant la dégradation de l'ECM. La diminution de la dégradation, bien que mineure in vitro, peut se produire en raison de l' augmentation liaison entreprotéines et donc plus de résistance à l'ECM remodelage par les cellules. Nous avons utilisé des balayages de fréquence sur un rhéomètre pour mesurer les propriétés mécaniques de l'hydrogel réticulé. Hydrogel rigidité a été trouvée comme étant directement corrélé à la concentration génipine avec la médiane et la plus pertinente étant la concentration à 0,01% (figure 6, le tissu natif non représenté). Un essai MTT a été utilisé pour quantifier une prolifération cellulaire et la survie de l'hydrogel réticulé. La prolifération cellulaire est supérieure à l'hydrogel réticulé (figure 7). Cela soutient la prolifération cellulaire accrue sur l'augmentation de la rigidité des autres. 12 genipin Varier le temps ou la température de réticulation peut conduire à des degrés différents de réticulation.
Figure 1: Images de Poumons Nous avons décellularisé. Photos de (A) poumon de souris après decellularisation et le coeur enlevé, (B) Rat après Triton X-100 rincé, (C) Pig, avant rinçage initial; ils cèdent ~ 5 mg, 40 mg et 10 g de poumon ECM, respectivement. Poumon (D) Souris et coeur intact, après décellularisation, avec canule encore suturés en place. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Vue d' ensemble des méthodes. Voici un aperçu de la méthode pour produire des hydrogels de poumons. En commençant par en bloc décellularisation du poumon de porc se produit en laissant le tissu blanc ou translucide seulement opaque qui est composé de protéines d'ECM. Ensuite, après avoir éliminé toute l'eau restante, et en augmentant l'aire de surface afin d'optimiser la digestion du tissu acide est solubilisé. Neutralisation de l'acid et en augmentant le sel à des niveaux physiologiques crée la solution de pré-gel prêt à gélification. Une fois que la solution forme un hydrogel à 37 ° C, la caractérisation a lieu avec un rhéomètre microscopie sur gel et électronique à balayage. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Représentant rhéologique données pour gélification sous Température Ramping. Après une balayage amplitude initiale pour déterminer plage viscoélastique linéaire, une rampe de température est utilisé pour déterminer la cinétique de gélification. Les données sont présentées sous forme de moyenne +/- écart-type. n = 4.
Figure 4: stabilité à long terme. Une iml'âge d'un ECM hydrogel de poumon de porc stocké dans du PBS pendant plus de 6 mois à température ambiante.
Figure 5: Metabolic Dosage de HpuVECs. les données de prolifération des cellules microvasculaires de MTT primaires endothéliales humaines (HpuVECs) ont été cultivés sur des plaques de culture de tissus non traités. solution Pregel de 1.3.3 a été ajouté à plaques, réfrigérés pendant la nuit et rincés pour former des plaques enduites ECM pulmonaire pré-gel. HpuVECs a montré une activité plus élevée MTT sur des plaques revêtues par rapport à l'ECM non revêtu. * P <0,05 par rapport au témoin. Les données sont la moyenne ± écart type n = 3 par groupe.
Figure 6: rhéologique données pour Réticulation Enhanced. données Rheometry pour la réticulation genipin. Les Rigidité augmente avec l'augmentation des concentrations de geniépingler sur un plateau à 1% genipin. Les données sont normalisées pour montrer un facteur d'augmentation de la réticulation avec genipin.
La figure 7; Prolifération cellulaire sur genipin réticulés Gels. données de MTT normalisées pour A549s sur hydrogels réticulés génipine. prolifération cellulaire accrue observée avec la rigidité accrue. p <0,05 par rapport au témoin. Les données sont la moyenne ± écart type. n = 3 par groupe.
| Problème | Problème | Résolution |
| La couleur rouge / rose conservé après décellularisation | décellularisation inefficace | Recommencer avec de nouveaux poumons |
| Supprimer les zones de décellularisation incomplète </ Td> | ||
| L'occlusion vasculaire | Recommencer avec de nouveaux poumons | |
| Retirer les zones de décellularisation incomplète | ||
| débris cellulaires significatives retenues | décellularisation inefficace | Recommencer avec de nouveaux poumons |
| Retirer les zones de décellularisation incomplète | ||
| L'occlusion vasculaire | Recommencer avec de nouveaux poumons | |
| Retirer les zones de décellularisation incomplète | ||
| Atélectasie | Recommencer avec de nouveaux poumons | |
| Retirer les zones de décellularisation incomplète | ||
| Destruction des membranes trouvé dans des échantillons histologiques | Over-pressurisation des navires pendant la perfusion | Réduire la pression de perfusiondes détergents |
| Grandes particules restant après le fraisage | Trop de matière lyophilisée dans le tube | Réduire la matière à broyer cylindre |
| Non blanchi assez longtemps | augmenter le temps de fraisage | |
| solution Prégel pas gélifiant | Solution pH trop élevée | Faire pH 7,4 |
| Commencez solution prégel avec de la poudre fraîche | ||
| Solution pH trop faible | Faire pH 7,4 | |
| Commencez solution prégel avec de la poudre fraîche | ||
| ECM plus digérées | Commencez solution prégel avec de la poudre fraîche | |
| Les cellules ne survivent pas | Microbes introduites après HCl digestion | Commencez à nouveau avec de la poudre fraîche et utiliser des solutions filtrées stériles |
| pH off | Recommencez solution prégel | |
| Faire pH 7,4 | ||
| Les cellules éclatent | Fix teneur en sel en solution prégel |
Tableau 2: Guide de dépannage pour identifier les sources d'erreurs potentielles.
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Discussion
Un des aspects les intégrales de la biologie est l'auto-organisation des molécules dans les structures hiérarchiques qui effectuent une tâche spécifique. 13 En laboratoire, l' auto-assemblage dépend de nombreux facteurs tels que la concentration en sel, le pH et la durée de digestion. Comme le montre, il se forme d'hydrogel auto-organisation lorsque les protéines solubilisées retour à une température physiologique. L'hydrogel formé est capable de favoriser l' attachement et la prolifération cellulaire in vitro.
Réponse cellulaire aux signaux biophysiques de l'ECM ne peut être étudié en utilisant des polymères. réponse cellulaire spécifique de tissus aux signaux biophysiques ne peut être étudié à l'aide d'autres tissus. chercheurs et les cliniciens pensent que la régénération en utilisant des échafaudages décellularisées améliore la régénération tissulaire et la cicatrisation. Chroniques souffrant de maladies du poumon ont besoin des améliorations thérapeutiques pour accroître la disponibilité d'organes et de diminuer l'immunogénicité. spécifiques, les interactions cellule-ECM Organ doivent êtredes recherches à d'autres la biologie d'organes.
ECM en utilisant comme échafaudage de cellules pour les cellules pulmonaires a montré des résultats cohérents. 14,15 Utilisation de tranches de poumon de modèles malades encourage le renouvellement de la maladie 16 cellules souches ou progénitrices, trouvés dans les poumons distales, 17,18 et nécessite des niches particulières pour empêcher la formation de tératome. En utilisant ECM spécifique d'un tissu en tant que véhicule d'administration, les effets de régénération des cellules progénitrices peuvent être améliorées. L'hydrogel ECM établit un environnement plus applicable pour évaluer les réactions cellulaires à la matrice extra-cellulaire.
Un grand corps de recherche existe en regardant la rigidité en ce qui concerne la signalisation cellulaire. Notre méthode de réticulation genipin permettent pour la cellule-rigidité de signalisation ainsi que les interactions composant cellulaire ECM. Alors que la rigidité d'hydrogel peut être manipulé par l'ECM quantité et le rapport des protéines, l'utilisation de la génipine permet des changements de rigidité d'hydrogel relativement indépendantes de la teneur ECM. Réglage genconcentration epin peut permettre un réglage précis des propriétés mécaniques pour ressembler plus étroitement le tissu pulmonaire naturel 6. A partir des données obtenues à l'aide génipine hydrogels de poumon périphérique dans la présente étude, une augmentation de 15 fois (de 5 Pa à 75 Pa) a été noté. D'après les données rhéologiques de tissu pulmonaire de rat normal biopsie qui a été décellularisé selon les mêmes méthodes, nous pouvons obtenir la rigidité du tissu pulmonaire périphérique approximative (données non représentées) par addition de 1% génipine hydrogels pulmonaires périphériques ou en ajoutant 0,01% à hydrogels de poumon entier (estimation ). Utilisation de l'ECM du poumon périphérique composé de parenchyme pulmonaire fait un gel considérablement plus doux par rapport à nos poumons ensemble les résultats publiés antérieurement ECM d'hydrogel 7. Par conséquent, en plus de genipin, en sélectionnant des régions spécifiques du tissu pulmonaire à decellularize peuvent considérablement influer sur la rigidité.
Il existe des possibilités d'améliorer cette méthode, qui peut inclure des étapes supplémentaires communément utilisés dans perfusisur la décellularisation d'un tissu pulmonaire entier. Cette méthode a été utilisée sur les tissus pulmonaires normaux et peut nécessiter une modification pour la décellularisation des poumons malades. On n'a pas encore examiné ce processus dans les états pathologiques spécifiques. Nous obtenons nos poumons expédiés sur la glace durant la nuit à partir d'un abattoir. Cette méthode pourrait limiter l'efficacité de notre processus en raison de l'atélectasie ou l'occlusion vasculaire; Cependant, nous avons rarement pour éliminer les zones de poumon qui ne l'ont pas été complètement décellularisé. Lors de l'obtention du tissu pulmonaire frais, nous recommandons faire toutes les solutions nécessaires avant d'obtenir les poumons pour éviter les pauses dans le traitement des tissus. Des recherches antérieures ont trouvé que l' utilisation de l' acide peracétique comme une étape de stérilisation finale à la matrice de production provoque une régénération M1 macrophage phénotype à infiltrer les cellules immunitaires, 19 améliorant potentiellement les effets pro - régénérateur de tissu décellularisé. D'autres recherches ont été consacrés à l'utilisation d'autres détergents pour compléter le processus, mais ceux Appear d'être des préférences spécifiques laboratoire avec finalement le même impact sur décellularisation. La procédure et de digestion étapes de décellularisation peuvent être optimisées en fonction de l'application spécifique du chercheur. Par exemple, en modifiant le temps ou la neutralisation des méthodes gel de digestion peut modifier la composition des protéines, des propriétés mécaniques ou la cinétique de gélification.
Alternatives à la méthode décrite ici peuvent varier en niveau de complexité en fonction des résultats expérimentaux souhaités. Par exemple, si l'objectif est de maintenir la membrane basale intacte, autant que possible, une pompe à perfusion avec un contrôle limité à la pression peut diminuer les dommages de la barrière. En outre, si l'on avait une configuration de laboratoire disponibles pour garder les deux poumons intacts pour les espèces plus grandes, le processus de décellularisation peut améliorer l'efficacité. A l'inverse, une main technique de broyage avec un mortier et un pilon peut être appliquée sur le tissu lyophilisé pour les laboratoires qui ne possèdent pas CryoMill. Nous nous attendons à Grindin maing pour produire des fragments plus grands, ce qui limite la surface disponible pour la digestion acide de sorte que les temps de digestion peut être nécessaire de modifier dans ce cas.
Alternatives ne sont pas limités aux étapes de décellularisation et la formation d'hydrogels. Glutaraldéhyde a été utilisé comme un agent de réticulation pour des hydrogels, en fournissant une alternative possible à augmenter la résistance mécanique des hydrogels biologiques utilisés pour les systèmes de modèles. D' autres systèmes modèles comprennent les poumons décellularisés intacts comme un système in vitro de culture 3D, ou plus communément en regardant les tranches de poumon comme un modèle 3D d'échafaudage in vitro. 20 Nous avons déjà mentionné les limitations qui viennent de travailler avec des échafaudages de polymères, ainsi que des échafaudages à composant unique, mais ceux qui restent comme des alternatives possibles à la procédure présentée ici. En outre, il existe des méthodes alternatives à la détermination de décellularisation efficacité (tels que l'isolement de l'ADN), la gélification (peut utiliser des tests de turbidité), et la fixation des cellules d'unnd prolifération (comme l'utilisation de CCK8). Nous avons constaté que les méthodes décrites ici sont plus que suffisantes pour caractériser hydrogels pour l'utilisation comme échafauds modèle 3D.
Les hydrogels ECM pulmonaires que nous décrivons ici fournissent une plate-forme efficace pour l'étude des interactions cellule-ECM. La solution de pré-gel présente un potentiel en tant que revêtement pour des supports de médicament polymère, ce qui facilite la livraison des cellules souches mésenchymateuses, ou comme une plate-forme de délivrance de médicament lui-même. Le protocole présenté ici fournit les étapes de base pour la création d'un hydrogel polyvalent dérivé d'ECM du poumon.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier les fermes de Smithfield pour le don du tissu pulmonaire porcin intact. Nous tenons également à remercier le Dr Hu Yang, le Dr Christina Tang et le département de chirurgie plastique VCU pour nous permettre d'utiliser leur équipement. échantillons hydrogels et de tissus ont été préparés pour SEM au Département VCU d'anatomie et de l'installation de neurobiologie Microscopie pris en charge, en partie, grâce au financement du NIH-NINDS Core Center Grant 5 P30 NS047463 et, en partie, par la forme de financement du NIH-NCI Cancer Support Center Grant P30 CA016059. SEM imagerie d'échantillons à l'installation de base Caractérisation VCU Nanotechnology (CCN). Ce travail a été financé par la National Science Foundation, CMMI 1351162.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100g | Use in hood with eye protection and gloves. |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500g | None |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-500g | None |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | None |
| HCl | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | Use with eye protection and gloves. |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | Use with eye protection and gloves. |
| Genipin | Wako Chemicals | 078-03021 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| PBS 10x | Quality Biological | 119-069-151 | None |
| PBS | VWR | 45000-448 | None |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Hand pump | Fisher Scientific | 10-239-1 | N/A |
| Graduate Beaker | VitLab | 445941 | N/A |
| Cryomill | SPEX | 6700 | Use cryogloves and eye protection. |
| Lyophilizer | FTS FlexiDry | Use gloves. | |
| Rheometer | Discovery | HR-2 | Use gloves and eye protection. |
References
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