Summary
Este es un método para crear un andamio de cultivo celular de 3 dimensiones de la matriz extracelular pulmonar. pulmonar intacta se procesa en hidrogeles que pueden apoyar el crecimiento de células en tres dimensiones.
Abstract
Aquí presentamos un método para establecer múltiples hidrogeles de cultivo de células de componentes para el cultivo in vitro de células de pulmón en. Comenzando con sano en tejido bloque de pulmón de porcino, de rata, o un ratón, el tejido es perfundido y sumergido en detergentes químicos subsiguientes para eliminar los restos celulares. comparación histológica del tejido antes y después del procesamiento confirma la eliminación de más del 95% de la doble tinción de ADN y alfa galactosidasa hebra sugiere se elimina la mayoría de los restos celulares. Después de la descelularización, el tejido es liofilizada y después cryomilled en un polvo. El polvo de la matriz se digiere durante 48 horas en una solución de digestión con pepsina ácida y después se neutralizó para formar la solución pregel. La gelificación de la solución pregel puede ser inducida por la incubación a 37 ° C y puede ser utilizado inmediatamente después de la neutralización o se almacenaron a 4 ° C durante hasta dos semanas. Los recubrimientos se pueden formar usando la solución pregel en una placa no tratada para capego ell. Las células pueden ser suspendidas en el pregel antes de la auto-ensamblaje de lograr una cultura 3D, chapada en la superficie de un gel formado a partir de la cual las células pueden migrar a través del andamio, o chapada en los revestimientos. Las alteraciones en la estrategia presentada puede afectar la temperatura de gelificación, la fuerza o el tamaño de los fragmentos de proteínas. Más allá de la formación del hidrogel, la rigidez de hidrogel se puede incrementar utilizando genipina.
Protocol
| Solución | filtro estéril | Direcciones |
| DiH 2 O | Sí | DiH 2 O; estéril filtrada |
| Solución Triton X-100 0,1% | Sí | Bajo campana de humos Añadir 100 ml de Triton X-100 a 100 ml Solución DiH 2 O y agitar hasta que se disuelva; filtro estéril. |
| 2% desoxicolato Solution | Sí | Bajo campana de humos agregar 2 g de solución de desoxicolato de sodio por 100 ml de DiH 2 O y agitar hasta que se disuelva; filtro estéril |
| 1 M NaCl | Sí | Añadir 58.44 g de NaCl a 1 L de DiH 2 O; agitar hasta que se disuelva; filtro estéril |
| solución de DNasa | Sí | Añadir 12.000unidades de DNasa a 1 L DiH 2 O; Añadir 0,156 g MgSO4 (Anhidro), y 0,222 g de CaCl 2; agitar hasta que se disuelva; filtro estéril |
| PBS | Sí | Combinar 27,2 g de Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (dibásico heptahidratado), 80 g de NaCl, y 2 g de KCl con 10 L DiH 2 O; agitar hasta que se disuelva; ajustar el pH a 7,4; filtro estéril |
Tabla 1: Soluciones requeridos para la descelularización de tejidos. Hacer las soluciones anteriores para el proceso de descelularización. Almacenar a 4 ° C. Aproximadamente se necesitará 2,5 L de un pulmón porcino.
1. Formación de hidrogel
- Porcino de pulmón descelularización (adaptado de referencias 9,10)
- Obtener, un cuarto bloque de pulmón porcino normal de un matadero, con el corazón y Vasculature intacto.
- Con unas tijeras de tejido o un bisturí para diseccionar el corazón, vasculatura lo más cerca posible al corazón de corte, vasculatura restante se utilizó en pasos posteriores para perfusión.
- diseccionar cuidadosamente el tejido conectivo que rodea la tráquea, los bronquios, y la vasculatura utilizando un escalpelo o tijeras.
NOTA: Determinar el mejor de pulmón a utilizar para el resto del procedimiento por la elección de un pulmón y sin grandes heridas o perforaciones a través de la pleura y grandes cantidades de atelectasia o la oclusión vascular que pueden impedir la eficacia del proceso de descelularización. - Cortar el pulmón subóptima deja la mayor parte del bronquio unidos a la tráquea como sea posible (corazón, tejido conectivo y los lóbulos del pulmón eliminado podrán ser eliminados). Debe haber un pulmón que permanezcan unidas a la tráquea y la vasculatura.
NOTA: Conservar secciones para histología si se desea. 9 - Cierre bronquios desconectados con abrazaderas o sutura a prevenir el exceso de flujo de retorno.
- Preparar las soluciones descelularización y refrigerar a 4 ° C hasta que se necesite (Tabla 1).
- El uso de una bomba de mano canulado para ajustarse a la arteria pulmonar, la perfusión del tejido pulmonar 3 veces con agua DI a través tanto de la arteria pulmonar y la tráquea. Perfundir vasculatura primera cada vez. Comienza con alrededor de 1 L en la vasculatura y 1,5 L en la tráquea para cada perfusión, pero como se elimina los desechos celulares más líquido puede ser perfundido a través del sistema.
- Perfundir tanto vasculatura y la tráquea con una solución de Triton X-100.
- Sumergir el tejido pulmonar en una solución de Triton X-100 durante 24 horas a 4 ° C.
- Perfuse vasculatura y tráquea 3 veces con agua DI para enjuagar.
- Perfundir tanto vasculatura y la tráquea con una solución de desoxicolato.
- Sumergir las secciones de tejido en desoxicolato durante 24 horas a 4 ° C.
- Perfuse vasculatura y tráquea 3 veces con agua DI para enjuagar.
- Perfundir tanto vasculatura y la tráquea con una solución de NaCl.
- Sumergir el tejido en solución de NaCl se filtró durante 1 hora a 4 ° C.
- Perfuse vasculatura y tráquea 3 veces con agua DI para enjuagar.
- Perfundir tanto vasculatura y la tráquea con una solución de DNasa.
- Sumergir el tejido en solución filtrada DNasa durante 1 hora a 4 ° C.
- Perfundir tanto vasculatura y la tráquea 5 veces con PBS.
- Diseccionar tejido cartilaginoso notable, tráquea y todo túbulos 2 mm o más de diámetro (que se encuentra principalmente en torno a la hilio y porciones mediales de los pulmones) de la realización de las vías respiratorias, dejando sólo las zonas respiratorias (principalmente las zonas periféricas).
- Diseccionar el tejido en secciones de 1 pulgada o más pequeños. Orientación del tejido no importa para este paso.
- Retirar el exceso de tejido líquido y colocar en tubos de 50 ml cónicos. Congelar el tejido a -80 ° C.
NOTA: Conservar secciones de histología para asegurar la eliminación de las células y debri celulars, si se desea. Utilizamos H & E, α-galactosidasa, PicoGreen, hidroxiprolina, ninhidrina, Alcian azul, SDS-PAGE y espectrometría de masas para caracterizar. 9
- Procesamiento de pulmón
- Retire las tapas de los tubos congelados que contienen tejido pulmonar descelularizado.
- Coloque papel de filtro sobre la abertura del tubo y asegurar con banda de goma.
NOTA: El tubo y el contenido todavía se deben congelar cualquier otra manera ponga en -80 ° C hasta que se congele. - Liofilizar el tejido hasta que todo el exceso de líquido se ha ido, utilizando un secador de congelación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Almacenar a -80 ° C hasta el momento de molino.
- Antes de comenzar añadir nitrógeno líquido para molino congelador para enfriar el aislamiento y los componentes internos de las condiciones de trabajo.
- Retire la barra magnética molino de tubo de molino y agregar el tejido para cubrir el fondo.
- Cambie la barra de molino y agregar el tejido sin apretar. La barra de molino todavía debe moverse libremente.
- Cerrar el tubo molino y place en el molino congelador.
- Llenar nitrógeno líquido para línea de llenado máximo.
- Molino Congelador todo el tejido en polvo fino (aproximadamente 5 min, la tasa de impactación de ~ 600 min -1), en un cilindro de policarbonato con un impactador de acero inoxidable, así como tapones de extremo de acero inoxidable utilizando el molino congelador de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Almacenar a -80 ° C hasta que esté listo para su uso.
- Micro-porosa formación de gel (8 mg / ml) (adaptado de referencias 9,11)
- Añadir 1% (w / v) del polvo descelularizado y 0,1% (w / v) de pepsina a M HCl 0,01, con agitación constante (debe ser capaz de ver el flujo en el nivel superior de líquido), a temperatura ambiente, durante 48 hr.
NOTA: El polvo se carga estáticamente, por lo que añadir el HCl después el polvo produce la oportunidad para lavar el exceso de las paredes del tubo. - Después de la digestión durante 48 h, colocar la solución y los reactivos en hielo durante 5 min.
- Usando refrigerado 10% (v / v) de NaOH 0,1 M, unad 11.11% (v / v) 10x PBS (para llevar la solución entera a 1x concentración), llevar la solución de proteína digerida a pH fisiológico de 7,4.
NOTA: La solución ahora se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de una semana. Realizar una cinética de gelificación utilizando reometría 9 si se desea.
- Añadir 1% (w / v) del polvo descelularizado y 0,1% (w / v) de pepsina a M HCl 0,01, con agitación constante (debe ser capaz de ver el flujo en el nivel superior de líquido), a temperatura ambiente, durante 48 hr.
2. El entrecruzamiento hidrogeles para mejorar la resistencia mecánica
- Las soluciones de 1%, 0,1% y 0,01% w / v solución genipina reticulación se prepararon disolviendo la cantidad necesaria de polvo de genipina en 10% de DMSO.
- Vortex la solución cada 15 min durante 1 hora.
- Añadir solución genipina para cubrir hidrogeles ECM (100 l por cada pocillo de una placa de 96 pocillos) que han sido previamente montados en parte 1.3.4.
- Dejar a cada hidrogel ECM para reticular durante 24 horas a 37 ° C.
- Enjuague el hidrogel ECM 3 veces con PBS hasta que la solución de lavado ya no es de color azul. Los hidrogeles reticulados serán entonces listo para su posterior caracterización y ceestudios de cultivo ll.
3. cultivo celular con microporosa Gel
- Recubrimiento de dos dimensiones
- Usando la solución de 1.3.3, añadir 20 l de solución de pregel a cada pocillo de una placa de cultivo tisular de 96 pocillos no tratados.
- refrigere durante la noche a 4 ° C para permitir la adsorción de proteínas a la placa.
- Aspirar solución pregel y enjuague con PBS.
- Células pasantes 9.
- Añadir 10.000 células / cm 2 a los pocillos.
- Aumentar los medios de comunicación a 100 l por pocillo y se incuba a 37 ° C.
- Tres de cultivo celular dimensional 9
- Utilizando la solución de 1.3.3, resuspender las células sedimentadas a una concentración de 1.000.000 células / ml de solución pregel.
- dispensar rápidamente 16 l de suspensión de células pregel en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, para formar un hidrogel de espesor ~ 500 micras para el cultivo celular en 3D.
- Incubar a 37 ° C durante 30min para el gel a la forma.
- Añadir 100 l de medios de comunicación a la parte superior de hidrogeles formados y se incuba a 37 ° C.
- Tres de cultivo celular dimensional en geles de rigidez variable
- Utilizando la solución de 1.3.3, pipeta 100 l de solución de pregel en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
- Incubar a 37 ° C durante 30 minutos para gel a la forma.
Nota: El entrecruzamiento pasos de la parte 2 se puede utilizar aquí. - Células pasantes 9.
- Añadir 10.000 células / cm 2 a los pocillos.
- Aumentar los medios de comunicación a 100 l por pocillo y se incuba a 37 ° C.
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Representative Results
Usando este método, hemos producido hidrogeles de cerdo normal de rata, y los pulmones de ratón (Figura 1). pulmones procesados proporcionan un estimado de 5 mg, 40 mg, y 10 g de polvo de ECM respectivamente. Una visión general del proceso se muestra en la Figura 2. visualizaciones clave durante el proceso incluyen: aspecto blanco de los pulmones después de aclarar desoxicolato; después de la formación pregel, la solución debe ser opaca y la solución debe ser homogénea durante meses si se almacena a 4 ° C. Hemos incluido una tabla de resolución de problemas básicos para ayudar a identificar las fuentes de error en todo el proceso (Tabla 2). Después de la gelificación, los hidrogeles se pueden utilizar inmediatamente o almacenar para uso futuro. Prueba reológica confirma que más del 90% de la gelificación se produce en los primeros minutos después de alcanzar 37 ° C (Figura 3). hidrogeles formados son estables durante largos períodos en PBS, pero la unión celular y proliferation puede cambiar (Figura 4).
Si bien este protocolo está escrito para pulmonar porcino, las limitaciones de espacio nos limitan a utilizar un solo pulmón cuando decellularizing pulmones de cerdo. Hemos utilizado el mismo procedimiento con la pequeña modificación decellularize ambos pulmones para otras especies. Para las ratas y los ratones, los pulmones se pueden dejar intacto y el corazón unidos, pero el tejido conectivo aún deben retirarse con un bisturí o tijeras. Nos reservamos el corazón intacto y unido para ratas y ratones, y la perfusión de las soluciones a través del ventrículo derecho en lugar de la arteria pulmonar. La perfusión de la tráquea sigue siendo el mismo; sin embargo, la cánula puede ser suturada en la tráquea para la facilidad de acceso para las especies más pequeñas.
Hemos añadido múltiples tipos de células, las células madre mesenquimatosas humanas, 9 células madre mesenquimales de ratón, líneas de células epiteliales humanas (A549s), Human endo microvascular primariacélulas telial (HpuVECs), y células humanas de la vena umbilical epiteliales (HUVECs) dentro de y en la superficie de los hidrogeles de ECM de pulmón. No hemos encontrado con las cuestiones relativas a la naturaleza xenogénica de los geles formados. Nuestro trabajo previo ha mostrado una reducción significativa de la α-galactosidasa en los hidrogeles de la especie porcina. 9 La solución de pre-gel también se puede usar como un revestimiento a 4 ° C para mejorar la unión celular. La solución pregel mejora la unión y la proliferación HpuVEC cuando se añade a las placas de cultivo de tejidos recubiertos de pulmón ECM. Pocillos recubiertos demuestran mejoraron significativamente la unión celular en comparación con los pozos no tratadas (Figura 5).
Adición de genipina aumenta la reticulación de hidrogel. Esta mayor reticulación puede proporcionar una rigidez más fisiológicamente relevante, mientras que la disminución de la degradación de la ECM. La disminución de la degradación, aunque de menor importancia en vitro, se puede producir debido a una mayor unión entreproteínas y por lo tanto más resistencia a la ECM remodelación por las células. Utilizamos barridos de frecuencia en un reómetro para medir las propiedades mecánicas del hidrogel reticulado. Se encontró hidrogel rigidez que se correlaciona directamente con genipina concentración con la mediana y siendo 0,01% de concentración más relevante (Figura 6, el tejido nativo no se muestra). Un ensayo de MTT se utilizó para cuantificar la proliferación celular y la supervivencia en el hidrogel reticulado. La proliferación celular es mayor en el hidrogel reticulado (Figura 7). Esto apoya el aumento de la proliferación celular en el aumento de la rigidez de los demás. 12 La variación de genipina tiempo o la temperatura de reticulación puede dar lugar a diferentes grados de reticulación.
Figura 1: Las imágenes de los pulmones tenemos descelularizado. Cuadros de (A) ratón de pulmón después de decellularización y el corazón eliminado, (B) de la rata después de Triton X-100 enjuaga, (C) Pig, antes de aclarado inicial; con ellos se obtienen ~ 5 mg, 40 mg, y 10 g de pulmón ECM, respectivamente. Pulmonar (D) del ratón y el corazón intacto, después de descelularización, con la cánula todavía sutura en su lugar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Visión general de los métodos. Esta es una visión general del método para producir hidrogeles de los pulmones. A partir de en bloque descelularización de pulmón de porcino se da dejando el tejido blanco o translúcido solamente opaca que se compone de proteínas de la MEC. Luego, después de la eliminación de cualquier resto de agua, y aumentando el área superficial para optimizar la digestión ácido el tejido es solubilizado. La neutralización de la acIdentificación y el aumento de la sal a niveles fisiológicos crea la solución pregel listo para la gelificación. Una vez que la solución forma un hidrogel a 37 ° C, la caracterización se lleva a cabo con un reómetro de microscopía de gel y electrónica de barrido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Representante reológicas de datos para la gelificación bajo rampa de temperatura. Después de un barrido inicial de amplitud para determinar gama viscoelástico lineal, se utilizó una rampa de temperatura para determinar la cinética de la gelificación. Los datos se presentan como media +/- desviación estándar. n = 4.
Figura 4: estabilidad a largo plazo. un imedad de un hidrogel ECM de pulmón de cerdo almacenada en PBS durante más de 6 meses a temperatura ambiente.
Figura 5: Ensayo de HpuVECs metabólico. los datos de proliferación de MTT de las células endoteliales microvasculares primarias humanas (HpuVECs) cultivadas en placas no tratadas de cultivo de tejidos. Se añadió una solución de pregel 1.3.3 para placas, refrigerados durante la noche y se aclararon para formar placas recubiertas de gel de pre-ECM de pulmón. HpuVECs mostró mayor actividad MTT en placas recubiertas de ECM en comparación con no recubierto. * P <0,05 en comparación con el control. Los datos son la media ± desviación estándar de n = 3 por grupo.
Figura 6: reológico de datos mejorada para la reticulación. datos de reometría para la reticulación genipina. La rigidez aumenta con el aumento de las concentraciones de geniajustar a una meseta a 1% genipín. Los datos se normalizan para mostrar un aumento de veces en la reticulación con genipina.
La Figura 7; La proliferación celular en genipín reticulados geles. MTT datos normalizados para A549s en hidrogeles reticulados genipín. El aumento de la proliferación de células ve con mayor rigidez. p <0,05 en comparación con el control. Los datos son la media ± desviación estándar. n = 3 por grupo.
| Problema | Problema | Resolución |
| Color rojo / rosa retenida después de descelularización | descelularización ineficaces | Empezar de nuevo con nuevos pulmones |
| Eliminar las zonas de descelularización incompleta </ Td> | ||
| La oclusión vascular | Empezar de nuevo con nuevos pulmones | |
| Eliminar las zonas de descelularización incompleta | ||
| restos celulares significativo retenido | descelularización ineficaces | Empezar de nuevo con nuevos pulmones |
| Eliminar las zonas de descelularización incompleta | ||
| La oclusión vascular | Empezar de nuevo con nuevos pulmones | |
| Eliminar las zonas de descelularización incompleta | ||
| atelectasia | Empezar de nuevo con nuevos pulmones | |
| Eliminar las zonas de descelularización incompleta | ||
| Destrucción de las membranas se encuentran en muestras histológicas | Un exceso de presión de los vasos durante la perfusión | Reducir la presión de perfusiónde detergentes |
| Large partículas permanece después de la molienda | El exceso de material liofilizado en tubo | Reducir el material en el rectificado de cilindro |
| No se molió durante el tiempo suficiente | aumentar el tiempo de molienda | |
| pregel solución no gelificante | Solución pH demasiado alto | Hacer pH 7,4 |
| Comience solución pregel con polvo fresco | ||
| Solución pH demasiado bajo | Hacer pH 7,4 | |
| Comience solución pregel con polvo fresco | ||
| ECM sobre digerido | Comience solución pregel con polvo fresco | |
| Las células no sobreviven | Los microbios introducidos después de la digestión HCl | Comience de nuevo con polvo fresco y utilizar soluciones filtradas estériles |
| FOff | Comience solución pregel nuevo | |
| Hacer pH 7,4 | ||
| Las células revientan | Fijar el contenido de sal en solución pregel |
Tabla 2: Guía de resolución para identificar las fuentes potenciales de error.
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Discussion
Uno de los aspectos integrales de la biología es la auto-organización de las moléculas en estructuras jerárquicas que realizan una tarea específica. 13 En el laboratorio, el autoensamblaje depende de numerosos factores tales como la concentración de sal, pH, y la duración de digestión. Como se muestra, se forma un hidrogel de auto-organización cuando las proteínas solubilizadas vuelve a la temperatura fisiológica. El hidrogel formado es capaz de promover la unión celular y la proliferación in vitro.
La respuesta celular a las señales biofísicas de ECM no puede ser investigado usando polímeros. Tissue respuesta celular específica a las señales biofísicas no puede ser investigado mediante el uso de otros tejidos. investigadores y médicos creen regeneración utilizando andamios descelularizados mejora la regeneración de tejidos y la cicatrización de heridas. víctimas de la enfermedad pulmonar crónica necesitan mejoras terapéuticas para aumentar la disponibilidad de órganos y disminuir la inmunogenicidad. De órganos, las interacciones específicas de células-ECM deben estarinvestigado a más de biología de órganos.
El uso de ECM como un andamio celular de células de pulmón ha mostrado resultados consistentes. 14,15 Usando rodajas de pulmón a partir de modelos enfermas estimula la renovación de la enfermedad 16 células madre o progenitoras, que se encuentran en los pulmones distales, 17,18 y requiere nichos especiales para evitar la formación de teratomas. El uso de ECM específico de tejido como vehículo de administración, efectos regeneradores de las células progenitoras se pueden mejorar. El hidrogel ECM establece un entorno más aplicable para evaluar las reacciones celulares a la matriz extracelular.
Una gran cantidad de investigaciones existe mirando a la rigidez que se refiere a la señalización celular. Nuestro método de reticulación genipina permite célula-rigidez de señalización, así como interacciones de los componentes de células-ECM. Mientras que la rigidez de hidrogel puede ser manipulado por cantidad ECM y la proporción de proteínas, el uso de genipina permite que los cambios de rigidez de hidrogel algo independiente del contenido de ECM. Ajuste genconcentración epin puede permitir realizar un ajuste de las propiedades mecánicas a parecerse más estrechamente tejidos de los pulmones naturales 6. De los datos obtenidos usando genipina hidrogeles de pulmón periférico en el presente estudio, se observó un incremento de 15 veces (de 5 Pa a 75 Pa). Basándose en los datos reológicos de tejido pulmonar de rata normal de biopsia que se descelularizada utilizando los mismos métodos, podemos lograr la rigidez del tejido pulmonar periférico aproximada (datos no mostrados) mediante la adición de 1% genipina a hidrogeles pulmonares periféricos o la adición de 0,01% a hidrogeles todo el pulmón (estimado ). Utilizando el ECM pulmonar periférico que consiste en parénquima pulmonar hizo un gel considerablemente más suave en comparación con nuestros publicados previamente todo el pulmón resultados ECM de hidrogel 7. Por lo tanto, además de genipín, seleccionar regiones específicas de tejido pulmonar para decellularize puede afectar drásticamente la rigidez.
Hay oportunidades para mejorar este método, que puede incluir pasos adicionales usados comúnmente en perfusien descelularización de tejido pulmonar conjunto. Este método ha sido utilizado en el tejido pulmonar normal y puede requerir la modificación de descelularización de pulmones enfermos. Todavía no hemos analizado este proceso en estados de enfermedad específicos. Obtenemos nuestros pulmones enviados en hielo durante la noche de un matadero. Este método podría limitar la eficacia de nuestro proceso, debido a atelectasia o la oclusión vascular; Sin embargo, rara vez tenemos para eliminar las áreas de los pulmones que no han sido descelularizados a fondo. Cuando la obtención de tejido pulmonar fresco, recomendamos hacer todas las soluciones que se requieren antes de llegar a los pulmones para evitar cualquier pausa en el procesamiento de tejidos. Investigaciones anteriores han encontrado que el uso de ácido peracético como una etapa de esterilización final a la matriz de producción provoca un fenotipo de macrófagos M1 regenerativa en la infiltración de células inmunes, 19 mejorando potencialmente efectos proregenerative de tejido descelularizado. Otra investigación ha entrado en el uso de otros detergentes para completar el proceso, pero los appear sea preferencias específicas de laboratorio con en última instancia, el mismo impacto en descelularización. Los pasos del procedimiento y la digestión descelularización pueden optimizarse dependiendo de la aplicación específica del investigador. Por ejemplo, alterando el tiempo o la neutralización de los métodos de digestión en gel puede cambiar la composición de proteínas, propiedades mecánicas, o la cinética de gelificación.
Alternativas al método descrito aquí pueden variar en nivel de complejidad en función de los resultados experimentales deseados. Por ejemplo, si el objetivo era mantener la membrana basal intacta tanto como sea posible, una bomba de perfusión con un control limitado de presión puede disminuir el daño de barrera. Además, si uno tenía una configuración de laboratorio disponibles para mantener a ambos pulmones intactos para las especies más grandes, el proceso de descelularización puede mejorar la eficacia. A la inversa, una mano de molienda técnica con un mortero y mano de mortero puede aplicarse al tejido liofilizado para laboratorios que no tienen un CryoMill. Es de esperar que la mano grinding para producir fragmentos más grandes, lo que limita el área superficial disponible para la digestión de ácido por lo que los tiempos de digestión pueden necesitar ser alterado en este caso.
Alternativas no se limitan a los pasos descelularización y formación de hidrogeles. Glutaraldehído ha sido utilizado como un agente de reticulación para los hidrogeles, proporcionando una alternativa posible al aumento de resistencia mecánica de los hidrogeles biológicos utilizados para los sistemas de modelo. Otros sistemas modelo incluyen pulmones descelularizados intactas como un sistema de cultivo in vitro 3D, o más comúnmente buscan en rodajas de pulmón como un modelo 3D andamio in vitro. 20 Ya hemos mencionado las limitaciones que vienen de trabajar con estructuras de polímeros, así como los andamios de un solo componente, pero los que permanecen como posibles alternativas al procedimiento que aquí se presenta. Además, hay métodos alternativos a la determinación de la eficacia descelularización (tales como el aislamiento de ADN), la gelificación (puede utilizar ensayos de turbidez), y la unión celular unala proliferación nd (como el uso de CCK8). Se encontró que los métodos descritos aquí son más que suficientes para caracterizar los hidrogeles para su uso como andamios modelo 3D.
Los hidrogeles ECM pulmonares que describimos aquí proporcionan una plataforma eficaz para el estudio de las interacciones célula-ECM. La solución pregel tiene potencial como un revestimiento para vehículos de fármaco polímero, ayudando en la entrega de las células madre mesenquimales, o como una plataforma de administración de fármacos por sí mismo. El protocolo presentado en este documento se describen los pasos básicos para crear un hidrogel versátil derivado de ECM de pulmón.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a las granjas de Smithfield de la donación del tejido pulmonar porcino intacta. También nos gustaría agradecer al Dr. Hu Yang, el Dr. Christina Tang y el Departamento de Cirugía Plástica de VCU para permitirnos usar sus equipos. muestras de hidrogel y tejidos se prepararon para la SEM en el Departamento de Anatomía y de las instalaciones Neurobiología Microscopía VCU apoyado, en parte, por fondos del NIH NINDS Core Center de Grant 5 P30 NS047463 y, en parte, por la forma de financiación de los NIH-NCI Cancer Center Proyectos financiados P30 CA016059. SEM de imágenes de muestras en la Instalación Core Caracterización VCU Nanotecnología (NCC). Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation, CMMI 1.351.162.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100g | Use in hood with eye protection and gloves. |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500g | None |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-500g | None |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | None |
| HCl | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | Use with eye protection and gloves. |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | Use with eye protection and gloves. |
| Genipin | Wako Chemicals | 078-03021 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| PBS 10x | Quality Biological | 119-069-151 | None |
| PBS | VWR | 45000-448 | None |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Hand pump | Fisher Scientific | 10-239-1 | N/A |
| Graduate Beaker | VitLab | 445941 | N/A |
| Cryomill | SPEX | 6700 | Use cryogloves and eye protection. |
| Lyophilizer | FTS FlexiDry | Use gloves. | |
| Rheometer | Discovery | HR-2 | Use gloves and eye protection. |
References
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