Summary
Questo è un metodo per creare un 3-dimensionale scaffold coltura cellulare dalla matrice extracellulare polmonare. polmone Intact è trasformato in idrogel in grado di sostenere la crescita delle cellule in tre dimensioni.
Abstract
Qui vi presentiamo un metodo per stabilire più idrogel di coltura cellulare di componenti per vitro coltura cellulare del polmone in. Cominciando con sano en bloc tessuto polmonare da suini, ratti, o il mouse, il tessuto è perfuso e immerso in successive detergenti chimici per rimuovere i detriti cellulari. Confronto istologica del tessuto prima e dopo l'elaborazione conferma rimozione di oltre il 95% della doppia elica colorazione del DNA e alfa galattosidasi suggerisce la maggioranza dei detriti cellulari viene rimosso. Dopo decellularization, il tessuto è liofilizzata e quindi cryomilled in una polvere. La polvere matrice viene digerito per 48 ore in una soluzione di pepsina di digestione acida e quindi neutralizzato per formare la soluzione pregel. Gelificazione della soluzione pregel può essere indotta da incubazione a 37 ° C e può essere utilizzato immediatamente dopo neutralizzazione o conservato a 4 ° C per un massimo di due settimane. I rivestimenti possono essere formati usando la soluzione pregel su una lastra non trattata per cattaccamento ell. Le celle possono essere sospesi in pregel prima autoassemblaggio per ottenere una coltura 3D, placcato sulla superficie di un gel costituito da cui le cellule possono migrare attraverso il ponteggio, o placcato sui rivestimenti. Modifiche alla strategia presentati possono influenzare la temperatura di gelificazione, la forza, o taglie frammento di proteina. Al di là di formazione idrogel, la rigidità idrogel può essere aumentata mediante genipina.
Protocol
| Soluzione | filtro sterile | Indicazioni |
| DIH 2 O | sì | DIH 2 O; sterile filtrato |
| 0,1% soluzione di Triton X-100 | sì | Sotto cappa aggiungere 100 ml Triton-X 100 Soluzione a 100 ml DIH 2 O e agitare fino alla dissoluzione; filtro sterile. |
| 2% Desossicolato Soluzione | sì | Sotto cappa aggiungere 2 g di sodio soluzione Desossicolato per 100 ml DIH 2 O e agitare fino alla dissoluzione; filtro sterile |
| 1 M NaCl | sì | Aggiungere 58,44 g di NaCl a 1 L di DIH 2 O; agitare fino a scioglimento; filtro sterile |
| soluzione DNasi | sì | Aggiungere 12.000unità di DNasi a 1 L DIH 2 O; Aggiungere 0,156 g MgSO 4 (Anidro), e 0,222 g CaCl 2; agitare fino a scioglimento; filtro sterile |
| PBS | sì | Unire 27,2 g di Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (bibasico eptaidrato), 80 g di NaCl, e 2 g KCl con 10 L DIH 2 O; agitare fino a scioglimento; aggiustare il pH a 7,4; filtro sterile |
Tabella 1: soluzioni necessarie per Tissue Decellularization. Effettuare le soluzioni di cui sopra per il processo di decellularization. Conservare a 4 ° C. Circa 2,5 L sarà necessario per un polmone suino.
1. Formazione Hydrogel
- Suina Lung Decellularization (adattato da riferimenti 9,10)
- Ottenere un blocco normale polmone suino, da un macello, con il cuore e Vasculature intatto.
- Utilizzare forbici di tessuto o un bisturi per sezionare il cuore, vasi più vicino possibile al cuore di taglio, la vascolarizzazione sarà utilizzato in fasi successive per perfusione.
- sezionare cura di collocare il tessuto connettivo circostante la trachea, bronchi e vasi con un bisturi o forbici.
NOTA: determinare le migliori polmone da utilizzare per il resto della procedura con la scelta di un polmone, senza grandi tagli o punture attraverso la pleura e grandi quantità di atelettasia o occlusione vascolare che possono ostacolare l'efficacia del processo di decellularization. - Tagliare il polmone non ottimale lasciando tanto bronchi attaccati alla trachea possibile (cuore, tessuto connettivo e i lobi del polmone rimosso può essere smaltito). Ci dovrebbe essere un polmone rimanendo attaccata alla trachea e vascolare.
NOTA: Conservare sezioni per istologia se lo si desidera. 9 - Chiudere bronchi scollegati con pinze o sutura per prevent riflusso eccesso.
- Preparare le soluzioni decellularization e conservare in frigorifero a 4 ° C fino al momento (Tabella 1).
- Utilizzando una pompa a mano cannulata per adattare l'arteria polmonare, profumato il tessuto polmonare 3 volte con acqua deionizzata sia attraverso l'arteria polmonare e la trachea. Profumato vascolarizzazione prima volta in volta. Iniziare con circa 1 L nel sistema vascolare e 1,5 L in trachea per ogni perfusione, ma come detriti cellulari viene rimosso più liquido può essere perfusi attraverso il sistema.
- Profumato sia vascolarizzazione e la trachea con Triton X-100 soluzione.
- Immergere tessuto polmonare in Triton X-100 soluzione per 24 ore a 4 ° C.
- Perfuse vascolare e trachea 3 volte con acqua deionizzata per sciacquare.
- Profumato sia vascolarizzazione e la trachea con la soluzione desossicolato.
- Immergere le sezioni di tessuto in desossicolato per 24 ore a 4 ° C.
- Perfuse vascolare e trachea 3 volte con acqua deionizzata per sciacquare.
- Profumato sia vascolarizzazione e la trachea con soluzione di NaCl.
- Immergere il tessuto in soluzione NaCl filtrata per 1 ora a 4 ° C.
- Perfuse vascolare e trachea 3 volte con acqua deionizzata per sciacquare.
- Profumato sia vascolarizzazione e la trachea con una soluzione di DNasi.
- Immergere il tessuto in soluzione DNasi filtrata per 1 ora a 4 ° C.
- Profumato sia vascolare e la trachea 5 volte con PBS.
- Sezionare via tessuto cartilagineo evidente, trachea e tutto tubuli 2 mm o più di diametro (che si trova principalmente attorno l'ilo e porzioni mediali dei polmoni) di condurre le vie aeree, lasciando solo le zone respiratorie (soprattutto le aree periferiche).
- Sezionare il tessuto in 1 sezioni pollici o più piccoli. Orientamento del tessuto non ha importanza per questo passo.
- Eliminare il tessuto liquido in eccesso e in 50 ml provette coniche. Congelare il tessuto a -80 ° C.
NOTA: Mantieni sezioni per l'esame istologico per garantire la rimozione di cellule e debri cellulares, se desiderato. Usiamo H & E, α-galattosidasi, PicoGreen, idrossiprolina, ninidrina, Alcian blu, SDS-PAGE, e spettrometria di massa per la caratterizzazione. 9
- Lung Processing
- Rimuovere i coperchi da tubi congelati contenenti tessuto polmonare decellularized.
- Mettere carta da filtro sopra l'apertura del tubo e fissare con nastro di gomma.
NOTA: Tube e contenuto deve ancora essere congelati comunque di trovarsi in -80 ° C fino congelati. - Lyophilize il tessuto fino a quando tutto il liquido in eccesso è andato, utilizzando un liofilizzatore secondo le istruzioni del produttore. Conservare a -80 ° C fino al momento di mulino.
- Prima di iniziare aggiungere azoto liquido fresare freezer per raffreddare isolamento e componenti interni alle condizioni di lavoro.
- Rimuovere la barra mulino magnetica dal tubo di mulino e aggiungere il tessuto per coprire fondo.
- Sostituire bar mulino e aggiungere il tessuto poco compresso. La barra mulino deve ancora muoversi liberamente.
- Chiudere la provetta mulino e PLAce nel mulino congelatore.
- Riempire azoto liquido per la linea di riempimento massimo.
- Mulino Congelatore tutto il tessuto in polvere fine (circa 5 minuti, il tasso di compressione pari a ~ 600 min -1), in un cilindro di policarbonato con un dispositivo di simulazione in acciaio inox così come tappi terminali in acciaio inox con il mulino congelatore secondo le istruzioni del produttore. Conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso.
- Micro-porosa formazione di gel (8 mg / ml) (adattato da riferimenti 9,11)
- Aggiungere 1% (w / v) di polvere decellularized e 0,1% (w / v) di pepsina per 0,01 M HCl, sotto costante agitazione (dovrebbe essere in grado di vedere il flusso a livello superiore del liquido), a temperatura ambiente, per 48 hr.
NOTA: La polvere viene caricata staticamente, in modo da aggiungere il HCl dopo la polvere offre la possibilità di lavare l'eccesso al largo delle pareti del tubo. - Dopo la digestione per 48 h, porre la soluzione e reagenti in ghiaccio per 5 min.
- Utilizzando refrigerato 10% (v / v) 0,1 M NaOH, und 11.11% (v / v) 10x PBS (per portare l'intera soluzione a 1x concentrazione), portare la soluzione proteica digerita a pH fisiologico di 7,4.
NOTA: La soluzione può essere conservato a 4 ° C per una settimana. Eseguire la cinetica di gelificazione utilizzando reometria 9 se lo si desidera.
- Aggiungere 1% (w / v) di polvere decellularized e 0,1% (w / v) di pepsina per 0,01 M HCl, sotto costante agitazione (dovrebbe essere in grado di vedere il flusso a livello superiore del liquido), a temperatura ambiente, per 48 hr.
2. Cross-collega idrogeli per migliorare la resistenza meccanica
- Soluzioni di 1%, 0,1% e 0,01% w / v soluzione genipina reticolazione sono state preparate sciogliendo la necessaria quantità di polvere genipina in 10% DMSO.
- Agitare la soluzione ogni 15 min per 1 ora.
- Aggiungere la soluzione genipina per coprire idrogel ECM (100 microlitri per ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti) che sono stati precedentemente assemblati in parte 1.3.4.
- Lasciare ogni idrogel ECM per reticolare per 24 ore a 37 ° C.
- Risciacquare l'idrogel ECM 3 volte con PBS fino a quando la soluzione di lavaggio non è più blu. Gli idrogel reticolati saranno quindi pronto per l'ulteriore caratterizzazione e cestudi su colture ll.
3. coltura cellulare con microporosa Gel
- Rivestimento bidimensionale
- Utilizzando la soluzione dalla 1.3.3, aggiungere 20 ml di soluzione pregel a ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti non trattate.
- durante la notte in frigorifero a 4 ° C per consentire la proteina adsorbimento al piatto.
- Aspirare soluzione PreGel e risciacquare con PBS.
- Cellule Passage 9.
- Aggiungere 10.000 cellule / cm 2 per pozzi.
- Aumentare la media per 100 pl per pozzetto e incubare a 37 ° C.
- Tre coltura cellulare dimensionale 9
- Utilizzando la soluzione da 1.3.3, risospendere le cellule pellet ad una concentrazione di 1.000.000 cellule / ml di soluzione pregel.
- erogare rapidamente 16 ml di sospensione PreGel cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, in modo da formare un idrogel di spessore ~ 500 micron per la coltura delle cellule 3D.
- Incubare a 37 ° C per 30min per il gel per formare.
- Aggiungere 100 microlitri di media all'inizio idrogel formati e incubare a 37 ° C.
- Tre coltura cellulare tridimensionale su gel di rigidità variabili
- Utilizzando la soluzione da 1.3.3, pipetta 100 ml di soluzione di PreGel in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti.
- Incubare a 37 ° C per 30 minuti per gel di forma.
Nota: Cross-collega passi dalla parte 2 può essere usato qui. - Cellule Passage 9.
- Aggiungere 10.000 cellule / cm 2 per pozzi.
- Aumentare la media per 100 pl per pozzetto e incubare a 37 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utilizzando questo metodo, abbiamo prodotto idrogel di maiale normale, ratto, e polmoni del mouse (Figura 1). polmoni trasformati forniscono una stima rispettivamente 5 mg, 40 mg e 10 g di polvere di ECM. Una panoramica del processo è mostrato nella figura 2. visualizzazioni chiave durante il processo sono: l'aspetto bianco dei polmoni dopo il risciacquo desossicolato; dopo la formazione pregel, la soluzione deve essere opaco e la soluzione deve apparire omogenea per mesi se conservata a 4 ° C. Abbiamo incluso un tavolo risoluzione di base per identificare fonti di errore durante tutto il processo (Tabella 2). Dopo gelificazione, idrogel possono essere utilizzati immediatamente o memorizzati per un utilizzo futuro. Test reologico conferma che oltre il 90% della gelificazione avviene nei primi minuti dopo aver raggiunto 37 ° C (figura 3). idrogel Formata sono stabili per lunghi periodi in PBS, ma l'adesione cellulare e proliferation può cambiare (Figura 4).
Anche se questo protocollo è stato scritto per polmone suino, limitazioni di spazio ci limitano ad utilizzare un solo polmone quando decellularizing polmoni di maiale. Abbiamo usato la stessa procedura con lievi modifiche per decellularize entrambi i polmoni per altre specie. Per ratti e topi, i polmoni possono essere lasciati intatti e cuore attaccate, ma il tessuto connettivo devono ancora essere rimossi con un bisturi o forbici. Manteniamo il cuore intatto e attaccato per ratti e topi e nei profumi delle soluzioni attraverso il ventricolo destro al posto dell'arteria polmonare. Perfusione della trachea è sempre la stessa; tuttavia, la cannula può essere suturata nella trachea per facilità di accesso per le specie più piccole.
Abbiamo aggiunto più tipi di cellule, le cellule staminali mesenchimali umane, 9 topo cellule staminali mesenchimali, linee di cellule epiteliali umane (A549s), primario endo microvascolare umanacellule thelial (HpuVECs), e cellule umane della vena ombelicale epiteliali (HUVEC) all'interno e sulla superficie degli idrogel ECM polmone. Non abbiamo incontrato problemi per quanto riguarda la natura xenogenica dei gel formati. Il nostro lavoro precedente ha mostrato una riduzione significativa α-galattosidasi in idrogel suina. 9 La soluzione pre-gel può essere usato anche come rivestimento a 4 ° C per migliorare l'adesione cellulare. La soluzione pregel migliora attaccamento HpuVEC e la proliferazione quando aggiunto a polmone ECM piastre di coltura dei tessuti rivestiti. Pozzetti dimostrano un significativo miglioramento attaccamento cellulare rispetto ai pozzi non trattate (Figura 5).
L'aggiunta di genipina aumenta idrogel reticolazione. Questa maggiore reticolazione può fornire una rigidità più fisiologicamente rilevanti, riducendo la degradazione della ECM. La diminuzione nella degradazione, ma minore in vitro, può verificarsi a causa di una maggiore adesione traproteine e quindi più resistenza al rimodellamento dalle cellule. Abbiamo usato cicli di frequenza su un reometro per misurare le proprietà meccaniche del idrogel reticolato. Idrogel rigidità è risultata essere correlata direttamente genipina concentrazione con la mediana e concentrazione essendo 0,01% pertinenza (Figura 6, tessuto nativo non mostrato). Un saggio MTT è stato usato per quantificare la proliferazione e sopravvivenza cellulare sul idrogel reticolato. La proliferazione cellulare è maggiore sul idrogel reticolato (Figura 7). Questo supporta aumento della proliferazione cellulare su una maggiore rigidità da parte degli altri. 12 Variando genipina tempo o della temperatura di reticolazione può provocare diversi gradi di reticolazione.
Figura 1: Immagini di polmoni c'e decellularized. Foto di (A) del mouse polmone dopo decellularizione e il cuore rimosso, (B) Rat dopo Triton X-100 sciacquato via, (C) Pig, prima di risciacquo iniziale; cedono ~ 5 mg, 40 mg e 10 g di Lung ECM rispettivamente. Polmonare (D) Mouse e cuore intatto, dopo decellularization, con la cannula ancora suturati al suo posto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Panoramica dei metodi. Questa è una panoramica del metodo per la produzione di idrogel di polmoni. Cominciando con blocco decellularization polmone maiale avviene lasciando tessuto bianco o traslucido solo opaca che si compone di proteine ECM. Poi, dopo la rimozione di eventuale acqua residua e aumentando la superficie di ottimizzare digestione acida il tessuto è solubilizzato. Neutralizzazione del acid e aumentando il sale a livelli fisiologici crea la soluzione pregel pronto per la gelificazione. Una volta che la soluzione forma un idrogel a 37 ° C, la caratterizzazione avviene con un microscopio gel reometro e scansione elettronica. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rappresentante reologico dati per gelificazione a temperatura rampa. Dopo uno sweep di ampiezza iniziale per determinare gamma viscoelastico lineare, una rampa di temperatura è stato utilizzato per determinare la cinetica di gelificazione. I dati sono presentati come media +/- deviazione standard. n = 4.
Figura 4: Stabilità a lungo termine. un imetà di un polmone suino ECM idrogel memorizzati in PBS per oltre 6 mesi a temperatura ambiente.
Figura 5: Metabolic Assay di HpuVECs. MTT dati proliferazione da primari cellule endoteliali microvascolari umane (HpuVECs) coltivate su piastre non trattate colture di tessuti. soluzione Pregel da 1.3.3 è stato aggiunto al piatti, frigorifero durante la notte e sciacquati per formare piastre rivestite di pre-gel polmone ECM. HpuVECs mostrato attività MTT superiore sul ECM piastre rivestite rispetto ai non-rivestita. * P <0,05 rispetto al controllo. I dati sono media ± deviazione standard n = 3 per gruppo.
Figura 6: reologico dati per reticolazione avanzato. dati reometria per reticolazione genipina. La rigidità aumenta con l'aumento delle concentrazioni di Genipin ad un plateau a 1% genipina. I dati sono normalizzati a mostrare un aumento di volte in reticolazione con genipina.
Figura 7; La proliferazione cellulare su genipina reticolati Gel. Dati MTT normalizzati per A549s su idrogel reticolati genipina. Aumento della proliferazione cellulare visto con maggiore rigidità. p <0,05 rispetto al controllo. I dati sono media ± deviazione standard. n = 3 per gruppo.
| Problema | Problema | Risoluzione |
| Rosso / colore rosa mantenuto dopo decellularization | decellularization inefficace | Ricominciare con nuovi polmoni |
| Rimuovere aree di decellularization incompleta </ Td> | ||
| occlusione vascolare | Ricominciare con nuovi polmoni | |
| Rimuovere aree di decellularization incompleta | ||
| detriti cellulari significativo mantenuta | decellularization inefficace | Ricominciare con nuovi polmoni |
| Rimuovere aree di decellularization incompleta | ||
| occlusione vascolare | Ricominciare con nuovi polmoni | |
| Rimuovere aree di decellularization incompleta | ||
| atelettasia | Ricominciare con nuovi polmoni | |
| Rimuovere aree di decellularization incompleta | ||
| La distruzione delle membrane trovato in campioni istologici | Over-pressurizzazione dei vasi durante la perfusione | Ridurre la pressione di perfusionedi detergenti |
| Grande particolato rimane dopo la fresatura | Troppo materiale liofilizzato in tubo | Ridurre il materiale in macinazione cilindro |
| Non fresata per un tempo sufficiente | aumentare il tempo di fresatura | |
| soluzione pregel non gelificante | Soluzione pH troppo elevato | Fare pH 7,4 |
| Inizia soluzione pregel con neve fresca | ||
| Soluzione pH troppo basso | Fare pH 7,4 | |
| Inizia soluzione pregel con neve fresca | ||
| ECM sopra digerito | Inizia soluzione pregel con neve fresca | |
| Le cellule non sopravvivono | I microbi introdotte dopo HCl digestione | Inizia di nuovo con neve fresca e utilizzare soluzioni filtrati sterili |
| pH off | Ricominciare soluzione pregel | |
| Fare pH 7,4 | ||
| Le cellule scoppiano | Fissare contenuto di sale in soluzione pregel |
Tabella 2: Guida alla risoluzione di identificare le fonti di errore potenziale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uno degli aspetti integranti della biologia è l'auto-organizzazione di molecole in strutture gerarchiche che svolgono un compito specifico. 13 Nel laboratorio, auto-assemblaggio dipende da numerosi fattori quali la concentrazione di sale, il pH e la durata digestione. Come si vede, un auto-organizzazione forme idrogel quando le proteine solubilizzati torna a una temperatura fisiologica. L'idrogel formatosi è in grado di promuovere l'attaccamento cellulare e la proliferazione in vitro.
risposta cellulare ai segnali biofisici da ECM non può essere ricercato con polimeri. risposta cellulare specifica del tessuto ai segnali biofisici non può essere ricercato utilizzando altri tessuti. ricercatori Rigenerazione e medici credono utilizzando ponteggi decellularized migliora la rigenerazione dei tessuti e la guarigione delle ferite. Cronica soffre di malattie polmonari hanno bisogno di miglioramenti terapeutici per aumentare la disponibilità di organi e diminuire immunogenicità. Organo specifico, interazioni cellula-ECM deve esserestudiato per ulteriori biologia organo.
Utilizzando ECM da impalcatura cellulare per le cellule del polmone ha mostrato risultati coerenti. 14,15 Utilizzando le fette di polmone da modelli malati incoraggia il rinnovamento malattia 16 staminali o progenitrici delle cellule, che si trova nei polmoni distali, 17,18 e richiede nicchie speciali per evitare la formazione di teratomi. Utilizzando tessuti ECM specifico come un veicolo di consegna, gli effetti rigenerativi delle cellule progenitrici possono essere aumentati. L'idrogel ECM stabilisce un ambiente più applicabile per valutare reazioni cellulari a matrice extracellulare.
Un grande corpo di ricerca esiste guardando rigidità come si riferisce alla segnalazione cellulare. Il nostro metodo di reticolazione genipina consentono di cellula-rigidità di segnalazione, nonché le interazioni dei componenti cellula-ECM. Mentre idrogel rigidità può essere manipolato da ECM quantità e il rapporto di proteine, l'uso di genipina permette idrogel modifiche rigidità alquanto indipendenti di contenuti ECM. Regolazione genconcentrazione EPIN può consentire accurata messa a punto delle proprietà meccaniche ad assomigliare più strettamente tessuto polmonare naturali 6. Dai dati ottenuti usando genipina idrogel dal polmone periferico nel presente studio, è stato osservato un aumento di 15 volte (da 5 Pa a 75 Pa). Sulla base dei dati reologiche del normale tessuto di ratto polmone biopsie che è stato decellularized usando gli stessi metodi, possiamo raggiungere approssimativo rigidità tessuto polmonare periferico (dati non riportati) con l'aggiunta di 1% genipina a idrogeli polmonari periferici o l'aggiunta di 0,01% a idrogel polmone intero (stimato ). Utilizzando la ECM polmone periferico costituito da parenchima polmonare ha fatto un gel notevolmente più morbido rispetto a tutto il nostro polmone ECM idrogel risultati precedentemente pubblicati 7. Pertanto, in aggiunta a genipina, selezionando specifiche regioni di tessuto polmonare per decellularize drammaticamente può influenzare la rigidità.
Ci sono opportunità per migliorare questo metodo, che può includere ulteriori passaggi comunemente utilizzati in perfusisulla decellularization del tessuto polmonare intero. Questo metodo è stato utilizzato il tessuto polmonare normale e può richiedere modifiche per decellularization dei polmoni malati. Non abbiamo ancora esaminato questo processo in specifici stati di malattia. Otteniamo i nostri polmoni spediti sul ghiaccio durante la notte da un macello. Questo metodo potrebbe limitare l'efficacia del nostro processo a causa di atelettasia o occlusione vascolare; tuttavia, raramente abbiamo per rimuovere le aree del polmone che non sono stati accuratamente decellularized. Quando l'ottenimento di tessuto polmonare fresco, si consiglia rendendo tutte le soluzioni necessarie prima di ottenere i polmoni per evitare pause della lavorazione dei tessuti. Precedenti ricerche hanno trovato che l'uso di acido peracetico come uno stadio di sterilizzazione finale alla matrice di produzione provoca un rigenerativa M1 macrofagi fenotipo ad infiltrarsi cellule del sistema immunitario, 19 potenzialmente migliorare gli effetti proregenerative di tessuto decellularized. Altre ricerche è andato in con altri detergenti per completare il processo, ma quelli appeaR da specifiche preferenze di laboratorio con in ultima analisi, lo stesso impatto sulla decellularization. La procedura e di digestione passi decellularization possono essere ottimizzate a seconda dell'applicazione specifica del ricercatore. Ad esempio, modificare il tempo o la neutralizzazione metodi di gel di digestione può cambiare la composizione delle proteine, le proprietà meccaniche, o cinetica di gelificazione.
Alternative al metodo qui descritto può variare del livello di complessità a seconda dei risultati sperimentali desiderati. Ad esempio, se l'obiettivo era di mantenere la membrana basale intatta per quanto possibile, una pompa di perfusione con un limitato controllo pressione può diminuire danni barriera. Inoltre, se uno aveva un setup di laboratorio a disposizione per mantenere intatto per le specie più grandi entrambi i polmoni, il processo decellularization può migliorare l'efficacia. Viceversa, una mano tecnica con un mortaio e pestello macinazione può essere applicato al tessuto liofilizzato per i laboratori che non hanno un Cryomill. Ci si aspetterebbe Grindin manog per produrre frammenti più grandi, limitando la superficie disponibile per la digestione acida così potrebbero dover essere modificato in questo caso i tempi di digestione.
Alternative non sono limitati ai passi decellularization e formazione di idrogel. Glutaraldeide è stato usato come un reticolante per idrogel, fornendo una possibile alternativa alla crescente resistenza meccanica degli idrogel biologici utilizzati per sistemi modello. Altri sistemi modello includono polmoni decellularized intatto come un sistema in vitro 3D cultura, o più comunemente in cerca di fette di polmone come un modello 3D in vitro patibolo. 20 abbiamo già accennato le limitazioni che vengono dal lavorare con impalcature di polimeri e ponteggi componenti singoli, ma quelli rimangono come possibili alternative alla procedura qui presentata. Inoltre, ci sono metodi alternativi per determinare l'efficacia decellularization (come l'isolamento del DNA), gelificazione (può usare saggi di torbidità), e l'attaccamento cellulare unND proliferazione (come l'uso di CCK8). Abbiamo trovato che i metodi qui descritti sono più che sufficienti per caratterizzare idrogel per uso come supporti del modello 3D.
Gli idrogel ECM polmonari che descriviamo qui di fornire una piattaforma efficace per lo studio delle interazioni cellula-ECM. La soluzione pregel ha un potenziale come rivestimento per trasportatori di farmaci polimero, aiutando nella fornitura di cellule staminali mesenchimali, o come una piattaforma di distribuzione di droga da solo. Il protocollo presentato qui fornisce i passaggi fondamentali per la creazione di un idrogel versatile derivato da ECM polmone.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare le aziende agricole Smithfield per la donazione di tessuto polmonare suino intatto. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Hu Yang, il Dr. Christina Tang e Chirurgia Dipartimento di VCU plastica per averci permesso di utilizzare le loro attrezzature. campioni di idrogel e di tessuto sono stati preparati per SEM presso il Dipartimento VCU di Anatomia e Neurobiologia Microscopia strumento sostenuto, in parte, da un finanziamento NIH-NINDS nucleo centrale di Grant 5 P30 NS047463 e, in parte, dalla forma di finanziamento NIH-NCI Cancer Support Center di Grant P30 CA016059. l'imaging SEM dei campioni presso il VCU Nanotecnologia Nucleo Caratterizzazione Facility (NCC). Questo lavoro è stato finanziato dalla National Science Foundation, CMMI 1.351.162.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100g | Use in hood with eye protection and gloves. |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500g | None |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-500g | None |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | None |
| HCl | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | Use with eye protection and gloves. |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | Use with eye protection and gloves. |
| Genipin | Wako Chemicals | 078-03021 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| PBS 10x | Quality Biological | 119-069-151 | None |
| PBS | VWR | 45000-448 | None |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Hand pump | Fisher Scientific | 10-239-1 | N/A |
| Graduate Beaker | VitLab | 445941 | N/A |
| Cryomill | SPEX | 6700 | Use cryogloves and eye protection. |
| Lyophilizer | FTS FlexiDry | Use gloves. | |
| Rheometer | Discovery | HR-2 | Use gloves and eye protection. |
References
- Lee, J., Cuddihy, M., Kotov, N. Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. 14, (2008).
- Haycock, J. W. 3D Cell Culture. , Humana Press. (2011).
- Walker, J. M., Ed, Epithelial cell culture protocols. , Humana Press: Springer. New York: New York. (2012).
- Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta Biomater. 5 (1), 1-13 (2009).
- Koo, H. -J., Lim, K. -H., Jung, H. -J., Park, E. -H. Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract, geniposide and genipin. J. Ethnopharmacol. 103 (3), 496-500 (2006).
- Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels to Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).
- Suckow, M. A., Voytik-Harbin, S. L., Terril, L. A., Badylak, S. F. Enhanced bone regeneration using porcine small intestinal submucosa. J. Invest. Surg. 12 (5), 277-287 (1998).
- Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl. Res. J. Lab. Clin. Med. 163 (4), 268-285 (2014).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. J.Biomed.Mater.Res.A. , (2016).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS One. 5 (9), e12905 (2010).
- Ratner, B. D., Bryant, S. J. Biomaterials: where we have been and where we are going. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 41-75 (2004).
- Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nat Protoc. 7 (6), 1138-1144 (2012).
- Zhang, W. -J., et al. The reconstruction of lung alveolus-like structure in collagen-matrigel/microcapsules scaffolds in vitro. J. Cell. Mol. Med. 15 (9), 1878-1886 (2011).
- Booth, A. J., et al. Acellular Normal and Fibrotic Human Lung Matrices as a Culture System for In Vitro Investigation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 186 (9), 866-876 (2016).
- Matsuda, A., et al. Evidence for human lung stem cells. N. Engl. J. Med. 364 (19), 1795-1806 (2011).
- Zuo, W., et al. p63+Krt5+ distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517 (7536), 616-620 (2015).
- Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
- Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. Ann Thorac Surg. 96 (3), 1046-1055 (2013).
