Summary
Dies ist eine Methode, um eine 3-dimensionale Zellkultur Gerüst von pulmonaler extrazellulären Matrix zu schaffen. Intact Lunge in Hydrogelen verarbeitet, die das Wachstum von Zellen in drei Dimensionen zu unterstützen.
Abstract
Hier stellen wir ein Verfahren zur Mehrkomponenten - Zellkultur - Hydrogele für in - vitro - Lungen - Zellkultur zu etablieren. Beginnend mit gesunden en bloc Lungengewebe von Schweinen, Ratte oder Maus wird das Gewebe durchblutet und unter Wasser in nachfolgenden chemischen Reinigungsmittel , die Zelltrümmer zu entfernen. Histologische Vergleich des Gewebes vor und nach der Verarbeitung bestätigt Entfernung von mehr als 95% der Doppelstrang-DNA und alpha-Galactosidase-Färbung schlägt die Mehrheit der Zelltrümmer entfernt wird. Nach Dezellularisierung wird das Gewebe lyophilisiert und dann in ein Pulver cryomilled. Das Matrixpulver wird 48 h in einer sauren Pepsinverdau Lösung verdaut und dann die Pregel-Lösung neutralisiert zu bilden. Gelieren der Pregel Lösung kann durch Inkubation bei 37 ° C induziert werden und kann unmittelbar nach der Neutralisation oder bei 4 ° C gelagert werden für bis zu zwei Wochen. Beschichtungen können unter Verwendung der Vorgellösung auf einer nicht behandelten Platte für c gebildet werdenell Befestigung. Zellen können in dem Vorgel vor Selbstmontage ausgesetzt werden, um eine 3D-Kultur zu erreichen, die auf der Oberfläche eines geformten Gels plattiert, aus dem die Zellen durch das Stützgerüst migrieren können oder auf den Beschichtungen überzogen. Änderungen der Strategie vorgestellt kann Gelierungstemperatur, Stärke oder Protein Fragmentgrößen auswirken. Jenseits Hydrogelbildung kann das Hydrogel Steifigkeit erhöht werden Genipin verwenden.
Protocol
| Lösung | Sterile Filter | Richtungen |
| DiH 2 O | ja | DiH 2 O; steril filtriert |
| 0,1% Triton X-100-Lösung | ja | Unter Abzugshaube mit 100 & mgr; l Triton-X 100 - Lösung auf 100 ml DiH 2 O und rühren , bis sie gelöst; Sterilfilter. |
| 2% Desoxycholat-Lösung | ja | Unter Laborabzug 2 g Natriumdesoxycholat-Lösung pro 100 ml DiH 2 O und rühren , bis sie gelöst; Sterilfilter |
| 1 M NaCl | ja | Hinzufügen , 58,44 g NaCl zu 1 L DiH 2 O; agitieren, bis sie gelöst; Sterilfilter |
| DNase-Lösung | ja | In 12.000Einheiten DNase auf 1 L DiH 2 O; In 0.156 g MgSO 4 (Wasserfrei) und 0,222 g CaCl 2; agitieren, bis sie gelöst; Sterilfilter |
| PBS | ja | Kombinieren 27,2 g Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (dibasisches Heptahydrat), 80 g NaCl, 2 g KCl und mit 10 L DiH 2 O; agitieren, bis sie gelöst; pH-Wert auf 7,4; Sterilfilter |
Tabelle 1: Lösungen für Tissue Dezellularisierung Erforderlich. Nehmen Sie die oben genannten Lösungen für die Dezellularisierung Prozess. Lagerung bei 4 ° C. Etwa 2,5 L für eine Schweine Lunge benötigt werden.
1. Hydrogelierung
- Porcine Lung Dezellularisierung (angepasst von Referenzen 9,10)
- Erhalten, ein en bloc normalen Schweine Lunge, aus einem Schlachthof, mit Herz und vasculature intakt.
- Verwenden Gewebe Schere oder einem Skalpell, das Herz zu sezieren entfernt Vaskulatur so nahe wie möglich an das Herz schneiden, werden verbleibende Vaskulatur in späteren Schritten für die Perfusion verwendet werden.
- sezieren vorsichtig das Bindegewebe rund um die Luftröhre, Bronchien und Gefäßen mit einem Skalpell oder einer Schere entfernt.
HINWEIS: Ermitteln Sie die beste Lunge für den Rest des Verfahrens zu verwenden, indem eine Lunge ohne große Schnitte oder Einstiche durch die Pleura und große Mengen an Atelektase oder Gefäßverschluss wählen, die die Wirksamkeit des Dezellularisierung Prozess behindern können. - Schneiden Sie das suboptimal Lunge verlässt, so viel Bronchus zur Trachea wie möglich angebracht entfernt (Herz, Bindegewebe und den Lappen der Lunge entfernt entsorgt werden kann). Es sollte eine Lunge zur Trachea und Vaskulatur befestigt bleibt sein.
HINWEIS: Bewahren Sie Abschnitte für die Histologie, falls gewünscht. 9 - Schließen Sie nicht angeschlossen Bronchien mit Klammern oder Naht prevent Überschuss Rückstau.
- Bereiten Sie die Dezellularisierung Lösungen und im Kühlschrank lagern bei 4 ° C , bis sie benötigt (Tabelle 1).
- Mit Hilfe einer Handpumpe eine Kanüle eingeführt, die Lungenarterie zu passen, perfuse sowohl das Lungengewebe 3-mal mit DI-Wasser durch Lungenarterie und der Trachea. Perfuse Gefäß erste jedes Mal. Beginnen Sie mit ca. 1 L in Gefäßen und 1,5 l in der Trachea für jede Perfusion, aber als Zelltrümmer mehr Flüssigkeit entfernt wird, kann durch das System durchblutet werden.
- Perfundieren sowohl Vaskulatur und der Trachea mit Triton X-100-Lösung.
- Unterzutauchen Lungengewebe in Triton X-100-Lösung für 24 h bei 4 ° C.
- Perfuse Gefäßsystem und der Trachea 3 mal mit VE-Wasser zu spülen.
- Perfuse beide Gefäße und der Trachea mit Desoxycholat-Lösung.
- Tauchen Sie die Gewebeschnitte in Desoxycholat für 24 h bei 4 ° C.
- Perfuse Gefäßsystem und der Trachea 3 mal mit VE-Wasser zu spülen.
- Perfuse beide Gefäße und der Trachea mit NaCl-Lösung.
- Unterzutauchen Gewebe in filtriert NaCl-Lösung für 1 h bei 4 ° C.
- Perfuse Gefäßsystem und der Trachea 3 mal mit VE-Wasser zu spülen.
- Perfuse beide Gefäße und der Trachea mit DNase-Lösung.
- Unterzutauchen Gewebe in filtriert DNase-Lösung für 1 Stunde bei 4 ° C.
- Perfuse beide Gefäße und der Trachea 5-mal mit PBS.
- Sezieren weg bemerkbar Knorpelgewebe, Luftröhre und alle Tubuli 2 mm oder größer im Durchmesser (in erster Linie um den Hilus und medialen Abschnitte der Lunge) aus Atemwege leitet, so dass nur Atmungszonen (in erster Linie die Randbereiche).
- Präparieren Gewebe in 1-Zoll-Abschnitte oder kleiner. Ausrichtung des Gewebes keine Rolle spielt für diesen Schritt.
- überschüssige Flüssigkeit und Stelle Gewebe in 50 ml konischen Röhrchen abgießen. Frieren Sie das Gewebe bei -80 ° C.
HINWEIS: Bewahren Abschnitte für die Histologie Entfernung von Zellen und Zell debri zu gewährleistens, wenn gewünscht. Wir verwenden H & E, α-Galactosidase, PicoGreen, Hydroxyprolin, Ninhydrin, Alcianblau, SDS-PAGE und Massenspektrometrie charakterisiert werden. 9
- Lung Verarbeitung
- Entfernen Sie Deckel aus gefrorenen Röhrchen dezellularisierter Lungengewebe enthält.
- Legen Sie Filterpapier über die Rohröffnung einsetzen und mit Gummiband.
HINWEIS: Rohr und der Inhalt sollte noch sonst in -80 ° C platzieren eingefroren werden, bis gefroren. - Lyophilisieren das Gewebe, bis das gesamte überschüssige Flüssigkeit weg ist, einen Gefriertrockner mit nach Hersteller Richtungen. Bei -80 ° C bis zum fertig zu fräsen.
- Vor flüssigem Stickstoff zu Gefrierschrank Mühle beginnt hinzufügen Isolierung zu kühlen und interne Komponenten auf die Arbeitsbedingungen.
- Entfernen Sie magnetische Mühle bar aus Mühle Rohr und fügen Gewebe Boden zu bedecken.
- Ersetzen Mühle bar und fügen Sie locker gepackten Gewebe. Die Mühle Bar sollte noch frei bewegen.
- Schließen Sie die Mühle Rohr und place in Gefrierschrank Mühle.
- Füllen von flüssigem Stickstoff bis max Fülllinie.
- Gefrierschrank Mühle alle Gewebe in ein feines Pulver (ca. 5 min, Impaktion Rate von ~ 600 min -1), in einem Polycarbonat - Zylinder mit einem Edelstahl - Impaktor sowie Edelstahl Endstopfen mit der Gefriermühle nach den Herstelleranweisungen. Bei -80 ° C bis zur Verwendung.
- Mikroporöse Gelbildung (8 mg / ml) ( in Anlehnung an Referenzen 9,11)
- 1% (w / v) des dezellularisierten Pulver und 0,1% (w / v) des Pepsins auf 0,01 M HCl, unter konstantem Rühren (sollte in der Lage sein Strömung auf der obersten Ebene der Flüssigkeit zu sehen), bei Raumtemperatur, 48 Std.
HINWEIS: Das Pulver statisch aufgeladen ist, so das HCl-Zugabe, nachdem das Pulver die Möglichkeit bietet den Überschuss aus den Rohrwänden zu waschen. - Nach der Verdauung 48 h, legen Sie die Lösung und Reagenzien auf Eis für 5 min.
- Verwendung gekühlter 10% (v / v) 0,1 M NaOH, eind 11.11% (v / v) 10 x PBS (die gesamte Lösung zu bringen Konzentration 1x), bringen die verdauten Proteinlösung auf physiologischen pH von 7,4.
HINWEIS: Die Lösung kann jetzt bis zu einer Woche bei 4 ° C gelagert werden. Führen Sie Gelieren Kinetik mit rheometry 9 , falls gewünscht.
- 1% (w / v) des dezellularisierten Pulver und 0,1% (w / v) des Pepsins auf 0,01 M HCl, unter konstantem Rühren (sollte in der Lage sein Strömung auf der obersten Ebene der Flüssigkeit zu sehen), bei Raumtemperatur, 48 Std.
2. Vernetzungs Hydrogele mechanische Festigkeit zu verbessern
- Lösungen von 1%, 0,1% und 0,01% w / v Genipin Vernetzungslösung wurden durch Lösen der erforderlichen Menge Genipin Pulver in 10% DMSO hergestellt.
- Vortex, um die Lösung alle 15 min für 1 Stunde.
- In Genipin Lösung ECM Hydrogele zu decken (100 & mgr; l für jede Vertiefung einer 96-Well-Platte), die zuvor in Teil 1.3.4 zusammengestellt.
- Verlassen jedes ECM Hydrogel für 24 h bei 37 ° C zu vernetzen.
- Spülen Sie das ECM-Hydrogel 3-mal mit PBS, bis die Waschlösung nicht mehr blau. Die vernetzten Hydrogele werden dann bereit sein, für die weitere Charakterisierung und cell Kulturstudien.
3. Zellkultur mit mikroporöser Gel
- Zweidimensionale Beschichtungs
- Verwendung der Lösung aus 1.3.3 werden 20 ul Pregel-Lösung in jede Vertiefung einer 96-well nicht behandelten Gewebekulturplatte.
- Kühlen Sie über Nacht bei 4 ° C Proteinadsorption an der Platte zu ermöglichen.
- Absaugen Vorgelats Lösung und Spülen mit PBS.
- Passage Zellen 9.
- In 10.000 Zellen / cm 2 in die Vertiefungen.
- Erhöhen Medien zu 100 ul pro Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C.
- Dreidimensionale Zellkultur 9
- Verwendung Lösung aus 1.3.3 resuspendieren pelletierten Zellen auf eine Konzentration von 1 Million Zellen / ml Vorgellösung.
- Schnell 16 ul Pregel-Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte verzichtet werden kann, ein ~ 500 & mgr; m dicke Hydrogel für 3D-Zellkultur zu bilden.
- bei 37 ° C inkubieren 30min für Gel zu bilden.
- 100 l Medien an die Spitze der gebildeten Hydrogele und bei 37 ° C inkubiert.
- Dreidimensionale Zellkultur auf variabler Steifigkeit Gele
- Mit Lösung von 1.3.3, Pipette 100 ul Pregel-Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.
- bei 37 ° C 30 Minuten inkubieren für Gel zu bilden.
Hinweis: Die Vernetzung Schritte von Teil 2 kann hier verwendet werden. - Passage Zellen 9.
- In 10.000 Zellen / cm 2 in die Vertiefungen.
- Erhöhen Medien zu 100 ul pro Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C.
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Representative Results
Unter Verwendung dieses Verfahrens haben wir Hydrogele aus normalen Schwein, Ratte produziert und Mauslungen (Abbildung 1). Verarbeitet Lungen liefern schätzungsweise 5 mg, 40 mg und 10 g ECM-Pulver sind. Ein Überblick über das Verfahren ist in Abbildung 2 dargestellt. Key-Visualisierungen während des Prozesses sind: weißes Aussehen der Lunge nach deoxycholate Spülen; nach der Bildung Pregel sollte die Lösung opak sein, und die Lösung sollte für Monate homogen erscheinen, wenn bei 4 ° C gelagert. Wir haben eine grundlegende Maßnahmen zur Fehlerbehebung Tabelle enthalten Fehlerquellen während des gesamten Prozesses (Tabelle 2) zu identifizieren. Nach dem Gelieren kann Hydrogele unmittelbar oder für eine spätere Verwendung gespeichert werden. Rheologische Tests bestätigt , dass mehr als 90% des Geliermittels in den ersten Minuten tritt nach Erreichen 37 ° C (Abbildung 3). Gebildet Hydrogele sind für lange Zeiträume stabil in PBS, aber die Zellhaftung und proliferation ändern kann (Abbildung 4).
Während dieses Protokoll für Schweinelungen geschrieben ist, begrenzen Platzbeschränkungen uns nur eine Lunge zu verwenden, wenn Schweinelungen Dezellularisieren. Wir haben das gleiche Verfahren mit geringen Modifikationen verwendet, um beide Lungen für andere Arten Dezellularisieren. Für Ratten und Mäuse, können die Lungen und das Herz intakt angebracht gelassen werden, aber das Bindegewebe sollte noch mit einem Skalpell oder einer Schere entfernt werden. Wir halten das Herz intakt und angebracht für Ratten und Mäuse und perfuse die Lösungen durch den rechten Ventrikel statt der Lungenarterie. Perfusion der Trachea ist immer noch die gleiche; jedoch kann die Kanüle für kleinere Spezies in der Trachea für einen leichten Zugang vernäht werden.
Wir haben mehrere Zelltypen, humanen mesenchymalen Stammzellen, 9 mesenchymale Stammzellen der Maus, humanen epithelialen Zelllinien (A549s), primäre menschliche mikrovaskuläre endo hinzugefügtthelial Zellen (HpuVECs) und menschlichen Nabelvene Epithelzellen (HUVECs) innerhalb und auf der Oberfläche der Lunge ECM Hydrogelen. Wir haben keine Probleme in Bezug auf die xenogenen Natur der gebildeten Gele angetroffen. Unsere vorherige Arbeit ist in den porcinen Hydrogele eine signifikante Reduktion der α-Galactosidase gezeigt. 9 Die Pre-Gel - Lösung kann auch als Beschichtung bei 4 ° C verwendet werden , die Zellanheftung zu verbessern. Pregel Lösung verbessert HpuVEC Anhaftung und Proliferation, wenn der Lungen ECM beschichteten Gewebekulturplatten gegeben. Beschichteten Vertiefungen demons Anheftung der Zellen deutlich verbessert im Vergleich zu nicht behandelten Wells (Abbildung 5).
Hinzufügen Genipin erhöht Hydrogel Vernetzung. Diese erhöhte Vernetzung kann eine physiologisch relevante Steifigkeit bieten, während eine Verschlechterung der ECM abnimmt. Der Rückgang der Abbau, wenn auch kleinere in vitro auftreten können aufgrund einer erhöhten Bindung zwischenProteine und damit mehr Widerstand gegen ECM Umbau von Zellen. Wir verwendeten Frequenzdurchläufe auf einem Rheometer der mechanischen Eigenschaften des vernetzten Hydrogels zu messen. Hydrogele Steifigkeit gefunden wurde direkt korreliert werden Konzentration mit dem Median zu Genipin und relevanteste - Konzentration von 0,01% (Abbildung 6, nativem Gewebe nicht gezeigt). Ein MTT-Assay wurde verwendet, die Zellproliferation und das Überleben auf dem vernetzten Hydrogel zu quantifizieren. Zellproliferation ist höher auf dem vernetzten Hydrogel (Abbildung 7). Dies unterstützt eine erhöhte Zellproliferation von anderen auf eine erhöhte Steifigkeit. 12 Wechselnde Genipin Vernetzungszeit oder Temperatur kann in verschiedenen Vernetzungsgraden führen.
Abbildung 1: Bilder von Lungs Wir Dezellularisierte Haben. Bilder aus (A) Mauslunge nach decellularisation und Herz entfernt, (B) Ratte nach Triton X-100 weggespült, (C) Schwein, vor dem ersten Spülgang; sie ergeben ~ 5 mg, 40 mg und 10 g der Lung ECM, respectively. (D) Maus Lunge und Herz intakt, nach Dezellularisierung, mit Kanüle noch an Ort und Stelle vernäht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Überblick über die Methoden. Dies ist ein Überblick über die Methode Hydrogele aus den Lungen zu erzeugen. Beginnend mit en bloc Schwein Lunge Dezellularisierung tritt nur undurchsichtige weiße oder durchscheinende Gewebe zu verlassen, die von ECM-Proteinen besteht. Dann, nachdem das restliche Wasser zu entfernen, und die Erhöhung der Oberflächenbereich Säureaufschluss zu optimieren, ist das Gewebe solubilisiert. Neutralisieren der acid und Erhöhung der Salz auf physiologische Werte schafft die Pregel Lösung bereit zum Gelieren. Sobald die Lösung ein Hydrogel bei 37 ° C bildet, erfolgt die Charakterisierung Stelle mit einem Gel-Rheometer und Rasterelektronenmikroskopie. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative rheologische Daten für Gelieren unter Temperatur Ramping. Nach einer ersten Amplitude Sweep linear viskoelastischen Bereich zu bestimmen, wurde eine Temperaturrampe verwendet Gelierung Kinetik zu bestimmen. Daten werden als Mittelwert +/- Standardabweichung dargestellt. n = 4.
Abbildung 4: Langzeitstabilität. Ein imAlter eines Schweinelungen ECM Hydrogels in PBS aufbewahrt für über 6 Monate bei Raumtemperatur.
Abbildung 5: Metabolic Assay von HpuVECs. MTT Proliferationsdaten aus primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HpuVECs) gewachsen auf nicht-behandelten Gewebekulturplatten. Pregel Lösung von 1.3.3 wurde auf Platten gegeben, über Nacht gekühlt und Pre-Gel-Lungen-ECM-beschichteten Platten zu bilden gespült. HpuVECs zeigten höhere MTT-Aktivität auf ECM-beschichteten Platten im Vergleich zu unbeschichteten. * P <0,05 im Vergleich zur Kontrolle. Die Daten sind Mittelwert ± Standardabweichung n = 3 pro Gruppe.
Abbildung 6: Rheologische Daten für verbesserte Vernetzung. Rheometrie Daten für Genipin Vernetzung. Die Steifigkeit erhöht sich mit erhöhten Konzentrationen von genibei 1% Genipin auf einem Plateau stecken. Die Daten werden normiert, um eine fache Steigerung um zu zeigen, mit Genipin bei der Vernetzung.
7; Zellproliferation auf Genipin Vernetzte Gele. Normierte MTT Daten für A549s auf Genipin vernetzten Hydrogelen. Erhöhte Zellproliferation mit erhöhter Steifigkeit gesehen. p <0,05 im Vergleich zur Kontrolle. Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung. n = 3 pro Gruppe.
| Problem | Problem | Lösung |
| Rot / rosa Farbe nach Dezellularisierung beibehalten | Unwirksame Dezellularisierung | Von vorn anfangen mit neuen Lungen |
| Entfernen Bereichen unvollständig Dezellularisierung </ Td> | ||
| Gefäßverschluss | Von vorn anfangen mit neuen Lungen | |
| Entfernen Bereichen unvollständig Dezellularisierung | ||
| Signifikante Zelltrümmer beibehalten | Unwirksame Dezellularisierung | Von vorn anfangen mit neuen Lungen |
| Entfernen Bereichen unvollständig Dezellularisierung | ||
| Gefäßverschluss | Von vorn anfangen mit neuen Lungen | |
| Entfernen Bereichen unvollständig Dezellularisierung | ||
| Atelektase | Von vorn anfangen mit neuen Lungen | |
| Entfernen Bereichen unvollständig Dezellularisierung | ||
| Zerstörung von Membranen in histologischen Proben gefunden | Überdruck von Schiffen während der Perfusion | Reduzieren Sie Perfusionsdruckvon Waschmitteln |
| Große Partikel bleibt nach dem Mahlen | Zu viel gefriergetrocknete Material in Rohr | Reduzieren Sie Material in Schleifzylinder |
| Nicht lange genug gemahlen | erhöhen Mahldauer | |
| Pregel Lösung nicht geliert | Lösung pH-Wert zu hoch | Machen Sie pH-Wert 7,4 |
| Beginnen Vorgelats Lösung mit frischem Pulver | ||
| Lösung pH-Wert zu niedrig | Machen Sie pH-Wert 7,4 | |
| Beginnen Vorgelats Lösung mit frischem Pulver | ||
| ECM über verdaute | Beginnen Vorgelats Lösung mit frischem Pulver | |
| Die Zellen nicht überleben | Microbes nach HCl Verdauung eingeführt | Beginnen Sie wieder mit frischem Pulver und verwenden steril filtriert Lösungen |
| pH-off | Beginnen Vorgellösung wieder | |
| Machen Sie pH-Wert 7,4 | ||
| Die Zellen platzen | Fix Salzgehalt in Vorgellösung |
Tabelle 2: Fehlerbehebung zu identifizieren Quellen möglicher Fehler.
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Discussion
Einer der integralen Aspekte der Biologie ist die Selbstorganisation der Moleküle in hierarchischer Strukturen, die eine bestimmte Aufgabe auszuführen. 13 Im Labor Selbstorganisation hängt von zahlreichen Faktoren wie Salzkonzentration, pH, und die Verdauung Dauer. Wie gezeigt ist, selbstorganisierend Hydrogel bildet sich, wenn solubilisiert Proteine Rückkehr zu einer physiologischen Temperatur. Das Hydrogel gebildet ist in der Lage zur Förderung der Zellanhaftung und Proliferation in vitro.
Zelluläre Antwort auf biophysikalische Signale von ECM kann nicht unter Verwendung von Polymeren untersucht werden. Gewebe-spezifische zelluläre Reaktion auf biophysikalischen Signale nicht durch die Verwendung anderer Gewebe untersucht werden. Regeneration Forscher und Kliniker glauben, mit dezellularisierter Gerüste Geweberegeneration und Wundheilung verbessert. Chronische Lungenkrankheit Erkrankten benötigen therapeutische Verbesserungen Organverfügbarkeit zu erhöhen und Immunogenität zu verringern. Organspezifische, zell ECM-Wechselwirkungen müssenzu weiteren Organbiologie erforscht.
Mit ECM als Zellgerüst für Lungenzellen hat konsistente Ergebnisse gezeigt. 14,15 Verwendung von Lungenschnitten von erkrankten Modellen fördert Krankheit Erneuerung 16 Stamm- oder Vorläuferzellen, in distale Lunge, 17,18 und erfordert spezielle Nischen Bildung von teratomas zu verhindern. Verwendung von gewebespezifischen ECM als Abgabevehikel kann regenerative Wirkungen von Vorläuferzellen verbessert werden. Das ECM-Hydrogel wird ein anwendbarer Umwelt zellulären Reaktionen auf extrazellulären Matrix zu bewerten.
Eine große Anzahl von Studien existiert Blick auf Steifigkeit, wie es zu zellulären Signal bezieht. Unsere Methode der Genipin Vernetzung ermöglichen zell Steifigkeit sowie Zell-ECM-Komponente Wechselwirkungen signalisiert. Während kann Hydrogels Steifigkeit durch ECM Menge und das Verhältnis von Proteinen manipuliert werden, ermöglicht die Verwendung von Genipin Änderungen Hydrogels Steifigkeit etwas unabhängig von ECM-Gehalt. Einstellen genePIN Konzentration kann für eine genaue Abstimmung der mechanischen Eigenschaften ermöglichen, am ehesten natürliche Lungengewebe 6 ähneln. Von Genipin Daten unter Verwendung von Hydrogelen, die aus peripheren Lunge in der vorliegenden Studie erhalten, einen 15-fachen Anstieg (von 5 Pa bis 75 Pa) wurde festgestellt. Basierend auf rheologischen Daten von biopsierten normalen Rattenlungengewebe, das dezellularisiert wurde mit den gleichen Methoden, können wir approximate periphere Lungengewebe Steifigkeit erreichen, indem (Daten nicht gezeigt) Zugabe von 1% Genipin peripherer Lungen Hydrogele oder Zugabe von 0,01% auf ganze Lunge Hydrogele (geschätzt ). Die peripheren Lungen ECM Verwendung von Lungenparenchym bestehend aus einem wesentlich weicher Gel im Vergleich zu unseren bisher ganze Lunge ECM Hydrogel Ergebnisse veröffentlicht 7. Daher neben Genipin, bestimmte Bereiche des Lungengewebes Auswahl dramatisch Dezellularisieren die Steifigkeit beeinflussen können.
Es gibt Möglichkeiten, dieses Verfahren zu verbessern, die häufig in perfusi verwendet, um zusätzliche Schritte umfassen könnenauf Dezellularisierung ganzer Lungengewebe. Diese Methode wurde auf normalem Lungengewebe verwendet und können Modifikation für Dezellularisierung von erkrankten Lungen erfordern. Wir haben noch nicht, diesen Prozess in bestimmten Krankheitszuständen untersucht. Wir beziehen unsere Lungen auf Eis verschifft über Nacht aus einem Schlachthof. Dieses Verfahren könnte die Wirksamkeit unseres Verfahrens aufgrund Atelektase oder vaskulären Okklusion begrenzen; aber wir haben nur selten Bereiche der Lunge zu entfernen, die nicht gründlich dezellularisiert worden. Wenn frisches Lungengewebe zu erhalten, würden wir, bevor sie in die Lunge erforderlich machen alle Lösungen empfehlen alle Pausen bei der Gewebeverarbeitung zu verhindern. Frühere Untersuchungen haben festgestellt , dass Peressigsäure als abschließende Sterilisationsschritt mit der Produktion zur Matrix eine regenerative M1 - Makrophagen - Phänotyp in infiltrieren Immunzellen verursacht, 19 potenziell proregenerative Effekte von dezellularisierter Gewebe zu verbessern. Andere Forschung hat in der Verwendung anderer Reiniger gegangen, um den Vorgang abzuschließen, aber die appear zu sein Labor spezifischen Präferenzen letztlich die gleichen Auswirkungen auf Dezellularisierung. Die Dezellularisierung Verfahren und die Verdauung Schritte können je nach der spezifischen Anwendung des Forschers optimiert werden. Zum Beispiel kann das Gel Aufschlusszeit oder Neutralisierungsverfahren Änderung der Zusammensetzung Protein verändern, mechanische Eigenschaften oder Gelieren Kinetik.
Alternativen zu dem Verfahren hier diskutiert wurden, können in Höhe der Komplexität variieren je nach gewünschten experimentellen Ergebnissen. Zum Beispiel, wenn das Ziel, die Basalmembran intakt, so viel wie möglich, eine Perfusions-Pumpe mit einem Druck begrenzte Kontrolle zu halten war möglicherweise ein Barriereschaden verringern. Außerdem, wenn man einen Laboraufbau zur Verfügung hatte, um beide Lungen für größere Arten intakt zu halten, kann der Dezellularisierung Prozess um die Wirksamkeit zu verbessern. Umgekehrt wird ein Handschleiftechnik mit einem Mörser und Stößel kann für Labors mit dem gefriergetrockneten Gewebe angewendet werden, die keine Cryomühle haben. Wir würden Hand grindin erwarteng größere Fragmente zu erzeugen, um die Oberfläche für den Säureaufschluss zur Verfügung zu begrenzen, so dass die Aufschlusszeiten müssen in diesem Fall geändert werden.
Alternativen sind nicht auf die Dezellularisierung Schritte und Ausbildung von Hydrogelen beschränkt. Glutaraldehyd wurde als Vernetzer für Hydrogele verwendet worden, um eine mögliche Alternative bieten Erhöhung der mechanischen Festigkeit der biologischen Hydrogele für Modellsysteme verwendet. Andere Modellsysteme umfassen intakte dezellularisierter Lungen als in vitro 3D - Kultursystem oder häufiger an Lungenschnitte als Modell aussehende 3D - In - vitro - Gerüst. 20 Wir haben bereits erwähnt , die Einschränkungen , die von der Arbeit mit Polymergerüsten sowie einzelne Komponente Gerüste kommen, aber die bleiben als mögliche Alternativen zu dem Verfahren vorgestellt. Darüber hinaus gibt es alternative Methoden zur Bestimmung Dezellularisierung Wirksamkeit (wie DNA-Isolierung), Gelieren (kann Trübung Assays verwendet werden), und die Zellbindung einnd Proliferation (wie die Verwendung von CCK8). Wir fanden, dass die Methoden, die hier sind beschrieben als ausreichend Hydrogele für als 3D-Modell Gerüste Verwendung zu charakterisieren.
Die Lungen ECM Hydrogele wir hier beschreiben, bieten eine effektive Plattform Zell-ECM-Wechselwirkungen zu studieren. Pregel Lösung hat als Beschichtung für Polymerarzneimittelträger Potential, in die Lieferung von mesenchymalen Stammzellen Beihilfe oder als Drug-Delivery-Plattform von selbst aus. Das Protokoll vorgestellt bietet hier die grundlegenden Schritte für ein vielseitiges Hydrogel aus der Lunge ECM abgeleitete Werke zu erstellen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir möchten, dass Smithfield Farmen zu danken für die intakte Schweinelungengewebe zu spenden. Wir möchten auch Dr. Hu Yang, Dr. Christina Tang und die VCU Abteilung für Plastische Chirurgie für die Erlaubnis, zu nutzen, um ihre Ausrüstung zu danken. Hydrogele und Gewebeproben wurden für SEM bei der VCU Abteilung für Anatomie vorbereitet und Neurobiologie Mikroskopie Einrichtung unterstützt, teilweise durch die Finanzierung von NIH-NINDS-Center Core-Grants 5 P30 NS047463 und zum Teil durch Finanzierungsform NIH-NCI Cancer Center Support Grants P30 CA016059. REM-Aufnahmen von Proben, die bei der VCU Nanotechnologie Kern Charakterisierung Facility (NCC). Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation, CMMI 1351162 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100g | Use in hood with eye protection and gloves. |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500g | None |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-500g | None |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | None |
| HCl | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | Use with eye protection and gloves. |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | Use with eye protection and gloves. |
| Genipin | Wako Chemicals | 078-03021 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| PBS 10x | Quality Biological | 119-069-151 | None |
| PBS | VWR | 45000-448 | None |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Hand pump | Fisher Scientific | 10-239-1 | N/A |
| Graduate Beaker | VitLab | 445941 | N/A |
| Cryomill | SPEX | 6700 | Use cryogloves and eye protection. |
| Lyophilizer | FTS FlexiDry | Use gloves. | |
| Rheometer | Discovery | HR-2 | Use gloves and eye protection. |
References
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