Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Сила простоты: Эмбрионы морского ежа, как Published: February 16, 2017 doi: 10.3791/55113
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Mississippi State University

Summary

Это видео статье подробно простой в методологии естественных условиях , которые могут быть использованы для систематического и эффективного характеризуют компоненты сложных сигнальных путей и регуляторных сетей во многих беспозвоночных эмбрионов.

Introduction

Генные регуляторные сети (GRNs) и пути передачи сигналов устанавливают пространственную и временную экспрессию генов во время эмбрионального развития, которые используются для создания плана взрослого животного тела. Cell-к-клетке пути передачи сигналов являются важными компонентами этих регуляторных сетей, предоставляя средства, с помощью которых клетки взаимодействуют. Эти клеточные взаимодействия установить и уточнить экспрессию регуляторных генов и дифференцировки в и среди различных территорий во время эмбриогенеза 1, 2. Взаимодействие между секретируемых внеклеточных модуляторов (лиганды, антагонисты), рецепторов и ко-рецепторов контролируют деятельность путей передачи сигнала. Ассортимент внутриклеточных молекул трансдуцирует эти входы, приводящие к изменению экспрессии генов, деление, и / или формы клетки. В то время как многие из ключевых молекул, используемых при внеклеточных и внутриклеточных уровней в основных путей являютсяИзвестно, что это неполное знание обусловлено в значительной степени сложности отдельных сигнальных путей. Кроме того, различные сигнальные пути часто взаимодействуют друг с другом либо положительно , либо отрицательно на внеклеточный, внутриклеточный и транскрипционные уровни 3, 4, 5, 6. Важно отметить, что основные компоненты путей передачи сигнала являются высоко консервативными у всех видов многоклеточных, и, что примечательно, большинство основных сигнальных путей , часто выполняют сходные функции развития у многих видов при сравнении организмов от тесно связанной с фил , в частности , 7, 8, 9, 10, 11.

Изучение сигнализации в процессе развития является сложной задачей в любом организме, и тамнесколько серьезных проблем в изучении сигнальных путей в большинстве моделей вторичноротые (позвоночных, беспозвоночных хордовых, полухордовых и иглокожих): 1) У позвоночных существует большое число возможных лиганда и рецептора / со-модуляторов взаимодействий, внутриклеточные молекулы трансдукции, а также потенциальные взаимодействия между различными сигнальными путями из - за сложности генома 12, 13, 14; 2) Комплекс морфологии и морфогенетические движения у позвоночных часто делают его более трудным для интерпретации функциональных взаимодействий внутри и среди путей передачи сигнала; 3) Анализы в большинстве не-иглокожих видов беспозвоночных вторичноротые модели ограничены короткими окнами беременности, за исключением некоторых видов оболочников 15, 16.

эмбрионе морского ежа имеет несколько из указанных выше ограничений , и предлагает множество уникальных качеств для выполнения детального анализа путей передачи сигнала в естественных условиях. К ним относятся следующие: 1) Относительная простота морского ежа генома значительно уменьшает количество возможных лигандов, рецепторов / корецептором и внутриклеточной молекулы трансдукции взаимодействиях 17; 2) GRNs контролирующие спецификации и кучность стрельбы из зародышевых листков и основных эмбриональных осей хорошо установлены в морских ежей эмбрионов, помогая в понимании нормативного контекста клеток / территории приема сигналов 18, 19; 3) Многие пути передачи сигналов могут быть изучены между ранними спайности и гаструлы , когда эмбрионы состоят из одного многослойного эпителия, морфология которых легче анализировать; 4) Молекулы связаныd сигнальных путей в морских ежей легко манипулировать; 5) Многие морские ежи Gravid от 10 до 11 месяцев в год (например , Strongylocentrotus purpuratus и Lytechinus variegatus).

Здесь мы представляем метод системно и эффективно характеризуют компоненты сигнальных путей, которые определяют и модели территорий, в морских ежей эмбрионов, чтобы проиллюстрировать преимущества, которые несколько беспозвоночные модельные системы предлагают в изучении сложных молекулярных механизмов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Стратегия Высокая пропускная способность Morpholino Design

  1. Идентифицировать ген (ы) интерес (например , ген подход кандидатов, цис-регуляторными анализ, Секвенирование РНК и / или протеомические дифференциальные экраны).
  2. Используйте геномную, транскриптомики и данные экспрессии генов , доступных на часто обновляемых веб - сайтов (например , SpBase http://www.echinobase.org 20 и С. purpuratus Геном поиска HTTP: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html), чтобы определить, что пространственно-временной профиль экспрессии перекрывается с механизмом развития в вопросе. Если ни одно выражение данные не доступны, а затем генерировать КПЦР праймеры и / или антисмысловой на месте зонд , чтобы оценить характер экспрессии генов.
  3. После определения пространственной и временной характер экспрессии, получение ДНК-последовательность из геномного веб-сайтов.
    1. Для создания перевода блокировки морфолино олигонуклеотиды, получим последовательность ое 5 'ип переведенный область (5' UTR) непосредственно вверх по течению от инициирующий кодон из последовательности тегов выражается (EST) баз данных , доступных на SpBase или S. purpuratus Геном поиска сайтов. Если эта информация недоступна для интересующего гена, а затем выполнить 5 'RACE.
    2. Для того, чтобы разработать сращивания-блокировочные морфолино, поиск геномной последовательности , включая экзонов и интронов с помощью инструмента эшафот BLASTN в SpBase или S. purpuratus Геном инструмент поиска.
  4. Использование олигонуклеотид проектирования сайта http://oligodesign.gene-tools.com с целью разработки желаемой последовательности оснований 25 пара морфолиновое.
    1. Для поступательно-блокирующие морфолино, используют последовательность мРНК из 5'-3 'в качестве источника поступательной последовательности-мишени. Включить последовательность 5'-UTR (приблизительно 70 нуклеотидов выше от сайта инициации транскрипции) плюс 25 основы кодирующей области (вниз по течению от сайта инициации) с стартовым кодоном заметному Wiй скобка (ГПТ).
    2. Для сращивания блокировки морфолино, выберите интрон-экзон или граничную последовательность экзон-интрон и включают 50 оснований (25 оснований последовательности экзона и 25 оснований последовательности интронов) вокруг пограничных областей. Сканирование генома с последовательностью морфолино, чтобы проверить, что последовательность уникальна.

2. Микроинъекция морфолино Олигонуклеотиды

  1. Подготовьте 3 мМ исходные растворы морфолино олигонуклеотидов путем добавления 100 мкл нуклеазы без воды в пузырек морфолино 300 нмоль.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте DEPC очищенную воду для повторной суспензии, поскольку диэтилпирокарбонат может привести к повреждению морфолино.
  2. Для первой восстанавливающей спином вниз во флакон, содержащий раствор запас олигонуклеотида в течение 30 секунд на полной скорости (14 000 - 16 000 XG), кратко вихря, нагревают при 65 ° С в течение от 5 до 10 мин, кратко вихря, и держать морфолиновое запас в комнате температура в течение не менее 1 ч. Исходный раствор Morpholino s сохраняются от -20 ° С до + 4 ° С.
  3. Готовят инъекционный раствор, содержащий морфолино олигонуклеотиды в нужной концентрации. Этот раствор обычно содержит 20% глицерина или 125 мМ KCl в качестве носителя и 15% FITC-декстрана (флуоресцеинизотиоцианат декстран 10000 МВт 2,5 мг мкл исходного раствора /). FITC-декстран и другие флуоресцентные декстрана конъюгаты, которые обычно используются для идентификации инъецированные эмбрионы с помощью эпифлуоресцентной микроскопии. Растворы для инъекций Хранить при -20 ° C.
  4. Нагрейте раствор морфолино при 65 ° C в блоке тепла или водяной бане в течение по крайней мере 2 - 5 мин.
  5. Кратко закрутить решение морфолиновое в течение 30 секунд на полной скорости (14 000 - 16 000 XG), вихрь в течение 1 мин и центрифуге при полной скорости (14 000 - 16 000 XG) в течение не менее 10 мин.
  6. Загрузите иглы для инъекций с раствором морфолино. Для детального протокола микроинъекции смотрите Степичева и Song, 2014 21 и возгласами и Ettensohn, 2004"> 22.

3. Закрепление и В Ситу протоколе на 24 ч после оплодотворения (ФВЧ) в С. purpuratus Эмбрионы

Примечание: Этот протокол изменяется от Аренас-Мена и др. , 2000 23 и Сетхи и др. , 2014 24.

  1. фиксация
    1. Добавьте несколько капель закрепителя (смотри ниже) в лунки, содержащие эмбрионы, осторожно перемешать с помощью пипетки, и дать им возможность осесть. Удалите раствор фиксаторный, а затем смешать эмбрионов с двумя дополнительными 180 мкл промывками закрепителя.
      Примечание: Важно тщательно перемешать эмбрионов во время мытья осторожно пипеткой вверх и вниз несколько раз. Несоблюдение этого правила может привести к снижению отношения сигнал-шум.
    2. Оставьте эмбрионов, чтобы зафиксировать во второй стирки фиксатором в течение 50 мин до 1 ч при комнатной температуре (RT) в 4% электронная микроскопия класса параформальдегида, состоящей из 10 мМ MOPS, рН 7,0, 0,1% твин-20, и искусственные seawateг (ASW). Сделать это решение каждый раз свежее для достижения наилучших результатов. Кроме того, для простоты и практичности эмбрионов зафиксированы в 96-луночные планшеты.
      1. Для получения 20 мл закрепляющего использованием 5 мл 16% параформальдегида, 15 мл ASW, 200 мкл 1 М MOPS рН 7,0, и 20 мкл Tween-20.
    3. Промыть 5 раз при комнатной температуре в 180 мкл MOPS промывочный буфер, состоящий из 0,1 М MOPS, рН 7,0, 0,5 М NaCl и 0,1% Tween-20 в течение не менее 5 мин или до эмбрионов падают на дно колодца. Опять же, важно тщательно перемешать эмбрионов в стиральный буфер, осторожно пипеткой вверх и вниз несколько раз. МОПС промывочный буфер может быть использован в течение 2-х дней при хранении при 4 ° С.
      1. Для 40 мл MOPS мыть использование буфера 4 мл 1 М MOPS рН 7,0, 4 мл 5 М NaCl, 32 мл дН 2 O и 40 мкл Tween-20.
      2. Фиксированные эмбрионы могут храниться при температуре 4 ° С в течение 2 -х дней.
        ПРИМЕЧАНИЕ: При хранении фиксированных эмбрионов дольше, а затем добавить 0,2% азида натрия в MOPS промывочный буфер для предотвращения роста бактерий.
  2. Pre-гибридизация
    1. Аспирата МОПС буфер для промывки и добавляют 180 мкл в соотношении 2: 1 MOPS промывочного буфера в буфере для гибридизации, смешайте эмбрионов в раствор осторожно пипеткой несколько раз, и инкубируют в течение по меньшей мере 20 мин при комнатной температуре. Гибридизация буфер состоит из 70% формамид, 0,1 М MOPS, рН 7,0, 0,5 М NaCl, 1 мг / мл БСА и 0,1% твина-20.
      1. Для получения 40 мл буфера гибридизации использованием 4 мл 1 М MOPS рН 7,0, 4 мл 5 М NaCl, 4 мл дН 2 O, 0,04 г БСА и 40 мкл Tween-20. Хорошо перемешать встряхиванием, добавьте 28 мл формамида, и вихрь снова.
    2. Удалите соотношении 2: 1 из МОПС моют и гибридизацию буферы и добавьте 180 мкл соотношении 1: 2 MOPS промывочного буфера в буфере для гибридизации, смешайте эмбрионы в раствор, и инкубируют в течение по меньшей мере 20 мин при комнатной температуре.
    3. До гибридизации с зондом осторожно перемешать эмбрионов в 100 - 150 мкл буфера гибридизации. Инкубируйте эмбрионов при 50 ° С в течение по меньшей мере 1час
      Примечание: Инкубация эмбрионов на ночь является приемлемым. Перед инкубацией, герметизации скважины с клейким листом, чтобы предотвратить испарение.
  3. гибридизация
    1. В отдельную пробирку добавляют 0,1 - 0,3 нг / мкл зонда и 500 мкг / мл дрожжевой тРНК в гибридизационного буфера, а затем вихрь осторожно, чтобы создать раствор зонда. Дрожжи тРНК к раствору добавляют зонд, чтобы уменьшить неспецифическое связывание антисмысловой зонда. Предварительный нагрев этот раствор до 50 ° С и аспирата гибридизационного буфера.
    2. Смешать предварительно гибридизовали эмбрионов в 100 мкл раствора зонда, печать с клейким листом, и гибридизуются при 50 ° С в течение 2 -х до 7 дней в зависимости от зонда (The foxq2 зонд можно инкубировать в течение 2- х дней).
      Примечание: время инкубации будет меняться в зависимости от зонда. Некоторые гены, выраженные на низких уровнях требуют до 7-дневной инкубации. 96-луночные планшеты могут быть помещены в коробку влажности в качестве страховки от испарения, если на adhesАйв лист не может запечатать должным образом.
    3. Промыть 5 раз при 50 ° С с 180 мкл свежеприготовленных MOPS промывочный буфер в общей сложности 3 ч. Затем промыть 3 раза (15 мин) с 180 мкл MOPS промывочный буфер при комнатной температуре. Не забудьте смешать эмбрионов в Промывочный буфер каждый раз, осторожно пипеткой несколько раз.
  4. Антитело Инкубационный
    1. Аспирата МОПС буфер для промывки и смешайте эмбрионов в 180 мкл блокирующего буфера, содержащего 10% нормальной сывороткой Овец и 5 мг / мл БСА в MOPS буфере для промывки и инкубировать в течение не менее 45 мин при комнатной температуре или температуре 4 ° С в течение ночи.
    2. Удалить блокирующий буфер и затем смешать эмбрионы в блокирующем буфере, содержащем 1: 1500 разведение щелочной фосфатазы конъюгированных с анти-дигоксигенином антитела, разведенного в блокирующем буфере. Инкубируют в течение ночи при комнатной температуре в герметично закрытой пластиной, чтобы избежать испарения. ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте антитела на дольше, чем в течение ночи.
    3. Вымойте эмбрионов 6 раз (5 мин или до тех пор, пока падение эмбрионов) в MOPS промывочный буфер при комнатной температуре. Эмбрионы могутхраниться в течение ночи при температуре 4 ° С.
  5. В месте развития
    1. Промыть эмбрионы 3 раза (10 мин) при комнатной температуре с свежеприготовленный рН 9,5 буфера , состоящего из 0,1 М Трис , рН 9,5, 100 мМ NaCl, 50 мМ MgCl 2, 1 мМ Левамизол, и 0,1% твина-20.
      1. Для получения 20 мл рН 9,5 буфере использованием 2 мл 1 М Трис рН 9,5, 400 мкл 5 М NaCl, 1 мл 1 М MgCl 2, 20 мкл твин-20, 16.6 мл дН 2 O, и 0,0048 г левамизол.
    2. Инкубируйте эмбрионов при 37 ° С в буфере для окрашивания защищенном от света месте. Окрашивание буфер состоит из 10% диметилформамидом, 4,5 мкл / мл 4-Нитро тетразолия хлорида (НСТ), и 3,5 мкл / мл 5-бром-4-хлор-3-индолил-фосфат (BCIP) в свежеприготовленной рН 9,5 буфере ,
      1. Для получения 1 мл окрашивающего буфера используют 100 мкл диметилформамидом, 4,5 мкл NBT и 3,5 мкл BCIP.
    3. Остановить щелочную реакцию фосфатазы путем промывки 3 до 5 раз в MOPS промывочный буфер. Реакцию Wiтый foxq2 зонд обычно занимает от 30 минут до 1 часа. Некоторые зонды, возможно, потребуется инкубацию в течение ночи при комнатной температуре либо или 4 ° С.
    4. Смешайте эмбрионы в раствор 70% стирке швабры и 30% глицерина. Глицерин обеспечивает показатель преломления, необходимый для микроскопии. Эмбрионы могут храниться в этом растворе в течение нескольких недель. Уплотнение пластин с пластиковой парафина для предотвращения испарения.
  6. Подготовка слайдов и захват изображения
    1. Подготовить слайд путем размещения трех небольших полос двухсторонней ленты в треугольник с небольшими промежутками между полосами на слайд.
    2. Перенос эмбрионов в 70% стирке швабры и 30% раствора глицерина в центре треугольника и покрывают покровным стеклом.
    3. Печать покровное путем нанесения слоя лака для ногтей по краям покровного стекла.
    4. Захват изображений с использованием соединения светового микроскопа с объективом 20Х и подключенной камеры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В эмбрионе морского ежа мы показали , что 3 -х различных Wnt сигнальных ветвей (Wnt / β-катенин, Wnt / JNK и Wnt / PKC) 4, 25 взаимодействуют с образованием Wnt сигнальной сети , которая управляет передне-задней (AP) кучность. Одним из наиболее важных следствий этих сигнальных событий , является то , что исходная широко выраженный передний нейроэктодерму (АНХ) ГИН оказывается ограниченной небольшой территорией вокруг переднего полюса к началу гаструляции (24 HPF у S. purpuratus). Эти результаты указывают на то, что Wnt сигнализации / β-катенин предотвращает активацию гена ANE в задней половине эмбриона на стадии 32-клеток. Затем этот путь передает сигнал к неканонической Wnt / JNK сигнального пути, который постепенно вниз регулирует АНХ GRN в передней половине зародыша между стадией 60-клеток и ранней гаструляции. И, наконец, третья неканонические Wnt pathwaу, Wnt / ПКС, противодействует Wnt / JNK сигнального пути и предотвращает его от устранения спецификации ANE вокруг переднего полюса (рис 1А) 4.

Мы используем пространственно - временной экспрессии foxq2 для анализа на активность каждого из сигнальных ветвей Wnt во время AP кучность , так как он является одним из первых двух генов , активированных в АНЭ ЗЕЛ и легко оценена с помощью гибридизация из - за его надежной выражения 26. Если какое - либо физическое лицо Wnt сигнализации ветви возмущается, то есть ясное выражение фенотипа , которые показывают , какие путь участвует: 1) В отсутствие Wnt / -катенина сигнализации широкий материнский механизм регулирования (рис 1А) активирует экспрессию foxq2 на протяжении всего эмбриона (Рисунок 1ББ); 2) При отсутствии Wnt / JNK сигнализации foxq2 выражается во всемпередняя половина эмбриона (рис 1Bc), но она по - прежнему вниз регулируется в задней половине из - за активности Wnt сигнализации / β-катенин (Рис 1А); При отсутствии экспрессии сигнализации foxq2 Wnt / ПКС полностью вниз регулируется по всему эмбриону (рис 1BD), так как Wnt / β-катенин и Wnt / JNK , сигнальные пути вверх регулируется 4, 25. Таким образом, мы разработали анализ , который мы назвали в foxq2 транскрипционной системы считывания , которая, в сочетании с нашим систематическим рабочего процесса (рисунок 2), позволяет эффективно идентифицировать и проверить , является ли участие представляющего интерес гена в одном или нескольких из Wnt сигнализации ветви.

Используя методологию и foxq2 считывания системы , представленной здесь, мы определили несколько предполагаемую внеклеточный или внутриклеточный Molecмологий вероятно , участвует в Wnt сети , регулирующей спецификации оси AP, четыре из которых представлены на рисунке 3. Эмбрионы , инъецированные Morpholinos , предназначенных для нокдауна экспрессии либо фактора транскрипции, ATF2 или секретируемого внеклеточного Wnt модулятор, Wif-1, показал разложение выражения foxq2 по направлению к заднему полюсу эмбриона на ранней стадии гаструляции (Фигура 3А - С ). Эти результаты имитировать фенотипы , наблюдаемые , когда члены / сигнального пути Wnt JNK сбиты 4, 25, предполагая , что они являются членами этой сигнальной ветви , которые необходимо регулировать экспрессию вниз АНХ GRN в передней половине зародыша. В противоположность этому , экспрессия foxq2 была устранена , когда мы нокдауне экспрессию фактора транскрипции, NFAT (рис 3D), и секретируемый внеклеточный модулятор, sFRP3 / 4 (рис 3E),предполагая, что эти молекулы участвуют в пути Wnt / PKC, который необходим, чтобы противодействовать регуляцию вниз ЭНА ЗЕЛ путем Wnt сигнализации / JNK. На основании этих быстро полученных результатов мы теперь в состоянии выполнять более детальных функциональных анализов, которые разместит эти факторы в развивающейся сети сигнализации Wnt, участвующих в GRN, регулирующему AP кучность в эмбрионе морского ежа.

Рисунок 1
Рисунок 1. Модель для спецификации AP и кучность стрельбы в морских ежей и foxq2 Транскрипционная счётчика системы. (A) Прогрессивное вниз регулирование АНХ GRN на территорию вокруг переднего полюса с помощью сигнальной сети Wnt подробно в тексте и в 4, 9. (B) transcriptionaСистема считывания л показывает экспрессию foxq2 в указанных Wnt Тропинка нокдаунов (KO). Шкала бар = 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Экспериментальная Структурная схема Эффективное Wnt сетевого анализа в эмбрионе морского ежа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Сигнальная трансдукция Молекулы , задействованные в спецификации Wnt сети управляющих AP оси и паттернирования Выявленные Использование foxq2 Транскрипционная счётчика системы. (A, B, C) морфолино нокдаун позволяют предположить , что внутриклеточный сигнальный модулятор, ATF2, и секретируемый внеклеточный модулятор, Wif-1, являются потенциальными игроками сигнализации / JNK пути Wnt. (А, D, Е) нокдауна эксперименты показали , что NFAT, внутриклеточный сигнальный модулятор, и sFRP3 / 4, секретируемый Wnt сигнализации модулятор, участвуют в Fzl1 / 2/7-ПКС сигнализации. Шкала бар = 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Методология, представленная здесь приведен пример, который иллюстрирует силу использования эмбрионов с меньшим количеством геномной и морфологической сложности, чем позвоночных животных, чтобы понять сигнальные пути трансдукции и GRNs, регулирующие фундаментальные механизмы развития .. Многие лаборатории используют аналогичные анализы во время раннего развития морского ежа рассекать сигнальных путей , участвующих в других спецификаций клеток судьба событий (например , Notch, Hedgehog, TGF - β и FGF сигнализации) 27, 28, 29, 30, 31. Эти морского ежа исследования выявили множество механизмов интересного и неизведанного сигнализации, и многие аспекты этих сигнальных механизмов , регулирующих раннее развитие морского ежа по всей видимости, сохраняется среди вторичноротых 9, 27, 30 <SUP>, 31, 32. Важно отметить, что изучение биологии развития нетрадиционных многоклеточных эмбрионов наблюдается рост в последние годы, и многие из этих акций характеристик с морских ежей эмбрионов на ранних стадиях развития 9, 15, 16, 33. Таким образом, методология, представленная здесь может быть широко применен к изучению путей передачи сигнала во многих из этих организмов на ранних стадиях развития.

Все методы, используемые, чтобы сбить экспрессию генов, потенциально может привести к офф-мишени сбить эффекты. Morpholinos оказались удивительно эффективным методом генной теории возмущений в морских ежей эмбрионов в значительной степени, потому что сообщество осуществляет строгий контроль, чтобы облегчить проблемы, что нокдаун фенотип неспецифическое. Эти основные контрольные анализы могут быть мodified и применены к другим нокдаун методов (т.е. четче / cas9). Элементы управления являются: 1) анализы, ответ Тщательное доза не выполняются с каждым морфолино до ≥ 80% инжектированных эмбрионов показывают, дефектный фенотип и / или экспрессией маркерного гена; 2) Morpholinos отбрасываются, если они вызывают серьезные задержки в развитии или даже смерти при умеренных концентрациях. Эти фенотипы, вероятно, из-за токсических эффектов от ворот; 3) По крайней мере, два Morpholinos, которые предназначены для различных целевых сайтов связывания используются для подтверждения нокдаун фенотип; 3) Миссенс Morpholinos впрыскивают; 4) морфолино фенотипы спасены путем введения мРНК гена-мишени в морфолино нокдаун эмбрионов; 5) при наличии, вся гора с использованием меченых антител анализы используются, чтобы показать, что морфолино нокдаун предотвратить перевод интересующего гена. Важно отметить, что морской еж сообщество использует по крайней мере четыре вида для функциональных исследований, в зависимости от того, где ученые расположены. В мой случаи, по нашим сведениям, различные Morpholinos используется , чтобы сбить ортологи генерировали подобные фенотипы у каждого вида (например , увидеть эти функциональные исследования по Nodal сигнализации 34, 35, 36, 37). Эти результаты убедительно доказывают, что наши строгие контрольные эксперименты сильно выбрать для тех Morpholinos, которые производят на мишени нокдаун эффекты.

Другим важным аспектом этой методики является тщательно идентифицировать транскрипционные цели, которые, скорее всего, непосредственно активируемые пути передачи сигналов при рассмотрении. Пример , который мы предлагаем здесь случайна, потому что пространственно - временная активация сигнальных путей и регулирование вниз из робастно выраженного гена, foxq2, происходят на ранних стадиях развития и GRNs , регулирующие зародышевые листки и спецификации оси в эмбрионе морского ежа хорошо-established. Таким образом, является очевидным ограничением этой методики является то, что во многих случаях может возникнуть необходимость в нокдаун активности конкретного сигнального пути на более поздних стадиях развития и в пределах конкретных территорий. Есть несколько технологий , доступных в настоящее время , которые могут быть использованы для преодоления этих ограничений (например , фото-Morpholinos, Зернистое / cas9 38, FACseq) даже в нетрадиционных модельных эмбрионов, которые не поддаются генетической манипуляции. Во многих случаях это может оказаться невозможным , чтобы идентифицировать ген - кандидат вниз поток сигнального пути интереса которого пространственно - временное выражение , как легко оценить , как foxq2, который имеет удивительно высокое отношение сигнал-шум. Обычно, чтобы найти гены с коэффициентами значительно ниже сигнал-шум. Если другой ген недоступен для конкретного анализа, то на месте зонд генерироваться для представляющего интерес гена должен быть как можно дольше. В общем случае, с использованием зондов длиной более 1000 пар основанийs значительно увеличивает сигнал и уменьшает шум в колориметрический и флуоресцентные в анализах на места.

После того, как транскрипционного анализа, который указывает, где и когда пути передачи сигнала интерес сигнализации устанавливается, следующим важным шагом является определение как пространственное и временное выражение предполагаемых регуляторных факторов, участвующих в механизме развития изучаемого. Дифференциальный экран и / или кПЦР данные являются важными инструментами, но они могут вводить в заблуждение. Подтверждая всем монтировки in - situ гибридизации , что ген , представляющий интерес выражается в пределах территории , где сигнальный путь является активным предотвращает тратой времени и ресурсов. Кроме того, эти данные позволяют предсказания быть сделаны о генной регуляторной архитектуре, которая сообщит более подробные анализы , которые будут следовать один раз вовлеченных игроков идентифицируются с этим начальным анализа (рисунок 2). Мы представляем Simpле колориметрический анализ в данном протоколе; Тем не менее, флуоресцентная гибридизация (FISH) в также может быть использован для визуализации нескольких флуоресцентных зондов в то же самое время, что позволяет для улучшенного пространственного разрешения в пределах территории интерес, а также конфокальной микроскопией 24. Кроме того, рыба может быть сопряжен с использованием меченых антител для выявления посттрансляционные модификации и / или где сигнальный путь интереса активен 24.

Есть два важных шагов в протоколе, которые часто упускают из виду. Одним из них является получение раствора морфолино олигонуклеотида. Важно, чтобы нагреть раствор морфолино при 65 ° С в течение 2 мин, 5 мин и центрифугировать его на полной скорости в течение по крайней мере 10 мин перед загрузкой иглы для инъекций. Эти шаги имеют важное значение, когда морфолино маточный раствор хранили при -20 ° С, так как морфолино олигонуклеотиды могут выпадать в осадок из раствора при низкой нравратуры и прядение раствора предотвращает иглы для инъекций от засорения частицами. Другим важным аспектом , чтобы рассмотреть , что эмбрионы должны быть тщательно перемешаны в различные решения на каждом этапе фиксации и протоколов гибридизации на места в. В наших руках, сигнал уменьшается и / или фона увеличивается, если этот простой шаг не выполняется.

Пожалуй, наиболее важным аспектом методологии, представленной здесь в том, что она позволяет эффективно функционального анализа больших наборов потенциальных молекул трансдукции сигналов, генерируемых следующих транскриптомику поколения и протеомики. После того, как эти первоначальные функциональные анализы подтверждают группу регуляторных факторов , участвующих в пути интереса, следующая задача состоит в использовании установленных анализов (например , функциональные нокдаунов, подробный разноцветная целом монтирование на месте; биохимические взаимодействия) , чтобы оценить , как они вписываются в extracelluLAR, внутриклеточное и транскрипционные уровни пути передачи сигналов, участвующих в конкретном процессе развития.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino Gene Tools LLC Customized More information at www.gene-tools.com
Glycerol Invitrogen 15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate) Invitrogen, Life Technologies D1821 Make 25 mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710
MOPS Sigma Aldrich M1254-250G
Tween-20 Sigma Aldrich 23336-0010
Formamide Sigma Aldrich 47671-1L-F
Yeast tRNA Invitrogen 15401-029
Normal Goat Serum Sigma Aldrich G9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody Roche 11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole) Sigma Aldrich L9756-5G
Tris Base UltraPure Research Products Internationall Corp 56-40-6
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Magnesium chloride Sigma Aldrich 7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate Roche 11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT) Roche 11 383 213 001
Dimethyl Formamide Sigma Aldrich D4551-500mL
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541-5KG
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761-500G
Magnesium Sulfate Sigma Aldrich M7506-2KG
Calcium Chloride Sigma Aldrich C1016-500G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erwin, D. H., Davidson, E. H. The evolution of hierarchical gene regulatory networks. Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).
  2. Peter, I. S., Davidson, E. H. Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development. Cell. 144, 970-985 (2011).
  3. Borggrefe, T., et al. The Notch intracellular domain integrates signals from Wnt, Hedgehog, TGFbeta/BMP and hypoxia pathways. Biochimica et biophysica acta. 1863, 303-313 (2016).
  4. Range, R. C., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Integration of canonical and noncanonical Wnt signaling pathways patterns the neuroectoderm along the anterior-posterior axis of sea urchin embryos. PLoS Biol. 11, e1001467 (2013).
  5. Cleary, M. A., van Osch, G. J., Brama, P. A., Hellingman, C. A., Narcisi, R. FGF, TGFbeta and Wnt crosstalk: embryonic to in vitro cartilage development from mesenchymal stem cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 9, 332-342 (2015).
  6. Lapraz, F., et al. RTK and TGF-beta signaling pathways genes in the sea urchin genome. Dev Biol. 300, 132-152 (2006).
  7. Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. The evolution of signalling pathways in animal development. Nature reviews. Genetics. 4, 39-49 (2003).
  8. Sethi, A. J., Wikramanayake, R. M., Angerer, R. C., Range, R. C., Angerer, L. M. Sequential signaling crosstalk regulates endomesoderm segregation in sea urchin embryos. Science. 335, 590-593 (2012).
  9. Range, R. Specification and positioning of the anterior neuroectoderm in deuterostome embryos. Genesis. 52, 222-234 (2014).
  10. Petersen, C. P., Reddien, P. W. Wnt signaling and the polarity of the primary body axis. Cell. 139, 1056-1068 (2009).
  11. Lapraz, F., Haillot, E., Lepage, T. A deuterostome origin of the Spemann organiser suggested by Nodal and ADMPs functions in Echinoderms. Nature communications. 6, 8434 (2015).
  12. Kikuchi, A., Yamamoto, H., Sato, A. Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways. Trends in cell biology. 19, 119-129 (2009).
  13. Hogan, B. L. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, 1580-1594 (1996).
  14. Houart, C., et al. Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling. Neuron. 35, 255-265 (2002).
  15. Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
  16. Rottinger, E., Lowe, C. J. Evolutionary crossroads in developmental biology: hemichordates. Development. 139, 2463-2475 (2012).
  17. Genome Sequencing Sea Urchin, C., et al. The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
  18. Ben-Tabou de-Leon, S., Su, Y. H., Lin, K. T., Li, E., Davidson, E. H. Gene regulatory control in the sea urchin aboral ectoderm: spatial initiation, signaling inputs, and cell fate lockdown. Dev Biol. 374, 245-254 (2013).
  19. Saudemont, A., et al. Ancestral regulatory circuits governing ectoderm patterning downstream of Nodal and BMP2/4 revealed by gene regulatory network analysis in an echinoderm. PLoS Genet. 6, e1001259 (2010).
  20. Cameron, R. A., Samanta, M., Yuan, A., He, D., Davidson, E. SpBase: the sea urchin genome database and web site. Nucleic Acids Res. 37, D750-D754 (2009).
  21. Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50841 (2014).
  22. Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods in cell biology. 74, 287-310 (2004).
  23. Arenas-Mena, C., Cameron, A. R., Davidson, E. H. Spatial expression of Hox cluster genes in the ontogeny of a sea urchin. Development. , 4631-4643 (2000).
  24. Sethi, A. J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Multicolor labeling in developmental gene regulatory network analysis. Methods in molecular biology. , 249-262 (2014).
  25. Wikramanayake, A. H., Huang, L., Klein, W. H. beta-Catenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9343 (1998).
  26. Yaguchi, S., Yaguchi, J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. A Wnt-FoxQ2-nodal pathway links primary and secondary axis specification in sea urchin embryos. Dev Cell. 14, 97-107 (2008).
  27. Molina, M. D., de Croze, N., Haillot, E., Lepage, T. Nodal: master and commander of the dorsal-ventral and left-right axes in the sea urchin embryo. Curr Opin Genet Dev. 23, 445-453 (2013).
  28. Range, R. C., Glenn, T. D., Miranda, E., McClay, D. R. LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo. Development. 135, 2445-2454 (2008).
  29. Range, R., et al. Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1. Development. 134, 3649-3664 (2007).
  30. Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin. Dev Biol. 411, 314-324 (2016).
  31. Rottinger, E., et al. FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development. Development. 135, 353-365 (2008).
  32. Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin. Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).
  33. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology. Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).
  34. Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm. PLoS Genet. 12, e1006001 (2016).
  35. Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo. Dev Cell. 6, 397-410 (2004).
  36. Bradham, C. A., et al. Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos. Dev Biol. 328, 221-233 (2009).
  37. Su, Y. H. Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos. Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).
  38. Lin, C. Y., Su, Y. H. Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system. Dev Biol. 409, 420-428 (2016).

Tags

Биология развития выпуск 120 морские ежи нейроэктодерме структурирование Wnt трансдукции сигнала переднезадний эволюция вторичноротые генных регуляторных сетей с высокой пропускной способностью,
Сила простоты: Эмбрионы морского ежа, как<em&gt; В Vivo</em&gt; Развивающие модели для изучения сложных Cell-к-Cell Signaling сетевых взаимодействий
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Range, R. C.,… More

Range, R. C., Martinez-Bartolomé, M., Burr, S. D. The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions. J. Vis. Exp. (120), e55113, doi:10.3791/55113 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter