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Developmental Biology

Die Kraft der Einfachheit: Seeigel Embry als Published: February 16, 2017 doi: 10.3791/55113
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Mississippi State University

Summary

Dieses Video Artikel beschreibt eine einfache In - vivo - Methodik , die verwendet werden können , um systematisch und effizient Komponenten komplexer Signalwege und regulatorische Netzwerke in vielen wirbellosen Embryonen zu charakterisieren.

Introduction

Gene regulatorische Netzwerke (KNS) und Signaltransduktionswege schaffen die räumliche und zeitliche Expression von Genen während der embryonalen Entwicklung, die verwendet werden, um die erwachsenen tierischen Körper Plan zu bauen. Zell-Zell-Signalwege sind wesentliche Bestandteile dieser regulatorischen Netzwerke, die Bereitstellung der Mittel, durch die Zellen in Verbindung stehen. Diese zellulären Interaktionen etablieren und die Expression von regulatorischen und Differenzierung Gene in und zwischen den verschiedenen Gebieten während der Embryonalentwicklung 1, 2 zu verfeinern. Wechselwirkungen zwischen sezerniert extrazellulären Modulatoren (Liganden, Antagonisten), Rezeptoren und Co-Rezeptoren steuern die Aktivitäten von Signaltransduktionswegen. Eine Auswahl von intrazellulären Molekülen wandelt diese Eingänge in veränderter Genexpression, Abteilung führt, und / oder die Form einer Zelle. Während viele der Schlüsselmoleküle bei den extrazellulären und intrazellulären Spiegel in den Hauptwegen verwendet werden,bekannt ist, ist es eine unvollständige Kenntnis der Komplexität der einzelnen Signalwege zu einem großen Teil. Zusätzlich interagieren verschiedene Signalwege oft miteinander entweder positiv oder negativ auf den extrazellulären, intrazellulären und Transkriptionsebenen 3, 4, 5, 6. Wichtig ist , dass die Kernkomponenten von Signaltransduktionswegen hoch in allen metazoan Spezies konserviert, und bemerkenswert, führen die meisten der wichtigsten Signalwege oft ähnliche Entwicklungsfunktionen in vielen Arten , wenn Organismen von eng verwandten Stämmen insbesondere 7, 8, 9 zu vergleichen, 10, 11.

Die Studie der während der Entwicklung Signalgebung ist eine schwierige Aufgabe in jedem Organismus, undmehrere bedeutende Herausforderungen zu studieren Signalwege in den meisten Deuterostomia Modelle (Vertebraten, Invertebraten Chordaten , Kiemenlochtiere und Echinoderme): 1) In Vertebraten gibt es eine große Anzahl von möglichen Liganden und Rezeptor / Co-Modulator - Wechselwirkungen, die intrazelluläre Transduktion Moleküle sowie mögliche Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Signalwegen aufgrund der Komplexität des Genoms 12, 13, 14; 2) Die komplexe Morphologie und morphogenetische Bewegungen bei Wirbeltieren oft erschweren funktionelle Interaktionen in und unter Signaltransduktionswege zu interpretieren; 3) Die Analysen in den meisten Nicht-echinoderm invertebrate Deuterostomia Modellarten werden durch kurze Fenster von gravidity mit Ausnahme einiger tunicate Arten 15, 16 begrenzt.

DasSeeigel embryo hat einige der oben erwähnten Beschränkungen und bietet viele einzigartige Eigenschaften für eine detaillierte Analyse von Signaltransduktionswegen in vivo durchgeführt wird . Dazu gehören die folgenden: 1) Die relative Einfachheit des Genoms Seeigel reduziert signifikant die Anzahl der möglichen Ligand, Rezeptor / Co-Rezeptor und intrazellulären Transduktion Molekül - Wechselwirkungen 17; 2) Die KNS die Spezifikation und die Strukturierung der Keimblätter und die wichtigsten embryonalen Achsen steuern gut in Seeigel - Embryonen etabliert, in dem Verständnis der regulatorischen Kontext der Zelle / Gebiet Beihilfe Empfangen der Signale 18, 19; 3) Viele Signaltransduktionswege können zwischen frühen Spaltung und Gastrula Stadien untersucht werden , wenn Embryonen von einem einschichtigen Epithel , deren Morphologie bestehen ist einfacher zu analysieren; 4) Die Moleküle beinhaltend in Bahnen in den Seeigeln Signalisierung leicht manipuliert werden; 5) Viele Seeigel sind für 10 bis 11 Monate im Jahr (zB Strongylocentrotus purpuratus und Lytechinus variegatus trächtig).

Hier präsentieren wir eine Methode, um systematisch und effizient Komponenten der Signalwege zu charakterisieren, die angeben, und das Muster Gebiete in Seeigel-Embryonen, die Vorteile zu verdeutlichen, dass mehrere wirbellosen Modellsysteme in der Studie von komplexen molekularen Mechanismen bieten.

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Protocol

1. Hoher Durchsatz Morpholino Design Strategy

  1. Identifizieren eines Gens (e) von Interesse (zB Kandidatengen - Ansatz, cis-regulatorische Analyse, RNA-Seq und / oder Proteom - Differential - Bildschirme).
  2. Verwenden Sie genomischen, Transkriptom und Genexpressionsdaten auf häufig aktualisierte Webseiten (zB SpBase http://www.echinobase.org 20 und S. purpuratus Genom suchen http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html), um festzustellen, dass der Raum-Zeit-Expressionsprofil überlappt sich mit dem Entwicklungsmechanismus in Frage. Wenn kein Ausdruckdaten verfügbar ist, dann erzeugen qPCR Primer und / oder ein Antisense - in - situ - Sonde , die die Genexpressionsmuster zu beurteilen.
  3. Nach der räumlichen und zeitlichen Expressionsmuster zu bestimmen, erhalten von den genomischen Websites die DNA-Sequenz.
    1. Zur Erzeugung von Morpholino-Oligonukleotide Translation-blocking, erhalten Sequenz of die 5 'un-translatierte Region (5' - UTR) direkt stromaufwärts vom Initiationscodon von exprimierten Sequenz - Tag (EST) der verfügbaren Datenbanken auf SpBase oder S. purpuratus Genom Search Websites. Wenn diese Informationen für das Gen von Interesse nicht verfügbar ist, führen Sie dann 5 'RACE.
    2. So entwerfen Sie einen Spleiß-Blocking - Morpholino, suchen Sie nach der genomischen Sequenz einschließlich der Exons und Introns mit dem Gerüst blastn- Werkzeug in SpBase oder S. purpuratus Genom Search Tool.
  4. Verwenden Sie das Oligonukleotid-Design Website http://oligodesign.gene-tools.com, um die gewünschte 25-Basenpaar-Morpholino-Sequenz zu entwerfen.
    1. Für eine translatorische blockierungs Morpholino, verwenden, um die mRNA-Sequenz von 5 'zu 3' als Quelle der Translationszielsequenz. Fügen Sie die UTR-Sequenz 5 '(ca. 70 Nukleotide stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle) plus 25 Basen der kodierenden Region (hinter der Startstelle) mit dem Start-Codon markierten with Klammer (ATG).
    2. Für eine Spleiß-blocking Morpholino, wählen Intron-Exon oder Exon-Intron-Grenze-Sequenz und umfassen 50 Basen (25 Basen von Exon-Sequenz und 25 Basen von Intron-Sequenz) um die Grenzbereiche. Scannen des Genoms mit dem Morpholino-Sequenz zu überprüfen, ob die Sequenz einzigartig ist.

2. Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden

  1. Bereiten Sie 3 mM Stammlösungen der Morpholino-Oligonukleotide durch Zugabe von 100 ul Nuklease-freies Wasser in die 300 nmol Morpholino Fläschchen.
    HINWEIS: Verwenden Sie nicht DEPC behandeltem Wasser für die Wieder Suspension verwenden, da Diethylpyrocarbonat die Morpholino beschädigen können.
  2. Zum ersten Rekonstitution Spin-Down das Fläschchen mit dem Lager-Oligonukleotid-Lösung für 30 s bei voller Geschwindigkeit, die (14.000 - 16.000 · g), kurz Wirbel, Wärme bei 65 ° C für 5 bis 10 min, kurz Wirbel, und halten Sie die Morpholino Lager bei Raum Temperatur für mindestens 1 h. Morpholino-Stammlösung s werden von -20 ° C bis + 4 ° C gelagert.
  3. Bereiten Injektionslösung morpholino Oligonukleotiden in der gewünschten Konzentration enthält. Diese Lösung enthält in der Regel 20% Glycerin oder 125 mM KCl als Trägerstoff und 15% FITC-Dextran (Fluorescein-Isothiocyanat-Dextran 10.000 MW 2,5 mg / & mgr; l Vorratslösung). FITC-Dextran und anderen fluoreszierenden Dextran-Konjugate werden routinemäßig zur Identifizierung injizierten Embryonen durch Epifluoreszenzmikroskopie verwendet. Store Injektionslösungen bei -20 ° C.
  4. Erhitzen Sie das Morpholino-Lösung bei 65 ° C in einem Heizblock oder Wasserbad für mindestens 2 - 5 min.
  5. Kurz Spin für 30 s bei voller Geschwindigkeit die Morpholino-Lösung (14.000 - 16.000 xg), Wirbel für 1 min und Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit (14.000 - 16.000 · g) für mindestens 10 min.
  6. Laden Sie die Injektionsnadeln mit der Morpholino-Lösung. Für eine detaillierte Mikroinjektionsprotokoll finden Sie unter Stepicheva und Song, 2014 21 und Prost und Ettensohn 2004"> 22.

3. Fixierung und In - Situ - Protokoll bei 24 h nach der Befruchtung (HPF) in S. purpuratus Embry

Hinweis: Dieses Protokoll von Arenas-Mena et al modifiziert wird. 2000 23 und Sethi et al. 2014 24.

  1. Fixierung
    1. Fügen Sie einige Tropfen Fixierungsmittel (siehe unten) zu Vertiefungen, die Embryonen vorsichtig mischen durch Pipettieren, und es ihnen ermöglichen, zu begleichen. Entfernen Sie die Fixierungslösung, und dann Embryonen mischen mit zwei zusätzlichen 180 ul Waschungen von Fixiermittel.
      Hinweis: Während der Wäschen durch sanftes Auf- und Abpipettieren mehrmals Es ist wichtig, gründlich die Embryonen mischen. Geschieht dies nicht , kann das Signal - Rausch - Verhältnis zu senken.
    2. Lassen Sie die Embryonen in der zweiten Fixierungsmittel waschen zu fixieren für 50 min bis 1 h bei Raumtemperatur (RT) in 4% Elektronenmikroskopie Klasse Paraformaldehyd, bestehend aus 10 mM MOPS pH 7,0, 0,1% Tween-20 und künstliche seawater (ASW). Machen Sie diese Lösung jedes Mal für die besten Ergebnisse frisch. Zusätzlich zur einfachen und Praktikabilität Embryonen werden in Platten mit 96 Vertiefungen fixiert.
      1. Für 20 ml Fixiermittel Verwendung 5 ml 16% Paraformaldehyd, 15 ml ASW, 200 & mgr; l 1 M MOPS pH 7,0, und 20 & mgr; l Tween-20.
    3. Waschen 5mal bei RT mit 180 & mgr; l MOPS-Waschpuffer von 0,1 M MOPS pH 7,0, bestehend, 0,5 M NaCl und 0,1% Tween-20 für mindestens 5 min oder bis Embryonen bis zum Boden des Bohrlochs fallen. Auch hier ist es wichtig, dass die Embryonen in die Waschpuffer durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren mehrmals gründlich zu mischen. MOPS Waschpuffer kann für 2 Tage verwendet werden, wenn bei 4 gespeichert ° C.
      1. Für 40 ml waschen MOPS - Puffer Gebrauch 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M NaCl, 32 ml dH 2 O und 40 ul Tween-20.
      2. Fest Embryonen für 2 Tage bei 4ºC gelagert werden.
        HINWEIS: Wenn fixierte Embryonen länger speichern, dann mit 0,2% Natriumazid in MOPS-Puffer waschen Bakterienwachstum zu verhindern.
  2. Vorhybridisierung
    1. Absaugen MOPS Waschpuffer und 180 ul einer 2 hinzuzufügen: 1-Verhältnis von MOPS waschen, um Hybridisierungspuffer Puffer, mischen Embryonen in die Lösung durch vorsichtiges Pipettieren mehrmals, und Inkubation mindestens 20 min bei RT. Hybridisierungspuffer besteht aus 70% Formamid, 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl, 1 mg / ml BSA und 0,1% Tween-20.
      1. Für 40 ml Hybridisierungspuffer Verwendung 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M NaCl, 4 ml dH 2 O, 0,04 g BSA und 40 ul Tween-20. Gut mischen durch Vortexen, fügen Sie 28 ml Formamid und Wirbel wieder.
    2. Entfernen Sie die 2: 1-Verhältnis von MOPS waschen und Hybridisierungspuffer und fügen 180 ul einer 1: 2-Verhältnis von MOPS-Puffer waschen, um Hybridisierungspuffer, mischen Embryonen in die Lösung und Inkubation für mindestens 20 min bei RT.
    3. Vor sanft Sondenhybridisierung Embryonen mischen in 100-150 ul Hybridisierungspuffer. Inkubieren Embryonen bei 50 ° C für mindestens 1h.
      HINWEIS: Inkubieren Embryonen über Nacht akzeptabel ist. Vor der Inkubation dichten die Vertiefungen mit einer Klebefolie um ein Verdampfen zu verhindern.
  3. Hybridisation
    1. 0,3 ng / & mgr; l-Sonde und 500 ug / ml Hefe-tRNA in Hybridisierungspuffer, dann Wirbel sanft Sonde Lösung zu schaffen - in einem separaten Röhrchen 0,1 hinzuzufügen. Hefe-tRNA wird an die Sondenlösung hinzugefügt des anti-sense Sondenbindungs ​​unspezifische zu verringern. Vorzuwärmen, diese Lösung auf 50 ° C und absaugen Hybridisierungspuffer.
    2. Mischungs vorhybridisiert Embryonen in 100 & mgr; l der Sondenlösung, Abdichten mit einer Klebefolie und hybridisieren bei 50 ° C für 2 bis 7 Tage , je nach der Sonde (die foxq2 Sonde kann für 2 Tage inkubiert werden).
      HINWEIS: Die Inkubationszeiten variiert die Sonde basiert. Einige Gene auf einem niedrigen Niveau exprimiert benötigen bis zu einer 7-tägigen Inkubation. 96-Well-Platten können in einer feuchten Box als Versicherung gegen Verdunstung, wenn die Klebs platziert werdenive Blatt nicht richtig abdichten.
    3. Waschen 5 mal bei 50 ° C mit 180 & mgr; l frisch zubereiteter MOPS-Waschpuffer für insgesamt 3 h. Dann wird 3x waschen (15 min) mit 180 & mgr; l MOPS-Waschpuffer bei RT. Denken Sie daran, Embryonen in die Wäsche zu mischen jedes Mal Puffer durch mehrmals vorsichtig pipettieren.
  4. Antikörperinkubation
    1. Absaugen MOPS Waschpuffer und mischen Embryonen in 180 & mgr; l der Blockierung über Nacht Puffer, bestehend aus 10% normalem Schafserum und 5 mg / ml BSA in MOPS Waschpuffer und Inkubation für mindestens 45 min bei RT oder 4 ° C.
    2. Entfernen Blocking-Puffer und dann Embryonen Mischung in einen Blockierungspuffer, enthaltend 1: 1.500-Verdünnung von mit alkalischer Phosphatase konjugierten anti-Digoxigenin-Antikörper, verdünnt in Blockierungspuffer. Inkubieren über Nacht bei RT in einem verschlossenen Platte Verdunstung zu vermeiden. HINWEIS: Lassen Sie keine Antikörper auf mehr als über Nacht.
    3. Waschen Embryonen 6-mal (5 min oder bis Embryonen fallen) in MOPS-Waschpuffer bei RT. Embryonenwerden über Nacht bei 4 ° C gelagert.
  5. In - situ - Entwicklung
    1. Waschen Embryonen 3 mal (10 min) bei RT mit frisch pH 9,5 - Puffer, bestehend aus 0,1 M Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl 2, 1 mM Levamisol und 0,1% Tween-20.
      1. 20 ml pH 9,5 - Puffer verwendet 2 ml 1 M Tris pH 9,5, 400 & mgr; l 5M NaCl, 1 ml 1 M MgCl 2, 20 & mgr; l Tween-20, 16,6 ml dH 2 O und 0,0048 g Levamisol.
    2. Inkubieren Embryonen bei 37 ° C in Färbepuffers vor Licht geschützt. Färbepuffer besteht aus 10% Dimethylformamid, 4,5 & mgr; l / ml 4-Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) und 3,5 ul / ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (BCIP) in frisch pH 9,5-Puffer, .
      1. Für 1 ml Färbepuffers verwenden 100 ul Dimethylformamid, 4,5 ul NBT und 3,5 ul BCIP.
    3. Stoppen Sie die alkalische Phosphatase-Reaktion von 3 bis 5 Mal in MOPS Waschen Waschpuffer. Die Reaktion with die foxq2 Sonde dauert in der Regel 30 min bis 1 h. Einige Sonden benötigen Inkubation über Nacht bei entweder RT oder bei 4 ° C.
    4. Mischen Sie Embryonen in eine Lösung von 70% MOPS waschen und 30% Glycerin. Das Glycerin stellt einen Brechungsindex, die für die Mikroskopie. Embryos können in dieser Lösung für mehrere Wochen gelagert werden. Verschließen Sie die Platten mit Kunststoff-Paraffin Verdunstung zu verhindern.
  6. Slide Vorbereitung und Bilderfassung
    1. Vorbereitung einer Folie durch drei kleine Streifen des doppelseitigen Klebebandes in ein Dreieck mit kleinen Lücken zwischen den Streifen auf einem Objektträger angeordnet werden.
    2. Übertragen Sie die Embryonen in der 70% MOPS waschen und 30% Glycerin-Lösung in die Mitte des Dreiecks und die Abdeckung mit einem Deckglas.
    3. Deckglasränder durch eine Schicht von Auftragen von Nagellack um die Ränder des Deckglases.
    4. Zum Aufzeichnen von Bildern eine Verbindung Lichtmikroskop mit einem 20x-Objektiv mit und einer angeschlossenen Kamera.

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Representative Results

Im Seeigel Embryo wir haben gezeigt , dass drei verschiedene Wnt - Signalzweige (Wnt / β-Catenin, Wnt / JNK und Wnt / PKC) 4, 25 interact ein Wnt - Signalnetzwerk zu bilden , die von vorne nach hinten (AP) Strukturierung regelt. Eine der wichtigsten Folgen dieser Signalisierungsereignisse besteht darin , dass die anfängliche breit ausgedrückt anterioren Neuroektoderm (ANE) GRN auf ein kleines Gebiet um den vorderen Pol durch den Beginn der Gastrulation (24 hpf in S. purpuratus) eingeschränkt wird. Diese Ergebnisse zeigen, dass Wnt / β-Catenin-Signalweg verhindert ANE Genaktivierung in der hinteren Hälfte des Embryos durch die 32-Zell-Stadium. Dann überträgt dieser Weg ein Signal an die nicht-kanonische Wnt / JNK-Signalwegs, die schrittweise nach unten die ANE GRN in der vorderen Hälfte des Embryos zwischen dem 60-Zellen-Stadium und frühen Gastrulation reguliert. Schließlich wird eine dritte nicht-kanonische Wnt pathway, Wnt / PKC, antagonisiert die Wnt / JNK - Signalwegs und verhindert das ANE Spezifikation um den vorderen Pol (1A) Eliminieren 4.

Wir verwenden die räumlich - zeitliche Expression von foxq2 für die Aktivität von jeder der Wnt - Signalzweige während AP Musterung zu testen , weil es eines der ersten beiden Gene in der ANE GRN aktiviert ist und es durch wegen seiner robusten Expression in - situ - Hybridisierung leicht beurteilt 26. Sollten einzelne Wnt - Signalzweig gestört wird, dann gibt es klar zum Ausdruck Phänotypen , die angeben , welche Weg beteiligt ist: 1) In Abwesenheit von Wnt / β-Catenin ein breites mütterlichen Regulationsmechanismus Signalisierung (Abbildung 1A) aktiviert foxq2 Ausdruck über den gesamten Embryo (Abbildung 1Bb); 2) In Abwesenheit von Wnt / JNK Signalisierungs foxq2 ausgedrückt ganzendie vordere Hälfte des Embryos (Abbildung 1Bc), aber es ist immer noch heruntergeregelt in der hinteren Hälfte aufgrund der Aktivität von Wnt / β-Catenin - Signalisierung (1A); In Abwesenheit von Wnt / PKC Signalisierung foxq2 Ausdruck vollständig nach unten während des gesamten Embryo (Abbildung 1Bd) geregelt, weil die Wnt / β-Catenin und Wnt / JNK - Signalwege bis 4 geregelt sind, 25. So haben wir einen Test entwickelt , dass wir die foxq2 Transkriptionsauslesesystem genannt haben , die, wenn sie mit unserer systematischen Workflow (Abbildung 2) kombiniert, uns effizient ermöglicht zu identifizieren und zu testen , ob ein Gen von Interesse an einem beteiligt ist oder mehr der Wnt Signalisierung Filialen.

Mit Hilfe der Methodik und foxq2 Auslesesystem hier vorgestellt haben wir mehrere mutmaßliche extrazelluläre oder intrazelluläre Molek identifiziertules wahrscheinlich in der Wnt - Netzwerk regeln AP Achse Spezifikation beteiligt, von denen vier in Abbildung 3 dargestellt. Embryonen mit Morpholinos injiziert entwickelt , um die Expression von Transkriptionsfaktors, ATF2 oder der sezerniert extrazellulären Wnt - Modulator, mit-1, zeigte eine Ausweitung der foxq2 Ausdruck in Richtung des hinteren Pol des Embryos in frühen Gastrulation Stufen (3A bis Knockdown - C ). Diese Ergebnisse imitieren die Phänotypen beobachtet werden, wenn die Mitglieder der Wnt / JNK - Signalweg geklopft werden um 4, 25, was darauf hindeutet , dass sie Mitglieder dieses Signalzweig sind , die notwendig ist , um nach unten ANE GRN Ausdruck in der vorderen Hälfte des Embryos zu regulieren. Im Gegensatz dazu wurde die Expression foxq2 eliminiert , wenn wir die Expression des Transkriptionsfaktors NFAT (Abbildung 3D) abgerissen und das sekretierte extrazelluläre Modulator sFRP3 / 4 (Figur 3E),was darauf hindeutet, dass diese Moleküle in den Wnt / PKC Weg beteiligt sind, die die Herunterregulierung des ANE GRN von Wnt / JNK-Signalisierung zu antagonisieren notwendig ist. Basierend auf diesen schnell erzielten Ergebnisse sind wir nun in der Lage, mehr detaillierte Funktionsanalysen durchzuführen, die diese Faktoren innerhalb des sich entwickelnden Wnt-Signalnetzwerk in der GRN beteiligt setzen wird, die AP Musterung im Seeigel Embryo regelt.

Abbildung 1
Abbildung 1. Das Modell für AP - Spezifikation und Patterning in der Seeigel und der foxq2 Transkriptions - Anzeigesystem. (A) Die schrittweise Herunterregulierung des ANE GRN auf ein Gebiet um den vorderen Pol durch das Netz Wnt - Signal im Text detailliert und in 4, 9. (B) A transcriptional Auslesesystem zeigt foxq2 Ausdruck in den angegebenen Wnt - Signalweg Niederschlägen (KO). Maßstabsbalken = 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
2. Eine experimentelle Flussdiagramm für eine effiziente Wnt Network Analysis Abbildung im Seeigel Embryo. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Signal Transduction beteiligten Moleküle im Wnt - Netzwerk EZB AP Achse Spezifikation und Patterning Identifizierte die Verwendung von foxq2 Transkriptions - Anzeigesystem. (A, B, C) Morpholino Niederschlägen legen nahe , dass eine intrazelluläre Signalmodulator, ATF2 und sekretierten extrazellulären Modulator, mit-1, sind potentielle Spieler des Wnt / JNK - Signalweg. (A, D, E) Knockdown Experimente zeigten , dass NFAT, ein intrazellulärer Signalmodulator und sFRP3 / 4, ein sezerniertes Wnt Signalisierungs Modulator sind in Fzl1 beteiligt / 2/7-PKC - Signalisierung. Maßstabsbalken = 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Die Methodik präsentiert hier ist ein Beispiel, das die Macht der Verwendung von Embryonen mit weniger genomischen und morphologische Komplexität als Wirbeltiere zeigt die Signalübertragungswege und KNS Regierungs grundlegenden Entwicklungsmechanismen .. Viele Labors verwenden ähnliche Tests während der frühen Seeigel Entwicklung zu verstehen, die zu sezieren Signalisierung in anderen Zellschicksal Spezifikation Ereignisse beteiligt Wege (zB Notch, Igel, TGF - β und FGF - Signalisierung) 27, 28, 29, 30, 31. Diese Seeigel Studien haben viele interessante und neuartige Signalmechanismen offenbart, und viele Aspekte dieser Signalmechanismen frühen Seeigel Entwicklung , die Errichtung erscheinen unter deuterostomes 9 konserviert, 27, 30 <sup>, 31, 32. Wichtig ist , dass die Erforschung der Entwicklungsbiologie von nichttraditionellen metazoan Embryonen während der frühen Entwicklung 9, 15, 16, 33 einen Anstieg in den letzten Jahren, und viele dieser Aktien Merkmale mit Seeigel - Embryonen gesehen. So hier vorgestellten die Methodik weithin zur Untersuchung der Signalübertragungswege in vielen dieser Organismen während der frühen Entwicklung angewendet werden könnte.

Alle Techniken Ausdruck knock down-Gen verwendet wird, kann möglicherweise Off-Target erzeugen Effekte abreißen. Morpholinos haben sich als bemerkenswert effektiv Gen Störung Verfahren in Seeigel-Embryonen zu einem großen Teil zu sein, weil die Gemeinschaft strenge Kontrollen durchführt, Bedenken zu lindern, dass der Zuschlags Phänotyp ist unspezifisch. Diese grundlegenden Steuer Assays können m seinodified und auf andere Zuschlags Techniken (dh CRISPER / Cas9). Die Kontrollen sind: 1) Eine sorgfältige Dosis-Wirkungs-Assays werden bis ≥ 80% der injizierten Embryonen zeigen defekten Phänotyp und / oder Markergenexpression mit jedem morpholino durchgeführt wird; 2) Morpholinos werden verworfen, wenn sie schwere Entwicklungsverzögerungen oder sogar zum Tod führen bei moderaten Konzentrationen führen. Diese Phänotypen sind wahrscheinlich durch toxische Nebeneffekte; 3) mindestens zwei Morpholinos, die verschiedene Bindungsstellen zu zielen sind entworfen werden verwendet Knockdown Phänotypen zu bestätigen; 3) Missense Morpholinos injiziert; 4) Morpholino Phänotypen durch die Einführung von mRNA für das Ziel-Gen in Morpholino Knockdown Embryonen gerettet; 5) Wenn vorhanden, ganze Berg Antikörperanfärbung Assays verwendet werden, die Morpholin Niederschläge Übersetzung des Gens von Interesse verhindern zu zeigen. Es ist wichtig, dass die Seeigel Gemeinschaft zu beachten, mindestens vier Arten für funktionelle Studien verwendet, je nachdem, wo Wissenschaftler befinden. in most Fällen zu unserem Wissen, verwendet die verschiedenen Morpholinos die Orthologe knock down haben in jeder Spezies ähnliche Phänotypen erzeugt (zum Beispiel diese funktionellen Untersuchungen an Nodal siehe Signalisierung 34, 35, 36, 37). Diese Ergebnisse überzeugend argumentieren, dass unsere strengen Kontrollexperimente stark für die Morpholinos auswählen, die On-Target-Knockdown-Effekte erzeugen.

Ein weiterer wichtiger Aspekt dieser Methode ist es, sorgfältig die Transkriptionsziele zu identifizieren, die am ehesten direkt durch den Signalweg unter Berücksichtigung aktiviert. Das Beispiel , das wir hier bieten ist zufällig, weil der Raum - Zeit - Aktivierung der Signalwege und die Down - Regulation eines Gens robust ausgedrückt, foxq2, früh in der Entwicklung auftreten und die KNS Keimschicht und Achsangabe im Seeigel Embryo regeln , sind gut-etabliert. Somit ist eine offensichtliche Beschränkung dieser Methode, die in vielen Fällen kann es notwendig sein, die Aktivität eines bestimmten Signalwegs während der späteren Stadien der Entwicklung und in bestimmten Gebieten Knockdown. Es gibt mehrere Technologien , die derzeit zur Verfügung , die verwendet werden können , diese Einschränkungen zu überwinden (zB Foto-Morpholinos, Crisper / Cas9 38, FACseq) auch in nicht-traditionellen Modell Embryonen , die nicht zugänglich sind genetische Manipulation. In vielen Fällen kann es nicht möglich sein , ein Kandidaten - Gen stromabwärts eines Signalwegs von Interesse Raum - Zeit - Ausdruck , dessen als leicht als foxq2 beurteilt zu identifizieren, die ein bemerkenswert hohes Signal-Rausch - Verhältnis aufweist. Es ist üblich, Gene zu finden, mit viel geringeren Signal-Rausch-Verhältnisse. Wenn ein anderes Gen für einen bestimmten Test nicht verfügbar ist, dann wird die in situ - Sonde für das Gen von Interesse erzeugt , sollte so lange wie möglich sein. In der Regel unter Verwendung von Sonden mehr als 1.000 Basenpaars erhöht signifikant das Signal und reduziert das Rauschen in kolorimetrische und Fluoreszenz - in situ - Assays.

Sobald der Transkriptions Test, wo und wann der Signaltransduktionsweg von Interesse signalisiert etabliert zeigt, ist der nächste wichtige Schritt ist, sowohl die räumliche als auch die zeitliche Expression der mutmaßlich regulatorischen Faktoren in den Entwicklungsmechanismus unter Studie beteiligt zu bestimmen. Differential-Bildschirm und / oder qPCR-Daten sind wichtige Werkzeuge, aber sie können irreführend sein. Bestätigen mit whole mount in situ Hybridisierung , dass das Gen von Interesse innerhalb des Gebiets ausgedrückt wird , in dem der Signalweg aktiv verhindert , dass eine Verschwendung von Zeit und Ressourcen. Darüber hinaus ermöglichen diese Daten Prognosen über die Gen regulatorischen Architektur gemacht werden, was die detaillierteren Analysen informieren, die beteiligt , sobald die Spieler folgen mit diesem ersten Test (Abbildung 2) identifiziert werden. Wir präsentieren eine einfale kolorimetrischen Test in diesem Protokoll; jedoch Fluoreszenz - in - situ - Hybridisierung (FISH) kann auch gleichzeitig zu visualisieren mehrere fluoreszierende Sonden verwendet werden, so dass für eine verbesserte räumliche Auflösung innerhalb des Gebiets von Interesse sowie konfokale Mikroskopie 24. Darüber hinaus können FISH mit Antikörperfärbung gepaart werden , um zu identifizieren , post-translationale Modifikationen und / oder wo der Signalweg von Interesse ist aktiv 24.

Es gibt zwei wichtige Schritte in dem Protokoll, das oft übersehen werden. Eine davon ist die Herstellung der morpholino Oligonucleotidlösung. Es ist wichtig, die Morpholino-Lösung bei 65 ° C für 2 min bis 5 min zu erhitzen und sie bei voller Geschwindigkeit für mindestens 10 min zu zentrifugieren, bevor die Injektionsnadeln lädt. Diese Schritte sind wichtig, wenn die Morpholino-Stammlösung bei -20 ° C aufbewahrt wird, weil Morpholino-Oligonukleotide aus der Lösung bei niedrigen Temperament ausfällenraturen und das Verspinnen der Lösung verhindert, dass die Injektionsnadeln von durch Partikel verstopft werden. Ein weiterer kritischer Aspekt ist , dass Embryonen gründlich bei jedem Schritt der Fixierung und in situ Hybridisierungsprotokolle in die verschiedenen Lösungen gemischt werden. In unseren Händen wird das Signal verringert und / oder der Hintergrund erhöht wird, wenn diese einfache Schritt nicht durchgeführt wird.

Der vielleicht wichtigste Aspekt der Methodik hier präsentiert ist, dass es für eine effiziente funktionelle Analysen von großen Mengen von potentiellen Signaltransduktions-Moleküle erzeugt, indem der nächsten Generation Transcriptomics und Proteomik ermöglicht. Sobald diese ersten Funktionsanalysen eine Gruppe von regulatorischen Faktoren bestätigen in einem Weg von Interesse beteiligt sind, ist die nächste Herausforderung etablierten Methoden zu verwenden (zB funktionelle Niederschlägen, detaillierte mehrfarbige whole mount in situ, biochemische Wechselwirkungen) zu beurteilen , wie sie sich in die extracellular, intrazellulär, und Transkriptionspegel der Signalübertragungswege in einem bestimmten Entwicklungsprozess beteiligt.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino Gene Tools LLC Customized More information at www.gene-tools.com
Glycerol Invitrogen 15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate) Invitrogen, Life Technologies D1821 Make 25 mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710
MOPS Sigma Aldrich M1254-250G
Tween-20 Sigma Aldrich 23336-0010
Formamide Sigma Aldrich 47671-1L-F
Yeast tRNA Invitrogen 15401-029
Normal Goat Serum Sigma Aldrich G9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody Roche 11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole) Sigma Aldrich L9756-5G
Tris Base UltraPure Research Products Internationall Corp 56-40-6
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Magnesium chloride Sigma Aldrich 7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate Roche 11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT) Roche 11 383 213 001
Dimethyl Formamide Sigma Aldrich D4551-500mL
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541-5KG
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761-500G
Magnesium Sulfate Sigma Aldrich M7506-2KG
Calcium Chloride Sigma Aldrich C1016-500G

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References

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Entwicklungsbiologie Heft 120 Seeigel Neuroektoderms Musterung Wnt Signaltransduktion anterior-posteriore Deuterostomia Evolution Gen regulatorische Netzwerke mit hohem Durchsatz,
Die Kraft der Einfachheit: Seeigel Embry als<em&gt; In Vivo</em&gt; Entwicklungsmodelle für komplexe Zell-zu-Zell-Signalnetzwerk Wechselwirkungen Studieren
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Range, R. C., Martinez-Bartolomé, M., Burr, S. D. The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions. J. Vis. Exp. (120), e55113, doi:10.3791/55113 (2017).

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