Summary
Denne videoen artikkelen detaljer en grei in vivo metodikk som kan brukes til systematisk og effektivt karakter komponenter i komplekse signalveier og regulatoriske nettverk i mange virvelløse embryoer.
Introduction
Gennettverk (GRNs) og signaltransduksjonsveiene etablere den romlige og tidsmessige ekspresjon av genene under embryonal utvikling som brukes til å bygge opp den voksne dyrekroppen plan. Celle-til-celle signaltransduksjonsveier er viktige komponenter i disse regulatoriske nettverk, noe som gir et middel som celler kommuniserer. Disse cellulære interaksjoner etablere og videreutvikle et uttrykk for regulatoriske og differensiering gener i og mellom de ulike områdene under embryogenese 1, 2. Interaksjoner mellom utskilte ekstracellulære modulatorer (ligander, antagonister), reseptorer, og co-reseptorer kontrollere aktiviteter signaltransduksjonsveiene. Et utvalg av intracellulære molekyler transduces disse inngangene resulterer i forandret genekspresjon, divisjon, og / eller formen av en celle. Mens mange av de viktigste molekylene som brukes på ekstracellulære og intracellulære nivåer i de store banene erkjent, er det en ufullstendig kjennskap skyldes i stor grad til kompleksiteten av de enkelte signalveier. I tillegg er forskjellige signalbaner ofte kommuniserer med hverandre enten positivt eller negativt i det ekstracellulære, intracellulære, og transkripsjonelle nivå 3, 4, 5, 6. Viktigere er de viktigste komponentene i signaloverføringsveier høyt konservert i alle metazo arter, og bemerkelsesverdig, de fleste av de store signalveier ofte utføre lignende utviklingsfunksjoner i mange arter når man sammenligner organismer fra nært beslektet phyla spesielt 7, 8, 9, 10, 11.
Studiet av signale under utvikling er en krevende oppgave i enhver organisme, og deter flere store utfordringer til å studere signalveier i de fleste deuterostomier modeller (virveldyr, virvelløse chordatar, hemichordater og pigghuder): 1) I virveldyr er det et stort antall mulige ligand og reseptor / co-modulator interaksjoner, intracellulære transduksjon molekyler, samt potensielle interaksjoner mellom forskjellige signalveier på grunn av kompleksiteten av genomet 12, 13, 14; 2) Et kompleks morfologi og morfogenetiske bevegelser hos virveldyr ofte gjøre det vanskeligere å tolke funksjonelle interaksjoner i og mellom signaloverføringsreaksjonsveier; 3) Analyser i de fleste ikke-echinoderm virvelløse deuterostomier modell arter er begrenset av korte vinduer av graviditet med unntak av noen kappe arter 15, 16.
Dekråkeboller embryo har noen av de ovenfor nevnte begrensninger, og byr på mange unike egenskaper for å utføre en detaljert analyse av signaltransduksjonsveier in vivo. Disse inkluderer følgende: 1) Den relative enkelhet av kråkeboller genomet reduserer antall mulige ligand, reseptor / co-reseptor og intracellulær transduksjon molekyl betydelig interaksjoner 17; 2) De GRNs kontrollere spesifikasjonen og fordelingen av kjønns lag og store embryonale akser er godt etablert i kråkebolle embryoer, hjelpe i forståelsen av regelverket sammenheng med celle / territorium mottar signalene 18, 19; 3) mange signaltransduksjonsveiene kan studeres mellom tidlige spaltningsseter og gastrula stadier når embryoer bestå av et enkelt lag epitelet hvis morfologi er lettere å analysere; 4) Molekylene involvered i signalveier i kråkebollene er lett manipulert; 5) Mange kråkeboller er gravid i 10 til 11 måneder i året (f.eks Strongylocentrotus purpuratus og Lytechinus variegatus).
Her presenterer vi en metode for å systematisk og effektivt karakter komponenter av signalveier som spesifiserer og mønster territorier i kråkebolle embryo for å illustrere fordelene at flere virvelløse modellsystemer tilbyr i studiet av komplekse molekylære mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Høy gjennomstrømning Morpholino Design Strategy
- Identifisere et gen (er) av interesse (f.eks kandidat genet tilnærming, cis-regulatoriske analyse, RNAseq og / eller proteomikk differensial skjermer).
- Bruk genomisk, transcriptomic, og genekspresjon data tilgjengelig på hyppig oppdaterte nettsider (f.eks SpBase http://www.echinobase.org 20 og S. purpuratus Genome Søk http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index html) for å fastslå at spatiotemporal uttrykket profilen lapper med utviklingsmekanismen i spørsmålet. Hvis ingen ekspresjon av data er tilgjengelig, og deretter generere qPCR primere og / eller et antisense in situ probe for å vurdere genuttrykksmønstrene.
- Etter å bestemme den romlige og tidsmessige uttrykk mønster, få DNA-sekvensen fra genomisk nettsider.
- For å generere oversettings-blokkering morfolino oligonukleotider, få sekvens of 5 'un-oversatt region (5' UTR) direkte oppstrøms fra startkodonet fra uttrykk sekvens tag (EST) databaser tilgjengelig på SpBase eller S. purpuratus Genome søke nettsteder. Hvis denne informasjonen ikke er tilgjengelig for det aktuelle genet, og deretter utføre 5 'RACE.
- Å designe et spleise-blokkering morfolino, søker du etter genomisk sekvens inkludert eksoner og introner ved hjelp av stillaset blastn verktøy i SpBase eller S. purpuratus Genome Search verktøyet.
- Bruk oligonukleotid designe nettsiden http://oligodesign.gene-tools.com for å utforme den ønskede 25 basepar morpholino sekvens.
- For en translatorisk-blokkerende morfolino, bruke mRNA-sekvensen fra 5 'til 3' som kilde for translasjons-target-sekvensen. Inkluder 5 'UTR-sekvens (ca. 70 nukleotider oppstrøms av transkripsjon start stedet) pluss 25 baser kodende område (nedstrøms fra start siden) med startkodonet markert with parentes (ATG).
- For et spleise-blokkering morfolino, velg intron-exon eller exon-intron grensen sekvensen og inkluderer 50 baser (25 baser av exon sekvens og 25 baser i intron sekvens) rundt grenseregionene. Skann genomet med morpholino sekvens for å verifisere at sekvensen er unik.
2. Mikroinjeksjon av morpholino oligonukleotider
- Fremstille 3 mM stamløsninger av morfolino oligonukleotider ved å tilsette 100 ul av nuklease-fri vann i 300 nmol morpholino hetteglass.
MERK: Ikke bruk DEPC behandlet vann for re-suspensjon fordi dietylpyrokarbonat kan skade morpholino. - For første tilberedning spinn ned i hetteglasset aksje oligonukleotid løsning i 30 s ved full hastighet (14 000 - 16 000 xg), kort vortex, varme ved 65 ° C i 5-10 min, kort vortex, og holde morpholino lager rom temperatur i minst 1 time. Morpholino stamløsning s lagres fra -20 ° C til 4 ° C.
- Fremstille injeksjonsoppløsning inneholdende morfolino oligonukleotider ved den ønskede konsentrasjon. Denne oppløsning inneholder vanligvis 20% glyserol eller 125 mM KCl som en bærer og 15% FITC-dekstran (fluoresceinisotiocyanat dextran 10.000 MW 2,5 mg / mL stamløsning). FITC-dekstran og andre fluorescerende dextran-konjugater blir rutinemessig brukt for å identifisere injiserte embryoer med epifluorescens mikroskopi. Oppbevar injeksjonsløsninger ved -20 ° C.
- Oppvarm morpholino-løsning ved 65 ° C i en varmeblokk eller vannbad på minst 2 - 5 min.
- I korthet spinne morpholino løsning i 30 s ved full hastighet (14 000 - 16 000 xg), vortex i 1 min og sentrifuger ved full hastighet (14 000 - 16 000 xg) i minst 10 min.
- Last inn kanyler med morpholino løsning. For en detaljert mikroinjeksjon protokoll se Stepicheva og Song, 2014 21 og Cheers og Ettensohn 2004"> 22.
3. Fiksering og In Situ protokoll på 24 timer etter befruktning (HPF) i S. purpuratus Embryoet
MERK: Denne protokollen er endret fra Arenas-Mena et al. 2000 23 og Sethi et al. 2014 24.
- Fiksering
- Legg til flere dråper av fiksativ (se nedenfor) til brønner som inneholder embryo, bland forsiktig ved pipettering, og tillate dem å avgjøre. Fjern fiksativ løsning, og deretter blande embryoer med to ekstra 180 mL vasker av fiksativ.
MERK: Det er viktig å grundig blande embryoene i løpet av de vasker ved forsiktig pipettering opp og ned flere ganger. Hvis dette ikke gjøres kan senke signal til støyforhold. - La embryoene å feste i det andre fikseringsmiddel vask i 50 minutter til 1 time ved romtemperatur (RT) i 4% paraformaldehyd elektronmikros klasse som består av 10 mM MOPS pH 7,0, 0,1% Tween-20, og kunstig seawater (ASW). Gjør denne løsningen frisk hver gang for best resultat. I tillegg, for enkle og praktiske embryoer blir løst i 96-brønners plater.
- Til 20 ml fiksativ bruk 5 ml 16% paraformaldehyd, 15 ml ASW, 200 ul 1 M MOPS pH 7,0, og 20 ul Tween-20.
- Vask 5 ganger ved romtemperatur med 180 pl MOPS-vaskebuffer bestående av 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl og 0,1% Tween-20 i minst 5 minutter eller inntil embryoer falle til bunnen av brønnen. Igjen er det viktig å grundig blande embryoene inn i vaskebuffer ved forsiktig pipettering opp og ned flere ganger. MOPS vaskebuffer kan anvendes i 2 dager ved oppbevaring ved 4 ° C.
- Til 40 ml MOPS vaskebuffer bruken 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M NaCl, 32 ml dH 2 O, og 40 ul Tween-20.
- Faste embryo kan lagres ved 4 o C i 2 dager.
MERK: Hvis lagring av faste embryo lenger, og deretter legge 0,2% natriumazid i MOPS vaskebuffer for å hindre bakterievekst.
- Legg til flere dråper av fiksativ (se nedenfor) til brønner som inneholder embryo, bland forsiktig ved pipettering, og tillate dem å avgjøre. Fjern fiksativ løsning, og deretter blande embryoer med to ekstra 180 mL vasker av fiksativ.
- Pre-hybridisering
- Aspirer MOPS vaskebuffer og tilsett 180 ul av en 2: 1 forhold av MOPS vaskebuffer til hybridiseringsbuffer, bland embryoer inn i oppløsningen ved forsiktig pipettering flere ganger, og inkuberes i minst 20 minutter ved RT. Hybridiseringsbuffer består av 70% formamid, 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl, 1 mg / ml BSA og 0,1% Tween-20.
- Til 40 ml hybridiseringsbuffer bruken 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M NaCl, 4 ml dH 2 O, 0,04 g BSA, og 40 ul Tween-20. Bland godt ved virvling, tilsett 28 ml formamid, og vortex igjen.
- Fjern det 2: 1 forhold av MOPS vaske og hybridiserings- buffere og tilsett 180 ul av en 1: 2 forhold av MOPS vaskebuffer til hybridiseringsbuffer, bland embryoer i løsningen, og inkuberes i minst 20 minutter ved RT.
- Før probehybridisering bland forsiktig embryoer i 100 - 150 ul av hybridiseringsbuffer. Inkuber embryoer ved 50 ° C i minst etth.
MERK: Inkubering embryoer natten er akseptabelt. Før inkubering, forsegle brønner med en klebefilm for å forhindre fordampning.
- Aspirer MOPS vaskebuffer og tilsett 180 ul av en 2: 1 forhold av MOPS vaskebuffer til hybridiseringsbuffer, bland embryoer inn i oppløsningen ved forsiktig pipettering flere ganger, og inkuberes i minst 20 minutter ved RT. Hybridiseringsbuffer består av 70% formamid, 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl, 1 mg / ml BSA og 0,1% Tween-20.
- hybridisering
- I et separat rør legger til 0,1 til 0,3 ng / ul av probe og 500 ug / ml gjær tRNA inn i hybridiseringsbuffer, deretter vortex forsiktig for å skape sonde løsning. Gjær-tRNA ble tilsatt til proben løsning for å redusere ikke-spesifikk binding av anti-sense-probe. Forvarme denne løsningen til 50 ° C, og aspirere hybridiseringsbuffer.
- Blande pre-hybridisert embryoer inn i 100 pl av proben oppløsningen, forsegler med en klebefilm, og hybridisere ved 50 ° C i 2 til 7 dager, avhengig av sonden (den foxq2 sonden kan inkubert i 2 dager).
MERK: Inkubasjon ganger vil variere basert av sonden. Noen gener uttrykt på lave nivåer kreve opp til en 7-dagers inkubasjon. 96-brønners plater kan plasseres i en fuktighetsboks som forsikring mot fordampning dersom klebemiddelive ark unnlater å forsegle ordentlig. - Vask 5 ganger ved 50 ° C med 180 pl av ferske MOPS vaskebuffer i totalt 3 timer. Deretter vaskes 3 ganger (15 min) med 180 pl MOPS-vaskebuffer ved RT. Husk å blande embryoer inn i vaskebuffer hver gang ved forsiktig pipettering flere ganger.
- antistoff Inkubasjon
- Aspirer MOPS vaskebuffer og bland embryoer i 180 ul blokkeringsbuffer bestående av 10% normal Sau serum og 5 mg / ml BSA i MOPS-vaskebuffer og inkuberes i minst 45 minutter ved romtemperatur eller 4 ° C over natten.
- Fjern blokkeringsbuffer, og deretter blande embryoer inn i blokkeringsbuffer inneholdende en 1: 1500 fortynning av alkalisk fosfatase-konjugert anti-digoksigenin antistoff fortynnet i blokkeringsbuffer. Inkuber over natten ved RT i en lukket plate for å forhindre fordampning. MERK: Ikke la antistoff på lenger enn over natten.
- Vask embryoer 6 ganger (5 min eller inntil embryoer slipp) i MOPS-vaskebuffer ved RT. Embryoet kanbli lagret over natten ved 4 ° C.
- In situ utvikling
- Vask embryoer 3 ganger (10 min) ved romtemperatur med rykende pH 9,5 buffer bestående av 0,1 M Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 1 mM levamisol, og 0,1% Tween-20.
- Til 20 ml pH 9,5 buffer bruk 2 ml 1 M Tris pH 9,5, 400 ul 5M NaCl og 1 ml 1 M MgCl2, 20 ul Tween-20, 16,6 ml dH 2 O, og 0,0048 g Levamisole.
- Inkuber embryoer ved 37 ° C i fargings buffer beskyttet mot lys. Beising buffer består av 10% dimetylformamid, 4,5 pl / ml 4-nitro blå tetrazoliumklorid (NBT), og 3,5 pl / ml 5-brom-4-klor-3-indolyl-fosfat (BCIP) i rykende pH 9,5 buffer .
- For 1 ml flekker buffer bruke 100 mL dimetylformamid, 4,5 mL NBT, og 3,5 mL BCIP.
- Stoppe den alkaliske fosfatase reaksjonen ved å vaske tre til fem ganger i MOPS-vaskebuffer. Reaksjonen with foxq2 sonden tar vanligvis 30 minutter til en time. Enkelte prober kan trenge inkubering over natten ved enten romtemperatur eller 4 ° C.
- Bland embryoer inn i en løsning av 70% MOPS vask og 30% glycerol. Den glycerol har en brytningsindeks som er nødvendig for mikroskopi. Embryo kan lagres i denne oppløsning i flere uker. Forsegle plater med plast parafin for å hindre fordamping.
- Vask embryoer 3 ganger (10 min) ved romtemperatur med rykende pH 9,5 buffer bestående av 0,1 M Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 1 mM levamisol, og 0,1% Tween-20.
- Slide forberedelse og bilde fange
- Forbered et lysbilde ved å arrangere tre små strimler av dobbeltsidig tape i en trekant med små hull mellom strimler på et lysbilde.
- Overfør embryoene i 70% MOPS vask og 30% glyserol løsning til midten av trekanten og dekk med et dekkglass.
- Forsegle dekkglass ved å påføre et lag av neglelakk rundt kantene av dekkglass.
- Ta bilder ved hjelp av et sammensatt lysmikroskop med 20X objektiv og en vedlagt kamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I kråkebolle embryo har vi vist at 3 forskjellige Wnt signale grener (Wnt / β-catenin, Wnt / JNK, og Wnt / PKC) 4, 25 samhandle for å danne en Wnt signalnettverk som styrer anterior-posterior (AP) mønster. En av de viktigste konsekvensene av disse signal hendelsene er at den første bredt uttrykt anterior neuroectoderm (ANE) grn blir begrenset til et lite område rundt fremre stang ved begynnelsen av gastrulation (24 HPF i S. purpuratus). Disse resultatene indikerer at Wnt / β-catenin signalering forhindrer ANE genaktivering i den bakre halvdel av embryoet ved 32-cellestadiet. Deretter videresender denne veien et signal til den ikke-kanonisk Wnt / JNK-signalveien som gradvis ned regulerer ANE grn i den fremre halvdel av embryoet mellom den 60-cellestadiet og tidlig gastrulation. Endelig, en tredje ikke-kanoniske Wnt pathway, Wnt / PKC, antagoniserer Wnt / JNK-signalreaksjonsveien og hindrer den fra å eliminere ANE spesifikasjonen rundt fremre stang (figur 1A) 4.
Vi bruker spatiotemporal ekspresjon av foxq2 å analysere for aktiviteten av hver av de wnt signale grenene i løpet av AP mønster fordi det er ett av de første to gener aktiveres i ANE grn og det er lett bedømmes ved in situ hybridisering på grunn av sin robuste uttrykk 26. Hvis noen enkelte Wnt signale gren blir opprørt, så er det klart uttrykk fenotyper som indikerer hvilken vei er involvert: 1) I fravær av Wnt / β-catenin signalisere en bred mors reguleringsmekanisme (figur 1A) aktiverer foxq2 uttrykk gjennom hele embryoet (figur 1BB); 2) I fravær av Wnt / JNK signale foxq2 uttrykkes gjennomden fremre halvdel av embryoet (figur 1BC), men det er fortsatt ned reguleres i den bakre halvdel på grunn av aktiviteten av Wnt / β-catenin signalering (figur 1A); I fravær av Wnt / PKC signale foxq2 uttrykk er helt nedregulert i løpet av embryo (figur 1Bd), fordi Wnt / β-catenin og Wnt / JNK signalveier er opp regulert 4, 25. Derfor har vi utviklet en metode som vi har kalt den foxq2 transkripsjonen avlesning system som, når kombinert med systematisk arbeidsflyt (figur 2), gir oss mulighet til å effektivt identifisere og teste om et gen av interesse er involvert i en eller flere av Wnt signale grener.
Bruk av metodikk og foxq2 avlesning systemet presenteres her, har vi identifisert flere antatte ekstracellulært eller intracellulære Molecules sannsynligvis involvert i Wnt nettverk styrende AP aksen spesifikasjon, hvorav fire er vist i figur 3. Embryoet injisert med morpholinos designet for å knockdown uttrykk for enten transkripsjonsfaktor, ATF2, eller utskilt ekstracellulære Wnt modulator, Wif-en, viste en utvidelse av foxq2 uttrykk mot bakre pol av embryoet på tidlige gastrulation stadier (figur 3A - C ). Disse resultatene etterligne fenotyper observert når medlemmer av Wnt / JNK signalveien blir slått ned 4, 25, noe som tyder på at de er medlemmer av denne signal gren som er nødvendig for å nedregulere ANE GRN uttrykk i fremre halvdel av embryo. I motsetning til dette ble foxq2 uttrykk eliminert når vi slått ned ekspresjonen av transkripsjonsfaktoren, NFAT (figur 3D), og det utskilte ekstracellulære modulator, sFRP3 / 4 (figur 3E),som tyder på at disse molekylene er involvert i Wnt / PKC vei som er nødvendig for å antagonisere nedregulering av den ANE grn av Wnt / JNK signalering. Basert på disse raskt oppnådde resultater er vi nå i stand til å utføre mer detaljerte funksjonelle analyser som vil plassere disse faktorene i utvikling Wnt signalnettverk involvert i GRN som styrer AP mønster i kråkebolle embryo.
Figur 1. Modell for AP Spesifikasjon og Mønstring i Sea Urchin og foxq2 Transkripsjonell Timer System. (A) Den progressive nedregulering av den ANE grn til et område rundt den fremre stang ved Wnt signaleringsnett beskrevet i teksten og i 4, 9. (B) En transcriptional avlesning system som viser foxq2 uttrykk i de angitte Wnt pathway knockdowns (KO). Scale bar = 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. En eksperimentell Flow Diagram for effektiv Wnt Network Analysis i Sea Urchin Embryo. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. signaltransduksjon molekyler som er involvert i Wnt Network styrende AP Axis Spesifikasjon og Mønster identifiseres ved hjelp av foxq2 Transkripsjonell Timer System. (A, B, C) morfolino knockdowns tyder på at en intracellulær signale modulator, ATF2, og skilles ekstracellulære modulator, Wif-en, er potensielle spillere av Wnt / JNK signalveien. (A, D, E) knockdown eksperimenter indikerte at NFAT, en intracellulær signale modulator, og sFRP3 / 4, en utskilt Wnt signale modulator, er involvert i Fzl1 / 2/7-PKC signalering. Scale bar = 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metodikken som presenteres her er et eksempel som illustrerer kraften i å bruke embryo med mindre genomisk og morfologisk kompleksitet enn virveldyr å forstå signaloverføringsveier og GRNs regulerer grunnleggende utviklingsmekanismer .. Mange laboratorier bruker lignende undersøkelser i løpet av tidlig kråkeboller utvikling for å dissekere signalveier involvert i andre arrangementer celle skjebne spesifikasjon (f.eks Notch, pinnsvin, TGF-β, og FGF signalering) 27, 28, 29, 30, 31. Disse kråkebolle studier har avdekket mange interessante og nye signalmekanismer, og mange aspekter av disse signalmekanismer som styrer tidlig kråkeboller utvikling synes å være konservert blant deuterostomes 9, 27, 30 <sup>, 31, 32. Viktigere, har utforskningen av utviklingsbiologi hos utradisjonelle metazo embryo sett en økning de siste årene, og mange av disse aksje egenskaper med kråkebolle embryoer under tidlig utvikling 9, 15, 16, 33. Dermed kunne metodikken som presenteres her bli mye brukt til studiet av signaloverføringsveier i mange av disse organismene under tidlig utvikling.
Alle teknikker som brukes til å slå ned genuttrykk kan potensielt produsere off-target slå ned effekter. Morpholinos har vist seg å være en utrolig effektiv gen perturbasjonsfremgangsmåten i kråkebolle embryoer i stor grad fordi samfunnet utfører strenge kontroller for å lindre bekymringer at knockdown fenotype er uspesifikke. Disse grunnleggende kontrollanalysene kan være modified og brukt til andre knockdown teknikker (dvs. skarpere / Cas9). Kontrollene er: 1) Forsiktig doserespons forsøk ble utført med hver morfolino inntil ≥ 80% av injiserte embryoer viser defekt fenotype og / eller markør-gen ekspresjon; 2) Morpholinos blir forkastet hvis de forårsaker alvorlige utviklingsforsinkelser eller død ved moderate konsentrasjoner. Disse fenotyper er trolig på grunn av giftige off-target effekter; 3) Minst to morpholinos som er utformet for å målrette ulike bindingssteder blir brukt til å bekrefte knockdown fenotyper; 3) missense morpholinos injiseres; 4) morfolino fenotyper er reddet ved å innføre mRNA for målet genet inn morfolino knockdown embryoer; 5) Når tilgjengelig, hele mount antistoff flekker analyser brukes for å vise at morfolino knockdowns hindre oversettelse av genet av interesse. Det er viktig å merke seg at kråkebollen samfunnet bruker minst fire arter for funksjonelle studier, avhengig av hvor forskere er plassert. i most tilfeller til vår kunnskap, de ulike morpholinos brukt til å slå ned de ortologer har generert lignende fenotyper i hver art (se for eksempel disse funksjonelle studier på Nodal signale 34, 35, 36, 37). Disse resultatene argumenterer overbevisende at våre strenge kontrollforsøk sterkt velge for de morpholinos som produserer på målet knockdown effekter.
Et annet viktig aspekt ved denne metoden er å nøye identifisere transkripsjons mål som mest sannsynlig direkte aktivert av signalveien som betraktes. Eksempelet som vi tilbyr her er tilfeldig, fordi spatiotemporal aktivering av signalveier og nedregulering av et robust uttrykk genet, foxq2, oppstår tidlig i utviklingen og GRNs styrende bakterie lag og aksen spesifikasjon i kråkebollen embryo er godtvitskape. Således, en åpenbar begrensning ved denne metoden er at i mange tilfeller kan det være nødvendig å knockdown aktiviteten til en bestemt signalveien under senere stadier av utvikling og innenfor bestemte områder. Det finnes flere teknologier nå tilgjengelig som kan brukes til å overvinne disse begrensningene (f.eks foto morpholinos, skarpere / Cas9 38, FACseq) selv i ikke-tradisjonelle modell embryoer som ikke er mottagelig for genetisk manipulasjon. I mange tilfeller kan det ikke være mulig å identifisere en kandidat-gen nedstrøms for en signalveien av interesse hvis spatiotemporal uttrykk er like lett vurderes som foxq2, som har en bemerkelsesverdig høy signal-til-støy-forhold. Det er vanlig å finne gener med mye lavere signal-til-støy-forhold. Dersom et annet gen ikke er tilgjengelig for en spesiell analyse, og deretter in situ-probe genereres for genet av interesse bør være så lang som mulig. Generelt, ved hjelp av sonder som er lengre enn 1000 basepars signifikant øker signal og reduserer støyen i kolorimetriske og fluorescerende in situ analyser.
Når transkripsjons analyse som viser hvor og når signaltransduksjonsbane av interesse signalis er etablert, er den neste viktige skritt for å bestemme både romlig og tidsmessig uttrykk for de antatte regulatoriske faktorer involvert i utviklingsmekanismen under studien. Differential skjerm og / eller qPCR data er viktige verktøy, men de kan være misvisende. Bekrefte med hele mount in situ hybridisering at det aktuelle genet uttrykkes territorium der signalveien er aktiv hindrer bortkastet tid og ressurser. I tillegg er disse dataene tillate spådommer gjøres om genet regulatoriske arkitektur, som vil informere mer detaljerte analyser som vil følge når de involverte aktørene er identifisert med denne innledende analysen (figur 2). Vi presenterer en enkel og effektle kolorimetrisk analyse i denne protokollen; imidlertid, kan fluorescerende in situ hybridisering (FISH) også bli brukt til å visualisere flere fluorescerende prober på samme tid, noe som muliggjør forbedret romlig oppløsning innen område av interesse, så vel som konfokal mikroskopi 24. I tillegg kan FISH pares med antistoff farging å identifisere posttranslasjonelle modifikasjoner og / eller der signalveien av interesse er aktiv 24.
Det er to viktige skritt i protokollen som ofte blir oversett. Den ene er fremstillingen av den morpholino oligonukleotid løsning. Det er viktig å oppvarme morpholino-løsning ved 65 ° C i 2 min til 5 min og å sentrifugere det ved full hastighet i minst 10 minutter før lasting av injeksjonsnåler. Disse trinnene er essensielt når den morpholino stamløsningen blir lagret ved -20 ° C fordi morfolino oligonukleotider kan felles ut fra oppløsningen ved lav hodetraturer og spinning av oppløsningen hindrer kanyler fra å bli tilstoppet av partikler. Et annet viktig aspekt å vurdere er at embryo skal blandes grundig inn i de ulike løsningene under hvert trinn av fiksering og in situ hybridisering protokoller. I våre hender, blir signalet reduseres og / eller bakgrunns økes hvis dette enkle trinnet ikke er utført.
Kanskje det viktigste aspektet ved metodikken som presenteres her, er at det gir mulighet for effektive funksjonelle analyser av store sett med potensielle signaltransduksjon molekyler som genereres av neste generasjons transcriptomics og proteomikk. Når disse innledende funksjonelle analyser bekrefter en gruppe av regulatoriske faktorer er involvert i en sti av interesse, er neste utfordring å bruke etablerte analyser (f.eks funksjonelle knockdowns, detaljert multi-farget hele mount in situ, biokjemiske interaksjoner) for å vurdere hvordan de passer inn den extracellular, intracellulært, og transkripsjonelle nivåer av signaloverføringsveier som er involvert i en spesiell utviklingsprosess.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino | Gene Tools LLC | Customized | More information at www.gene-tools.com |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| FITC (dextran fluorescein isothiocyanate) | Invitrogen, Life Technologies | D1821 | Make 25 mg/mL stock solution |
| Paraformaldehyde 16% solution EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| MOPS | Sigma Aldrich | M1254-250G | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 23336-0010 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 47671-1L-F | |
| Yeast tRNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| Normal Goat Serum | Sigma Aldrich | G9023-10mL | |
| Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody | Roche | 11 093 274 910 | |
| Tetramisole hydrochloride (levamisole) | Sigma Aldrich | L9756-5G | |
| Tris Base UltraPure | Research Products Internationall Corp | 56-40-6 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 7786-30-3 | |
| BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate | Roche | 11 383 221 001 | |
| 4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT) | Roche | 11 383 213 001 | |
| Dimethyl Formamide | Sigma Aldrich | D4551-500mL | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541-5KG | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Magnesium Sulfate | Sigma Aldrich | M7506-2KG | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C1016-500G |
References
- Erwin, D. H., Davidson, E. H. The evolution of hierarchical gene regulatory networks. Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).
- Peter, I. S., Davidson, E. H. Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development. Cell. 144, 970-985 (2011).
- Borggrefe, T., et al. The Notch intracellular domain integrates signals from Wnt, Hedgehog, TGFbeta/BMP and hypoxia pathways. Biochimica et biophysica acta. 1863, 303-313 (2016).
- Range, R. C., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Integration of canonical and noncanonical Wnt signaling pathways patterns the neuroectoderm along the anterior-posterior axis of sea urchin embryos. PLoS Biol. 11, e1001467 (2013).
- Cleary, M. A., van Osch, G. J., Brama, P. A., Hellingman, C. A., Narcisi, R. FGF, TGFbeta and Wnt crosstalk: embryonic to in vitro cartilage development from mesenchymal stem cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 9, 332-342 (2015).
- Lapraz, F., et al. RTK and TGF-beta signaling pathways genes in the sea urchin genome. Dev Biol. 300, 132-152 (2006).
- Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. The evolution of signalling pathways in animal development. Nature reviews. Genetics. 4, 39-49 (2003).
- Sethi, A. J., Wikramanayake, R. M., Angerer, R. C., Range, R. C., Angerer, L. M. Sequential signaling crosstalk regulates endomesoderm segregation in sea urchin embryos. Science. 335, 590-593 (2012).
- Range, R. Specification and positioning of the anterior neuroectoderm in deuterostome embryos. Genesis. 52, 222-234 (2014).
- Petersen, C. P., Reddien, P. W. Wnt signaling and the polarity of the primary body axis. Cell. 139, 1056-1068 (2009).
- Lapraz, F., Haillot, E., Lepage, T. A deuterostome origin of the Spemann organiser suggested by Nodal and ADMPs functions in Echinoderms. Nature communications. 6, 8434 (2015).
- Kikuchi, A., Yamamoto, H., Sato, A. Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways. Trends in cell biology. 19, 119-129 (2009).
- Hogan, B. L. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, 1580-1594 (1996).
- Houart, C., et al. Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling. Neuron. 35, 255-265 (2002).
- Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
- Rottinger, E., Lowe, C. J. Evolutionary crossroads in developmental biology: hemichordates. Development. 139, 2463-2475 (2012).
- Genome Sequencing Sea Urchin, C., et al. The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
- Ben-Tabou de-Leon, S., Su, Y. H., Lin, K. T., Li, E., Davidson, E. H. Gene regulatory control in the sea urchin aboral ectoderm: spatial initiation, signaling inputs, and cell fate lockdown. Dev Biol. 374, 245-254 (2013).
- Saudemont, A., et al. Ancestral regulatory circuits governing ectoderm patterning downstream of Nodal and BMP2/4 revealed by gene regulatory network analysis in an echinoderm. PLoS Genet. 6, e1001259 (2010).
- Cameron, R. A., Samanta, M., Yuan, A., He, D., Davidson, E. SpBase: the sea urchin genome database and web site. Nucleic Acids Res. 37, D750-D754 (2009).
- Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50841 (2014).
- Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods in cell biology. 74, 287-310 (2004).
- Arenas-Mena, C., Cameron, A. R., Davidson, E. H. Spatial expression of Hox cluster genes in the ontogeny of a sea urchin. Development. , 4631-4643 (2000).
- Sethi, A. J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Multicolor labeling in developmental gene regulatory network analysis. Methods in molecular biology. , 249-262 (2014).
- Wikramanayake, A. H., Huang, L., Klein, W. H. beta-Catenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9343 (1998).
- Yaguchi, S., Yaguchi, J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. A Wnt-FoxQ2-nodal pathway links primary and secondary axis specification in sea urchin embryos. Dev Cell. 14, 97-107 (2008).
- Molina, M. D., de Croze, N., Haillot, E., Lepage, T. Nodal: master and commander of the dorsal-ventral and left-right axes in the sea urchin embryo. Curr Opin Genet Dev. 23, 445-453 (2013).
- Range, R. C., Glenn, T. D., Miranda, E., McClay, D. R. LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo. Development. 135, 2445-2454 (2008).
- Range, R., et al. Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1. Development. 134, 3649-3664 (2007).
- Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin. Dev Biol. 411, 314-324 (2016).
- Rottinger, E., et al. FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development. Development. 135, 353-365 (2008).
- Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin. Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).
- Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology. Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).
- Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm. PLoS Genet. 12, e1006001 (2016).
- Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo. Dev Cell. 6, 397-410 (2004).
- Bradham, C. A., et al. Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos. Dev Biol. 328, 221-233 (2009).
- Su, Y. H. Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos. Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).
- Lin, C. Y., Su, Y. H. Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system. Dev Biol. 409, 420-428 (2016).
