Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

כוחה של פשטות: עובר קיפוד ים כמו Published: February 16, 2017 doi: 10.3791/55113
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Mississippi State University

Summary

במאמר זה וידאו מפרט פשוטה במתודולוגיה vivo, שניתן להשתמש בהם כדי בשיטתיות וביעילות לאפיין מרכיבי מסלולי איתות מורכבות ורשתות רגולטוריות בעוברים חסרי חוליות רבים.

Introduction

ג'ין רשתות רגולטוריות (GRNs) ואת מסלולי העברת אותות להקים הביטוי במרחב ובזמן של גנים במהלך ההתפתחות העוברית המשמשים לבניית תוכנית גוף החיה הבוגרת. תא אל תא מסלולי העברת אותות הם מרכיבים חיוניים של רשתות רגולטוריות אלו, מתן הכלי שבאמצעותו תאים מתקשרים. אינטראקציות הסלולר אלה להקים ולשפר את הביטוי של גני רגולטוריים והבחינו ובקרב בשטחים השונים במהלך embryogenesis 1, 2. אינטראקציות בין מאפננים תאיים מופרשים (הליגנדים, אנטגוניסטים), קולטנים, ו-קולטנים שיתוף לשלוט על פעילות מסלולי העברת אותות. מבחר של מולקולות תאיות transduces תשומות אלה וכתוצאה מכך ביטוי גנים שהשתנה, חלוקה, ו / או צורה של תא. בעוד רבים של מולקולות המפתח בשימוש ברמות התאיות ו תאי על המסלולים העיקריים הםידוע, הוא ידע שלם נובע במידה רבה למורכבות של מסלולי איתות בודדים. בנוסף, מסלולי איתות שונים לעתים קרובות אינטראקציה זה עם זה חיובי או שלילי על התאים, תאיים, ורמות תעתיק 3, 4, 5, 6. חשוב לציין, מרכיבי הליבה של מסלולי העברת אותות הם שמורים ביותר בכל המינים מטזואניים, ו, להפליא, רוב מסלולי איתות הגדולים לעתים קרובות לבצע פונקציות התפתחותי דומות במינים רבים כאשר משווים אורגניזמים טווח מערכת קשור קשר הדוק בפרט 7, 8, 9, 10, 11.

המחקר של איתות במהלך ההתפתחות הוא משימה מרתיעה בכל אורגניזם, וישכמה אתגרים משמעותיים ללימוד מסלולי איתות במודלים השניוניים הפה ביותר (בעלי חוליות, המיתרנים חסרי חוליות, hemichordates, ו echinoderms): 1) בקרב בעלי חוליות יש מספר גדול של ליגנד האפשרי ואינטראקציות קולטן / אפנן-שיתוף, מולקולות התמרה תאיות, כמו גם אינטראקציות פוטנציאליות בין נתיבים שונים מאותתים בשל המורכבות של הגנום 12, 13, 14; 2) המורפולוגיה המורכבת ותנועות המוךפו"גנטי שהולכות חוליות לעתים קרובות לעשות את זה יותר קשה לפרש אינטראקציות תפקודיות ובקרב מסלולי העברת אותות; 3) ניתוח ברוב מיני מודל שאינו קווצי עור חסר חוליות שניוניות פה מוגבל על ידי חלון קצר gravidity למעט כמה מיני מיתרני זנב 15, 16.

העובר ים קיפוד יש כמה מן המגבלות הנ"ל ומציע איכויות ייחודיות רבות לביצוע ניתוח מפורט של מסלולי העברת אותות in vivo. אלה כוללים את הבאים: 1) הפשטות היחסית של הגנום קיפוד הים מפחית באופן משמעותי את המספר ליגנד אפשרי, קולטן / שיתוף הקולטן מולקולת התמרה תאית קשרי גומלין 17; 2) GRNs שליטה במפרט הדפוסים של השכבות הניבטות וגרזנים עובריים עיקריים מבוססות היטב בעוברי קיפוד ים, בסיוע להבנת ההקשר רגולטוריות של התא / טריטורית קבלת האותות 18, 19; 3) מסלולי העברת אותות רבים ניתן ללמוד בין שלבי מחשוף gastrula מוקדם כאשר עוברים מורכבת של האפיתל שכבתית יחידה מורפולוגיה אשר קל יותר לנתח; 4) המולקולות לערבד ב מסלולי איתות של קיפודי הים הם מניפולציה בקלות; 5) קיפודי ים רבים המעוברים במשך 10 עד 11 חודשים בשנה (למשל Strongylocentrotus purpuratus ו Lytechinus variegatus).

כאן, אנו מציגים שיטה בשיטתיות וביעילות לאפיין מרכיבי מסלולי איתות המציינים וטריטוריות דפוס בעוברי קיפוד ים כדי להמחיש את היתרונות כי מספר מערכות מודל חסרות חוליות להציע בחקר מנגנונים מולקולריים מורכבים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. עיצוב אסטרטגית Morpholino תפוקה גבוהה

  1. לזהות גן (ים) של עניין (גישת הגן המועמד למשל, ניתוח הרגולציה ציס, RNA-seq ו / או מסכי ההפרש proteomic).
  2. השתמש גנומית, transcriptomic, ונתוני ביטוי גנים באתרים מתעדכנים בתדירות גבוהה (למשל SpBase http://www.echinobase.org 20 וס purpuratus הגנום http חיפוש: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) כדי לקבוע שפרופיל הביטוי spatiotemporal חופף עם מנגנון התפתחות מדובר. אם אין נתוני ביטוי זמינים, ולאחר מכן ליצור פריימרים qPCR ו / או antisense ב חללית באתרו להעריך את דפוס ביטוי גנים.
  3. לאחר קביעת דפוס ביטוי במרחב ובזמן, להשיג את רצף הדנ"א מאתרי האינטרנט הגנומי.
    1. להפקה oligonucleotides morpholino חסימה-תרגום, להשיג רצף of 5 'באזור un-מתורגם (5' UTR) ישירות במעלה הזרם מן קודון ייזום מהתג רצף הביע (EST) מאגרי מידע נגיש SpBase או ס purpuratus הגנום אתרי חיפוש. אם מידע זה אינו זמין עבור הגן של עניין, ולאחר מכן לבצע 5 'RACE.
    2. כדי לעצב morpholino חסימת-אחוי, לחפש את הרצף הגנומי כולל אקסונים אינטרונים שימוש באפשרות פיגום blastn בכלי חיפוש SpBase או ס purpuratus הגנום.
  4. השתמש באתר בעיצוב oligonucleotide http://oligodesign.gene-tools.com כדי לעצב את רצף morpholino זוג 25 בסיס הרצוי.
    1. במשך morpholino חסימת-translational, השתמש רצף mRNA מ 5 'ל 3' כמקור רצף היעד translational. כלול את רצף UTR '5 (כ -70 נוקלאוטידים upstream של אתר תחילת השעתוק) בתוספת 25 בסיסים של קידוד באזור (במורד הזרם של האתר התחל) עם תחילת קודון wi ניכרתבסוגריים ה (ATG).
    2. במשך morpholino חסימה-אחוי, בחר אינטרון-אקסון או רצף גבול-אינטרון אקסון וכולל 50 בסיסים (25 בסיסים של רצף אקסון ו -25 בסיסים של רצף אינטרון) סביב אזורי הגבול. סרוק את הגנום עם רצף morpholino כדי לוודא את הרצף ייחודי.

2. Microinjection של Oligonucleotides Morpholino

  1. הכן 3 פתרונות מניות מ"מ של oligonucleotides morpholino על ידי הוספת 100 μL מים nuclease חינם לתוך בקבוקון morpholino 300 nmol.
    הערה: אל תשתמש במים DEPC שטופלו מחדש ההשעיה בגלל diethyl pyrocarbonate יכול להזיק morpholino.
  2. עבור ספין הכינון מחדש הראשון במורד בקבוקון המכיל את פתרון oligonucleotide המניות למשך 30 שניות במלוא המהירות (14,000 - 16,000 XG), בקצרה מערבולת, חום 65 מעלות צלזיוס במשך 5 עד 10 דקות, מערבולת בקצרה, ולשמור את המניה morpholino ב חדר טמפרטורה לפחות h 1. פתרון המניות Morpholino s מאוחסן מ -20 ° C עד 4+ מעלות צלזיוס.
  3. כן פתרון הזרקה המכיל oligonucleotides morpholino בריכוז הרצוי. פתרון זה מכיל בדרך כלל 20% גליצרול או 125 מ"מ KCl כנשא ו -15% FITC-dextran (והעמסת isothiocyanate dextran 10,000 MW 2.5 מ"ג / μL פתרון המניות). FITC-dextran ו conjugates dextran ניאון אחרים משמשים באופן שגרתי כדי לזהות עוברים מוזרק על ידי מיקרוסקופ epifluorescence. פתרונות הזרקת חנות ב -20 מעלות צלזיוס.
  4. מחמם את פתרון morpholino ב 65 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום או אמבט מים במשך לפחות 2 - 5 דקות.
  5. בקצרה ספין פתרון morpholino למשך 30 שניות במלוא המהירות (14,000 - 16,000 XG), מערבולת דקות 1 ו צנטריפוגות במלוא המהירות (14,000 - 16,000 XG) במשך 10 דקות לפחות.
  6. טען את מחטי הזרקה עם פתרון morpholino. לקבלת פרוטוקול microinjection מפורט ראה Stepicheva ושיר 2014 21 ו תרועות Ettensohn 2004"> 22.

קיבוע 3. בפרוטוקול באתרו ב 24 שעות לאחר ההפריה (hpf) ב ס purpuratus עוברים

הערה: פרוטוקול זה שונה מן ארנס-Mena et al. 2000 23 ו Sethi et al. 2014 24.

  1. קיבוע
    1. להוסיף מספר טיפות של מקבע (ראה להלן) כדי בארות המכילות עובר, לערבב בעדינות על ידי pipetting, ולאפשר להם להתיישב. הסר את הפתרון מקבע, ולאחר מכן לערבב עובר עם שתי שטיפות נוספות 180 μL של מקבע.
      הערה: חשוב לערבב את העוברים ביסודיות במהלך הכביסות של עד pipetting עדין ומטה מספר פעמים. אי ביצוע הוראה זו יכולה להוריד את יחס האות לרעש.
    2. השאר את העוברים לתקן בכביסה מקבעת השנייה למשך 50 דקות עד 1 שעות בטמפרטורת חדר (RT) ב paraformaldehyde הכיתה במיקרוסקופ אלקטרוני 4% בהיקף של 10 מ"מ מגבים 7.0 pH, 0.1% Tween-20, ומלאכותי seawater (ASW). הפוך את הפתרון הזה טרי בכל פעם עבור התוצאות הטובות ביותר. בנוסף, עבור עוברי הקלות והמעשיות המתוקנות ב- 96-גם הצלחות.
      1. במשך 20 שימוש מקבע 5 מ"ל paraformaldehyde מ"ל 16%, 15 מ"ל ASW, 200 μL 1 M מגבים pH 7.0, ו -20 μL Tween-20.
    3. לשטוף 5 פעמים ב RT עם 180 μL של מגבים לשטוף חיץ המורכב pH 0.1 M מגבים 7.0, 0.5 M NaCl ו 0.1% Tween-20 במשך 5 דקות או עד העוברים לפחות טיפה לתחתית הבאר. שוב, חשוב לערבב את העוברים ביסודיות לתוך המאגר לשטוף ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה מספר פעמים. חיץ מגבים לשטוף יכול לשמש 2 ימים אם לאחסן 4 מעלות צלזיוס.
      1. במשך 40 מ"ל מגבים לשטוף חיץ שימוש 4 מ"ל 1 M מגבים pH 7.0, 4 מ"ל 5 M NaCl, 32 מ"ל DH 2 O, ו -40 μL Tween-20.
      2. עוברים קבועים יכולים להיות מאוחסן על 4 מעלות צלסיוס למשך 2 ימים.
        הערה: אם אחסון עוברים קבוע יותר, ולאחר מכן להוסיף 0.2% אזיד הנתרן מגבים חיץ לשטוף כדי למנוע התפתחות חיידקים.
  2. טרום הכלאה
    1. לשאוב מגבים חיץ לשטוף ולהוסיף 180 μL של 2: יחס 1 של מגבים חיץ לשטוף למאגר הכלאה, לערבב עוברים לתוך התמיסה על ידי מספר פעמים pipetting עדין, דגירה במשך 20 דקות לפחות ב RT. הכלאה חיץ מורכב 70% לפוראמיד, 0.1 M מגבים pH 7.0, 0.5 M NaCl, 1 מ"ג / מ"ל ​​BSA ו -0.1% Tween-20.
      1. במשך 40 מ"ל חיץ הכלאה שימוש 4 מ"ל 1 M מגבים pH 7.0, 4 מ"ל 5 M NaCl, 4 מ"ל DH 2 O, 0.04 גרם BSA, ו -40 μL Tween-20. מערבבים היטב על ידי vortexing, להוסיף 28 לפוראמיד מ"ל, מערבולת שוב.
    2. הסר את 2: יחס 1 של המגבים לשטוף מאגרי הכלאה ולהוסיף 180 μL של יחס של 1: 2 של מגבי חיץ לשטוף למאגר הכלאה, לערבב עובר לתוך התמיסה, דגירה במשך 20 דקות לפחות ב RT.
    3. לפני הכלאת הבדיקה לערבב עוברת בעדינות לתוך 100 - 150 μL של חיץ הכלאה. דגירה עוברים על 50 מעלות צלזיוס לפחות 1ח.
      הערה: הקבוצה מתחילה עובר לילה מקובל. לפני דוגרים, לאטום את הבארות עם גיליון דבק כדי למנוע אידוי.
  3. הַכלָאָה
    1. בתוך צינור נפרד להוסיף 0.1 - 0.3 ng / μL של חללית ו -500 מיקרוגרם / מיליליטר השמרים tRNA למאגר הכלאה, ואז מערבולת בעדינות כדי ליצור פתרון חללי. tRNA שמרים מתווסף פתרון הבדיקה כדי להקטין הלא ספציפי מחייב של החללית אנטי תחושה. מחממים את הפתרון הזה ל -50 מעלות צלזיוס, חיץ הכלאה לשאוב.
    2. מערבב בעוברים בשלב טרום הכלאה לתוך 100 μL של פתרון הבדיקה, חותם עם גיליון דבק, להכליא על 50 מעלות צלזיוס למשך 2 עד 7 ימים, תלוי הבדיקה (חללית foxq2 ניתן וטופחה במשך 2 ימים).
      הערה: פעמים דגירה תשתנה בהתאם את החללית. גנים מסוימים לידי ביטוי ברמות נמוכות דורשים עד דגירת 7 ימים. ניתן להציב 96-גם הצלחות בקופסת לחות כביטוח נגד אידוי אם adhesגיליון ive נכשל לאטום כמו שצריך.
    3. לשטוף 5 פעמים ב 50 מעלות צלזיוס עם 180 μL של מגבים טריים לשטוף חיץ עבור סכום כולל של 3 שעות. לאחר מכן, לשטוף 3 פעמים (15 דקות) עם 180 μL של מגבים לשטוף חיץ ב RT. זכור לערבב עוברים לתוך לשטוף חיץ בכל פעם על ידי pipetting מספר פעמים בעדינות.
  4. דגירת נוגדן
    1. לשאוב מגבי חיץ לשטוף ומערבבים עוברים 180 μL של חיץ חסימת מורכב סרום כבשים 10% רגילים ו -5 מ"ג / המ"ל BSA ב מגבי חיץ לשטוף דגירה במשך 45 דקות לפחות ב RT או 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    2. הסר חסימת חיץ ואז לערבב העוברים לתוך חסימת מאגר המכיל דילול 1: 1,500 של נוגדן אנטי digoxigenin phosphatase מצומדות אלקליין מדולל חסימת חיץ. דגירת הלילה ב RT צלחת אטומה כדי למנוע אידוי. הערה: אל תשאיר נוגדן על יותר הלילה.
    3. לשטוף עוברים 6 פעמים (5 דקות או עד העוברים טיפה) ב מגבים לשטוף חיץ ב RT. יכול עוברלאחסן לילה בשעה 4 ° C..
  5. בפיתוח באתרו
    1. שטפו עוברי 3 פעמים (10 דקות) ב RT עם חיץ pH 9.5 טריים המורכב 0.1 M טריס pH 9.5, 100 מ"מ NaCl, 50 2 מ"מ MgCl, 1 מ"מ Levamisole, ו -0.1% Tween-20.
      1. במשך 20 מ"ל pH 9.5 חיץ שימוש 2 מ"ל 1 M טריס pH 9.5, 400 μL 5M NaCl, 1 מ"ל 1 M MgCl 2, 20 μL Tween-20, 16.6 מ"ל DH 2 O, ו 0.0048 Levamisole גרם.
    2. דגירה עוברים על 37 מעלות צלזיוס במאגר מכתים מוגן מפני אור. חיץ מכתים מורכב מ 10% דימתיל Formamide, 4.5 μL / מ"ל ​​4-Nitro כלוריד כחול tetrazolium (NBT), ו -3.5 μL / מ"ל ​​5-Bromo-4-כלורו-3-indolyl-פוספט (BCIP) במאגר pH 9.5 טריות .
      1. עבור 1 מ"ל של חיץ מכתים להשתמש 100 μL דימתיל Formamide, 4.5 μL NBT, ו -3.5 μL BCIP.
    3. עצור את תגובת phosphatase אלקליין על ידי שטיפת 3 עד 5 פעמים ב מגבה לשטוף חיץ. ה- Wi התגובהה החללית foxq2 בדרך כלל לוקח 30 דקות עד 1 שעה. בדיקות מסוימות עשויות צריכות דגירת הלילה משני RT או 4 מעלות צלזיוס.
    4. מערבבים עוברים לתוך תמיסה של לשטוף 70% מגבים ו -30% גליצרול. גליצרול מספק מקדם השבירה צורך במיקרוסקופ. עוברים ניתן לאחסן את הפתרון הזה במשך כמה שבועות. חותם את הצלחות עם פרפין פלסטיק כדי למנוע אידוי.
  6. הכנת שקופיות ולכידת תמונה
    1. כן שקופית ידי סידור שלוש רצועות קטנות של דבק דו צדדי למשולש עם פערים קטנים בין רצועות לשקופית.
    2. מעבירים את העוברים בכביסה 70% מגבים פתרון גליצרול 30% למרכז המשולש ומכסים coverslip.
    3. חותם את coverslip ידי החלת שכבת לק מסביב לקצוות של coverslip.
    4. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ אור מתחם עם מטרת 20X ומצלמה מצורפת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעובר הים קיפוד הראינו כי 3 איתות סניפים Wnt שונים (Wnt / β-קטנין, Wnt / JNK, ו Wnt / PKC) 4, 25 פועלים יחד כדי ליצור רשת איתות Wnt השולט הקדמי-אחורי דפוסים (AP). אחת התוצאות החשובות ביותר של אירועי איתות אלה היא כי קדמי neuroectoderm רחב הביע הראשונית (Ane) GRN הופכת מוגבלת לטריטוריה קטנה סביב הקוטב הקדמי עד תחילת gastrulation (24 hpf ב ס purpuratus). תוצאות אלו מצביעות כי Wnt / β-קטנין איתות מונעת הפעלה גן Ane במחצית האחורית של העובר על ידי במת 32 התאים. לאחר מכן, מסלול זה מעביר אות אל מסלול איתות קאנונית Wnt / JNK כי בהדרגה למטה מסדיר את GRN Ane במחצית הקדמית של העובר בין שלב 60-תא gastrulation מוקדם. לבסוף, pathwa Wnt קאנונית השלישיy, Wnt / PKC, מהופך Wnt / JNK מסלול איתות ומונע ממנה ביטול מפרט Ane סביב הקוטב הקדמי (איור 1 א) 4.

אנו משתמשים בביטוי spatiotemporal של foxq2 כדי assay הפעילות בכל סניפי איתות Wnt במהלך דפוסי AP כי הוא אחד משני הגנים הראשונים הופעלו GRN Ane והוא להעריך בקלות על ידי כלאה באתרו בגלל הביטוי החזק שלה 26. אם בכל סניף איתות בודד Wnt הוא מוטרד, אז יש פנוטיפים ביטוי ברורים לציין איזה מסלול מעורב: 1) בהעדר Wnt / β-קטנין איתות מנגנון רגולציה אמהיות רחב (איור 1 א) הפעיל ביטוי foxq2 ברחבי העובר כולו (איור 1Bb); 2) בהעדר Wnt / JNK איתות foxq2 מתבטא לאורךבמחצית הקדמית של העובר (האיור 1Bc), אבל זה עדיין מוסדר למטה במחצית האחורית בשל הפעילות של Wnt / β-קטנין איתות (איור 1 א); בהיעדר ביטוי איתות foxq2 Wnt / PKC מוסדר כליל ברחבי העובר (איור 1Bd), משום שמסלולי Wnt / β-קטנין ו Wnt / JNK איתות מוסדרים עד 4, 25. לכן, פתחנו assay כי שכינינו מערכת readout תעתיק foxq2 אשר, בשילוב עם העבודה השיטתית שלנו (איור 2), מאפשרת לנו לזהות ביעילות לבדוק אם גן של עניין מעורב אחד או יותר של Wnt איתות סניפים.

שימוש במערכת readout המתודולוגיה foxq2 שהוצג כאן, זיהינו Molec תאי או תאיים המשוער מספרules קרוב לוודאי מעורב ברשת Wnt מסדירים מפרטים ציר AP, ארבעה מהם מוצגים באיור 3. עובר הוזרק morpholinos נועד מציאת הביטוי של מי מבני גורם השעתוק, ATF2, או אפנן Wnt התאי המופרש, WIF-1, הראה התרחבות ביטוי foxq2 כלפי בקוטב האחורי של עובר בשלבי gastrulation מוקדם (איור 3 א - ג ). תוצאות אלו לחקות את פנוטיפים נצפה כאשר חברי מסלול ה- Wnt / JNK האיתות הם הפילו 4, 25, מה שמראה כי הם חברי סניף איתות זה כי יש צורך להסדיר את ביטוי Ane GRN במחצית הקדמית של העובר. לעומת זאת, ביטוי foxq2 חוסל כשאנחנו הפלנו את הביטוי של גורם השעתוק, NFAT (איור 3D), ואת אפנן תאיים המופרש, sFRP3 / 4 (3E איור),דבר המצביע על כך המולקולות האלה מעורבים מסלול ה- Wnt / PKC כי יש צורך להרגיז את תקנה למטה של ​​איתות Ane GRN ידי Wnt / JNK. בהתבסס על תוצאות במהירות שיג אלה אנו מסוגלים עתה לבצע ניתוחים פונקציונליים מפורטים יותר כי יציבו הגורמים הללו בתוך רשת איתות Wnt המתפתחת מעורבת GRN השולטת דפוסי AP בעובר קיפוד הים.

איור 1
איור 1. מודל מפרט AP ו דפוסים של קיפוד הים ואת foxq2 מערכת Readout תעתיק. (א) תקנה למטה מתקדמת של Ane GRN לטריטוריה סביב הקוטב הקדמי על ידי רשת איתות Wnt המפורטים טקסט ב 4, 9. (ב) transcriptionaמערכת readout l מראה ביטוי foxq2 ב knockdowns מסלול ה- Wnt המצוין (KO). בר סולם = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. תרשים זרימה של ניסיוני עבור יעיל Wnt רשת ניתוח בעובר קיפוד ים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. איתותים התמרו מולקולות המעורבים מפרט Wnt רשת המנהל AP הציר וזיהו דפוסי שימוש מערכת Readout תעתיק foxq2. (A, B, C) knockdowns Morpholino מראה כי אפנן איתות תאית, ATF2, ו אפנן תאיים מופרש, WIF-1, הם שחקנים פוטנציאליים של מסלול איתות Wnt / JNK. (A, D, E) ניסויי מציאה ציינו כי NFAT, אפנן איתות תאית, ו sFRP3 / 4, אפנן איתות Wnt מופרש, מעורבים Fzl1 / 2/7-PKC איתות. בר סולם = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המתודולוגיה המוצגת כאן היא דוגמא שממחישה את הכח של שימוש בעוברים עם מורכבות גנומית וצורניות פחות חוליות להבין את מסלולי העברת איתות GRNs המסדירים מנגנוני התפתחותיים יסוד .. מעבדות רבות משתמשות מבחנים דומים במהלך התפתחות קיפוד הים מוקדם לנתח את מסלולי איתות מעורבים באירועי מפרט גורל תאים אחרים (למשל Notch, קיפוד, β TGF-, ואיתות FGF) 27, 28, 29, 30, 31. מחקרי קיפוד ים אלה חשפו מנגנוני איתות מעניינים רבים רומן, והיבטים רבים של מנגנוני איתות אלה לפיקוח על בניית קיפוד ים מוקדם להיראות נשמרים בין שניוני פה 9, 27, 30 <sup>, 31, 32. חשוב לציין כי הסקר של הביולוגיה ההתפתחותית של עוברים מטזואניים הלא מסורתיים יש לראות גידול בשנים האחרונות, ורבים מאפיינים ולשתף אותן עם עוברי ים קיפוד במהלך מוקדמות פיתוח 9, 15, 16, 33. לפיכך, המתודולוגיה המוצגת כאן יכולה להיות מיושמת באופן נרחב במחקר של מסלולי העברת אותות רבים של אורגניזמים אלה במהלך ההתפתחות מוקדמת.

כל הטכניקות המשמשות כדי להפיל ביטוי גנים פוטנציאליים יכולות לייצר מחוץ היעד להפיל אפקטים. Morpholinos הוכיח להיות שיטת הפרעות גן יעילה להפליא בעוברי קיפוד ים במידה רבה משום שהקהילה מבצעת בקרה קפדנית על מנת להקל על חששות כי הפנוטיפ המציאה הוא לא ספציפי. מבחני שליטה הבסיסיים אלה יכולים להיות מodified וכן להחיל טכניקות מציאה אחרות (כלומר במצנן / Cas9). הפקדים: 1) מבחני מנת תגובה זהירה מבוצעים עם כל morpholino עד ≥ 80% של עוברים מוזרקים להראות פנוטיפ פגום ו / או ביטוי גני סמן; 2) Morpholinos מבוטל אם הם לגרום לעיכובים התפתחותיים חמורים ואף למוות בריכוזים מתונים. פנוטיפים אלה צפויים בשל השפעות חוץ-היעד רעילים; 3) לפחות שני morpholinos אשר נועדו למקד אתרי קישור שונים משמשים כדי לאשר פנוטיפים מציאה; 3) missense morpholinos מוזרק; 4) פנוטיפים Morpholino הם חולצו על ידי החדרת mRNA עבור גן המטרה לעוברי מציאה morpholino; 5) תאריך כניסה, מבחני הר שלם מכתים נוגדן משמשים להראות כי knockdowns morpholino למנוע התרגום של הגן של עניין. חשוב לציין שקהילת קיפוד הים משתמשת לפחות ארבעה מינים ללימודים תפקודיים, תלוי איפה מדענים נמצאים. ב מובמקרי st, למיטב ידיעתנו, את morpholinos השונה המשמשים להפיל את orthologs יצר פנוטיפים דומים בכל מין (למשל לראות מחקרים פונקציונליים אלה על קטרי איתות 34, 35, 36, 37). תוצאות אלו טיעונים משכנעים כי ניסויי השליטה הקפדנים שלנו ובחרו בחום למי morpholinos המייצר על יעד תופעות מציאה.

היבט חשוב נוסף של מתודולוגיה זו הוא לזהות את מטרות תעתיק בקפידה אשר מופעלות ישירות ככל הנראה על ידי מסלול האיתות נדון. הדוגמא שאנו מספקים כאן היא מבורכת, שכן הפעלת spatiotemporal של מסלולי האיתות והרגולציה למטה של גן הביע וחסונה, foxq2, להתרחש בשלב מוקדם של התפתחות ואת GRNs מסדירי שכבת ניבט מפרט ציר בעובר קיפוד הים הם גם-מְבוּסָס. לפיכך, מגבלה ברורה של מתודולוגיה זו היא כי במקרים רבים זה עשוי להיות נחוץ כדי מציאה את הפעילות של מסלול איתות מסוים בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות ובתוך טריטוריות ספציפיות. ישנן מספר טכנולוגיות זמינות כעת כי ניתן להשתמש כדי להתגבר על המגבלות האלה (למשל צילום morpholinos, Crisper / Cas9 38, FACseq) אפילו בעוברי מודל הלא מסורתיים שאינם למניפולציה גנטית. במקרים רבים זה לא יכול להיות אפשרי לזהות גן מועמד במורד הזרם של מסלול איתות עניין ביטוי spatiotemporal אשר נבחן באותה קלות שבה foxq2, בעלת גבוה להפליא יחס אות לרעש. זה נפוץ למצוא גנים עם יחס נמוך הרבה אות לרעש. אם גן נוסף אינו זמין עבור assay מסוים, ואז החללית באתר שנוצרה עבור הגן של עניין צריכה להיות כמה שיותר זמן. באופן כללי, בדיקות באמצעות יותר זוג בסיס 1,000הים מגביר באופן משמעותי את האות ומפחית את הרעש colorimetric ו ניאון מבחנים באתרו.

לאחר assay התעתיק המציין היכן ומתי המסלול הולך אותות עניין מאותת מוקם, הצעד החשוב הבא הוא לקבוע הן מרחבית הביטוי הזמני של גורמי רגולטוריים המשוערת מעורב מנגנון התפתחותי נחקר. נתוני מסך ו / או QPCR דיפרנציאל הם כלים חשובים, אבל הם יכולים להיות מטעים. אישור עם הר שלם הכלאה באתרו כי הגן של העניין מתבטא בשטח שבו מסלול האיתות פעיל מונע בזבוז של זמן ומשאבים. בנוסף, נתונים אלה מאפשרים תחזיות להתבצע על הארכיטקטורה של בקרת הגנים, אשר תודיע ניתוחים מפורטים יותר כי יעברו פעם השחקנים המעורבים מזוהים עם assay הראשוני הזה (איור 2). אנו מציגים פתיle assay colorimetric בפרוטוקול זה; עם זאת, ניאון הכלאה באתרו (FISH) יכול לשמש גם כדי להמחיש כמה בדיקות ניאון בעת ובעונה אחת, ומאפשר טיפול רזולוציה מרחבית משופרת בתוך שטחה של עניין, כמו גם confocal מיקרוסקופיה 24. בנוסף, FISH ניתן לזווג עם מכתים נוגדן לזהות שלאחר translational שינויים ו / או שם מסלול האיתות של עניין הוא 24 פעילים.

ישנם שני שלבים קריטיים בפרוטוקול כי הם לעתים קרובות התעלמו. אחת היא הכנת הפתרון oligonucleotide morpholino. חשוב לחמם את פתרון morpholino ב 65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות עד 5 דקות ו צנטריפוגות זה במלוא המהיר לפחות 10 דקות לפני טעינת מחטי ההזרקה. צעדים אלה חיוניים כאשר מניות הפתרון morpholino מאוחסן ב -20 ° C כי oligonucleotides morpholino יכול לזרז מהפתרון ב קור נמוךatures ואת ספינינג של הפתרון מונע מחטי הזרקה מלהיות סתומים על ידי חלקיקים. עוד היבט קריטי להביא בחשבון כי עוברים צריך להיות מעורב באופן יסודי לתוך פתרונות שונים במהלך כל שלב של קיבעון בפרוטוקולים הכלאה באתרו. בידיים שלנו, את האות מצטמצם ו / או ברקע הוא גדל אם שלב זה פשוט לא מבוצע.

אולי ההיבט החשוב ביותר של המתודולוגיה המוצגת כאן הוא בכך שהיא מאפשרת עבור ניתוחים תפקודיים יעילים של קבוצות גדולות של מולקולות הולכים אותות פוטנציאל שנוצרו על ידי transcriptomics ו פרוטאומיקה הדור הבא. לאחר ניתוחים תפקודיים הראשוניים אלה מאשרים קבוצה של גורמי רגולטוריים מעורבים מסלול של ריבית, האתגר הבא הוא להשתמש מבחנים ומבוססים (כגון knockdowns הפונקציונלי; צבעוניות מפורטת הר שלם באתרו; אינטראקציות ביוכימי) להעריך כיצד הם משתלבים extracelluLar, תאיים, ורמות תעתיק של מסלולי העברת אותות מעורבים בתהליך התפתחותי מסוים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino Gene Tools LLC Customized More information at www.gene-tools.com
Glycerol Invitrogen 15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate) Invitrogen, Life Technologies D1821 Make 25 mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710
MOPS Sigma Aldrich M1254-250G
Tween-20 Sigma Aldrich 23336-0010
Formamide Sigma Aldrich 47671-1L-F
Yeast tRNA Invitrogen 15401-029
Normal Goat Serum Sigma Aldrich G9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody Roche 11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole) Sigma Aldrich L9756-5G
Tris Base UltraPure Research Products Internationall Corp 56-40-6
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Magnesium chloride Sigma Aldrich 7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate Roche 11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT) Roche 11 383 213 001
Dimethyl Formamide Sigma Aldrich D4551-500mL
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541-5KG
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761-500G
Magnesium Sulfate Sigma Aldrich M7506-2KG
Calcium Chloride Sigma Aldrich C1016-500G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erwin, D. H., Davidson, E. H. The evolution of hierarchical gene regulatory networks. Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).
  2. Peter, I. S., Davidson, E. H. Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development. Cell. 144, 970-985 (2011).
  3. Borggrefe, T., et al. The Notch intracellular domain integrates signals from Wnt, Hedgehog, TGFbeta/BMP and hypoxia pathways. Biochimica et biophysica acta. 1863, 303-313 (2016).
  4. Range, R. C., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Integration of canonical and noncanonical Wnt signaling pathways patterns the neuroectoderm along the anterior-posterior axis of sea urchin embryos. PLoS Biol. 11, e1001467 (2013).
  5. Cleary, M. A., van Osch, G. J., Brama, P. A., Hellingman, C. A., Narcisi, R. FGF, TGFbeta and Wnt crosstalk: embryonic to in vitro cartilage development from mesenchymal stem cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 9, 332-342 (2015).
  6. Lapraz, F., et al. RTK and TGF-beta signaling pathways genes in the sea urchin genome. Dev Biol. 300, 132-152 (2006).
  7. Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. The evolution of signalling pathways in animal development. Nature reviews. Genetics. 4, 39-49 (2003).
  8. Sethi, A. J., Wikramanayake, R. M., Angerer, R. C., Range, R. C., Angerer, L. M. Sequential signaling crosstalk regulates endomesoderm segregation in sea urchin embryos. Science. 335, 590-593 (2012).
  9. Range, R. Specification and positioning of the anterior neuroectoderm in deuterostome embryos. Genesis. 52, 222-234 (2014).
  10. Petersen, C. P., Reddien, P. W. Wnt signaling and the polarity of the primary body axis. Cell. 139, 1056-1068 (2009).
  11. Lapraz, F., Haillot, E., Lepage, T. A deuterostome origin of the Spemann organiser suggested by Nodal and ADMPs functions in Echinoderms. Nature communications. 6, 8434 (2015).
  12. Kikuchi, A., Yamamoto, H., Sato, A. Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways. Trends in cell biology. 19, 119-129 (2009).
  13. Hogan, B. L. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, 1580-1594 (1996).
  14. Houart, C., et al. Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling. Neuron. 35, 255-265 (2002).
  15. Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
  16. Rottinger, E., Lowe, C. J. Evolutionary crossroads in developmental biology: hemichordates. Development. 139, 2463-2475 (2012).
  17. Genome Sequencing Sea Urchin, C., et al. The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
  18. Ben-Tabou de-Leon, S., Su, Y. H., Lin, K. T., Li, E., Davidson, E. H. Gene regulatory control in the sea urchin aboral ectoderm: spatial initiation, signaling inputs, and cell fate lockdown. Dev Biol. 374, 245-254 (2013).
  19. Saudemont, A., et al. Ancestral regulatory circuits governing ectoderm patterning downstream of Nodal and BMP2/4 revealed by gene regulatory network analysis in an echinoderm. PLoS Genet. 6, e1001259 (2010).
  20. Cameron, R. A., Samanta, M., Yuan, A., He, D., Davidson, E. SpBase: the sea urchin genome database and web site. Nucleic Acids Res. 37, D750-D754 (2009).
  21. Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50841 (2014).
  22. Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods in cell biology. 74, 287-310 (2004).
  23. Arenas-Mena, C., Cameron, A. R., Davidson, E. H. Spatial expression of Hox cluster genes in the ontogeny of a sea urchin. Development. , 4631-4643 (2000).
  24. Sethi, A. J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Multicolor labeling in developmental gene regulatory network analysis. Methods in molecular biology. , 249-262 (2014).
  25. Wikramanayake, A. H., Huang, L., Klein, W. H. beta-Catenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9343 (1998).
  26. Yaguchi, S., Yaguchi, J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. A Wnt-FoxQ2-nodal pathway links primary and secondary axis specification in sea urchin embryos. Dev Cell. 14, 97-107 (2008).
  27. Molina, M. D., de Croze, N., Haillot, E., Lepage, T. Nodal: master and commander of the dorsal-ventral and left-right axes in the sea urchin embryo. Curr Opin Genet Dev. 23, 445-453 (2013).
  28. Range, R. C., Glenn, T. D., Miranda, E., McClay, D. R. LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo. Development. 135, 2445-2454 (2008).
  29. Range, R., et al. Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1. Development. 134, 3649-3664 (2007).
  30. Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin. Dev Biol. 411, 314-324 (2016).
  31. Rottinger, E., et al. FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development. Development. 135, 353-365 (2008).
  32. Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin. Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).
  33. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology. Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).
  34. Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm. PLoS Genet. 12, e1006001 (2016).
  35. Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo. Dev Cell. 6, 397-410 (2004).
  36. Bradham, C. A., et al. Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos. Dev Biol. 328, 221-233 (2009).
  37. Su, Y. H. Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos. Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).
  38. Lin, C. Y., Su, Y. H. Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system. Dev Biol. 409, 420-428 (2016).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 120 קיפודי ים דפוסי neuroectoderm Wnt הולכים אותות קדמית אחורי אבולוציה שניונית פה רשתות רגולטוריות גן קצב העברת נתונים גבוהים,
כוחה של פשטות: עובר קיפוד ים כמו<em&gt; ב Vivo</em&gt; מודלים התפתחותי לימוד Cell ל-תא קומפלקס אינטראקציות רשת איתות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Range, R. C.,… More

Range, R. C., Martinez-Bartolomé, M., Burr, S. D. The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions. J. Vis. Exp. (120), e55113, doi:10.3791/55113 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter