Summary
이 비디오 기사는 체계적이고 효율적으로 많은 무척추 동물 배아에서 복잡한 신호 전달 경로 및 규제 네트워크의 구성 요소를 특성화하는 데 사용할 수있는 생체 방법론에 직접적인을 자세히 설명합니다.
Introduction
유전자 조절 네트워크 (GRNs) 신호 전달 경로는 성인 동물 신체 계획을 작성하는 데 사용되는 배아 발달 동안 유전자의 시공간적 식을 설정. 세포 간 신호 전달 경로는 세포가 통신하는 수단을 제공하는 이러한 규제 네트워크의 필수적인 구성 요소이다. 이러한 세포의 상호 작용을 수립하고 배아 1, 2 중에 다양한 지역과 중 규제 및 분화 유전자의 발현을 수정. 세포 외 분비 조절제 (리간드 길항제) 수용체 공동 수용체 간의 상호 작용은 신호 전달 경로의 활동을 제어한다. 세포 내 분자의 구색은 세포의 변형 된 유전자 발현, 분할 및 / 또는 형상의 결과로 이러한 입력을 transduces. 주요 경로에있는 세포 및 세포 수준에서 사용되는 키 분자의 대부분은 있지만공지 그것은 개개 신호 경로의 복잡성으로 인해 많은 부분에서 불완전한 지식이다. 또한, 다른 신호 경로는 종종 세포, 세포 내에서 양 또는 음 중 서로 상호 작용하고 전사 레벨 3, 4, 5, 6. 중요한 신호 전달 경로의 중심 구성 요소는 고도로 모든 후생 동물 종에서 보존하고, 특히 관련성 phyla의 발 미생물과 비교하면 현저하게 중요한 신호 전달 경로의 대부분은 종종 많은 종에서 유사한 발달 기능을 수행하는 7, 8, 9, 10, 11.
개발하는 동안 신호의 연구는 모든 생물의 발굴 작업이며,이척추 동물에서 큰 가능한 리간드 및 수용체 / 공동 변조기 상호 작용의 수, 세포 내 전달 분자뿐만 아니라, 거기에 1) : 가장 후구 동물 모델 (척추 동물, 무척추 척색, 반삭 동물 및 극피)의 신호 전달 경로를 연구하는 몇 가지 중요한 문제는 때문에 유전체 (12, 13), (14)의 복잡도에 서로 다른 신호 경로들 사이의 상호 작용 가능성; 2) 척추 동물의 복잡한 형태와 형태 형성의 움직임은 종종 더 어렵게 및 신호 전달 경로 사이에서 상호 작용을 해석 할 수 있도록; 3) 대부분의 비 극피 동물 무척추 동물의 후구 동물 모델 종의 분석은 일부 피막이 종 (15, 16)를 제외하고 임신 횟수의 짧은 창으로 제한됩니다.
그만큼성게 배아 상술 제한 몇 가지며 생체 내 신호 전달 경로의 상세한 분석을 수행하기 위해 많은 독특한 특성을 제공한다. 이들은 다음을 포함한다 : 1) 성게 게놈의 상대적 단순성 크게 가능한 리간드, 수용체 / 공동 수용체 및 세포 내 전달 분자의 수를 감소시킨다 (17)과의 상호 작용; 2) 세균 층 및 주요 배아 축 사양 및 패턴을 제어하는 GRNs 잘 신호 (18), (19) 수신 셀 / 지역의 규제 문맥의 이해를 돕고, 성게 배아 년에 설립된다 배아가 그 형태를 분석하기 쉽다 단층 상피 구성 때 3) 다수의 신호 전달 경로는 초기 및 절단 낭배 단계 사이 연구 될 수있다 4) 분자를 포함쉽게 조작하는 성게의 신호 전달 경로에서 D; 5) 많은 성게는 10 ~ 11 개월 년 (예 : Strongylocentrotus의 purpuratus 및 Lytechinus의 variegatus)에 대한 임신하는됩니다.
여기서 우리는 체계적이고 효율적으로 지정하고 성게 배아의 패턴 영역이 여러 무척추 동물 모델 시스템은 복잡한 분자 메커니즘의 연구에 제공하는 이점을 설명하기 위해 신호 전달 경로의 구성 요소를 특성화 할 수있는 방법을 제시한다.
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Protocol
1. 높은 처리량 모르 폴리 노 디자인 전략
- 관심의 유전자 (들) (예를 들어 후보 유전자 접근 방식, 시스 - 규제 분석, RNAseq 및 / 또는 단백체 차동 화면)를 확인합니다.
- 자주 업데이트되는 웹 사이트에서 게놈, transcriptomic 및 유전자 발현 데이터를 사용 (예 : SpBase http://www.echinobase.org (20)와 S. purpuratus 게놈 검색에 http : ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html)을 시공간 발현 프로파일이 문제의 발달 메커니즘과 겹치는 것을 확인합니다. 어떤 발현 데이터가 없다면, qPCR에 프라이머를 생성 및 / 또는 인 시츄 프로브는 안티센스 유전자 발현 패턴을 평가.
- 시공간 발현 패턴을 결정한 후, 게놈 웹 사이트로부터의 DNA 서열을 얻었다.
- 번역 차단 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드를 생성하는 오 시퀀스를 획득F 5 '비 - 번역 영역 (5'UTR) 직접 상류에서 SpBase 또는 S. purpuratus 게놈 검색 웹 사이트에서 표현 된 시퀀스 태그 (EST) 데이터베이스에서 개시 코돈. 이 정보가 관심의 유전자를 사용할 수없는 경우, 다음 5 'RACE를 수행합니다.
- , 스플 라이스 차단 모르 폴리 노를 설계 엑손과 SpBase 또는 S. purpuratus 게놈 검색 도구의 발판 BLASTN 도구를 사용하여 인트론을 포함하여 게놈 시퀀스를 검색합니다.
- 목적하는 25 염기 쌍 모르 시퀀스를 설계하기 위해, 올리고 뉴클레오티드 설계 사이트 http://oligodesign.gene-tools.com를 사용한다.
- 병진 차단 모르 들어 병진 표적 서열의 소스로 '3'(5)로부터의 mRNA 서열을 사용한다. 5 'UTR 서열 (전사 시작 사이트의 상류 약 70 뉴클레오티드) 플러스 마크 위스콘신 코돈 시작으로 (시작 사이트의 다운 스트림) 코딩 영역의 25 기지를 포함번째 괄호 (ATG).
- 스플 라이스 차단 모르 들면, 인트론 - 엑손 또는 인트론 - 엑손 경계 시퀀스를 선택하고, 경계 영역 50 염기 (엑손 서열 25 염기 및 인트론 서열 25 염기)를 포함한다. 순서가 고유한지 확인 모르 폴리 노 서열과 게놈을 스캔합니다.
모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드 2. 미세 주입
- 300 nmol의 모르 폴리 노의 바이알에 클레아없는 물 100 μL를 첨가하여 폴리 노 올리고 뉴클레오티드의 3 mM의 스톡 용액을 준비한다.
참고 : 디 에틸 피로 카보네이트는 모르 폴리 노를 손상시킬 수 있기 때문에 재 현탁액에 대한 DEPC 처리 된 물을 사용하지 마십시오. - 최고 속도로 30 초에 대한 재고 올리고 뉴클레오티드 용액이 들어있는 유리 병 아래 첫 번째 재구성 스핀 - 5 ~ 10 분, 짧게 소용돌이 65 ° C에서 (14,000 16,000 XG), 간단히 소용돌이, 열, 룸에서 모르 폴리 노의 재고를 유지 적어도 1 시간 동안 온도. 모르 폴리 노 원액 들 +4 ℃로 -20 ° C에서 저장됩니다.
- 원하는 농도 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오타이드를 포함하는 주사 솔루션을 준비합니다. 이 솔루션은 일반적으로 20 % 글리세롤 또는 캐리어 125 밀리미터의 KCl 15 % (형광 염료 덱스 트란 10,000 MW 2.5 밀리그램 / μL 원액) FITC-덱스 트란이 포함되어 있습니다. FITC 덱스 트란 등의 형광 덱스 트란 접합체 일상적 표면 형광 현미경으로 주입 된 배아를 식별하는 데 사용된다. -20 ℃에서 보관 주사액.
- 5 분 - 적어도 2 열 블록 또는 수욕에서 65 ° C에서 모르 용액을 가열한다.
- 적어도 10 분 - (16,000 XG 14,000) 최고 속도로 1 분간 원심 분리를위한 - (16,000 XG 14,000), 소용돌이 짧게 모르 폴리 노의 최고 속도에서 30 초 동안 솔루션을 스핀.
- 모르 폴리 노 용액 주입 바늘을 넣습니다. 자세한 미세 주입 프로토콜 Stepicheva과 노래 2014 년 21 환호와 Ettensohn 2004를 참조하십시오"> 22.
S. purpuratus 태아에서 24 시간 후 수정 (HPF)에서 3. 고정하고 제자리 프로토콜에서
참고 :이 프로토콜은 아레나스 - 메나 등에서 수정됩니다. 2000 년 23 세티 등. 2014 년 24.
- 정착
- , 배아를 포함하는 웰 (아래 참조) 정착의 몇 방울을 추가 피펫으로 부드럽게 혼합하고, 그들이 정착 할 수 있습니다. 정착액 솔루션을 제거하고 고정액의 두 개의 추가 180 μL 세척과 배아를 혼합한다.
참고 : 철저하게 부드러운 피펫 위아래로 몇 번으로 세척하는 동안 배아를 혼합하는 것이 중요하다. 그렇지 않으면 신호 대 잡음비를 낮출 수있다. - pH를 7.0 10mM의 MOPS로 구성된 4 % 전자 현미경 등급 파라 포름 알데히드 실온에서 50 분 시간 1에 대한 두 번째 정착액 세척 (RT)에 수정 배아를 남겨, 0.1 % 트윈 20, 인공 seawateR (ASW). 최상의 결과를 위해 각 시간이 솔루션은 신선합니다. 또한, 편의성과 실용성 배아 96 웰 플레이트에 고정되어있다.
- 20 ML의 정착액 사용 5 mL의 16 % 파라 포름 알데히드, 15 mL의 ASW, 200 μL 1 M MOPS pH를 7.0, 20 μL 트윈 20.
- MOPS 180 μL에 실온에서 5 회 반복한다 0.1 M MOPS pH를 7.0, 0.5 M의 NaCl 및 트윈 20 적어도 5 분 동안 또는 배아 때까지이 우물의 바닥에 떨어 0.1 %로 구성된 버퍼를 씻는다. 다시, 충분히 부드럽게 피펫 팅하여 여러 번 아래 세척 완충액으로 배아를 혼합하는 것이 중요하다. (4)에 저장된 경우 MOPS 세척 완충액을 2 일 동안 사용될 수있다 기음.
- 40 mL를 들어 MOPS 버퍼 사용 4 mL의 1 M MOPS pH를 7.0, 4 ㎖의 5 M NaCl을 32 mL의 DH 2 O, 40 μL 트윈 20을 씻는다.
- 고정 배아 2 일 동안 4 ℃로 저장 될 수있다.
주 : 이상 고정 된 배아를 저장하는 경우, 박테리아 성장을 방지하기 위해 버퍼 워시 MOPS에 0.2 % 아 지드 화 나트륨을 추가한다.
- , 배아를 포함하는 웰 (아래 참조) 정착의 몇 방울을 추가 피펫으로 부드럽게 혼합하고, 그들이 정착 할 수 있습니다. 정착액 솔루션을 제거하고 고정액의 두 개의 추가 180 μL 세척과 배아를 혼합한다.
- 사전 하이브리드
- MOPS는 버퍼 워시 기음과 2의 180 μL를 추가, 하이브리드 버퍼에 버퍼 부드러운 피펫 몇 배 용액에 배아를 혼합하고 실온에서 적어도 20 분 동안 품어 씻어 MOPS의 1의 비율. 혼성화 완충액 70 % 포름 아미드, 0.1 M MOPS pH를 7.0, 0.5 M NaCl을 구성, 1 ㎎ / ㎖의 BSA, 0.1 % 트윈 -20.
- 40 mL의 하이브리드 버퍼 사용 4 mL의 1 M MOPS pH를 7.0, 4 ㎖의 5 M NaCl을, 4 mL의 DH 2 O, 0.04 g의 BSA, 40 μL 트윈 20. , 텍싱에 의해 잘 섞는다 다시 28 mL의 포름 아미드, 및 소용돌이를 추가합니다.
- MOPS 세척 및 하이브리드 버퍼의 1의 비율과 1의 180 μL를 추가 : 2를 제거, 하이브리드 버퍼에 버퍼 용액에 배아를 혼합하고 실온에서 적어도 20 분 동안 품어 씻어 MOPS 2 비율.
- 하이브리드 버퍼 150 μL - 프로브 하이브리드 부드럽게 (100)에 배아를 혼합하기 전에. 적어도 1, 50 ° C에서 배아 부화시간.
참고 : 하룻밤 배아를 배양하는 것은 허용됩니다. 배양 전에 증발을 방지하기 위해 접착 시트 웰을 밀봉.
- MOPS는 버퍼 워시 기음과 2의 180 μL를 추가, 하이브리드 버퍼에 버퍼 부드러운 피펫 몇 배 용액에 배아를 혼합하고 실온에서 적어도 20 분 동안 품어 씻어 MOPS의 1의 비율. 혼성화 완충액 70 % 포름 아미드, 0.1 M MOPS pH를 7.0, 0.5 M NaCl을 구성, 1 ㎎ / ㎖의 BSA, 0.1 % 트윈 -20.
- 이종 교잡
- 프로브 솔루션을 만들 부드럽게 한 다음, 하이브리드 버퍼에 소용돌이를 0.3 프로브의 NG / μL 500 μg의 / mL의 효모의 tRNA - 별도의 튜브에 0.1를 추가합니다. 효모의 tRNA는 안티센스 프로브의 비특이적 결합을 감소 시키도록 프로브 용액에 첨가된다. 이 50 ° C의 솔루션 및 흡인 하이브리드 버퍼를 예열.
- 프로브 용액 100 μL에 미리 혼성화 된 배아 믹스 접착 시트로 밀봉하고, 상기 프로브에 따라 2 내지 7 일 동안 50 ° C에서 혼성화합니다 (foxq2 프로브 2 일 동안 배양 될 수있다).
참고 : 배양 시간은 프로브를 따라 달라질 수 있습니다. 낮은 수준으로 발현 일부 유전자는 7 일 동안 배양까지 필요로한다. 96- 웰 플레이트는 ADHES 경우 증발에 대하여 보험 등 습도 상자에 배치 될 수있다필자 시트가 제대로 밀봉되지 않습니다. - 갓 만든 MOPS 180 μL와 50 ° C에서 5 회 반복 3 시간 총 버퍼를 씻는다. 이어서, MOPS의 μL 실온에서 세척 완충액 (180)으로 3 회 (15 분) 세척 하였다. 세척에 배아 부드럽게 여러 번 피펫 팅에 의해 때마다 버퍼 혼합해야합니다.
- 항체 배양
- MOPS는 버퍼 워시 대기음 10 % 정상 양 혈청 5 밀리그램으로 구성된 버퍼를 차단의 180 μL에 배아를 혼합 / 버퍼 하룻밤 실온에서 적어도 45 분 4 ° C에 대해 품어 씻어 MOPS에서 ㎖의 BSA.
- 버퍼를 차단 제거한 다음 1 포함하는 버퍼 차단으로 배아를 혼합 : 버퍼를 차단에 희석 알칼리 포스 파타 아제 접합 된 항 - 디그 옥시 제닌 항체의 1,500 희석. 증발을 방지하기위한 밀봉 판에 RT에서 밤새 인큐베이션. 참고 : 하룻밤 이상에서 항체를 두지 마십시오.
- 배아 6 번 씻으 (5 분 또는 배아가 떨어질 때까지) MOPS에 실온에서 버퍼를 씻는다. 배아 수4 ℃에서 하룻밤 저장 될 수있다.
- 현장 개발
- 0.1 M 트리스의 pH 9.5, 100 mM의 염화나트륨, 50 mM의의 MgCl 2, 1 ㎜의 levamisole로 구성된 갓의 pH 9.5 완충액으로 실온에서 배아 3 회 (10 분) 세척하고, 0.1 % 트윈 20.
- 20 ㎖의 pH 9.5 버퍼 사용 2 mL의 1 M 트리스 산도 9.5, 400 μL 5M NaCl을 1 mL의 1 M의 MgCl 2, 20 μL 트윈 20, 16.6 mL의 DH 2 O, 및 0.0048 g의의 levamisole.
- 빛으로부터 보호 염색 버퍼에 37 ° C에서 배아를 품어. 염색 완충액 10 %의 디메틸 포름 아미드로 구성 4.5 μL / ㎖ 4- 니트로 블루 테트라 졸륨 클로라이드 (NBT) 및 갓의 pH 9.5 완충액 3.5 μL / ㎖의 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 일 포스페이트 (BCIP) .
- 염색 버퍼의 한 ML 100 μL 디메틸 포름 아미드, 4.5 μL NBT, 3.5 μL의 BCIP를 사용합니다.
- MOPS에 3 ~ 5 회 세척하여 알칼리 포스 파타 아제 반응을 중지 버퍼를 씻는다. 반응 위스콘신foxq2 프로브는 일반적으로 1 시간 30 분 소요 번째. 일부 프로브는 RT 4 °에 C 중 하나에서 하룻밤 배양을해야 할 수도 있습니다.
- 70 % MOPS 세척 30 % 글리세롤의 솔루션으로 배아를 섞는다. 글리세롤 현미경 필요한 굴절률을 제공한다. 배아 몇 주 동안이 용액에 저장 될 수있다. 증발을 방지하기 위해 플라스틱 파라핀으로 판을 밀봉합니다.
- 0.1 M 트리스의 pH 9.5, 100 mM의 염화나트륨, 50 mM의의 MgCl 2, 1 ㎜의 levamisole로 구성된 갓의 pH 9.5 완충액으로 실온에서 배아 3 회 (10 분) 세척하고, 0.1 % 트윈 20.
- 슬라이드 준비 및 이미지 캡처
- 슬라이드 위에 스트립 사이의 작은 틈으로 삼각형에 양면 테이프의 세 개의 작은 스트립을 배치하여 슬라이드를 준비합니다.
- 삼각형의 중심에 70 % MOPS 세척하고 30 %의 글리세롤 용액에서 배아를 전송하고, 커버 슬립으로 덮고.
- 커버 슬립의 가장자리 주위 매니큐어의 층을 도포하여 커버 슬립을 밀봉.
- 20 배의 대물 렌즈와 연결된 카메라 복합 광학 현미경을 사용하여 이미지를 캡쳐.
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Representative Results
성게 배아에서 우리는 3 가지의 Wnt 신호 지점 (이 Wnt / β-catenin이,이 Wnt / JNK와의 Wnt / PKC) 4, 25 상호 작용은 전후방 (AP) 패턴에 적용의 Wnt 신호 전달 네트워크를 형성하는 것으로 나타났습니다. 이러한 시그널링 이벤트의 가장 중요한 결과 중 하나는 초기 넓게 표현 전방 neuroectoderm (ANE) GRN가 낭배의 시작 (S.의 purpuratus HPF 24)에 의해 전방 기둥 주위의 작은 영역에 제한된다 있다는 것이다. 이러한 결과는이 Wnt / β-catenin의 신호가 32 세포 단계에서 배아의 후방 절반 ANE 유전자의 활성화를 방지 함을 나타냅니다. 그리고,이 경로는 점진적으로 아래로 60 세포 단계 초기 낭배의 배아의 앞쪽 절반에 ANE GRN을 조절 비표준의 Wnt / JNK 신호 경로로 신호를 중계한다. 마지막으로, 세 번째 비정규이 Wnt의 pathwaY,이 Wnt / PKC가 신호 전달 경로의 Wnt / JNK를 길항하고 전방 극의 주위에 (그림 1A)을 ANE 사양을 제거 할 수없는 4.
우리는 ANE의 GRN 활성화 처음 두 개의 유전자들 중 하나이기 때문에 AP 패터닝 동안 Wnt 신호 분기의 각각의 활성에 대한 분석하기 foxq2의 시공간 식을 사용하고 쉽게 때문에 강력한 발현 원위치 혼성화에 의해 평가되고 26. 개인 Wnt 신호 분기가 교란되면, 관련되는 경로를 나타내는 명확한 표현 표현형이 있습니다 : 1) 다양한 모성 규제기구 (그림 1A)를 신호의 Wnt / β-catenin이의 부재에서 전체 배아에 걸쳐 foxq2 발현을 활성화 (그림 1BB); 2)의 Wnt / JNK 신호 foxq2의 부재를 통해 표현된다배아 (그림 1Bc)의 앞쪽 절반은 있지만 여전히 아래로 인해이 Wnt / β-catenin의 신호 (그림 1A)의 활동에 후방 반으로 조절된다; 의 Wnt / β-catenin이와 신호 전달 경로의 Wnt / JNK는 최대 4, 25을 규제하고 있기 때문에이 Wnt / PKC 신호 foxq2 식의 부재에서 완전히, 배아 (그림 1Bd)를 통해 조절된다. 따라서, 우리는 우리가 우리의 체계적인 워크 플로우 (그림 2)와 결합 될 때, 우리는 효율적으로 파악하고 관심의 유전자가 하나 또는이 Wnt의 이상에 관련되어 있는지 여부를 테스트 할 수 있도록 foxq2 전사 판독 시스템을 명명 한 분석법을 개발했다 가지 신호.
여기에 제시된 방법론과 foxq2 판독 시스템을 사용하여, 우리는 몇 가지 추정되는 세포 또는 세포 내 molec을 확인했다ules은 가능성이 그림 3에 제시된 네 개의있는 AP 축 사양을 지배하는이 Wnt 네트워크에 참여. 전사 인자, ATF2 또는 분비 세포의 Wnt 변조기 중 하나의 표현에서는 Wi-1 넉다운 설계 morpholinos 주입 배아 초기 낭배 단계에서 배아 극부 향해 foxq2 식의 팽창을 나타내었다 (도 3A - C ). 이러한 결과는 아래 배아의 앞쪽 절반에 ANE GRN의 발현을 조절하는 것이 필요하다이 신호 분기의 구성원이라는 것을 시사의 Wnt / JNK 신호 전달 경로의 회원이 아래로 4, 25 기절 할 때 관찰 된 표현형을 모방. 반대로 foxq2 발현 우리는 전사 인자, NFAT (도 3d)의 발현을 녹다운 때 제거하고, 분비 된 세포 외 변조기 sFRP3 / 4 (도 3E),이러한 분자의 Wnt / JNK 신호에 의해 ANE GRN의 다운 규제를 길항하는 것이 필요하다의 Wnt / PKC 경로에 관여하는 것을 시사한다. 이 빠른 속도로 얻은 결과를 바탕으로 우리는 지금 성게 배아에서 AP 패터닝에 적용되는 GRN에 참여 진화하는 Wnt 신호 네트워크 내에서 이러한 요소를 배치합니다 자세한 기능 분석을 수행 할 수 있습니다.
그림 1. AP 사양 및 패터닝 성게에서와 foxq2 전사 판독 시스템의 모델입니다. (A) (9), 텍스트 및 4에 설명 된 Wnt 신호 네트워크에 의해 전방 극 주변 지역에 ANE GRN의 아래로 진보적 인 규제. (나)의 transcriptiona지시의 Wnt 경로의 knockdowns (KO)에 foxq2 식을 보여주는 리터 판독 시스템. 스케일 바는 20 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
성게 배아에서 효율적인 대한 Wnt 네트워크 분석 2. 실험 흐름도를 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
의 Wnt 네트워크 집행 AP 축 사양 및 패터닝에 관여 그림 3. 신호 전달 분자는 사용하여 확인 된 foxq2 전사 판독 시스템. (A, B, C) 모르 폴리 knockdowns는 세포 내 신호 변조기, ATF2, 분비 세포 변조기에서는 Wi-1 상기의 Wnt / JNK 신호 전달 경로의 잠재적 플레이어임을 시사한다. (A, D, E) 녹다운 실험 NFAT, 세포 내 신호 변조기 및 sFRP3 / 4 분비 Wnt 신호 변조기, Fzl1 / 20 / 7 PKC 신호 전달에 관여하는 것으로 나타났다. 스케일 바는 20 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 방법은 .. 많은 연구소가 해부 일찍 성게 개발 과정에서 유사한 분석을 사용하는 기본적인 발달 메커니즘을 지배하는 신호 전달 경로와 GRNs을 이해하는 척추 동물보다 작은 게놈과 형태 학적 복잡성 배아를 사용하는 능력을 보여주는 예입니다 다른 세포 운명 사양 이벤트에 관련된 신호 전달 경로 (예 노치 헤지 호그, TGF-β의와 FGF 신호) 27, 28, 29, 30, 31. 이 성게 연구는 후구 동물 9, 27, 30 <사이에서 보존되는 초기 성게 개발을 관리하는 많은 흥미롭고 새로운 신호 메커니즘, 이러한 신호 전달 메커니즘의 여러 측면을 나타납니다 밝혀졌다SUP> 31, 32. 중요한 것은, 비 전통적인 후생 동물 배아의 발달 생물학의 탐사는 초기 개발 9, 15, 16, 33 중에 최근 몇 년 동안 증가하고, 성게 배아 이러한 공유 특성을 많이 보았다. 따라서, 여기에서 제시된 방법은 널리 초기 발달 동안 이러한 생물의 대부분의 신호 전달 경로의 연구에 적용될 수있다.
유전자 발현을 허물고 사용되는 모든 기술은 잠재적으로 오프 대상 효과를 허물고 생성 할 수 있습니다. 지역 사회가 엄격한 컨트롤은 최저 표현형이 아닌 특정 문제를 완화하기 위해 수행하기 때문에 Morpholinos는 많은 부분에서 성게 배아에서 매우 효과적인 유전자 섭동 방법으로 입증했다. 이러한 기본 제어 분석은 m 일 수있다odified 및 기타 최저 기술에 적용 (즉, 선명 / Cas9). 컨트롤은 : 1) 신중한 투여 량 반응 분석은 주입 배아 ≥ 80 % 불량 표현형 및 / 또는 마커 유전자의 발현을 표시 할 때까지 각각의 모르 수행된다; 그들은 적당한 농도의 심한 발달 지연 또는 사망을 일으킬 경우 2) Morpholinos은 삭제됩니다. 이 표현형은 독성 오프 대상 효과에 의한 가능성이있다; 3) 다른 결합 부위를 대상으로 설계되어 적어도 두 morpholinos는 최저 표현형을 확인하는 데 사용됩니다; 3) 과오 morpholinos는 주입; 4) 모르 폴리 노의 표현형은 모르 폴리 노 녹다운 배아에 대상 유전자의 mRNA를 도입하여 구출된다 5) 사용 가능, 전체 마운트 항체 염색 분석은 그 모르 폴리 노의 knockdowns 관심있는 유전자의 번역을 방지 표시하는 데 사용하는 경우. 성게 사회 과학자의 위치에 따라 기능 연구, 적어도 네 개의 종을 사용하는 것이 중요합니다. 미주리에서세인트 경우, 우리의 지식, 다양한 morpholinos (예를 들어 34, 35, 36, 37 신호 마디에 이러한 기능 연구 참조) 각 종에서 유사한 표현형을 생성 한 orthologs을 노크하는 데 사용됩니다. 이러한 결과는 우리의 엄격한 제어 실험을 강력히에 대상 넉다운 효과를 그 morpholinos을 위해 선택하는 것이 설득력있게 주장한다.
이 방법의 또 다른 중요한 측면은 신중 대부분 직접 고려하는 신호 전달 경로에 의해 활성화되는 전사 대상을 식별 할 수있다. 신호 전달 경로의 시공간 활성화하고 견고하게 발현 유전자의 다운 규제, foxq2은 개발 초기에 발생 성게 배아에서 배아 층과 축 사양 적용되는 GRNs 잘 때문에 우리가 여기에서 제공하는 예는 뜻밖이다-established. 따라서, 이러한 방법의 명백한 한계는 많은 경우에 개발의 후기 단계 동안 특정 영역에서 특정 신호 전달 경로의 활성을 넉다운 할 필요가있을 수 있다는 것이다. 이러한 한계를 극복하는 데 사용할 수 있습니다 지금 사용할 수있는 여러 가지 기술이있다 (예를 들면 사진 morpholinos, 또렷한 / Cas9 38, FACseq)도 유전자 조작 의무가없는 비 전통적인 모델 배아있다. 많은 경우에 시공간 식 쉽게 현저하게 높은 신호 대 잡음비를 갖는다 foxq2로 평가된다 관심의 신호 전달 경로 다운 스트림의 후보 유전자를 확인하는 것이 가능하지 않을 수도있다. 훨씬 낮은 신호대 잡음비와 유전자를 발견하는 것이 일반적이다. 다른 유전자 특정 분석에 사용할 수없는 경우, 목적 유전자에 대해 생성 시츄 프로브는 가능한 한 길게해야한다. 1000 염기쌍 이상 일반적으로 사용하는 프로브에S 크게 신호를 증가시키고 계내 분석에서 형광 색채의 노이즈를 감소시킨다.
여기서 관심있는 신호 전달 경로가 성립되는 시그널링 될 때, 다음으로 중요한 단계는 공간적, 연구중인 발전기구에 관련된 추정 조절 요소의 시간적 발현 양을 결정하는 것이다 나타내는 전사 분석법 일단. 차동 화면 및 / 또는 QPCR 데이터는 중요한 도구입니다,하지만 그들은 오해의 소지가 될 수 있습니다. 관심의 유전자가 신호 전달 경로가 활성화 영토 내에서 표현되는 현장 하이브리드에 전체 마운트로 확인하는 것은 시간과 자원의 낭비를 방지 할 수 있습니다. 또한, 이러한 데이터는 예측이 초기 분석 (그림 2)로 식별됩니다 관련된 선수 한 번 수행됩니다 더 자세한 분석 정보를 통보하는 유전자 규제 아키텍처에 대해 할 수 있습니다. 우리는 바보을 제시제작이 프로토콜의 비색 분석; 그러나 계내 혼성화 (FISH) 형광도 관심의 영역 내에서 공간 해상도 향상뿐만 아니라, 공 초점 현미경 (24)을 허용 동시에 여러 형광 프로브를 시각화 할 수있다. 또한, FISH는 번역 후 변형을 식별하는 항체 염색와 결합 될 수 있고 / 또는 관심의 신호 경로 (24)가 활성이다.
종종 간과되는 프로토콜의 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 하나는 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드 용액을 제조한다. 또한, 5 분 2 분 동안 65 ° C에서 모르 용액을 가열하고, 주사 바늘을 로딩하기 전에 적어도 10 분 동안 최고 속도로 원심 분리하는 것이 중요하다. 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드가 낮은 기질에서 용액으로부터 침전 할 수 있기 때문에 폴리 노 스톡 용액을 -20 ℃에서 보관하는 경우,이 단계는 필수적인atures 용액의 방사가 미립자에 의해 막히게되는 주사 바늘을 방지한다. 고려해야 할 또 다른 중요한 측면은 배아가 완전히 정착의 모든 단계에서와 현장 하이브리드 프로토콜의 다양한 솔루션에 혼합해야한다는 것입니다. 우리 손, 신호가 감소 및 / 또는 간단한 공정이 수행되지 않은 경우 백그라운드가 증가된다.
아마도 여기에 제시된 방법의 가장 중요한 측면은 차세대 transcriptomics 및 프로테오믹스 생성 전위 신호 전달 분자의 큰 집합의 효율적인 기능 분석을 가능하게한다는 것이다. 그들에 맞는 방법을 평가하기 위해 이러한 초기 기능 분석은 관심의 경로에 관여하는 조절 인자의 그룹을 확인하면, 다음 과제는 설립 분석 (생화학 적 상호 작용; 현장에서 자세한 멀티 전체 마운트 예를 들어 기능 knockdowns)를 사용하는 것입니다 extracelluLAR, 세포, 및 특정 발달 과정에 관여하는 신호 전달 경로의 전사 수준.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino | Gene Tools LLC | Customized | More information at www.gene-tools.com |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| FITC (dextran fluorescein isothiocyanate) | Invitrogen, Life Technologies | D1821 | Make 25 mg/mL stock solution |
| Paraformaldehyde 16% solution EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| MOPS | Sigma Aldrich | M1254-250G | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 23336-0010 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 47671-1L-F | |
| Yeast tRNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| Normal Goat Serum | Sigma Aldrich | G9023-10mL | |
| Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody | Roche | 11 093 274 910 | |
| Tetramisole hydrochloride (levamisole) | Sigma Aldrich | L9756-5G | |
| Tris Base UltraPure | Research Products Internationall Corp | 56-40-6 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 7786-30-3 | |
| BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate | Roche | 11 383 221 001 | |
| 4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT) | Roche | 11 383 213 001 | |
| Dimethyl Formamide | Sigma Aldrich | D4551-500mL | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541-5KG | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Magnesium Sulfate | Sigma Aldrich | M7506-2KG | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C1016-500G |
References
- Erwin, D. H., Davidson, E. H. The evolution of hierarchical gene regulatory networks. Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).
- Peter, I. S., Davidson, E. H. Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development. Cell. 144, 970-985 (2011).
- Borggrefe, T., et al. The Notch intracellular domain integrates signals from Wnt, Hedgehog, TGFbeta/BMP and hypoxia pathways. Biochimica et biophysica acta. 1863, 303-313 (2016).
- Range, R. C., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Integration of canonical and noncanonical Wnt signaling pathways patterns the neuroectoderm along the anterior-posterior axis of sea urchin embryos. PLoS Biol. 11, e1001467 (2013).
- Cleary, M. A., van Osch, G. J., Brama, P. A., Hellingman, C. A., Narcisi, R. FGF, TGFbeta and Wnt crosstalk: embryonic to in vitro cartilage development from mesenchymal stem cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 9, 332-342 (2015).
- Lapraz, F., et al. RTK and TGF-beta signaling pathways genes in the sea urchin genome. Dev Biol. 300, 132-152 (2006).
- Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. The evolution of signalling pathways in animal development. Nature reviews. Genetics. 4, 39-49 (2003).
- Sethi, A. J., Wikramanayake, R. M., Angerer, R. C., Range, R. C., Angerer, L. M. Sequential signaling crosstalk regulates endomesoderm segregation in sea urchin embryos. Science. 335, 590-593 (2012).
- Range, R. Specification and positioning of the anterior neuroectoderm in deuterostome embryos. Genesis. 52, 222-234 (2014).
- Petersen, C. P., Reddien, P. W. Wnt signaling and the polarity of the primary body axis. Cell. 139, 1056-1068 (2009).
- Lapraz, F., Haillot, E., Lepage, T. A deuterostome origin of the Spemann organiser suggested by Nodal and ADMPs functions in Echinoderms. Nature communications. 6, 8434 (2015).
- Kikuchi, A., Yamamoto, H., Sato, A. Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways. Trends in cell biology. 19, 119-129 (2009).
- Hogan, B. L. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, 1580-1594 (1996).
- Houart, C., et al. Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling. Neuron. 35, 255-265 (2002).
- Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
- Rottinger, E., Lowe, C. J. Evolutionary crossroads in developmental biology: hemichordates. Development. 139, 2463-2475 (2012).
- Genome Sequencing Sea Urchin, C., et al. The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
- Ben-Tabou de-Leon, S., Su, Y. H., Lin, K. T., Li, E., Davidson, E. H. Gene regulatory control in the sea urchin aboral ectoderm: spatial initiation, signaling inputs, and cell fate lockdown. Dev Biol. 374, 245-254 (2013).
- Saudemont, A., et al. Ancestral regulatory circuits governing ectoderm patterning downstream of Nodal and BMP2/4 revealed by gene regulatory network analysis in an echinoderm. PLoS Genet. 6, e1001259 (2010).
- Cameron, R. A., Samanta, M., Yuan, A., He, D., Davidson, E. SpBase: the sea urchin genome database and web site. Nucleic Acids Res. 37, D750-D754 (2009).
- Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50841 (2014).
- Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods in cell biology. 74, 287-310 (2004).
- Arenas-Mena, C., Cameron, A. R., Davidson, E. H. Spatial expression of Hox cluster genes in the ontogeny of a sea urchin. Development. , 4631-4643 (2000).
- Sethi, A. J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Multicolor labeling in developmental gene regulatory network analysis. Methods in molecular biology. , 249-262 (2014).
- Wikramanayake, A. H., Huang, L., Klein, W. H. beta-Catenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9343 (1998).
- Yaguchi, S., Yaguchi, J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. A Wnt-FoxQ2-nodal pathway links primary and secondary axis specification in sea urchin embryos. Dev Cell. 14, 97-107 (2008).
- Molina, M. D., de Croze, N., Haillot, E., Lepage, T. Nodal: master and commander of the dorsal-ventral and left-right axes in the sea urchin embryo. Curr Opin Genet Dev. 23, 445-453 (2013).
- Range, R. C., Glenn, T. D., Miranda, E., McClay, D. R. LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo. Development. 135, 2445-2454 (2008).
- Range, R., et al. Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1. Development. 134, 3649-3664 (2007).
- Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin. Dev Biol. 411, 314-324 (2016).
- Rottinger, E., et al. FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development. Development. 135, 353-365 (2008).
- Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin. Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).
- Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology. Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).
- Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm. PLoS Genet. 12, e1006001 (2016).
- Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo. Dev Cell. 6, 397-410 (2004).
- Bradham, C. A., et al. Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos. Dev Biol. 328, 221-233 (2009).
- Su, Y. H. Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos. Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).
- Lin, C. Y., Su, Y. H. Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system. Dev Biol. 409, 420-428 (2016).
