Summary
Deze video artikel beschrijft een eenvoudige in vivo methodiek die gebruikt kunnen worden om systematisch en efficiënt te karakteriseren componenten van complexe signaalwegen en regulatorische netwerken in vele ongewervelde embryo's.
Introduction
Gen regulerende netwerken (GRNs) en signaaltransductiewegen stellen de ruimtelijke en temporele expressie van genen tijdens de embryonale ontwikkeling die worden gebruikt om het volwassen dier lichaam kunnen samenstellen. Cel-tot-cel signaaloverdracht zijn essentiële componenten van deze regulerende netwerken die het mogelijk maakt waarbij cellen communiceren. Deze cellulaire interacties vast te stellen en verfijnen van de expressie van de regelgevende en differentiatie genen in en tussen de verschillende gebieden tijdens de embryogenese 1, 2. Interacties tussen uitgescheiden extracellulaire modulatoren (liganden, antagonisten), receptoren en co-receptoren controle over de activiteiten van signaaltransductieroutes. Een assortiment van intracellulaire moleculen transduceert deze ingangen resulteert in veranderde genexpressie, delen en / of vorm van een cel. Hoewel veel van de sleutelfactoren die de extracellulaire en intracellulaire niveaus in grote pathwaybekend is, is een onvolledige kennis grotendeels te danken aan de complexiteit van afzonderlijke signaalpaden. Bovendien hebben verschillende signaalwegen vaak met elkaar positief of negatief in de extracellulaire intracellulaire en transcriptionele niveau 3, 4, 5, 6. Belangrijk is dat de kerncomponenten van signaaltransductiewegen sterk geconserveerd in alle metazoan soort en, opmerkelijk meeste grote signaalwegen voeren vaak dezelfde ontwikkelingsfunctie in vele species bij vergelijking organismen van nauw verwante phyla name 7, 8, 9, 10, 11.
De studie van signalering tijdens de ontwikkeling is een enorme taak in elk organisme, en erzijn verscheidene belangrijke uitdagingen voor het bestuderen signaalwegen meeste nieuwmondigen modellen (gewervelde, ongewervelde chordates, hemichordaten en stekelhuidigen): 1) In vertebraten er grote aantallen mogelijke ligand en receptor / co-modulator interacties intracellulaire transductie moleculen, alsmede mogelijke interacties tussen verschillende signaalwegen vanwege de complexiteit van het genoom 12, 13, 14; 2) Het complex morfologie en morfogenetische mutaties in gewervelden vaak moeilijker om functionele interacties in en tussen signaaltransductieroutes interpreteren; 3) Analyses in de meeste niet-echinoderm invertebrate nieuwmondigen model soorten worden beperkt door korte vensters van graviditeit met uitzondering van enkele soorten manteldier 15, 16.
Dezeeëgel embryo enkele van de hierboven genoemde beperkingen en biedt een uitstekende eigenschappen voor het uitvoeren van een gedetailleerde analyse van signaaltransductie in vivo. Deze omvatten het volgende: 1) De relatieve eenvoud van de zee-egel genoom vermindert het aantal mogelijke ligand, receptor / coreceptor en intracellulaire transductie molecuul interacties 17; 2) De GRNs besturen van de specificatie en patroonvorming van de kiem lagen en grote embryonale assen zijn goed ingeburgerd in zeeëgel embryo, hulp bij het begrijpen van de regulerende context van de cel / gebied ontvangen van de signalen 18, 19; 3) Vele signaaltransductieroutes kunnen worden onderzocht tussen splitsing en vroege stadia, gastrula embryo uit één gelaagde epitheel waarvan de morfologie gemakkelijker te analyseren; 4) De moleculen omvattend in signaalwegen in de zee-egels zijn gemakkelijk te manipuleren; 5) Veel zee-egels zijn gravid gedurende 10 tot 11 maanden per jaar (bv Strongylocentrotus purpuratus en Lytechinus variegatus).
Hier presenteren we een methode om systematisch en doeltreffend karakteriseren componenten van de signaalroutes die aangeven en patroon gebieden zeeegel's naar de voordelen die verschillende ongewervelde modelsystemen bieden in de studie van complexe moleculaire mechanismen illustreren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. High Throughput Morfolino Design Strategy
- Identificeer een gen (s) van belang (bijvoorbeeld kandidaat-gen benadering, cis-regulerende analyse RNAseq en / of proteomics differentiële schermen).
- Gebruik genomische, transcriptoom, en genexpressie gegevens beschikbaar over regelmatig bijgewerkt websites (bv SpBase http://www.echinobase.org 20 en S. purpuratus Genome Search http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) om vast te stellen dat de spatiotemporele expressie profiel overlapt met de ontwikkelings-mechanisme in kwestie. Als geen expressie gegevens beschikbaar zijn, dan genereert qPCR primers en / of een antisense probe voor in situ genexpressie patroon beoordelen.
- Na het bepalen van de ruimtelijke en temporele expressie, het verkrijgen van de DNA-sequentie van de genomische websites.
- Voor het opwekken van translatie-blokkerende morfolino oligonucleotiden, het verkrijgen van sequentie of de 5 'niet-vertaalde gebied (5' UTR) direct stroomopwaarts van het initiatiecodon van expressed sequence tag (EST) databases beschikbaar SpBase of S. purpuratus Genome Search websites. Als deze informatie niet beschikbaar is voor het gen van belang, voer dan 5 'RACE.
- Om een verbinding te blokkeren morfolino ontwerpen, zoeken naar de genoomsequentie waaronder de exons en introns met behulp van het schavot BLASTN instrument in SpBase of S. purpuratus Genome Search tool.
- Met het oligonucleotide ontwerpen website http://oligodesign.gene-tools.com teneinde de gewenste 25 baseparen sequentie morfolino ontwerpen.
- Voor een translationele blokkering morfolino Gebruik de mRNA sequentie van 5 'naar 3' als bron van translationele doelsequentie. Omvatten de 5 'UTR sequentie (ongeveer 70 nucleotiden stroomopwaarts van de transcriptie startplaats) plus 25 basen van coderende gebied (stroomafwaarts van de startplaats) met het startcodon gemarkeerde with haakjes (ATG).
- Voor een verbinding blokkerende morfolino, selecteert intron-exon of exon-intron grens sequentie en omvatten 50 basen (25 bases van exon sequentie en 25 bases van intronsequentie) rond de grens regio's. Scan het genoom met morfolino sequentie te controleren of de sequentie is uniek.
2. Micro-injectie van morfolino oligonucleotiden
- Bereid 3 mM voorraadoplossingen van de morfolino oligonucleotiden door toevoeging van 100 pi nuclease-vrij water in de 300 nmol morfolino flacon.
LET OP: Gebruik geen DEPC behandeld water voor de re-ophanging, omdat diethylpyrocarbonaat de morfolino kunnen beschadigen. - Voor de eerste bereiding draai naar beneden de flacon met de voorraad oligonucleotide oplossing gedurende 30 seconden op volle snelheid (14.000 - 16.000 xg), kort vortex, warmte bij 65 ° C gedurende 5 tot 10 min, kort vortex, en houden de morfolino voorraad bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur. Morfolino stockoplossing s zijn opgeslagen -20 ° C tot 4 ° C.
- Bereid injectieoplossing die morfolino oligonucleotiden in de gewenste concentratie. Deze oplossing bevat gewoonlijk 20% glycerol en 125 mM KCl als drager en 15% FITC-dextraan (fluoresceïne isothiocyanaat dextran 10.000 MW 2,5 mg / pl voorraadoplossing). FITC-dextraan en andere fluorescerende dextran conjugaten worden routinematig gebruikt om geïnjecteerde embryo's te identificeren door epifluorescentie microscopie. WINKEL injectieoplossingen bij -20 ° C.
- Verwarm de morfolino oplossing bij 65 ° C in een verwarmingsblok of waterbad gedurende tenminste 2-5 minuten.
- Kort draaien de morfolino oplossing gedurende 30 seconden bij volle snelheid (14.000 - 16.000 xg), vortex gedurende 1 minuut en centrifugeer bij volle snelheid (14.000 - 16.000 xg) gedurende ten minste 10 min.
- Laad de injectienaalden met de morfolino oplossing. Voor een gedetailleerde micro-injectie protocol zie Stepicheva en Song, 2014 21 en Proost en Ettensohn 2004"> 22.
3. Fixatie en In Situ Protocol na 24 uur na de bevruchting (HPF) in S. purpuratus Embryo's
LET OP: Dit protocol is gewijzigd ten opzichte van Arenas-Mena et al. , 2000 23 en Sethi et al. 2014 24.
- bevestiging
- Voeg enkele druppels fixatief (zie hieronder) om putjes die embryo's, meng voorzichtig door pipetteren, en hen in staat stellen om zich te vestigen. Verwijder het fixatief en meng embryo's met twee additionele 180 pl wassingen fixatief.
LET OP: Het is belangrijk om goed te mengen de embryo's tijdens de wasbeurten door voorzichtig en neer te pipetteren meerdere malen. Als dit niet gebeurt kan de signaal-ruisverhouding te verlagen. - Laat de embryo vast te stellen in de tweede fixeermiddel was voor 50 minuten tot 1 uur bij kamertemperatuur (RT) in 4% paraformaldehyde elektronenmicroscopie rang bestaande uit 10 mM MOPS pH 7,0, 0,1% Tween-20, en kunstmatige seawater (ASW). Maak deze oplossing vers elke keer voor de beste resultaten. Bovendien Eenvoudig, praktisch embryo's worden gefixeerd in 96-well platen.
- Voor 20 ml fixeermiddel gebruik 5 mL 16% paraformaldehyde, 15 ml ASW, 200 pi 1 M MOPS pH 7,0, en 20 ul Tween-20.
- 5 keer wassen bij kamertemperatuur met 180 ul MOPS wasbuffer bestaande uit 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl en 0,1% Tween-20 gedurende ten minste 5 minuten of totdat embryo naar de bodem van de put. Nogmaals, het is belangrijk om de embryo's in de wasbuffer meng door voorzichtig en neer te pipetteren meerdere malen. MOPS wasbuffer kan worden gebruikt voor 2 dagen houdbaar bij 4 ° C.
- Voor 40 ml MOPS wasbuffer gebruik 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M NaCl, 32 ml dH 2 O en 40 ul Tween-20.
- Vaste embryo's kunnen gedurende 2 dagen bewaard bij 4 ° C.
Opmerking: Als het opslaan vaste embryo langer, voeg dan 0,2% natriumazide in MOPS wasbuffer om bacteriegroei te voorkomen.
- Voeg enkele druppels fixatief (zie hieronder) om putjes die embryo's, meng voorzichtig door pipetteren, en hen in staat stellen om zich te vestigen. Verwijder het fixatief en meng embryo's met twee additionele 180 pl wassingen fixatief.
- Pre-hybridisatie
- Zuig het MOPS wasbuffer en voeg 180 ul van een 2: 1 verhouding van MOPS wasbuffer aan hybridisatiebuffer, meng embryo's in de oplossing door voorzichtig pipetteren meerdere malen en incubeer gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur. Hybridisatiebuffer bestaat uit 70% formamide, 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl, 1 mg / ml BSA en 0,1% Tween-20.
- Voor 40 ml hybridisatiebuffer gebruik 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M NaCl, 4 ml dH 2 O, 0,04 g BSA en 40 ul Tween-20. Meng goed door vortexen, voeg 28 ml formamide, en vortex weer.
- Verwijder de 2: 1 verhouding van MOPS wassen en hybridisatie buffers en voeg 180 ul van een 1: 2 verhouding van MOPS wasbuffer aan hybridisatiebuffer, meng embryo in de oplossing en incubeer gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Voordat probe hybridisatie meng embryo's in 100-150 ul hybridisatiebuffer. Incubeer embryo's bij 50 ° C gedurende ten minste 1h.
OPMERKING: incuberen embryo 's nachts is aanvaardbaar. Vóór incuberen, sluit de putjes van een kleefvel om verdamping te voorkomen.
- Zuig het MOPS wasbuffer en voeg 180 ul van een 2: 1 verhouding van MOPS wasbuffer aan hybridisatiebuffer, meng embryo's in de oplossing door voorzichtig pipetteren meerdere malen en incubeer gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur. Hybridisatiebuffer bestaat uit 70% formamide, 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl, 1 mg / ml BSA en 0,1% Tween-20.
- Hybridisatie
- In een afzonderlijke buis voeg 0,1-0,3 ng / pl probe en 500 ug / ml gist tRNA in hybridisatiebuffer, dan vortex zachtjes probe-oplossing te maken. Gist tRNA wordt toegevoegd aan de probe-oplossing om niet-specifieke binding van de antisense probe verlagen. Verwarm de oplossing tot 50 ° C, en zuig hybridisatiebuffer.
- Mix pre-embryo gehybridiseerd in 100 pi van de probe-oplossing, afdichting met een kleefvel en hybridiseren bij 50 ° C gedurende 2-7 dagen, afhankelijk van de probe (de foxq2 probe kan worden gedurende 2 dagen).
LET OP: Incubation tijden zullen variëren op basis van de sonde. Sommige genen tot expressie op een laag niveau vereisen tot 7 dagen incubatie. 96-well platen kunnen in een vochtige doos worden geplaatst verzekering tegen verdamping als de kleefstoive vel niet goed af te dichten. - Was 5 keer bij 50 ° C met 180 pi vers gemaakte MOPS wasbuffer voor een totaal van 3 uur. Vervolgens was 3 keer (15 minuten) met 180 ul MOPS wasbuffer bij kamertemperatuur. Vergeet niet om te mengen embryo's in de wasbuffer telkens met enkele malen zachtjes pipetteren.
- antilichaam Incubation
- Zuig het MOPS wasbuffer en meng embryo's in 180 ui blokkerende buffer bestaande uit 10% normaal serum van schapen en 5 mg / ml BSA in wasbuffer MOPS en incubeer gedurende ten minste 45 minuten bij kamertemperatuur of 4 ° C overnacht.
- Verwijder blokkerende buffer en meng embryo's in het blokkeren van buffer die een 1: 1500 verdunning van alkalische fosfatase geconjugeerd anti-digoxigenine antilichaam verdund in het blokkeren van buffer. Incubeer overnacht bij kamertemperatuur in een gesloten plaat verdamping plaatsvindt. OPMERKING: antilichaam niet achter op meer dan 's nachts.
- Was de embryo's 6 keer (5 minuten of tot de embryo's te laten vallen) in MOPS wasbuffer bij kamertemperatuur. embryo's kunnenworden 's nachts bewaard bij 4 ° C.
- In situ ontwikkeling
- Was embryo 3 keer (10 min) bij kamertemperatuur met vers gemaakte pH 9,5 buffer bestaande uit 0,1 M Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 1 mM Levamisol en 0,1% Tween-20.
- Voor 20 mL pH 9,5 buffer gebruik 2 ml 1 M Tris pH 9,5, 400 ui 5M NaCl, 1 ml 1 M MgCl2, 20 ul Tween-20, 16,6 ml dH 2 O en 0,0048 g Levamisool.
- Incubeer embryo's bij 37 ° C in kleurbuffer beschermd tegen licht. Kleuring buffer bestaat uit 10% dimethyl formamide, 4,5 ul / ml 4-nitro blauw tetrazolium chloride (NBT) en 3,5 pl / ml 5-broom-4-chloor-3-indolyl-fosfaat (BCIP) in vers bereide pH 9,5 buffer .
- Voor 1 ml vlekken buffer 100 ul dimethyl formamide, 4,5 pi NBT en 3,5 pi BCIP.
- Stop de alkalische fosfatase reactie door wassen 3-5 keer MOPS wasbuffer. De reactie with de foxq2 sonde duurt meestal 30 minuten tot 1 uur. Sommige probes kunnen overnacht incubatie nodig op ofwel kamertemperatuur of 4 ° C.
- Meng embryo's in een oplossing van 70% MOPS was en 30% glycerol. De glycerol verschaft een brekingsindex nodig voor microscopie. Embryo's kunnen worden opgeslagen in deze oplossing gedurende enkele weken. Dicht de platen met plastic paraffine om verdamping te voorkomen.
- Was embryo 3 keer (10 min) bij kamertemperatuur met vers gemaakte pH 9,5 buffer bestaande uit 0,1 M Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 1 mM Levamisol en 0,1% Tween-20.
- Dia voorbereiding en vastleggen van het beeld
- Bereid een dia door het organiseren van drie kleine strookjes dubbelzijdige tape in een driehoek met kleine openingen tussen de stroken op een glijbaan.
- Overdracht van de embryo's in de 70% MOPS was en 30% glycerol oplossing voor het midden van de driehoek en bedek met een dekglaasje.
- Dicht de dekglaasje door een laag nagellak rond de randen van het dekglaasje.
- Maak foto's met behulp van een samengestelde lichtmicroscoop met een 20X objectief en een aangesloten camera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de zee-egel embryo hebben we aangetoond dat 3 verschillende Wnt signalering branches (Wnt / β-catenine, Wnt / JNK en Wnt / PKC) 4, 25 interactie vertonen een Wnt signalering netwerk anterior-posterior (AP) patronen regelt vormen. Een van de belangrijkste gevolgen van deze signalering gebeurtenissen is die de oorspronkelijke algemeen uitgedrukt anterior neuroectoderm (ANE) GRN wordt beperkt tot een klein gebied rond de oogbol door het begin van gastrulatie (24 HPF in S. purpuratus). Deze resultaten tonen aan dat Wnt / β-catenine signalering voorkomt ANE genactivatie in de achterste helft van het embryo door het 32-cellig stadium. Werd deze weg stuurt een signaal naar de niet-canonieke Wnt / JNK signaleringsroute die geleidelijk omlaag reguleert de ANE GRN in de voorste helft van het embryo tussen de 60-cellig stadium en vroege gastrulatie. Tot slot, een derde niet-canonieke Wnt pathway, Wnt / PKC, antagoneert de Wnt / JNK signaleringsroute en voorkomt dat het elimineren ANE specificatie rond de oogbol (Figuur 1A) 4.
We gebruiken de spatiotemporele expressie van foxq2 te testen op de activiteit van elk van de Wnt signalering takken tijdens AP patroonvorming omdat het één van de eerste twee genen geactiveerd in de ANE GRN en wordt gemakkelijk bepaald door in situ hybridisatie door zijn robuuste expressie 26. Als een individu Wnt-signalering tak wordt verstoord, dan zijn er duidelijke uitdrukking fenotypes die aangeven welke route wordt betrokken: 1) Bij het ontbreken van Wnt / β-catenine signalering een brede moederlijke regulerend mechanisme (figuur 1A) activeert foxq2 uitdrukking in het hele embryo (Figuur 1BB); 2) Bij het ontbreken van Wnt / JNK signalering foxq2 wordt uitgedrukt in heelde voorste helft van de embryo (figuur 1BC), maar het is nog omlaag gereguleerd in de achterste helft vanwege de activiteit van Wnt / β-catenine signalering (figuur 1A); Aangezien Wnt / PKC signaleren foxq2 expressie volledig downgereguleerde gehele embryo (figuur 1Bd), omdat de Wnt / β-catenine en Wnt / JNK signaalroutes up geregeld 4, 25. Zo hebben we een test waarmee we de foxq2 transcriptionele uitleessysteem die in combinatie met onze systematische workflow (figuur 2), kunnen we efficiënt identificeren en testen of een gen van belang is betrokken bij één of meer van de Wnt hebben genoemd ontwikkeld signalering takken.
Met behulp van de methodologie en foxq2 uitlezing systeem hier wordt gepresenteerd, hebben we een aantal vermeende extracellulaire of intracellulaire Molec geïdentificeerdules waarschijnlijk betrokken bij de Wnt netwerk inzake AP as specificatie, waarvan er vier zijn weergegeven in Figuur 3. Embryo geïnjecteerd met morpholinos ontworpen om de uitdrukking van de transcriptiefactor, ATF2, of uitgescheiden extracellulaire Wnt modulator, Wif-1 knockdown, vertoonde een uitbreiding van foxq2 expressie naar de postérieure pool van de embryo in vroeg gastrulatie stadium (figuur 3A - C ). Deze resultaten na te bootsen de fenotypes waargenomen wanneer de leden van de Wnt / JNK signaleringsroute een daling van 4, 25 worden geklopt, wat suggereert dat zij lid zijn van deze signalering tak die nodig is om af te reguleren ANE GRN uitdrukking in de voorste helft van het embryo. Daarentegen werd foxq2 expressie uitgeschakeld toen we neergehaald de expressie van de transcriptiefactor NFAT (figuur 3D), en het uitgescheiden extracellulaire modulator, sFRP3 / 4 (figuur 3E),suggereert dat deze moleculen betrokken zijn bij de Wnt / PKC pathway die noodzakelijk is om de neerwaartse regulatie van de ANE GRN antagoniseren door Wnt / JNK signalering. Op basis van deze snel verkregen resultaten zijn we nu in staat om meer gedetailleerde functionele analyses dat deze factoren zal plaatsvinden binnen de evoluerende Wnt-signalering netwerk betrokken bij de GRN dat AP patroonvorming regeert in de zee-egel embryo uit te voeren.
Figuur 1. Het model voor AP Specificatie en patroonvorming in de Zee Urchin en de foxq2 Transcriptionele uitlezing System. (A) De progressieve neerwaartse regulatie van de ANE GRN om een gebied rond de voorste paal van het Wnt-signalering netwerk beschreven in de tekst en in 4, 9. (B) A transcriptional uitlezen systeem toont foxq2 uitdrukking in het aangegeven Wnt pathway knockdowns (KO). Schaal bar = 20 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Een experimentele Flow Diagram voor Efficient Wnt Network Analysis in the Sea Urchin Embryo. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Signaaltransductie moleculen die betrokken zijn in de Wnt Network AP bestuur Axis Specification en patroonvorming geïdentificeerd met behulp van de foxq2 Transcriptionele uitlezing System. (A, B, C) morfolino knockdowns suggereren dat een intracellulair signalering modulator, ATF2 en uitgescheiden extracellulaire modulator, Wif-1, zijn potentiële spelers van het Wnt / JNK signaleringsroute. (A, D, E) Knockdown experimenten gaven aan dat NFAT, een intracellulair signalering modulator en sFRP3 / 4, een uitgescheiden Wnt signalering modulator betrokken zijn bij Fzl1 / 2/7 PKC-signalering. Schaal bar = 20 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde methodiek is een voorbeeld dat de kracht van het gebruik van embryo's met minder genomische en morfologische complexiteit dan gewervelde dieren aan de signalering-routes en GRNs betreffende fundamentele ontwikkelingsstoornissen mechanismen te begrijpen illustreert .. Veel labs worden met vergelijkbare testen tijdens de zee-egel vroege ontwikkeling van het ontleden signaalwegen betrokken bij andere lot van de cel specificatie evenementen (bijv Notch, Hedgehog, TGF-β, en FGF signalering) 27, 28, 29, 30, 31. Deze zee-egel studies hebben veel interessante en nieuwe signalering mechanismen, en de vele aspecten van deze signalering mechanismen die vroege zee-egel ontwikkeling onthuld lijken te worden geconserveerd onder deuterostomes 9, 27, 30 <sup>, 31, 32. Belangrijk is dat het onderzoek van de ontwikkelingsbiologie van niet-traditionele metazoan embryo een stijging in de afgelopen jaren, en veel van deze kenmerken deel met zeeëgel embryo tijdens de vroege ontwikkeling 9, 15, 16, 33 gezien. Zo kunnen de hier gepresenteerde methode op grote schaal worden toegepast op de studie van de signaaltransductieroutes in veel van deze organismen tijdens de vroege ontwikkeling.
Alle technieken die worden gebruikt voor het neerslaan van genexpressie kan mogelijk produceren off-target knock down effect. Morpholinos hebben bewezen een opmerkelijk effectieve gen verstoring werkwijze zeeëgel embryo grotendeels omdat de gemeenschap voert strenge controles zorgen dat de knockdown fenotype aspecifieke verlichten. Deze fundamentele controle assays kan worden modified en toegepast op andere knock-down technieken (dwz scherper / Cas9). De besturing is: 1) Een zorgvuldige dosis respons assays worden uitgevoerd bij elke morfolino tot ≥ 80% van de geïnjecteerde embryo tonen defect fenotype en / of marker gen expressie; 2) Morpholinos worden verwijderd als zij leiden tot ernstige ontwikkelingsstoornissen vertragingen of zelfs de dood bij matige concentraties. Deze fenotypes zijn waarschijnlijk het gevolg van giftige off-target effecten; 3) Ten minste twee morpholinos die zijn ontworpen om verschillende bindingsplaatsen richten worden gebruikt om fenotypen knockdown bevestigen; 3) Missense morfolino geïnjecteerd; 4) Morfolino fenotypes worden gered door de invoering van mRNA voor het doelwit gen in morfolino knockdown embryo's; 5) Indien beschikbaar, ganse berg antilichaamkleuring assays worden aangetoond dat het gebruik morfolino knockdowns voorkomen translatie van het gen van belang. Het is belangrijk op te merken dat de zee-egel gemeenschap gebruikt minstens vier soorten voor functionele studies, afhankelijk van waar wetenschappers zich bevinden. in most gevallen, voor zover wij weten, de verschillende morpholinos gebruikt voor het neerslaan van de orthologen hebben gelijkaardige fenotypes in elke soort gegenereerd (zie bijvoorbeeld deze functionele studies over Nodal signalering 34, 35, 36, 37). Deze resultaten pleiten overtuigend aan dat onze strenge controle-experimenten selecteren sterk voor degenen morpholinos die on-target knockdown effecten te produceren.
Een ander belangrijk aspect van deze methode is de transcriptionele doelwitten die waarschijnlijk direct de signaleringsroute beschouwde geactiveerd nauwkeurig identificeren. Het voorbeeld dat wij hier is toevallig, omdat de spatiotemporele activering van de signaalwegen en de regulering van een robuust uitgedrukt gen, foxq2, optreden vroeg in de ontwikkeling en de GRNs inzake kiem laag en as specificatie in de zee-egel embryo zijn goed-gevestigd. Aldus is een duidelijke beperking van deze methode is dat in veel gevallen noodzakelijk zijn om de activiteit van een bepaalde signaalweg knockdown tijdens latere stadia van ontwikkeling en in specifieke gebieden. Er zijn verschillende technieken nu beschikbaar die kunnen worden gebruikt om deze beperkingen te overwinnen (bijvoorbeeld foto-morfolino, scherpere / Cas9 38, FACseq) ook in niet-traditionele model embryo's die niet vatbaar zijn voor genetische manipulatie. In veel gevallen kan het niet mogelijk zijn om een kandidaatgen te identificeren stroomafwaarts van een signaleringsroute plaats waarvan tijdruimtelijk expressie zo gemakkelijk beoordeeld als foxq2, die een opmerkelijk hoge signaal-ruisverhouding heeft. Het is gebruikelijk om genen te vinden met een veel lagere signaal-ruisverhoudingen. Als ander gen niet beschikbaar is voor een bepaalde assay, zijn de in situ gevormde probe voor het gen van interesse moet zo lang mogelijk zijn. In het algemeen gebruiken probes meer dan 1000 baseparens verhoogt het signaal en vermindert de ruis in colorimetrische en fluorescente in situ testen.
Zodra de transcriptionele assay die aangeeft waar en wanneer de signaaltransductieroute belang signalering wordt vastgesteld, de volgende belangrijke stap is om zowel de ruimtelijke en temporele expressie van de putatieve regulerende factoren die betrokken zijn bij de ontwikkeling mechanisme bestudeerde bepalen. Differential scherm en / of QPCR gegevens zijn belangrijke hulpmiddelen, maar ze kunnen misleidend zijn. Bevestigen met ganse berg in situ hybridisatie die het gen van belang tot expressie wordt gebracht op het grondgebied waar de signaalroute actief voorkomt een verspilling van tijd en middelen. Bovendien zijn deze gegevens mogelijk voorspellingen te doen over de genregulerend architectuur die de gedetailleerde analyse die volgt na de betrokken geïdentificeerd met deze eerste assay (figuur 2) spelers informeert. We presenteren een simple colorimetrische assay in dit protocol; echter, fluorescente in situ hybridisatie (FISH) kan ook worden gebruikt om verschillende fluorescerende probes visualiseren op hetzelfde moment, waardoor verbeterde ruimtelijke resolutie in het gebied van belang en confocale microscopie 24. Bovendien kan FISH worden gecombineerd met antilichaam kleuring om post-translationele modificaties te identificeren en / of waar de signaalroute van belang is actief 24.
Er zijn twee kritische stappen in het protocol dat vaak over het hoofd gezien. Eén is de bereiding van de morfolino oligonucleotidenoplossing. Het is belangrijk om de morfolino oplossing te verwarmen bij 65 ° C gedurende 2 minuten tot 5 minuten en het centrifugeren op volle snelheid gedurende ten minste 10 minuten voordat de injectienaalden. Deze stappen zijn essentieel bij de morfolino voorraadoplossing wordt bewaard bij -20 ° C omdat morfolino- oligonucleotiden kan neerslaan uit de oplossing bij lage temperperaturen en het spinnen van de oplossing voorkomt dat de injectienaalden verstopt raken met deeltjes. Een ander cruciaal aspect dat aandacht verdient is dat de embryo's moet worden grondig in de verschillende oplossingen bij elke stap van de fixatie en in situ hybridisatie protocollen gemengd. In onze handen, wordt het signaal verminderd en / of de achtergrond wordt verhoogd als deze eenvoudige stap niet wordt uitgevoerd.
Misschien het belangrijkste aspect van de hier gepresenteerde methode is dat het voor een efficiënte functionele analyse van grote sets van potentiële signaaltransductie moleculen gegenereerd door next generation transcriptomics en proteomics. Zodra deze eerste functionele analyses van een groep van regulerende factoren zijn betrokken bij een route van belang te bevestigen, is de volgende uitdaging is om gevestigde assays (bijv functionele knockdowns, gedetailleerde bonte ganse berg in situ; biochemische interacties) te gebruiken om te beoordelen hoe ze passen in de extracellular, intracellulaire en transcriptionele niveau van de signaal transductie routes betrokken bij een bepaald ontwikkelingsproces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino | Gene Tools LLC | Customized | More information at www.gene-tools.com |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| FITC (dextran fluorescein isothiocyanate) | Invitrogen, Life Technologies | D1821 | Make 25 mg/mL stock solution |
| Paraformaldehyde 16% solution EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| MOPS | Sigma Aldrich | M1254-250G | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 23336-0010 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 47671-1L-F | |
| Yeast tRNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| Normal Goat Serum | Sigma Aldrich | G9023-10mL | |
| Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody | Roche | 11 093 274 910 | |
| Tetramisole hydrochloride (levamisole) | Sigma Aldrich | L9756-5G | |
| Tris Base UltraPure | Research Products Internationall Corp | 56-40-6 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 7786-30-3 | |
| BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate | Roche | 11 383 221 001 | |
| 4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT) | Roche | 11 383 213 001 | |
| Dimethyl Formamide | Sigma Aldrich | D4551-500mL | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541-5KG | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Magnesium Sulfate | Sigma Aldrich | M7506-2KG | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C1016-500G |
References
- Erwin, D. H., Davidson, E. H. The evolution of hierarchical gene regulatory networks. Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).
- Peter, I. S., Davidson, E. H. Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development. Cell. 144, 970-985 (2011).
- Borggrefe, T., et al. The Notch intracellular domain integrates signals from Wnt, Hedgehog, TGFbeta/BMP and hypoxia pathways. Biochimica et biophysica acta. 1863, 303-313 (2016).
- Range, R. C., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Integration of canonical and noncanonical Wnt signaling pathways patterns the neuroectoderm along the anterior-posterior axis of sea urchin embryos. PLoS Biol. 11, e1001467 (2013).
- Cleary, M. A., van Osch, G. J., Brama, P. A., Hellingman, C. A., Narcisi, R. FGF, TGFbeta and Wnt crosstalk: embryonic to in vitro cartilage development from mesenchymal stem cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 9, 332-342 (2015).
- Lapraz, F., et al. RTK and TGF-beta signaling pathways genes in the sea urchin genome. Dev Biol. 300, 132-152 (2006).
- Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. The evolution of signalling pathways in animal development. Nature reviews. Genetics. 4, 39-49 (2003).
- Sethi, A. J., Wikramanayake, R. M., Angerer, R. C., Range, R. C., Angerer, L. M. Sequential signaling crosstalk regulates endomesoderm segregation in sea urchin embryos. Science. 335, 590-593 (2012).
- Range, R. Specification and positioning of the anterior neuroectoderm in deuterostome embryos. Genesis. 52, 222-234 (2014).
- Petersen, C. P., Reddien, P. W. Wnt signaling and the polarity of the primary body axis. Cell. 139, 1056-1068 (2009).
- Lapraz, F., Haillot, E., Lepage, T. A deuterostome origin of the Spemann organiser suggested by Nodal and ADMPs functions in Echinoderms. Nature communications. 6, 8434 (2015).
- Kikuchi, A., Yamamoto, H., Sato, A. Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways. Trends in cell biology. 19, 119-129 (2009).
- Hogan, B. L. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, 1580-1594 (1996).
- Houart, C., et al. Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling. Neuron. 35, 255-265 (2002).
- Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
- Rottinger, E., Lowe, C. J. Evolutionary crossroads in developmental biology: hemichordates. Development. 139, 2463-2475 (2012).
- Genome Sequencing Sea Urchin, C., et al. The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
- Ben-Tabou de-Leon, S., Su, Y. H., Lin, K. T., Li, E., Davidson, E. H. Gene regulatory control in the sea urchin aboral ectoderm: spatial initiation, signaling inputs, and cell fate lockdown. Dev Biol. 374, 245-254 (2013).
- Saudemont, A., et al. Ancestral regulatory circuits governing ectoderm patterning downstream of Nodal and BMP2/4 revealed by gene regulatory network analysis in an echinoderm. PLoS Genet. 6, e1001259 (2010).
- Cameron, R. A., Samanta, M., Yuan, A., He, D., Davidson, E. SpBase: the sea urchin genome database and web site. Nucleic Acids Res. 37, D750-D754 (2009).
- Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50841 (2014).
- Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods in cell biology. 74, 287-310 (2004).
- Arenas-Mena, C., Cameron, A. R., Davidson, E. H. Spatial expression of Hox cluster genes in the ontogeny of a sea urchin. Development. , 4631-4643 (2000).
- Sethi, A. J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Multicolor labeling in developmental gene regulatory network analysis. Methods in molecular biology. , 249-262 (2014).
- Wikramanayake, A. H., Huang, L., Klein, W. H. beta-Catenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9343 (1998).
- Yaguchi, S., Yaguchi, J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. A Wnt-FoxQ2-nodal pathway links primary and secondary axis specification in sea urchin embryos. Dev Cell. 14, 97-107 (2008).
- Molina, M. D., de Croze, N., Haillot, E., Lepage, T. Nodal: master and commander of the dorsal-ventral and left-right axes in the sea urchin embryo. Curr Opin Genet Dev. 23, 445-453 (2013).
- Range, R. C., Glenn, T. D., Miranda, E., McClay, D. R. LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo. Development. 135, 2445-2454 (2008).
- Range, R., et al. Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1. Development. 134, 3649-3664 (2007).
- Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin. Dev Biol. 411, 314-324 (2016).
- Rottinger, E., et al. FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development. Development. 135, 353-365 (2008).
- Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin. Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).
- Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology. Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).
- Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm. PLoS Genet. 12, e1006001 (2016).
- Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo. Dev Cell. 6, 397-410 (2004).
- Bradham, C. A., et al. Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos. Dev Biol. 328, 221-233 (2009).
- Su, Y. H. Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos. Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).
- Lin, C. Y., Su, Y. H. Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system. Dev Biol. 409, 420-428 (2016).
