Summary
פרוטוקול זה מתאר את הדמיה intravital של העכברים הטרנסגניים לבטא סמני פלואורסצנט תאים ספציפיים. הדמיה intravital מספק שיטה לא פולשנית ברזולוציה גבוהה תצפיות בבעלי חיים באמצעות windows מושתלת שדרכו החזיית תהליכים מיקרוסקופיים אפשרית. שיטה זו שימושית במיוחד ללמוד תהליכים האורך.
Abstract
גידול, התפתחות כלי הגידול, כמו גם גידול בתגובה הרפוי, הם תהליכים ביולוגיים דינמי מאוד. היסטולוגיה מספק מידע סטטי, לעתים קרובות לא מספיקה פרשנות נכונה. הערכה intravital, שבו תהליך מלווה בזמן, מספק מידע נוסף ובלתי צפוי לעתים קרובות. עם הקמתה של חיות הטרנסגניים לבטא סמנים ייחודיים תא, המשדרים תא חי, שיפורים ציוד הדמיה, הפיתוח של מספר תאי הדמיה, מיקרוסקופ intravital הפך כלי חשוב כדי להבין טוב יותר תהליכים ביולוגיים. מאמר זה מתאר עיצוב ניסיוני עבור החקירה של התפתחות כלי הגידול ואת ההשפעות הטיפוליות בצורה מרחבית טמפורלית. באמצעות תוכנית התקנה זו, בשלב של התפתחות כלי, תא עצה היווצרות לומן, זרימת הדם, extravasation, הוקמה המיטה כלי דם והרס כלי דם יכול להיות דמיינו ועקבתי. יתר על כן, השפעות טיפוליות intratumoral הגורל, הלוקליזציה של תרכובות כימותרפיות יכול גם להיות במעקב.
Introduction
בעוד מחקרים במבחנה לאפשר דימות ברזולוציה קינטי של תהליכים, ניסויים במבחנה אינו מאפשר הערכה בהקשר הנכון. למשל, לא ניתן לחקור את האינטראקציה של תאים סרטניים עם תאי סטרומה או סמים משלוחים והפצה בתוך הגידול בצלחת תרבות. מודלים בעלי חיים משמשים ולכן כדי לחקות את הפיזיולוגיה האנושית ואת הפתולוגיה. עם זאת, ההדמיה האורך של תהליכים, במיוחד ברזולוציה subcellular, הוא מאתגר. שיטות הדמיה מולקולרית, כגון דימות תהודה מגנטית (MRI), פליטת פוטון בודד שחושב טומוגרפיה (SPECT), ויש טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET), חדירה לעומק אבל חוסר רזולוציה או להיכשל להמחיש מבנים אנטומיים. הדמיה אופטית מספק רזולוציה גבוהה ומאפשר ההדמיה של מבנים, אך מלווה עני חדירה מינימאלית1. היישום של מיקרוסקופ intravital בשילוב עם חלון קאמרית טכנולוגיות כגון הגבי skinfold או חלון בטן, מאפשר ברזולוציה גבוהה הדמיה ויוו2,3,4. טכנולוגיה זו יש יתרונות ברורים, שכן היא מאפשרת עבור הדמיה האורך במשך שעות, אפילו ימים, הדמיה של תהליכים בהקשר המתאים (למשל, אינטראקציות תאים תאים בתוך הרקמה שבעורך), ולכל הרזולוציות בקצה אופטי מיקרוסקופ קונפוקלי ו multiphoton מתקדם.
המבוא של חיות הטרנסגניים עם תוויות פלורסנט ספציפיים התא או חלבון פותחת שפע של אפשרויות experimentations ויוו ו- ex-vivo . עבור מופע, תא-תא אינטראקציות, ייצור חלבונים, וגם התגובה מניפולציה או טיפול שניתן ללמוד ויוו באמצעות אלה מודלים5,-6,-7,-8. חשוב למקם בתוך הזמן והמקום יכול להיקבע עם ציוד הדמיה מתאים, מתודולוגיה. כאן, את מיקרוסקופ intravital של חיות לבטא סמן אנדותל בשילוב עם סוכנים גידול מושתלים ששונה בזריקות הגבי skinfold קאמרית חלון מוצג.
Protocol
כל הניסויים נעשו בהתאם לחוק ההולנדי, פרוטוקולים אושרו על-ידי ועדה של חיה הניסויים של המטאלקאמפ ארסמוס, רוטרדם, הולנד.
1. הנמען העכבר
- כאשר העכברים הטרנסגניים נולדים, מסך החיות עבור גנוטיפ המתאים באמצעות הליכים סטנדרטיים9.
הערה: כתב יד זה, והנתונים שהתקבלו קו eNOStag-GFP9 שפותחו ו קו10 רוזה-mTmG (מניות 007676) שנרכש מוצגים. - השתמש עכברים כי הם 12 שבועות ומעלה, שהם מעל 20 גרם.
2. התורם העכבר
הערה: קטע הגידול להשתלה בחלון הגבי מתקבל מחיה תורם שאינו מהונדס. בהתאם לסוג הגידול, משמשים רגילה (עם גידולים syngeneic) או immunodeficient (xenografts) עכברים.
- לגדל את התאים הסרטניים במדיום תוספי המתאים ב תרבות מבחנות-CO 37 ° C ו-5%2.
- להסיר את המדיום המבחנות תא, לשטוף פעם עם 1 x PBS ולנתק את התאים באמצעות טריפסין 0.25%.
- בטל את טריפסין על-ידי הוספת תא תרבות בינוני. לאסוף את התאים, ספין למטה ב g x 1,200 במשך 5 דקות, resuspend בגדר ב 5 מ של PBS.
- למהול 20 µL של התליה תא עם 20 µL של trypan blue, אשר כתמי תאים מתים. ספירת מספר התאים חי וגם מת באמצעות hemocytometer; מספר תאים מתים לא יעלה על 10%.
- לסובב את התאים שוב ב g x 1,200 עבור 5 דקות resuspend בגדר תא ב- PBS קר כקרח, מניב 1 מיליון תאים לכל 100 µL. להעביר את התאים על קרח לחדר הניתוח.
- עזים ומתנגד החיה באמצעות איזופלוריין/O2. להפעיל את החמצן ולהתאים את זרימת 0.5 מ ל לדקה התאם מאדה איזופלוריין ל-3%. אחרי כמה דקות, מקם את העכבר בבית הבליעה הרדמה.
הערה: Prefill תא כדי להבטיח שהוא מוכן לשימוש למזער את הלחץ. -
כאשר העכבר מורדמת, להביא את החיה לשולחן הניתוחים חימום, שמרו ב 37 מעלות צלזיוס, ולמקם את החוטם קונוס האף בהרדמה.
- הערה: החיה כראוי טשטוש כאשר הוא לא מגיב קמצוץ לו טביעות רגל הוא ציין.
- לגלח את העכבר משופרת של ההזרקה. לחסן באמצעות מזרק אינסולין 0.5 מ; להזריק 100 µL של תאים לתוך האגף של העכבר ולאפשר גידול לפתח.
- מאת נקע בצוואר הרחם תחת הרדמה כמאושרים על-ידי שלך אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש להרדימו. בעזרת מלקחיים ומספריים זעירים, תחתוך את העור במיקום של הגידול, לנתח את הגידול. הכניסו את הגידול צלחת פטרי עם PBS. באמצעות מספריים מיקרו ומלקחיים, לחתוך את הגידול לחלקים של 1 מ3 (איור 1 א'-a).
הערה: הגידול של העכבר התורם צריך להיות גדול מספיק כדי לתת מספיק חומר, אך להימנע גידולים גדולים, נמק. עבור רוב הגידולים, מספיק קוטר ממוצע של 10 מ מ.
3. השרשת תא חלון
- ביצוע כל ההליכים בתנאים אספטי. אוטוקלב גניקולוגיות (איור 1 א') וחומרים קאמרית (איור 1B).
הערה: תא חלון המשמש כאן, עם משקל כולל של 1.1 g, עשוי פוליאטר אתר קטון (פיק), חומר אור, סינתטי זה MRI תואם. הצצה 3.4-fold קל יותר טיטניום, אשר נמצא בשימוש נפוץ בספרות לחלונות אלה. שזה עמיד בפני רוב הכימיקלים, פושרת, לא לעורר תגובות החיסון, חסון. חלון זה הוא גם קטן יותר בעיצוב בהשוואה ל- windows שפורסמו בעבר. עכברים מצויד שהמופע חלון מלא קיבולת של תנועה יכול לטפס, במשקל וזהובה כדי עכברים ללא תא חלון. כי החיה יכול לנשוך על החלון, windows סינתטי יימשך קצר בהשוואה ל- windows טיטניום; עם זאת, הם קל כדי להפוך והם זולים. חלונות מסוימים אלה נעשים ללא צורך במיקור חוץ, ניתן לרכוש על פי בקשה. - תרופת הרגעה העכבר נמען באמצעות אינהלציה הרדמה (קרי, איזופלוריין/O2) בחדר הרדמה. להביא את העכבר לשולחן הניתוחים מחוממת שמרו ב 37 מעלות צלזיוס ולמקם את החוטם קונוס האף הרדמה (ראה שלב 2.6). להחיל משחה העין כדי למנוע יובש.
- להסיר את השיער כולו בחזרה על-ידי גילוח והחלת ג'ל להסרת שיער. . שמור על עצמך כי יעיר הוסר על ידי שטיפה החיה בזהירות עם מי ברז יד-חם. יבש את החיה, לנקות את העור עם 70% אתנול.
הערה: ההליך גילוח יכול להיעשות גם יום לפני ההשתלה חלון. הקרם צורך להסיר ביסודיות עם מים חמים-יד כמו זה יכול לגרום גירוי בעור. - סימון הקו המרכזי על עמוד השדרה עכבר עם סמן כדי להבטיח את מיקום סימטרית קאמרית. למקם מחדש את העכבר, משוך את העור לתוך דש באמצעות הקו המרכזי כמו עמדה מתקפלים, לאחוז באמצע הכנף. מקם את החלון כך את החלק העליון של המסגרת הוא לפחות 2 מ מ מתחת מרכז קו ועיגול אזור תצוגת החלון על העור עם סמן.
- שימוש בגודל מחזיק/להב סכין מספריים 15 ו מיקרו, להסיר את העור לאורך הקו המעגלי מצוירות. להיזהר לא לפגוע fascia המשמש כבסיס.
הערה: פעולה זו יוצרת אזור התצוגה חלון החדר שבו הגידול מושתלים. - . תעלה skinfold להשתמש ניקוב האוזן כדי מנקבים חורים 1 מ"מ קוטר דרך העור, אחד מכל צד של אזור התצוגה (איור 1 א'-ב').
הערה: אלה חורים עבור שני ברגים לתקן את מסגרות חלון ביחד. - להציב את המסגרת התא הקדמי בהזמנה אישית באמצעות ברגים (דמויות 1B-a, 1B-c) ומקם המסגרת האחורית (איור 1B-b) על המנעולים. במקום אגוזים (איור 1B-d) בגיל המסגרת האחורית על המנעולים.
הערה: ברגים אלו משמשות עבור תיקון התאים ביחד נגד skinfold משמשים מאוחר יותר על מנת לשתק את התא במהלך ההערכה מתחת למיקרוסקופ. - משוך את העור 2-3 מ מ מעל החלק העליון של המסגרות וודא כי אזור תצוגת החלון שיפותחו תואם את האזור קאמרית. מקום 23 גרם מחטים דרך שני החורים תפר קטן (איור 1B, חץ שחור) בחלק העליון של המסגרת. להדק את האגוזים על המנעולים עם מברג מיקרו (איור 1 א'-c), בעל מחט clamping לשתק את האגוזים.
הערה: לנקוט אמצעי זהירות כדי להבטיח כי העור לא הופך סביב הברגים והדק לא יותר מדי. - החלף את המחטים התפרים, מתחיל בראש, כדי לתקן את המסגרות על העור. לעשות את זה עבור 5 זוגות של חורים תפר (איור 1B, חץ לבן) במסגרת
- הפעל את העכבר כדי לחשוף את הישבן של חלון החדר. מניחים חתיכת מילוי זכוכית עבה עם קוטר של 10 מ מ, עובי של 0.55 מ מ (איור 1B-e), ולאחר מכן כוס מכסה סטנדרטי של 12 מ מ (איור 1B-f). . לאבטח את אלה עם טבעת תומכים (איור 1B-g) באזור הגב-הקאמרית.
הערה: הזכוכית מלוי מניעת רווח כדי לפתוח בין fascia לחלון על הצד הקדמי, אשר משמש עבור הדמיה. - מימה אזור תצוגת החלון שבו הגידול יתווסף על-ידי מילוי מזרק 1 מ"ל עם סטרילי 0.9% NaCl. אפשר כמה טיפות ליפול על אזור תצוגה זו. להסיר את עודף מלח עם טיפ כותנה סטרילי.
- ב- fascia, ליצור כיס גדול מספיק כדי להכיל 1 מ3 גידול השבר (איור 1 א'-a) באמצעות מחט 25 גרם את קצהו מכופף בזווית של 90 מעלות (איור 1 א'-d). באמצעות המחט או מלקחיים קלי, הכנס השבר הגידול באמצע אזור תצוגת חלון שיפותחו בכיס.
- סגור את אזור התצוגה חלון עם זכוכית מכסה סטנדרטי של 12 מ מ, טבעת תומכים.
הערה: בועת אוויר יכול הטופס, אבל זה יעלם בתוך שעות.
4. קדם, הצהרון של החיה
- מחלקים תרופות לשיכוך כאבים (קרי, הבופרנורפין 0.05 מ"ג/ק"ג) subcutaneously כפי שאושרו על-ידי שלך אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש. לאפשר את העכבר כדי להתאושש הרדמה תחת מנורת חימום.
- לחוד חלון מניבי עכברים בכלוב ונמצא בחדר מערכת בקרת אקלים להגדיר עד 32 ° C ומעל 50% לחות. ודא בקבוקי מים בטמפרטורת הסביבה לפני שמניחים אותם על הכלוב כדי למנוע דליפה. השתמש הכלובים והעשרה המאפשרים תנועה פתוח וגישה מזון ומים.
הערה: החדר החלון הזה היא נסבלת היטב, עכברים מפגינים התנהגות נורמלית. למגורים נפרדים מונע נזק לתא חלון הנגרמת על ידי עכברים אחרים, ומונע הטמפרטורה/לחות גבוהה הקירור למטה והתייבשות של skinfold. - בדוק את העכבר באופן קבוע עבור לעס את התפרים, ברגים משוחררים/אגוזים או שברי זכוכית מכסה. מיד לתקן ולהחליף כשזה קורה. כיסוי עשויים מחומר קל עשוי לשמש כדי להגן על החלון.
5. הדמיה intravital
הערה: הליך זה, מיקרוסקופ multiphoton, התוכנה הפקד המתאים משמשים. . הנה, חבילות תוכנה שסופקו עם המיקרוסקופים משמשים. המנהל, יהיה מכל חבילת תוכנה מגיע עם מיקרוסקופ והוא נועד לבקרת מיקרוסקופ ועבור לכידתו של תמונות סוויטת מטרה זו.
- אדליק את המערכת: PC/מיקרוסקופ, כוח ליחידת הבקרה קונאפוקלית, לייזר חשמל, לייזר פליטה. לדוגמה, עם תוכנה זו, להפעיל את התוכנה, לאתחל לשולחן המיקרוסקופ (איור 1E-a ו- 1E-c) על-ידי לחיצה על "אפשרות לאתחל טבלה". אדליק את המערכת והגדר אותה למצב הפעלת את המחשב כדי לשלוט מיקרוסקופ, xy-טבלה, מיצוב-z, לכידת התמונה.
- מעבר באור פלורסנט (איור 1E-b).
הערה: משמש להערכת פלורסצנטיות תמונות באמצעות העינים יחד עם שדה בהיר. - לעבור על פלטפורמת בהזמנה אישית, בטמפרטורה מבוקרת (איור 1 C-c; תיאר בדיון בפירוט רב יותר) שוכן ב 37 º C.
- לעבור על יחידת הרדמה באמצעות איזופלוריין/O2 (איור 1E-d). הר הצינור הרדמה על הבמה מיקרוסקופ (איור 1 ג'-e). התקן מלחציים על הבמה-xy לתקן את היצירה החוטם הרדמה.
- להעריך מראש את החיה להקים את השלב של התפתחות כלי הגידול; זה תלוי המהירות של הגידול, אבל זה יכול להשתנות בין עכברים בודדים.
- לסמם את העכבר באמצעות אינהלציה הרדמה (איזופלוריין/O2) בחדר הרדמה (ראה שלב 2.6).
- המקום החיה על פלטפורמת מבוקרי טמפרטורה רכוב על הבמה מיקרוסקופ; הדבר מונע התקררות של החיה כאשר זה הוא מורדם. ודא שהחוטם של העכבר ממוקם קונוס הרדמה ולהחיל העין משחה אם ההערכה ייקח יותר מ 5 דקות.
הערה: יכלול יותר מ 1 h, להפחית את הזרימה איזופלוריין ל- 2%. - השתמש את המנעולים קאמרית כדי לתקן (איור 1 C-b, חץ מלא) התא על בעל תא בהזמנה אישית (איור 1 ג'-a). בורג זה מחזיק (איור 1 C-d, חץ מקווקו) פלטפורמת מחוממת (איור 1 C-c).
הערה: שילוב זה מונע תנועה חפצים באזור תצוגת חלון תוך מתן אפשרות החיה לנשום בחופשיות. - הקפד לנקות את הזכוכית של אזור תצוגת חלון עם טיפ צמר גפן טבולים במים כדי למנוע של תמונה מטושטשת והפרעות מגיע פסולת על החלק החיצוני של הזכוכית. מקם את הפלטפורמה ואת העכבר על הבמה מיקרוסקופ (איור 1D).
הערה: תשמרי את הזנב אינו נתקע בין הרציף לבין השלב מיקרוסקופ. - בדיקה חזותית את השלב של התפתחות כלי הגידול באמצעות 10 X עדשה אובייקטיבי, בהיר-שדה, אור ניאון.
הערה: כלי פלורסנט צריך להיות בפוקוס, זרימת הדם אמורה להיות מוצגת באמצעות שדה בהיר. כאשר להערכת הוא ראה בבירור, להעריך את השלב של התפתחות כלי הגידול. למשל, לקבוע אם קיימת התפתחות מוקדמת אנגיוגנזה עם הצמיחה של תאים עצה או מבוססות להערכת למשלוח סמים. ניתן להעריך אותה חיה שוב, כמו גידול פיתוח הינו תהליך מתמשך. מספר שלבים נראים גם גידול יחיד בו זמנית.- כאשר אין אפשרות להתמקד להערכת, להסיר את החיה מן הבמה, תאפשר את העכבר לשחזר, והמקום החיה בחזרה בחלל מערכת בקרת אקלים. . בדוק אותו שוב מאוחר יותר... כאשר העכבר מוכן להערכה, להמשיך עם התהליך המתואר להלן.
- . הפעילי את הלייזרים קונאפוקלית ואת הבקרה על-ידי לחיצה על "לייזר" 'Ctrl לוח"בכרטיסיה ' תצורה'
הערה: מומלץ לקבוע את עוצמת הלייזר נמוך, במיוחד עבור הלייזר, כדי למנוע הלבנת, החימום של רקמות, וכן נזקי... לוח הבקרה ניתן להגדיר העדפות אישיות. עבור הדמיה intravital באמצעות fluorophores מרובים מומלץ ליישם את ההגדרות הבאות: "חכמה רווח, 100 וולט לכל פנייה," "חכמה היסט, 10% לכל פנייה," "זום, בינוני," "X עמדה, בינוניות," "מיקום Y, בינוני," ואת "מיקום Z, 100 מיקרומטר בכל תור". לפני הדמיה, כוונון ההיסט של כדי למזער את הרעש ולמטב את יחס אות לרעש. פונקציית זום קונאפוקלית מאפשר הגדלה גבוהה יותר מבלי לשנות את העדשות אובייקטיבי. שליטה X, Y ו- Z יש צורך לאתר את תחומי עניין. עבור מיקרוסקופ intravital, Z-מיצוב צריך להיות כ-100 מיקרומטר בכל תור כמו רקמות שנתות מוערך. - לחץ על "רכישת" בכרטיסיה ' רכוש ', שנה את ההגדרה כדי: "רכישת מצב XYZ או XYZT," "תבנית (512 x 512 או 1024 x 1024)", "מהירות (400 Hz או 200 Hz)." לחץ על "חריר" ולהגדיר אותו 1 יחידה אוורירי. לחץ על "דו-כיווני X".
הערה: כדי למטב את התמונות, איזון בין עוצמת הלייזר, רווח, חריר צריך להיות פגע, אשר מוזכר בדיון. - בעת הערכת fluorophores מרובים, בחר "סריקה רציפה" ובין "מסגרות" כדי למנוע דימום-דרך, אשר מוזכר בדיון. לבחור "קו ממוצע 4" כדי להשיג ירידה טובה של הרעש.
הערה: בהתאם פלורסצנטיות מהותי נוכח החיה מהונדס, סמנים פלורסנט אחרים, כמו dextrans, Hoechst, FITC-BSA, chemotherapeutics פלורסנט, ו/או חלקיקים מדולל לריכוז הרצוי ב- 0.9% NaCl יכול להיות מנוהל, העריך בגידול. אלה הם מוזרק דרך הזנב או וריד הפין. - לחץ על "ניסוי" בכרטיסיה ' רכוש ' ובחר "חדש" כדי ליצור בסיס נתונים.
- להעריך את באמצעות בעלי חיים, בהתאם שאלת המחקר, 10 X, 20 X או המטרה X 40 עדשות. באמצעות העינים, למצוא משרה כדי להעריך.
הערה: מומלץ להשתמש עדשות יבש עם נה גבוה ככל האפשר, יבש עדשות להיות ארוכות יחסית מרחק ולעשות לא צריך טבילה נוזל. בדיון, מוזכר שימוש בעדשות המטרה טבילה במים. - השתמש סריקה מהירה בשידור חי כדי למצוא רווח תקין, היסט כדי למנוע חשיפת יתר וכדי לייעל את יחס אות לרעש. גם, לשמור על אותן הגדרות הדמיה בזמן ובין ניסויים אם השוואה כמותית נחוצה.
הערה: שיקולים נוספים עבור הדמיה אופטימלית שהוזכרו בדיון. ניתן להשלים את המיקום XYZ ואת זום במהלך הסריקה בשידור חי באמצעות החלונית ' בקרה '. - כדי להפוך Z-מחסנית, בחר "Z-מחסנית" היחידים ידרשו להפוך מהר Z-סריקה באמצעות Z-המיקום בלוח הבקרה והגדר את ההתחלה ואת הסוף של הסריקה על ידי לחיצה על "בגין מיקרומטר" ו- "קצה מיקרומטר." להגדיר את גודל Z-צעד גודל חריר.
- ללכוד את התמונות על ידי לחיצה על "התחל".
הערה: כמו מיקרוסקופ intravital הכל על קינטיקה ותהליכים דינאמיים ולכן שנצפו, פשרה בין הזמן כדי להשיג תמונה, המהירות של תהליכים ביולוגיים חייבת להיעשות. באופן כללי, ככל שהרזולוציה, הערוצים יותר פלורסנט הם שנסרקו, גדול יותר סריקה שדה, הפיקסלים יותר לכל תמונה. Z-ערימות עבה יותר לתרגם זמן עוד הדמיה. פעם עוד הדמיה מגדילה את הסיכוי של התנועה חפצים, עלול לגרום נזק לרקמת עם תמונה. כמו כן, להיות מודע כי סריקת מסוימים תוויות פלורסנט גורמת הלבנת ורעילות, אשר מושפע עוצמת הלייזר ואת ריכוז לצבוע שהצטברו. - לאחר הסריקה את Z-המחסנית ניתן במהירות להעריך על-ידי לחיצה על "הקרנה מקסימלי". Z-המחסנית נשמר באופן אוטומטי בבסיס הנתונים, ניתן לשנות את שמם.
6. ניתוח נתונים
- בהתאם שאלת המחקר המקורי, השתמש באחת מספר תוכניות, כגון ImageJ5, Matlab11או אמירה, לניתוח נתונים. ניתוח הנכונים היא קריטית.
Representative Results
התכונה העיקרית של הדמיה intravital הוא הפריט החזותי האורך של תהליכים תאיים ללא התערבות פולשנית. בשביל זה, בעלי חיים הטרנסגניים לבטא סמן פלורסנט מכוננת או inducible בתאים עניין משמשים. איור 2 מדגים את הביטוי של תוויות פלורסנט חלבון פלואורסצנטי eNOStag-ירוק (GFP)9 ו רוזה-mTmG העכבר שורות10. ENOStag-GFP הוא קו העכבר שהופק בחברה באמצעות גן אנוס קטום כתגית GFP. חשוב, אנוס מאוד מבוטא בתאי האנדותל, האות ה-GFP הוא ראה בבירור ב- th eGolgi, הממברנה התאית (איור 2 א). רוזה-mTmG עכברים יש אלל כתב Cre קרום, ממוקדות פלורסצנטיות שני צבעים. הקו הזה מבטא mTomato זריחה בתאים נרחבת mGFP בתאים המבטאים recombinase Cre ומשמש במידה רבה לצורך מעקב אחר שושלת היוחסין. כמו חתיכה הגידול הוא מושתלים מתורם שאינו מהונדס, פלואורסצנטי אדום מתבטא בעיקר בחלקים סטרומה בגידול (למשל, ממברנה של תאים לכלי הדם, מחזורי תאים, הסתננו תאי דם, וסרטניים הקשורים fibroblasts (איור 2B)).
היווצרות כלי מוסדר בחוזקה, מודל מצויין ללמוד זאת פיתוח רשתית12,13. כמו כן, גידול כלי הגידול הוא תהליך קינטי הדומה בעיקרון התפתחות כלי ברשתית. עם זאת, כלי הגידול חוסר הארגון וגם, כמו גידול ללא הרף שיפוץ, להערכת סרטניים הקשורים. יכולה להיות היתרונות בעת שימוש הגידול כמודל האנגיוגנזה, כמו בכל שלבי התפתחות כלי לעתים קרובות ניתן למצוא את הגידול אותו באותו זמן. אלה כוללים של החזית נבטי אנדותל גדל לתוך חלק האו ם vascularized של הגידול (איור 2C); כלי פגום (איור דו-ממדי); ומיטה וסקולרית הוקמה (איור 2E-אני) עם בוגרים, בענף כלי (איור 2E-II). עם זאת, ניתן למצוא תאי אנדותל האנגיוגנזה גם באזורים אלה. כאשר גירוי על ידי גירויים האנגיוגנזה, תא אנדותל בולט filopodia (איור 2E-III), יכול להתקדם לתוך תא עצה, באמצעות filopodia אלה עבור סריקה, כיווני הגירה (איור 2E-IV). תא טיפ זה נודד אל interstitium הגידול, מלווה על ידי חלוקת תאים גבעול. תא יחיד עצה אנדותל יש מספר filopodia הרחבה, היציבה, חידוש בכל עת, והוא ניתן לעקוב באמצעות מיקרוסקופ intravital (איור 2F).
שנית, מיקרוסקופ intravital יכול לשמש כדי לקבוע היווצרות לומן בחזית אנגיוגנזה, דם זורם ברחבי הגידול, extravasation. בהתאם כבר-נוכח אותות פלואורסצנט מהותי לחיה, תרכובות שונה פלורסנט יכולה להינתן. זרימת הדם ואת extravasation, ניתן לאבחן באמצעות Hoechst, פלורסנט dextrans או FITC-BSA. ללימודים מורחבים על דם זרם של חלקיקים extravasation, מחזור ארוך הנקרא fluorescently חלקיקים pegylated של 100 ננומטר יכול לשמש. לפרטים על הכנת חלקיקים אלה, ראה הפרסום הקודם5. העסקתם של תרכובות אלו הוא הפגין באיור3. תאי אנדותל עצה עכבר רוזה-mTmG ניתן לראות בבירור את רקמת הגידול פולשים. זרימת הדם פונקציונלי מומחש על קרינה פלואורסצנטית סגול של חלקיקים מערכתית מוזרק ב לומן של צינורות כלי הדם (איור 3 א-אני). חלקיקים להגיע מקרוב תאי אנדותל עצה הממחישות את היווצרות לומן באזור תא גבעול (איור 3 א-II). המסירה של chemotherapeutics מערכתית בניהול תלוי להערכת תפקודית כדי להגיע interstitium את הגידול, כפי שמוצג באיור 3B, סוכנים להזרקה, תלוי בגודל שלהם, לא לחדור אזורים עם כלי ההרוס, דחוס כלי, או כלי עם דם ההקפאה.
באיברים רוב, הציפוי אנדותל יוצרת מחסום פונקציונלי בין הדם לבין רקמות הבסיסית, המעבר של המולקולות מוסדר בחוזקה. סרטניים הקשורים להערכת, עם זאת, ידוע כי דולפים, גודל הנקבוביות ניתוק תלויה במידה רבה סוג הגידול14. יכול להיות מוזרק dextrans מצומדת פלורסנט עם גדלים שונים כדי להעריך את זרימת הדם, חדירות ו extravasation. Hoechst (615 Da) מפזרת במהירות לתוך רקמת הגידול, הוא נלקח על ידי התאים שמסביב (איור 3C-אני). זמן קצר לאחר הזריקה לתוספי KDa 10 (איור 3CII) ו 2 מד א (איור 3 ג-III) נמצאים במחזור הדם. עם זאת, לתוספי ש-kda 10 גם אצל interstitium הגידול, המציין את החדירות של רירית אנדותל עבור מולקולות קטנות יותר, תכונה ייחסה לכלי הגידול. 40 דקות לאחר ההזרקה (איור 3 ג-IV), לתוספי 10 KDa מנוקה זרם הדם (איור 3 ג-V), ואת עוצמת פלורסנט לתוספי 2MDa ירד גם כן (איור 3 ג-VI). עם זאת, dextrans גדולה לא נמצאים interstitium הגידול, מפגינות חוסר חדירות כדי מולקולות גדולות בתוך פרק הזמן.
פתופסיולוגיה הגידול, עם אזורים שלה מאוד מתרבים נמק, האו ם vascularized, יכול להיות די אינפורמטיבי בעת שימוש הגידול כמודל אנגיוגנזה. עם זאת, מהווה בעיה עבור טיפול יעיל והחקירה. הטרוגניות של סרטניים הקשורים להערכת גורם הפצת סמים מנוהל, עוזב את כל האזורים מסמים15הטרוגנית. כדי לשפר את משלוח סמים, מספר אסטרטגיות יכול להיות שימושית15,16,17, התקדמות טיפולית תוכל להיבדק באמצעות עיצוב intravital זה. להערכת סרטניים הקשורים ניתן לטפל באמצעות סוכנים vasoactive כדי לשפר את משלוח סמים17. התוצאות של מניפולציה כלי הגידול באמצעות הגידול נמק אלפא (TNF) כסוכן vasoactive בשילוב עם ודוקסיל, ניסוח liposomal שעברו אנקפסולציה של דוקסורוביצין, כסוכן כימותרפיות מוצגים זה כתב היד5, 18 , 19. בניגוד dextrans, pegylated חלקיקים עשויים לזרום במשך מספר שעות אם לא ימים, זרימת הדם20.
כאמור, אזור הגידול ניתן מראש סרוקים כדי לזהות את אזורי הגידול הנכון בהתאם שאלת המחקר. גורל הסם שניתן להעריכו באזורים עם להערכת תפקודית לעומת אזורים עם מיטה כלי דם פגומים כבר (נתונים לא מוצג). כדי לחקור את גורלו של סוכנים כימותרפיות ללא הפרעה ציטוטוקסיות, חלקיקים עם הרכב אותו כסוכן טיפולית יכול לשמש כסם מודל. חיה eNOStag-GFP עירוי שטופלו עם חלקיקים האלה, עם תמונה 24 שעות מאוחר יותר. חלקיקים היו עדיין נוכח להערכת, עם extravasation מינימלי לתוך interstitium הגידול (4A איור-אני). עם זאת, כאשר חלקיקים נוהלו בשילוב עם TNF, extravasation נצפתה של זרם הדם לתוך interstitium הגידול (איור 4A-II), הגדלת משלוח סמים intratumoral. באמצעות עדשות המטרה ברזולוציה גבוהה, לוקליזציה תאיים של תרכובת ניתן לזהות, כמוצג כאן על ידי מיקום הגרעין Hoechst ב ירוק תאי אנדותל ותאים של interstitium הגידול (איור 4B). יתר על כן, כפי סוכנים כימותרפיות רבות, כמו דוקסורוביצין, intercalate עם ה-DNA, הלוקליזציה של תרכובות אלו ניתן להעריך. דוקסורוביצין יש מאפיינים ניאון אדום, ניתן לסמן את nanocarrier עם, למשל, tetramethylindotricarbocyanine פרכלורט (עשו). חיה eNOStag-GFP הוזרק עירוי עם ודוקסיל-בשילוב עם TNF, וגם התמונות צולמו 24 שעות לאחר הטיפול. ודוקסיל-extravasated מתוך כלי הדם, צולמה על ידי גידול הרקמה שמסביב (איור 4C-אני). הערכה מפורטת יותר של תאים בודדים (איור 4 C-II) הראה כי המנשא ניתן למצוא בציטופלסמה, בעוד דוקסורוביצין שפורסמו נצפתה בגרעין הסלולר.
איור 1: כלי נגינה, הגבי תא skinfold, ואת התקנת ציוד לצורך ההליך. (א) הגידול קטעים (א) וכלי כירורגי לצורך ההשתלה. מכשירים שאינם סטנדרטיים הם של ניקוב האוזן (b), הנהג בורג מיקרו (ג) ומחט כפוף (d). (B) העזוב קאמרית חלון skinfold. קדמית (א) ואחורית (ב) חלון (חץ: חורים שפורץ; ראש חץ: חורים עבור ברגים מוטבע), בורחת 2 (ג), אגוזים 2 (ד), מילוי 1 זכוכית (e), 2 כוסות כיסוי (f), ו-2 תמך טבעות (ז). כמו כן, תמך טבעות ללא ווים (חץ לבן) ניתן להשתמש בעת הצורך. (ג) קאמרית בהזמנה אישית מחזיק (א), ברגים מחזיק קאמרית-כדי-הקאמרית (b), טמפרטורה מבוקרת פלטפורמה (ג), בורחת כדי לאבטח את המחזיק קאמרית פלטפורמה (ד), המחזיק עם ההרדמה צינור (e). בעלי חיים (D) לטעון המחזיק קאמרית על הרציף. גידול B16BL6 (חץ) מוצגת באזור תצוגת חלון. (E) הציוד הדרוש על הערכה intravital. מחשב עם הדמיה, מיקרוסקופ שליטה תוכנה (א) תקן ניאון בהיר (ב), המיקרוסקופ. Multiphoton קונאפוקלית היה בשימוש (c) עם יחידת הרדמה (d). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: זריחה פנימיים של חיות הטרנסגניים. כל התמונות המוצגות כאן הן הקרנות Z-מחסנית בין 50 ו 70 מיקרומטר עבה. (א) קו eNOSGFP-תג, מבוטא GFP גולג'י (כוכבית), קרום התא (חץ) של תאי אנדותל. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) ביטוי Intratumoral של mTomato של הקו רוזה-mTmG מצוי בעיקר קרום התא של תאי הדם (חץ), תאי דם (כוכבית). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ג) A השלכה של חזית האנגיוגנזה גדל לתוך הגידול vascularized האו ם. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ד) A הקרנת החלק של הגידול עם הוקמה וספינות פגום (כוכבית). (ה) הקרנת הגידול הוקמה להערכת (EI) מציג שנתות בוגרת כלי (EII); אנגיוגנזה תאי אנדותל עצה עם filopodia (EIII, ראש חץ); כלי קיבול בוגרת, שממנו תא אנדותל בודד משתרע על filopodium (EIV, ראש חץ) לתוך interstitium... סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. תנועת (F) filopodia, אחריו במשך 1 h. כל 15 דקות, Z-מחסנית נלקח; הקרנה מרבי מוצג כאן. Filopodia אתה מרחיב (חץ לבן), קיפאון (=), מפסק (חץ אדום), או אפילו לגמרי הנעלם (-). סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ניהול של תוויות להזרקה להמחשת extravasation וזרימת דם. (א) א רוזה mTmG העכבר הוזרק עם חלקיקים ניאון סגולים, ו- Z-ערימת בחזית תא הפולשים עצה נלקח 10 דקות מאוחר יותר (AI). תחזית מציג שיש נבטים ביותר אנדותל של לומן פונקציונלי (כל, חץ). רק לעתים רחוקות רואים אנדותל נבטים ללא זרימה (כל, ראש חץ). סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר. (B) הקרנה Z-מחסנית זו מציגה את אזור כלי הגידול נהרס בחיה eNOStag-GFP לפני הטיפול (BI). החיה הוזרק עם חלקיקים (סגול, BII) ו Hoechst (כחול, ביל). חלקיקים Hoechst לא להגיע אזורים ההרוס, המצוין על-ידי שאריות תאים מגורען עדיין לבטא GFP. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר. (ג) העכבר eNOStag-GFP הוזרק עם שני dextrans בגדלים שונים (אדום = מד א 2 לתוספי; סגול = לתוספי 10 KDa) ו Hoechst (כחול = 615 Da), מטוס יחיד תמונות ומוצגים כאן. 10 דקות לאחר ההזרקה, נוכחות הדם, extravasation נראים באותה התמונה. Hoechst extravasates כמעט מיד מתוך כלי הדם, הוא נלקח על ידי התאים הסמוכים (CI). לתוספי 10 KDa (CII) ניתן לראות כלי, interstitium את הגידול. לתוספי 2 מד א (CIII) ניתן למצוא את כלי הדם. 40 דקות לאחר ההזרקה (אזרחי), לתוספי 10 KDa נעלם מהדם (CV), עוצמת פלורסנט לתוספי 2 מד א היה גם מופחתת (CVI). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: חוקרים את גורלו של סוכנים כימותרפיות. (א) חיים eNOStag-GFP עירוי שטופלו עם חלקיקים, עם תמונה 24 שעות מאוחר יותר. חלקיקים נמצאים עדיין כלי, עם extravasation מינימלית ב interstitium הגידול (AI). כאשר חלקיקי משולבים עם TNF, extravasation הוא ציין של זרם הדם לתוך interstitium הגידול (כל). סרגל קנה מידה = 250 ניתן לזהות מיקרומטר. (B) שימוש ברזולוציה גבוהה עדשות, (ירוק) אנדותל ציטופלזמה גרעין של תא יחיד (כחול). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (ג) חיים eNOStag-GFP הזריקו עירוי ודוקסיל-בשילוב עם TNF, וגם התמונות צולמו 24 שעות מאוחר יותר. הנה, את extravasation של ודוקסיל-האם מתוך כלי לתוך הגידול interstitium הוא ברור (CI). הערכה מפורטת יותר של תאים בודדים (CII) מראה כי המוביל סגול ניתן למצוא בציטופלסמה (חץ), ואילו דוקסורוביצין המשוחררים (אדום) הוא ציין בגרעין הסלולר (חץ). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
כמו גידול, התפתחות כלי הגידול, כמו גם השפעות טיפוליות הגידול, הם תהליכים דינאמיים מאוד, הערכה intravital היא כלי אלגנטי לבצע הערכה נכונה של תהליכים אלה באופן זמן המרחבי ותלוי. עם הזמינות הגוברת של תא חי סמני היצירה של בעלי חיים מהונדס, קידום שיטות הדמיה, הדמיה intravital נהיה יותר ויותר פופולרי. למרות היסטולוגיה משמש עדיין באופן שגרתי, שפע של סמנים יכול לשמש כדי לזהות תאים ומבנים, רקמות חלוקתה יש חסרונות בחקירת תהליכים דינאמיים. חיתוך רקמה נדרשת, מתן מידע סטטי בלבד; קיבוע משפיעה על איכות רקמת; לחתוך נזקים באינטראקציה תאית. גם, כאשר חוקר תהליכים דינאמיים, רקמות לנתיחה בנקודות שונות, וכן לעיתים קרובות המשוער, זמן-דורש כמות גדולה של בעלי חיים. עם הדמיה intravital, ניתן להעריך את ממדי מרחבי XYZ ואת המימד הנוסף של הזמן של אותה חיה, שהופך את מיקום מתאים של שחקנים שונים אפשריים במרחב ובזמן. לכן, הן נקודות זמן אופטימלי ולא החמיצה, מספר בעלי חיים המשמש לכל ניסוי פוחת באופן משמעותי. שנית, חלון הזמן הקים עם הערכה intravital יכול להיות אומדן כדי למטב את רקמת החילוץ. שלישית, השלב הרצוי של גידול כלי יכול להיות מזוהה intravitally, צבעונית כמו רקמה כולה-הר.
העיצוב intravital הזכיר כתב יד זה משתמש בשילוב של חיות הטרנסגניים לבטא תווית פלורסנט בתאי האנדותל, ששונה הגבי skinfold קאמרית דגם מיקרוסקופ קונפוקלי-multiphoton ייעודי.
תאי אנדותל לעבור מספר שלבים21,22 במהלך אנגיוגנזה, שלבים אלה לעתים קרובות ניתן לראות בו זמנית גידול. באמצעות שורת העכבר eNOSTag-GFP, תאי אנדותל בודדים ניתן בעקבות, אפילו filopodia dynamics שיכול להוביל. לכן מודל טוב ללמוד התפתחות כלי intravitally. בהתאם לתוויות מהותי כבר-נוכח, סוכנים פלורסנט להזרקה ניתן להשתמש כדי להעריך את היווצרות לומן, זרימת הדם, extravasation, סיווג דם. העכבר הוא עם תמונה באופן רציף במשך עד 5 שעות. הערכת לטווח ארוך חיים הוא ריאלי כאשר נלקחים מספר אמצעי זהירות לגבי ההרדמה של החיה, אשר כבר שתוארה לעיל23. מחקר זה הוא מרוכז על סרטן, גידולים רקמות או תאים שהיו מושתלים. עם זאת, אנחנו גם ניסויים מתוך הרגל והריאות עובריים. עם זאת, קצב גדילת רקמה שנבחנה מגבילה, כאשר לאחר מספר שבועות, העור יתחיל לצמוח מחדש, שיכולה להיות בעיה עם גידולים או רקמות הגדלים לאט.
במהלך שלב אימות, מהראש skinfold חלון החדר היה שונה במידה ניכרת לעומת דגם קלאסי4. המסגרות נבנות מחומר סינתטי autoclavable והם קלים וקטנים, עם אזור נוף חלון גדול. הקרס של הטבעת הסגירה (דמות 1Bg, ראש חץ לבן) משמש רק עבור הסרת קל של הטבעת. שכר טרחה טבעות ללא ווים יכול לשמש כאשר אלה להפריע הדמיה. העור לא נמתחת מדי, התרופפות אינה מתרחשת במודל זה, של זיהומים הם רק לעתים נדירות. לבצע שינויים אלה לצמצם את אי נוחות בעלי חיים ולמקד את שגרת חיים באופן משמעותי. בנוסף, חלקי המתכת ניתן להסיר בקלות כאשר הדימות הגידול באמצעות MRI24.
כל מיקרוסקופ ניתן לאמץ intravitally התמונה הגבי צ'יימברס skinfold. הדרישה המרכזית היא השטח הפנוי בין השלב מיקרוסקופ העדשה אובייקטיבי. היבט חשוב המשפיעה על הדמיה היא תנועה. כדי למנוע תנועה חפצים, פלטפורמה מתאימה שבטבלה מיקרוסקופ (לאחר הסרת כל מוסיף) ותומך העכבר אמור לשמש. . זה לא הכרחי לרסן את העכבר כאשר זה תחת הרדמה, עדיף לתת את הנשימה העכבר בחופשיות. עם זאת, החלון. הוא נעול על הפלטפורמה, מתן קיבעון אופטימלית של שדה הראייה (קרי, הגידול הוא גלוי דרך חלון החדר). פלטפורמת מחוממת באמצעות רכיב pad חימום אלקטרוניות, משמש להסקה בעלי חיים. פלטפורמה זו נעשתה ללא צורך במיקור חוץ, פרטים ניתן לקבל על פי בקשה. עדשה המטרה ברזולוציה גבוהה היא הכרח בעת הערכת תהליכים תאיים והופכת אותו ניתן להפלות בין הציטופלסמה לגרעין. השימוש של עדשה מחודדות עם רזולוציה אופטית טובה (NA גבוהה) אבל ארוך יחסית ומרחק עבודה (רצוי 2 מ מ ומעלה) מומלץ. המגבלה בתחום ההדמיה היא עומק חדירה לבין עוצמת פלורסנט התוויות. יתר על כן, photobleaching, phototoxicity, רוויה יש להימנע במהלך דימות.
כאן, שימשו משולב קונאפוקלית-multiphoton ומיקרוסקופ קונפוקלי. Multiphoton הוא זקוף, אמנם קונאפוקלית מיקרוסקופ הפוכה. היתרון של מיקרוסקופ זקוף הוא השימוש קל של מים-טבילה עדשות. העדשות של נה גבוהה ויש הרבה זמן ומרחק עבודה, אפילו בהגדלה גדולה גבוהה (למשל, 20 או 40 X). באופן ספציפי, מומלץ להשיג 20 X 1.0 נה עדשה טבילה במים, אשר נמכרת על ידי מספר חברות. שים לב כי, כאשר משתמשים טבילה עדשות, המטרה העדשה ואת נוזל טבילה צריך להיות מחומם ל- 37 מעלות צלזיוס. עבור התמונות הטובות ביותר, מומלץ להשתמש בהגדרות קונאפוקלית אופטימלית (קרי, חריר-1 יחידה אוורירי, לייזר כוח נמוך כמו רווח אפשרי, לא יותר מדי גבוה (במיוחד אם הרווח מציג רעש), קו מהירות מקסימלית, וכן אין חישוב ממוצע של סריקות). חשיפת יתר, רוויה, הפרש עוצמות בין תמונות לסכן את איכות הנתונים. מומלץ למנוע הרוויה של חשיפת יתר. זה יכול להיות מצויין רכישת תמונות בהגדרות שונות רווח. שינוי של הרווח הוא הדרך הקלה ביותר כדי לשנות את הבהירות של התמונה. במידת הצורך, ניתן לכוונן את עוצמת הלייזר. כדי לתקנן את איכות התמונה, שקופיות עם עוצמת קרינה פלואורסצנטית קבוע יכול לשמש. אחד יש לזכור כי גם כאשר המיקרוסקופ מוגדר בצורה אופטימלית, איכות התמונה נקבעת במידה רבה על-ידי האיכות של חלון תא, רקמה
בעת סריקה מספר סמני פלורסנט בו זמנית, בליד-דרך, שבה fluorophore אחד מתגלה הערוץ של עוד אחד, יש להמנע ממנו. הימנע בליד-דרך באמצעות שילוב של fluorophores עם ספקטרה חופפים מינימלי, רציפים סריקה בין מסגרות. התמונות שהוצגו כאן נסרקו באמצעות 3 סריקות רציפות (לעקוב אחרי 1: ה-GFP, DID או fluor647 עם לייזר 488, 633; רצועה 2: rhodamine, ודוקסיל או mTomato עם לייזר 543; ולעקוב אחר 3: Hoechst עם לייזר 405).
האפשרות של הערכת מספר שלבים של התפתחות כלי הגידול, עצה תא dynamics, היווצרות לומן, extravasation ונזק בכלי הדם מוצגים כאן. באמצעות קו eNOStag-GFP, אזורי גידול עם מיטה כלי הדם שנהרסו מאותרים בקלות על ידי מגורען שאריות הסלולר עדיין לבטא GFP. ללא סוכן להזרקה זוהה באזורים אלה, המציין את חוסר זרימה. פירושו של דבר מנוהל סוכנים כימותרפיות גם לא תגיע באזורים אלה. עם זאת, כלי הרס יכול להיות גם תוצאה טיפולית. הערכה טרום הגידול, כדי לבדוק אם טיפול טרום כלי הרס, היא תנאי מוקדם על הערכה טיפולית מדויקת, ניתן בקלות לבצע באמצעות עיצוב ניסיוני זה.
יש שפע של אפשרויות שעבורם ניתן להשתמש במיקרוסקופ intravital, דיון מפורט מעבר להיקף של פרסום זה. כדי לתת. תובנה קצרה, היישומים האפשריים כוללים מחקרים על ההצטברות של chemotherapeutics רקמת הגידול, הפיתוח של כלי (למשל, מספר כלי, סניפים, ובנקודות המפגש) ושל זרימת הדם, תא-תא אינטראקציות, תא מיקוד, עיבוד תאיים, וכן דוגמאות שהוזכרו לעיל, המוצג כאן. כמו ניתוח מבוסס על קרינה פלואורסצנטית, להיות מודע עוצמת תנודות בזכות האיכות של החלון או רקמה. כמו כן, כמו רקמת הגידול הוא יחסית עבה, זריחה מעל או מתחת למטוס של תצוגת יש השפעה על האות בתמונה. מומלץ לשלב את ניתוח כמותי תמונה עם מדידות אובייקטיביות. למשל, אם אתם מעוניינים בריכוזים סמים, להסיר את רקמת הגידול מחלון לאחר מיקרוסקופ intravital ולקבוע את התרופה תוכן באמצעות HPLC להשוות עם תמונות קונפוקלי.
ניתן לבצע הערכת התגובה הגידול כמו גם שימוש במודל זה, אבל עם כמה אמצעי. אחד חייב להבין כי גידולים גם לגדול פנימה, לתוך העור. ניתן לבצע מדידות תלת-ממד אם החדירה עמוק מספיק כדי לכסות את כל הגידול. במקרה כזה, יש להשתמש צבעי מרחיקת אדום. תא חלון כמו שמתואר כאן עסקאות עם גידולים בסביבה העור, חשוב לציין כי החלון שומרת על חום נמוך במקצת יותר הטמפרטורה בגוף העכבר הרגיל. לכן, עדיף ללמוד גידולים בהגדרת סביבתי נכון מיקרו לאשר לימודי intravital עם מהראש skinfold קאמרית חלון. חשוב, מהראש תא skinfold מציע תובנה קינטיקה של תהליכים ומנגנונים, ומספק בסיס אינסטרומנטלי עבור השיפור של טיפול. כמו כן, ניתן לקבל מידע נוסף על biodistribution ועל פרמקוקינטיקה. בסגנון קלאסי, מחקרים biodistribution אלה מבוצעים על ידי טיפול בבעלי-חיים נושאות, לנתח גידולים/איברים כדי למדוד את ספיגת התרופה. בעזרת המודל intravital המיקום intratumoral של תרופה (קרי, קרישה תוך-כלית, intratumoral, תאיים או גרעיני) יכולה להינתן5,25,26. הוא לא רק המיקום של הסם נחשף, אבל גם הזמן החלון הזדמנויות הקליטה האופטימלי ביותר.
באמצעות עיצוב ניסיוני המתוארות במאמר זה, ניתן להעריך מגוון רחב של פרמטרים באווירה הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית. באופן ספציפי, כאן אנו מראים שמיקרוסקופ intravital זה מספק תובנות חשובות הדינמיקה של התפתחות כלי הגידול, תגובה טיפולית.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות Rien ואן Haperen, ריני דה קרום על התרומה של קו eNOSTag-GFP, יוסט המקומות אקולוגיה לסיוע טכני שלו עם העבודה בעלי חיים, המטפלות בבעלי חיים על עזרתם ופיתוח שלהם. המתקנים מיקרוסקופ המשמש חלק המרכז דימות אופטי ארסמוס, אנחנו רוצים להודות לצוות OIC עבור השירות שלהם. מחקר זה נתמך על ידי מענק DDHK 2000-2224 מן האגודה לסרטן הולנדי, רוטרדם אוניברסיטת ארסמוס "Vereniging Trustfonds", "Stichting ארסמוס Heelkundig Kankeronderzoek", אנו מודים חברי הוועדות על התרומה הנדיבה שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D1145 | Supplemented with 10% FCS |
| Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | Make a 0.1% solution in PBS, sterile |
| PBS | |||
| Window frames | Costum made | ||
| Filler glass 10 mm, 0.55 mm | Abrisia technologies | ||
| Cover glass 12mm, #1 thickness | Thermo Scientific/VWR | 631-0713 | |
| Hear removal gel (veet) | for sensitive skin | ||
| Eye ointment | |||
| Buprenorfine hydrochloride | use 0.05 mg/kg | ||
| Anesthesia unit | O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone | ||
| insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green | BD | 324824 | |
| Needles 23G 1 1/4" | Braun | 4657640 | |
| Needles 25G 5/8" | Braun | 4657853 | |
| Sutures silkan 0.7 | Braun | 1134019 | |
| Nuts | Jeveka | 934 A2 1 | |
| Bolts | Jeveka | 84 A2 1 10 | |
| 0.9% NaCl | |||
| Microscope + software | The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal | ||
| Heated temperature controlled platform | Costum made | ||
| Window holder | Costum made | ||
| tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran | Invitrogen | D7139 | 100 µg/mouse |
| Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran | Invitrogen | D22914 | 100 µg/mouse |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 25 µg/mouse |
| Pegulated nanoparticles | ref 5 | ||
| LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope | Leica | ||
| LAS AF Software | Leica |
References
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14, 406-418 (2014).
- Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), pdb prot5452 (2010).
- Palmer, G. M., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent reporters. Nat. Protocols. 6, 1355-1366 (2011).
- Seynhaeve, A. L., et al. Tumor necrosis factor alpha mediates homogeneous distribution of liposomes in murine melanoma that contributes to a better tumor response. Cancer Res. 67, 9455-9462 (2007).
- Schiffelers, R. M., et al. Ligand-targeted liposomes directed against pathological vasculature. J Liposome Res. 12, 129-135 (2002).
- Straetemans, T., et al. T-cell receptor gene therapy in human melanoma-bearing immune-deficient mice: human but not mouse T cells recapitulate outcome of clinical studies. Hum Gene Ther. 23, 187-201 (2012).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- van Haperen, R., et al. Functional expression of endothelial nitric oxide synthase fused to green fluorescent protein in transgenic mice. Am J Pathol. 163, 1677-1686 (2003).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Manzoor, A. A., et al. Overcoming limitations in nanoparticle drug delivery: triggered, intravascular release to improve drug penetration into tumors. Cancer Res. 72, 5566-5575 (2012).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5, 1518-1534 (2010).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. J Vis Exp. , e50546 (2013).
- Hobbs, S. K., et al. Regulation of transport pathways in tumor vessels: role of tumor type and microenvironment. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4607-4612 (1998).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Koning, G. A., Eggermont, A. M., Lindner, L. H., Hagen, ten, L, T. Hyperthermia and thermosensitive liposomes for improved delivery of chemotherapeutic drugs to solid tumors. Pharm Res. 27, 1750-1754 (2010).
- Seynhaeve, A. L., Eggermont, A. M., ten Hagen, T. L. TNF and manipulation of the tumor cell-stromal interface: "ways to make chemotherapy effective". Front Biosci. 13, 3034-3045 (2008).
- Brouckaert, P., et al. Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics. Int J Cancer. 109, 442-448 (2004).
- Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., ten Hagen, L. T. Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats. Anticancer Drugs. 16, 667-674 (2005).
- Gabizon, A., et al. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54, 987-992 (1994).
- Bergers, G., Benjamin, L. E. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer. 3, 401-410 (2003).
- Eilken, H. M., Adams, R. H. Dynamics of endothelial cell behavior in sprouting angiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 22, 617-625 (2010).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. , e50088 (2013).
- van Vliet, M., et al. MR angiography of tumor-related vasculature: from the clinic to the micro-environment. Radiographics. 25, Suppl 1. S85-S97 (2005).
- Dicheva, B. M., et al. Cationic thermosensitive liposomes: a novel dual targeted heat-triggered drug delivery approach for endothelial and tumor cells. Nano Lett. 13, 2324-2331 (2013).
- Li, L., et al. Improved intratumoral nanoparticle extravasation and penetration by mild hyperthermia. J Control Release. 167, 130-137 (2013).
