我们目前使用的测定使用荧光共振能量转移(FRET)的读数蛋白质相互作用自动荧光寿命成像(FLIM)一个开源的高内涵分析(HCA)的仪器。此openFLIM-HCA仪数据采集是通过软件写入μManager和数据分析在FLIMfit进行控制。
We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in µManager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.
在药物发现1测定化合物库中越来越多地使用自动化的高内涵分析(HCA)是由对自动成像实验的系统研究, 例如 ,用于siRNA库的表型的屏幕在生命科学基础研究的趋势补充。自动HCA也成为了通常被实施与几十用常规显微镜成像细胞的菜肴手动试验规模较小生物学研究越来越重要。通过向测定和分析数百至数千视场的能力赋予的统计力量使实验噪声平均值(包括“生物噪音”)和图像数据的采集和大样本阵列分析的自动化可以帮助消除操作人员的偏见,往往可用于检测的系统误差,例如在采集过程中的IRF轮廓的变化的发生。基于荧光测定在HCA广泛实施,与大多数市售的HCA仪表设有荧光强度成像在一个或多个光谱信道映射的相对分布和标记的蛋白的共定位。更复杂的荧光成像模态,例如荧光寿命成像(FLIM),偏振各向异性成像和时间分辨荧光各向异性成像,没有被广泛利用在商业HCA仪器,虽然它们提供了强大的定量读数, 例如,蛋白质的相互作用。在这里,我们提出了一个开源的方式来为HCA自动化显微镜实现FLIM。
荧光寿命提供了可用于区分不同的分子种类或探测荧光团的局部分子环境是不敏感的荧光团浓度,激励/检测效率固有比例分光读出,并以scatte的冲击环和样品吸收2。此外,由于荧光寿命测量可以在单个光谱信道进行,它们是无需校准不同的仪器和样品之间直接比较。它们可以应用到内源性荧光团,包括一些细胞代谢产物,脂质和细胞外基质组分,以提供生物过程和病理的固有读数。因而无标记FLIM可以映射在细胞3,4-代谢改变和已被应用到监测干细胞分化5,6-和胶原支架7的生长。我们最近证明FLIM HCA可用于利用自发荧光8细胞代谢的自动化无标记测定。更常见的是,然而,荧光寿命测量和FLIM被施加到该标签特定的生物分子的外源荧光团,常常使用染色细胞区室的染料实现,使用染料耦合到antibodieS中的靶在固定的细胞特异性蛋白质,或使用耦合到特定的蛋白质的基因表达的荧光团。荧光寿命可以用于提供荧光探针感测其物理或化学环境的健壮定量读数。对于实施例,染料已部署以检测细胞膜9或细胞粘度10和基因表达的荧光蛋白质为基础的生物传感器的局部脂质相已被开发来报告细胞的浓度的信号分子包括如IP3 11,PIP2 12和钙蛋白酶13或离子如钙14,15,钾16和氯17。
许多这样的生物传感器利用荧光共振能量转移(FRET)18,19提供生物传感器的构象变化的读数。 “供体”和“受体”荧光团之间的FRET经由短程直接偶极相互作用产生对于其中的荧光团通常由小于约10纳米的分离。因此FRET的检测表明适当标记的蛋白质的紧密接近,因而提供了一种读出蛋白质-蛋白质相互作用20,例如结合或低聚-或者作为在固定的细胞或作为动态事件中的活时间过程的测量结束点细胞。通过标记与供体和受体荧光团的适当的分子构建体,也可以读出构象变化-或者裂解-经由FRET的变化构建体,这是许多生物传感器21的基础。的FRET效率测量可以提供供体 – 受体距离和供体荧光团经历FRET的人口比例的信息。因此,基于FRET的成像技术可以被用于映射和定量在空间和时间, 例如分子间的相互作用,以阐明细胞信号处理22。自动售货机ING这种成像技术可以根据信号通路或网络的读数提供高通量检测。
在HCA中,读出FRET最常实行的是光谱成像比例,其中受体供体强度比的变化映射。虽然这种方法很容易实现的-并且可在许多市售的多孔板读取器-定量光谱分辨FRET测量需要系统23的光谱响应的校准。这包括从受的光谱渗出通过与直接激发以及仪器的传输特性和样品(内滤效应)而产生的光谱串扰。原则上,这需要的是标有捐赠者要么只或受体,唯一的额外“对照”样品的测量。
从这种光谱比例的FRET的测量,一个有效的FRET效率(实际的FRET效率和FRETing供体/受体分子的级分的产物)可与供体和受体分子24的相对比例沿来获得。光谱比例的FRET通常与单分子FRET生物传感器,其中可以假设在供体/受体的化学计量被称为使用。为了确定FRETing供体和受体, 例如人口馏分,得到剂量反应曲线,需要的实际的FRET效率知识。这可通过测量与已知特性的正FRET对照样品或通过使用不同的方法来测量FRET效率,如受体漂白或FLIM获得。
使用荧光寿命读数,FRET可以检测和由单独的供体发射的测量量化 – 除去用于频谱校准和进一步对照样品的需要。因此,FLIM FRET读数可以仪器之间进行比较和不同样品之间-从内窥镜或活疾病模型25断层允许数据对基于细胞的试验的测量结果进行基准测试。通过安装供体荧光衰减曲线对应于FRETing和非FRETing捐助人群适当的多指数衰减模型,FRET效率和人口部分,原则上,可以直接而无需进一步测量获得。这些显著优点,但是,来在FLIM的成本,需要每像素多个检测到的光子比光谱分辨强度成像 – 通常数百光子被要求达到10%寿命判定的精度时嵌合于单指数衰减模型而当拟合荧光衰减曲线到复杂的(多指数衰减)模型,需要检测的光子数量增加到数千人。这通常导致长的采集时间(几十到几百秒,每六场EW)为FLIM,使用时间特别是当相关,在激光扫描显微镜顺序像素收购实现单光子计数(TCSPC)。试图通过使用较高的激发强度可以导致显著漂白和/或光毒性,以增加成像速度。与缺乏适当市售仪器和软件工具在一起,这已经从HCA被用于药物发现或系统生物学,其中数百至数千的视场是要被成像受阻FLIM。激光扫描TCSPC FLIM已在自动多孔板显微镜26进行二次测量,下面的“命中”由稳态偏振分辨荧光各向异性成像27,它可以达到类似的成像速度与它共享频谱比例成像28鉴定实施许多的优点和缺点。荧光各向异性成像利用下降在FRET的存在下受体的荧光各向异性和也是频谱串扰( 例如,受体的直接激发)很敏感。它需要校准以考虑偏振串扰并且不提供的FRET效率的直接测量。
为了实现FLIM为HCA的优点,我们已经努力解决图像采集的速度,并以该技术更广泛地获得等问题。在这里,我们提供了可以用于实现自动化的快速FLIM的多孔板是与典范的FRET基的测定法如下所述,一起读取开源软件和硬件组件的完整列表。在我们的方法29,FLIM是用宽视场的时间选通成像使用选通光图像增强器(GOI),其在图1,可以提供由于更快的成像速率和更低的漂白比单光束扫描TCSPC所示实现平行像素INTERRogation。我们openFLIM-HCA仪器可以提供无监督FLIM,只需要几秒钟就可以获取FLIM数据检测每像素几100光子(取决于样品的亮度)。与到样品从视先前场移动,来调整采集设置,并保持在焦点的样品所需要的时间相结合,这通常导致在多孔板采集时间〜10秒每视场25,28。光学切片可使用准宽视场尼普科夫(“旋转的光盘”)扫描器30来实现。
对于FLIM数据的分析,我们已经开发了一种叫做FLIMfit 31的开源软件工具,能够快速分析在传统PC工作站多孔板FLIM数据集,是OMERO 32插件。 FLIMfit规定,使FLIM数据进行拟合与邻复杂模型的全球分析能力(在1.2节中讨论)NLY每像素几100个光子的假设是,荧光寿命组分是整个图像或感兴趣区域(ROI)的区域不变下,因此降低了检测到的光子的所需的数量,光线照射到样品和图像采集时间。一个标准的台式电脑上运行FLIMfit,只需要的计算时间10秒秒来分析包括上百视场的数据集。从而既FLIM的数据采集和分析可以对用于HCA实际时间表进行。
openFLIM-HCA硬件
我们FLIM HCA的实施包括六个关键组成部分:(i)与光学自动对焦荧光显微镜框架; (ii)一种机动(XYZ)显微镜阶段; (iii)一种激发激光源; (四)一个宽视场时间选通FLIM系统,选通光增强(印度政府),延迟发生器和摄像头; (五)进行数据采集和分析以及(vi)一尼普科夫盘扫描器的计算机单位光学切片成像来抑制失焦光。成像弱信号, 例如 ,当从在细胞质膜的FRET生物传感器,能够通过从盖玻片或培养基的细胞质荧光或背景的贡献被淹没这可能是很重要的。时间选通FLIM的数据是通过照射与超短脉冲激发辐射样品,成像荧光发射到所述GOI的光电阴极和获取一系列所述GOI的荧光体的CCD图像为一系列的时间延迟的设定获取激励脉冲到来后的光增强大门。如以下励磁时间门延迟的增加,荧光信号被视为降低和串联在CCD获取的时间选通荧光强度图像的形成来分析所有的荧光团的衰变型材中的视场所需的数据集。所述GOI的选通同步于激发脉冲并且,对于该系列的CCD收购,门相对于激发脉冲的时间的延迟被设定为一个系列的所需范围增加的值。这种同步是使用延迟发生器,它包括一个“快滞箱”(在第1步PS拖延提供高达20纳秒)和一个“粗延迟盒子”,提供延迟25 ps的最小步实现。
对于FLIM,激励可通过任何超快激光来提供。为方便起见,我们通常采用光纤激光器泵浦超连续源横跨从该合适的激发辐射可以使用机动滤光轮具有不同带通滤波器的任何荧光团来选择可见光谱提供皮秒脉冲可调。通常情况下,我们使用〜100-200μW的平均功率在40或60兆赫兹的重复率与脉冲样本。这种激发功率也可以通过基于对倍频超快激光源提供锁模钛掺杂蓝宝石激光器。请注意,下面〜100ps的激励脉冲的持续时间是足以满足大多数实验。搭载中性密度滤镜的第二个电动滤光轮用于调节激发强度。为安全和方便,激发辐射可经由单模光纤递送。对宽视场FLIM的且光学切片FLIM的配置在图2和3分别呈现。对于所用的精密零件的详细信息,请访问openFLIM-HCA维基33。当前零件清单的副本在补充材料中给出。
对宽视场FLIM,激发辐射是需要尽可能均匀地照射的整个视场。为此,我们直接激发激光束到在10-50赫兹旋转时间平均激光散斑全息“顶帽”扩散器,与DIF平面定影被成像到物镜的显微镜透镜的后焦平面。从显微镜的输出端口的荧光图像被中继到所述GOI的光电阴极和所述GOI(有效面积的对角线18毫米)的荧光体被成像到冷却的科学的CCD(芯片尺寸10.2毫米×8.3毫米)的传感器相机采用了一对相机镜头提供的0.7倍率的。该系统由被接口到采用RS232协议的仪器的标准PC的控制。此外,一个Arduino微处理器是用于控制在所述激励光路的快门关闭除非当CCD摄像机获取FLIM的数据,并从该被用来测量从频谱过滤超连续平均功率的光电二极管记录信号激励源。为光学截面FLIM,激发激光辐射耦合到单模偏振保持光纤直接连接到所述尼普科夫盘扫描器单元,为shown在图3中。从尼普科夫扫描仪单元的输出荧光图像被中继到所述GOI的光电阴极与系统的其余部分是相同的为宽视场FLIM。
openFLIM-HCA软件
数据获取软件被写入μManager34。它提供了包括期权改变,其中板的孔进行成像序列,以获得时间进程为任何视场,以在测量过程中自动地保持焦点,并控制激发和发射滤光轮和分色变换器充分HCA数据采集功能自动化多色成像。它也可以以自动识别并记录适当的FOV的位置,根据标准, 例如 ,基于强度随后FLIM采集运行“预扫描”采集荧光强度。 FLIM HCA的数据可以保存为一个系列的TIFF文件,为一系列的OME TIFF文件( 即每FOV一个),或从多孔板结合所有数据的单一OME-TIFF文件。更多的信息和对μManager软件的详细描述可以在openFLIM-HCA维基33中找到。
数据分析软件,FLIMfit 31,为对OMERO图像数据管理平台32的基于MATLAB开源客户,是能够从OMERO服务器或计算机磁盘读取FLIM数据, 如图4所示。它已被设计成分析从TCSPC或宽视场时间选通FLIM的文书数据,并提供了许多功能,以从openFLIM-HCA拟合数据,包括拟合到单指数衰变型材,以及双指数和更高的复杂性衰变型材,包括模型,如偏振分辨荧光衰减曲线。它也可以采取固定和随时间变化的背景信号的帐户,并可以利用互联网宣传自丽泽测量的时空仪器响应函数(IRF)或可以适合使用的理想化的IRF可能时移通过从全实验的IRF测量确定的量的逐像素的基础上。在IRF和荧光样品之间的全局时间差异(t 0)可以由一个荧光标准的测量来确定。在背景信号和IRF空间变化也可以被考虑在内。 FLIMfit能够适应逐像素的基础上FLIM数据或使用“ 全局分级 ”或“ 全局拟合 ”,以方便与适度的(数百)FLIM数据拟合光子数到复杂的衰变模型。
全局分级办法涉及每个时间点汇集来自一个用户定义的ROI内的像素的所有检测到的光子,以提供足够的光子数,以使嵌合到复杂的衰变模型。在ROI可以是视场(FOV)的整个领域,它可以是手动ð由用户efined,或者它可以使用图像分割的工具来确定。在ROI也可以使用导入到从其他图像分割软件FLIMfit掩模限定。用于FRET应用中,通常使用全局分级以适合于双指数衰减模型来确定对应于FRETing和非FRETing供体荧光团被认为是在整个ROI空间不变的荧光寿命组件,然后改装上的逐像素的基础固定,以获得在每个像素中的FRETing施主人口馏分这些寿命成分的山谷。
全球拟合限嗣继承同时拟合横跨整个FOV-或跨FLIM数据集可以包括多个视场, 例如 ,从多孔板实验或时间序列荧光寿命图像的寿命组件和逐像素的FRETing献血人群分数。全球拟合能够利用的空间差来在整个图像人口馏分是在全局分级方法输给提供在组件的寿命估计强约束的-在显著更多的计算35的成本虽然- ,因此更可靠的结果。 FLIMfit可以快速分析与常规PC工作站与全球嵌合多孔板FLIM数据集,例如,多孔时间选通FLIM数据集,为每个394 FOV各自包含672×512象素五个时间门获得,只需要32秒和2 GB内存以适应双指数衰减模型31。这是通过利用可分离非线性使用多线程并行算法,以便在多核处理器和FLIMfit代码进行了优化,以减少内存使用有效的缩放实现最小二乘法拟合算法来实现。 图5示出FLIMfit的图形用户界面的快照并且可以在参考给定的36对全球拟合和全球分级的更多信息的网页上找到更多的细节可以参考31中找到。
使用我们openFLIM-HCA仪器和软件FLIM HCA以下协议可以适于范围广泛的与FLIM的读数细胞成像实验。在一般情况下,多孔板FRET实验的设计应包括的除了条件阳性和阴性生物控制重复孔正在研究中。这里,我们描述了具体的实施来执行光学截面FLIM( 见图3)表达的FRET构建体由通过短肽连接体连接的mTurquoise荧光蛋白和金星荧光蛋白的Cos细胞。这里mTq32V,mTq17V和mTq5V FRET结构(以代表性的成果中讨论)提供低,中,高效率的FRET连同非FRETing mTq5A构建。这些构建体并遵循该协议所要求的其他材料都列在材料清单。
我们所描述的自动多孔板显微镜使用时间选通FLIM为HCA设计的。该仪器是用写在μManager使用FLIMfit 36,写在Matlab和可作为OMERO客户端32μManager仪器的一个开源项目正在开展中的数据保存到一个OMERO服务器和FLIM数据分析选择开源软件控制控制软件,openFLIM-HCA,可在线33系统组件48的列表,使学术研究人员构建自己的FLIM HCA仪器。
为了获得健壮FLIM数据,有必要优化GOI和CCD采集设置,考虑到的任何变化的第t 0。如3.8.2所述,所述GOI增益设置和CCD照相机的积分时间应设置为达到〜CCD的动态范围的75%。 ü在每个时间门延迟唱更高GOI的电压和多个CCD的帧积累增加信噪比49,但是这增加了总FLIM的采集时间(因为更少的荧光光子CCD摄象机饱和物和帧积累的这样的数量之前每帧获得的应增加)等这种折衷应当决定每个实验。延迟发生器的校准取决于激光重复率,这是因此,有必要确保所使用的重复率的正确的校准文件被装入采集软件。用于校准延迟框的步骤可在openFLIM-HCA维基33中找到。
如果相比于荧光信号的细胞自发荧光低,我们使用的信号从一个孔含有只是培养基,以提供随时间变化的背景(TVB)。为了最小化从细胞培养基中的背景荧光,我们避免含有酚红的媒体。如果蜂窝自发荧光是显著,则无线电视可以由未标记细胞的测量得出。然而,在这种情况下,必须小心,因为这假定自体荧光背景是为图像中的每个像素是相同的。如果自发荧光跨细胞或如果激发束或检测灵敏度不均匀的视场显著变化这一假设将是无效的。
使用散射激发光脉冲在IRF图像的获取提供卷积与在嵌合过程中的数据模型的时间IRF信息,并且还提供在地图上的IRF跨越视场的空间变化的。该IRF可以通过成像散射样品使用分散来自尼普科夫圆盘提供了IRF的清洁测量激发光来测量,如胶体悬浮液,虽然在我们的仪器。时机邻精确测定F中的IRF是重要的,因为在激发和时间选通之间的时间延迟误差可以显著影响的嵌合过程中,特别是当嵌合到复指数衰变模型。在IRF使用散射的激发光不被需要正是对于拟合过程,因为它被记录在激发波长,而不是在荧光发射波长,这会影响它的定时,虽然在IRF的空间变化应该是相同的获取在两个波长。此外,该分散的IRF可以在全球范围内相对于真正的IRF时移由于从散射物体A型不同的光路长度,为的是在光学截面FLIM从尼普科夫盘获取的IRF的情况。这种校正, 叔 0,这是应该施加到所获取的散射激发光IRF中所需的全局时间偏移,是从单指数参考染料的数据计算为Protoc指示OL步4.4。以下染料可用于不同的激发波长:75μM香豆素153溶液在甲醇(τ〜4.3纳秒50)可用于在范围295-442纳米激发;在乙醇中的75微米的香豆素6溶液(τ〜2.43纳秒37)可用于在范围430-500纳米激发;和在水中的75微米罗丹明B溶液(τ〜1.7纳秒37)可以在范围488-575纳米用于激发。我们注意到,虽然它在FLIMfit使用不同的IRF为系统的每个像素是可能的,它通常是合理的,使该空间上变化的IRF具有用于在图像中的每个像素的同一时间轮廓的假设,但提出了一系列的空间变化相对于全局T 0的时间偏移。我们描述这种作为IRF变速图,这是从散射光的IRF确定。总之,IRF的轮廓,T 0和IRF变速图被用来连接确保在FOV每个像素配有一个适当的IRF。重要的是,T 0 的可以慢慢随着时间的推移,所以应该任何FLIM数据采集前测量而变化。
用户应决定如何采样的荧光衰减型材和需要设置时间门和激发后其相对延迟的宽度。在一般情况下,理想的是使用广泛栅极宽度以最大化所检测的信号,并且通常我们使用设置为4纳秒为标记有荧光蛋白的细胞的FLIM的栅极宽度。时间门延迟的数目应足以采样荧光衰变分布给出了将在分析中使用拟合模型的复杂性(包括一个栅极仅有激励脉冲之前测量的信号)。的最佳值可取决于寿命和衰减组件的相对幅度。在一般情况下,4个门足以嵌合单指数衰减,而7或更多的门可可用于更复杂的衰变模型。
我们注意到,FLIM可使用的范围内的时域或频域技术使用FRET 51的频域寿命读数来实现,并且多孔板阵列的自动FLIM HCA在一个(非切片)中的第一个实施宽视场显微镜。然后报告的第一个自动光学切片FLIM多孔板HCA利用宽视场时间选通成像28读者了。接着,宽视场(非切片)频域FLIM HCA应用于筛选跨越使用FRET 52基因文库和时间选通FLIM HCA翻译后修饰(酪氨酸磷酸化)已经被应用到FRET的HIV-1的Gag的测定法齐聚53和FOXM1 54和雷丘RhoA和Rac1的生物传感器33的SUMO化的。另外,也可以使用TCSPC为多孔板FLIM 26但迄今为止,已经证明具有挑战性的,以匹配吨他吞吐量的技术开发宽视场检测。一种新兴的方法,可以解决这个问题是利用单光子计数探测器阵列,如SPAD阵列55。
我们注意到,使用荧光蛋白荧光共振能量转移的任何读数应该谨慎和从FLIMfit或任何其他FLIM的分析软件获得将取决于与嵌合模型相关联的假设参数的绝对值进行处理。例如,当FRET供体具有显著第二衰减部件,使用双指数模型的拟合FRET FLIM数据可导致更快衰减分量的贡献,通常与FRETing人口比它应有的显示更高有关。因此,希望使用供体与单指数寿命如mTq2FP。即使这样,最近的研究已经表明,FRET分析仍然可以通过受体荧光蛋白或由暗状态的影响由于荧光团的构象具有多种生色角的分布和取向因子κ2的异质性的距离56。尽管如此,我们和其他人已经表明,FRET的荧光寿命读数做产生与生物化学测量关联,并且可以用于筛选蛋白质相互作用或遵循生物传感器的动态有用的结果。因此,本openFLIM HCA平台可应用于广泛利用FRET或细胞的自体荧光8,以及提供基于染料的探针25的定量读数荧光基于寿命的测定的。
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.
microscope frame | Olympus | IX81 | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
optical autofocus | Olympus | ZDC | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
motorized (x-y-z) microscope stage | Marzhauser | 00-24-565-0000 | Stage with Corvus controlle |
excitation laser source | Fianium | SC400-4 | Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/ |
gated optical intensifier | Kentech | High Rate Imager (HRI) | |
delay generators | Kentech | — | See agile delay generator and precision delay generator |
camera | Hamamatsu | ORCA-ER-II | |
Nipkow disc scanner unit | Yokogawa | CSU-X1 | http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/ |
Top hat diffuser | Thorlabs | ED1-S20-MD | Engineered diffusers |
mTq5V | Oxford Genetics | P3850 | mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker |
mTq17V | Oxford Genetics | P3847 | mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker |
mTq32V | Oxford Genetics | P3848 | mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker |
mTq5A | Oxford Genetics | P3849 | mTurquoise Amber construct |
HEK293T | — | — | cell type used |
phenol red-free HBSS | Sigma Aldrich | 55021C-1000ML | imaging media |
culture media | DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics | ||
DMEM | Sigma Aldrich | D6046-500ML | for culture media |
FBS | Sigma Aldrich | 12003C-500ML | for culture media |
xTremeGene9 | Sigma Aldrich | 6.37E+09 | for transfection, follow online protocol from La Roche |
trypsin/EDTA Solution | Thermo Fischer | R001100 | for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer |