Summary
우리는 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 기초 판독하여 단백질 상호 작용을 분석 자동화 형광 수명 이미징 (FLIM)을 이용하는 오픈 소스 고 함량 분석 (HCA) 기기를 제시한다. 이 openFLIM-HCA 기기에 대한 데이터 수집은 소프트웨어 μManager 작성 및 데이터 분석 FLIMfit에 착수에 의해 제어된다.
Introduction
분석 화합물 라이브러리에 대한 신약 개발 1 자동화 된 고 함량 분석 (HCA)의 사용 증가는 siRNA를 라이브러리의 표현형 화면에 대한 체계적인 연구, 예를 들어, 자동화 된 이미징 실험으로 생명 과학 기초 연구의 경향에 의해 보완된다. 자동화 된 HCA는 일반적으로 기존의 현미경으로 몇 군데 세포의 요리 수십와 수동 실험으로 구현 된 작은 규모의 생물학적 연구에 점점 더 중요 해지고있다. 보기의 필드의 수천 수백을 분석하고 분석 할 수있는 능력에 의해 부여 된 통계 전력 및 운영자 편견을 제거하고 자주 도움이 될 수 있습니다 이미지 데이터 수집 및 대형 샘플 배열 분석의 자동화 ( "생물학적 잡음"포함) 실험 잡음의 평균 수 이러한 취득시 IRF 프로파일의 변경으로 체계적인 오류의 발생을 검출하는데 사용될 수있다. 형광 기반의 분석가장 널리 시판 HCA 계측 상대적 분포 표지 단백질의 공동 지역화 매핑하는 하나 이상의 분광 채널에서 형광 강도를 갖춘 촬상와 HCA에 구현된다. 그들은 단백질 상호 작용의 예를 들어 강력한 양적 판독을 제공하지만, 이러한 형광 수명 이미징 (FLIM), 편광 이방성 이미징 및 시간 해결 형광 이방성 이미징과 같은 더 정교한 형광 이미징의 양식은, 널리, 상업 HCA 기기에서 악용되지 않습니다. 여기에서 우리는 HCA위한 자동화 현미경에 FLIM을 구현하는 오픈 소스 접근 방식을 제시한다.
형광 수명은 상이한 분자 화학 종을 구별 또는 형광의 로컬 분자 환경을 조사하고, 여기 / 검출 효율로 형광 농도에 민감하지 사용될 수있는 본질적으로 비율 적 광학적 판독을 제공하고, scatte의 영향링 및 샘플 흡수 2. 형광 수명 측정은 단일 채널 스펙트럼 할 수 때문에, 이들은 교정없이 다른 악기 샘플과 직접 비교된다. 이들은 생물학적 과정과 병리 극한 판독을 제공하는 일부 세포 대사, 지질 및 세포 외 매트릭스 성분을 포함 내인성 형광체에도 적용 할 수있다. 따라서, 라벨없는 FLIM 셀 3,4- 대사 변화를 매핑 할 수 있으며 줄기 세포의 분화 5,6- 콜라겐 지지체 (7)의 성장을 모니터링하기 위해 적용되었다. 최근 FLIM HCA는 형광도 8을 이용하여 세포 대사의 자동 라벨없는 분석을 위해 사용될 수 있음을 보여 주었다. 더 일반적으로, 그러나, 형광 수명 측정 및 FLIM 종종 antibodie하도록 결합 된 염료를 사용하여, 세포 구획 착색 염료를 사용하여 구현 특정 생체 분자를 형광 라벨 외인성에 적용특정 단백질에 결합 유전자 발현 형광체를 사용하여 고정 된 세포에서 특정 단백질을 대상으로, 또는의. 형광 수명은 물리적 또는 화학적 환경을 감지하는 형광 프로브 강력한 정량 판독을 제공하는데 사용될 수있다. 예를 들어, 염료를 포함한 신호 분자 세포 농도를보고하기 위해 개발 된 세포막 9 셀 점도 10 유전자 발현 형광 단백질 기반 바이오 센서의 로컬 지질 위상을 감지하도록 배치 된 IP3 11 PIP2 12, 카르 파인 13 또는 칼슘 14, 15, 칼륨 (16)과 염소 (17) 이온.
많은 이러한 바이오 센서는 바이오 센서의 형태 변화의 판독을 제공하기 위해 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) (18, 19)을 이용한다. '공여체'및 '수용체'형광체 간의 FRET은 단거리 직접 쌍극자 - 쌍극자 상호 작용을 통해 발생하는 형광은 일반적으로 ~ 10 나노 미터 이하로 구분됩니다. 따라서 FRET 검출 적절히 표지 된 단백질의 근접을 나타내며, 따라서 이러한 결합 또는 올리고머로서 단백질 - 단백질 상호 작용 (20)을 판독 할 수있는 수단을 제공한다 - 하나 라이브의 시간 경과 측정 고정 된 세포 또는 동적 이벤트의 종료 지점으로서 세포. 또는 절단 - - 공여체 및 형광 수용체 모두 적합한 분자 구조를 라벨링함으로써, 구조적 변화를 판독하는 것도 가능하다 FRET의 변화를 통해 구조체와이 많은 바이오 센서 (21)의 기초가된다. 프렛 효율 측정은 도너 - 억 셉터 거리 FRET을받은 도너 형광 인구 분획에 대한 정보를 제공 할 수있다. 따라서, FRET 기반 이미징 기술은 세포 신호 (22)를 처리 해명 시공간 예 : 분자 상호 작용을 매핑하고 정량하는데 사용될 수있다. 자동 판매기보내고 그러한 이미징 기술은 네트워크 경로 또는 신호의 판독에 기초하여 높은 처리량 분석을 제공 할 수있다.
HCA에서 가장 일반적으로 구현 FRET 판독은 도너 강도 수용체의 비의 변화가 매핑되는 분광 화상 비율 적이다. 이 방법은 쉽게 구현되어 있지만 - 많은 상업적으로 이용 가능한 멀티 웰 플레이트 리더로 사용할 수 있습니다 - 양적 스펙트럼 해결 FRET 측정 시스템 (23)의 스펙트럼 응답의 교정이 필요합니다. 이것은 스펙트럼 블리드 스루 직접 자극 수용체뿐만 아니라 기기의 전송 특성 및 시료 (내부 필터 효과)로 인한 스펙트럼 크로스 토크 (cross-talk)를 포함한다. 원칙적으로,이 중 공여체 또는 수용체 만 전용으로 표시되는 추가 "컨트롤"샘플의 측정을 수반한다.
이러한 스펙트럼 비율 계량 FRET 측정에서, 효과적인 FRET효율 (실제 FRET 효율성 FRETing 도너 / 억 셉터 분자 분획의 제조) 공여체 및 수용체 분자 (24)의 상대적인 비율을 함께 얻을 수있다. 스펙트럼 비율 적 FRET 종종 도너 / 억 셉터 화학량 알려진 것으로 가정 될 수있는 단 분자 FRET 바이오 센서와 함께 사용된다. 투여 량 반응 곡선을 얻기 위해 상기 FRETing 공여체 및 수용체, 예를 들어 인구 분획을 확인하기 위해 실제 FRET 효율성의 기술이 요구된다. 이는 공지 된 특성을 갖는 포지티브 FRET 제어 샘플을 측정함으로써, 또는 수용체 또는 광표백 FLIM 같이 FRET 효율성을 측정하는 다른 방법을 사용하여 얻을 수있다.
형광 수명 판독을 사용하여, FRET은 감지 형 도너 발광 측정에 의해 정량화 될 수있다 - 스펙트럼 보정 및 상기 대조 시료에 대한 필요성을 제거하는 단계를 포함한다. 따라서, FLIM FRET 판독은 악기 사이에 비교 될 수있다다른 샘플 사이 - 내시경 또는 라이브 질병 모델 (25)의 단층 촬영에서 허용하는 데이터 셀 기반 분석의 측정에 대해 벤치마킹한다. FRETing 비 FRETing 공여체 집단에 대응하는 적절한 멀티 지수 감쇠 모델 도너 형광 감쇠 프로파일 피팅함으로써 효율성과 인구 분획 원칙적으로, 상기 측정하지 않고 직접 얻을 수있다 FRET. 장착시 때 단일 지수 감쇠 모델로 10 %의 수명 판정의 정확도를 달성하기 위해 필요한 일반적으로 광자 수백 -이 중요한 장점이 있지만, 스펙트럼 해결 강도 화상보다 화소 당 검출 된 광자를 필요로 FLIM 비용에서 올 착체 (multiexponential 감쇠) 모델 피팅 형광 감쇄 정보는 검출 된 광자의 수는 수천 증가를 요구했다. 이것은 종래 (수십 VI의 필드 당 초 수백 긴 획득 시간을 주도하고있다EW) FLIM 위해, 시간을 사용하여 특히 레이저 스캐닝 현미경의 연속 픽셀 인수로 구현 단일 광자 계산 (TCSPC)를 상관 관계. 상당한 광표백 및 / 또는 광독성을 초래할 수 이상 여진 강도를 사용하여 영상화 속도를 증가하려고 시도. 함께 적절한 상업적으로 이용 가능한 장비 및 소프트웨어 도구의 부족이 수백보기의 필드의 수천을 이미지화 할 수있는 신약 개발이나 시스템 생물학에 대한 HCA에 사용되는 FLIM을 방해하고있다. 레이저 스캐닝 TCSPC FLIM은이 공유되는 스펙트럼 비율 적 이미지 (28)와 유사한 묘화 속도에 도달 할 수 정상 편광 - 분해 형광 이방성 영상 (27)에 의해 "히트"의 식별 후에 이차 측정 자동화 멀티 웰 플레이트 현미경 (26)에 구현 된 많은 장점과 단점. 형광 이방성 이미징은 감소 활용FRET의 존재하에 수용체 형광 이방성 또한 스펙트럼 크로스 토크 (수용체의 예를 들면, 직접 여기)에 민감하다. 이는 편파 크로스 토크를 고려하는 캘리브레이션이 필요하며 FRET 효율의 직접적인 측정을 제공하지 않는다.
HCA위한 FLIM의 이점을 실현하기 위해 화상 취득의 속도 및 기술 넓은 액세스 문제를 해결하기 위해 노력하고있다. 여기서는 모형 FRET - 기반 분석법과 함께, 후술하는 자동 급 FLIM 멀티 웰 플레이트 판독기를 구현하는데 이용 될 수있는 오픈 소스 소프트웨어 및 하드웨어 구성 요소의 전체 목록을 제공한다. 우리의 방법 29에서, FLIM 인해에 단일 빔 주사 TCSPC보다 빠르게 촬상 요금 및 하부 광표백을 제공 할 수있는도 1에 도시 된 게이트 형 광학 이미지 인 텐시 파이어 (GOI)를 사용하여 넓은 필드 시간 게이팅 이미징을 사용하여 실현 병렬 픽셀 INTERRogation. 우리 openFLIM HCA-악기 (샘플의 휘도)에 따라 픽셀 당 몇 백 광자 검출 FLIM 데이터를 획득하기 위해 단지 수 초를 필요 자율 FLIM을 제공 할 수있다. , 인수 설정을 조정하고 초점 샘플을 유지하기 위해,보기의 이전 필드에서 샘플을 이동하는 데 필요한 시간과 결합이 일반적으로보기 25, 28의 필드 당 ~의 멀티 웰 플레이트 수집 시간에 10 초를 초래한다. 광학 절편은 준 와이드 필드 Nipkow ( "스피닝 디스크") 스캐너 (30)를 이용하여 구현 될 수있다.
FLIM 데이터 분석을 위해, 우리는 빠른 속도로 기존 PC 워크 스테이션에서 멀티 웰 플레이트 FLIM 데이터 세트를 분석 할 수 있으며, 플러그인 OMERO 32입니다 FLIMfit (31)라는 오픈 소스 소프트웨어 도구를 개발했습니다. FLIMfit은 오와 복잡한 모델에 장착 될 FLIM 데이터를 사용 (1.2 절에서 논의) 글로벌 분석 기능을 제공합니다따라서 필요한 검출 된 광자의 수의 샘플 이미지 획득 시간으로 노광을 감소 형광 수명 성분 화상 또는 관심 (ROI)의 영역에 걸쳐 불변한다는 가정하에 화소 당 몇 백 광자 할수 있답니다. 표준 데스크톱 PC에 FLIMfit 실행, 영상 범위의 수백을 포함하는 데이터 세트를 분석하는 계산 시간 (초)의 10 초를 필요로한다. 따라서 두 FLIM 데이터 수집 및 분석 HCA에 대한 실용적인 시간 척도에서 수행 할 수 있습니다.
openFLIM-HCA 하드웨어
FLIM 된 HCA의 본 구현 예는 6 개 주요 구성 요소를 포함 : (ⅰ) 광학적 자동 초점 형광 현미경 프레임; (ⅱ) 전동 (XYZ) 현미경 단계; (ⅲ) 여기 레이저 광원; (ⅳ) 문이 광 증강 (GOI), 지연 발생기와 카메라 넓은 필드 시간 문 FLIM 시스템; (ⅴ) 데이터 수집 및 분석, (VI)를 Nipkow 디스크 스캐너 컴퓨터광학적으로 구분 이미징 유닛 포커스 빛 억제. 커버 슬립 또는 배양 배지로부터 세포질 형광 또는 배경의 기여에 의해 압도 될 수있는 세포의 원형질막 FRET 바이오 센서에서, 예를 들면 약한 신호를 촬상 할 때 중요 할 수있다. 타임 게이팅 FLIM 데이터는 초단 펄스 여기 방사선 샘플을 조명하는 GOI의 광 음극의 형광 방출을 이미징의 시간 지연의 설정의 범위의 GOI의 형광체의 CCD 이미지의 시리즈를 취득하여 취득 상기 여기 펄스의 도착 후 광 증강 게이트. 여기 다음 시간 게이트 지연이 증가함에 따라, 형광 신호가 감소하는 것으로되고, CCD에 취득 시간 게이트 된 형광 세기의 일련의 이미지는 시야에있는 모든 형광의 붕괴 정보를 분석하기 위해 필요한 상기 데이터 세트를 형성 . GOI의 게이팅은 여기 펄스에 동기화그리고, CCD 취득 일련 위해 여기 펄스까지의 시간 게이트 상대적인 지연은 원하는 범위의 값을 증가하는 일련으로 설정된다. 이 동기는 "빠르고 지연 상자"(1 PS 단계에서 20 ns의에 지연을 제공하는) 25 ps의 최소 단계 지연을 제공하는 "거친 지연 상자"를 포함하는 지연 발생기를 사용하여 달성된다.
FLIM 들어, 여기 모든 초고속 레이저에 의해 제공 될 수있다. 편의를 위해, 우리는 일반적으로 적절한 자극 방사선이 다른 대역 통과 필터를 전동 필터 휠을 사용하는 형광으로 선정 할 수있는 가시 광선 영역에 걸쳐 피코 초 펄스 동조를 제공하는 파이버 레이저 펌핑 초 연속 소스를 이용한다. 일반적으로, 우리는 40 또는 60 MHz의 반복율에서 펄스를 시료에 ~ 100-200 μW의 평균 전력을 사용한다. 이러한 여기 전력은 주파수의 두배에 기반 초고속 레이저 소스에 의해 제공 될 수있다모드 잠금 티타늄 도핑 된 사파이어 레이저. ~ 100 ps의 아래 여기 펄스 지속 시간은 대부분의 실험에 충분합니다. 감광 필터를 구비 한 제 전동식 필터 휠 여진 강도를 조절하는 데 사용된다. 안전과 편의를 위해, 여기 방사선은 단일 모드 광섬유를 통해 전달 될 수있다. 넓은 필드 FLIM 및 광학적으로 구분 FLIM의 구성은 각각 그림 2와 3에 제시되어있다. 사용 된 정확한 구성 요소에 대한 자세한 내용은 openFLIM-HCA 위키 (33)를 참조하십시오. 현재 부품 목록의 사본은 보충 자료에 나와있다.
넓은 필드 FLIM 들어, 여기 방사선은 가능한 한 균일 뷰 필드 전체를 조명 할 필요가있다. 이를 위해, 우리는 DIF의면에, 시간 평균 10-50 Hz에서 레이저 스펙 클 회전 홀로그램 "탑 햇"확산기의 여기 레이저 빔을 지향정착은 현미경 대물 렌즈의 초점면에 결상된다. 현미경의 출력 포트에서 형광 화상은 냉각 과학 CCD (칩 크기 10.2 mm X 8.3 mm)의 센서로 촬상 된 GOI의 광 음극 및 GOI (활성 영역 대각선 18mm)의 형광체에 중계된다 0.7의 배율을 제공하는 카메라 렌즈의 쌍을 사용하는 카메라. 시스템은 RS232 프로토콜을 사용하여 계측에 인터페이스되는 표준 PC에 의해 제어된다. 또한, Arduino를 마이크로 프로세서는 CCD 카메라 FLIM 데이터를 취득하고, 상기 스펙트럼 필터 초 연속의 평균 전력을 측정하는 데 사용되는 포토 다이오드로부터의 신호를 기록하는 경우를 제외하고는 폐쇄된다 여기 광 경로에서 셔터를 제어하는 데 사용 여기 원. 광학적으로 단면 한 FLIM 들어, 여기 레이저 방사선 (S)과 같이 Nipkow 디스크 스캐너 장치를 직접 연결하는 단일 모드 편광 유지 광섬유로 연결되고hown 그림 3인치 Nipkow 스캐너 유닛으로부터 출력 형광 화상은 GOI의 광 음극에 전달하고, 나머지 시스템 와이드 FLIM 필드와 동일하다.
openFLIM-HCA 소프트웨어
데이터 수집 소프트웨어 μManager (34)에 기입된다. 자동 측정하는 동안 초점을 유지하고, 여기 및 방사 필터 휠과 이색 체인저를 제어하는 임의의 FOV 시간 코스를 획득하기 위해 플레이트의 웰에 이미징되는 순서를 변경하는 옵션을 포함하여 전체 HCA 데이터 획득 기능을 제공 자동화 된 여러 가지 빛깔의 이미징. 자동 강도에 기초하여 예를 들어 기준에 따른 후속 FLIM 취득 적합한 영상 범위의 위치를 식별하고 기록하기 위해 형광 강도의 "프리 스캔"획득을 실행하는 것도 가능하다. FLIM HCA 데이터는 시리즈로 저장할 수 있습니다TIFF 파일, OME-TIFF 파일의 일련의 (즉, FOV 하나씩) 또는 멀티 웰 플레이트로부터의 모든 데이터를 포함하는 단일 - OME TIFF 파일로. 더 많은 정보와 μManager 소프트웨어에 대한 자세한 설명은 openFLIM-HCA 위키 (33)에서 찾을 수 있습니다.
데이터 분석 소프트웨어 (31)는 상기 OMERO 화상 데이터 관리 플랫폼 (32)의 오픈 소스 MATLAB 기반 클라이언트 FLIMfit,도 4에 나타내는 등의 OMERO 서버 또는 컴퓨터 디스크 FLIM 데이터를 판독 할 수있다. TCSPC 또는 와이드 필드 시간 게이팅 FLIM 기기로부터 데이터를 분석하도록 설계된 많은 기능을 붕괴 정보를 단지 수 피팅을 포함 openFLIM-HCA에서 데이터를 적합하고, 다음과 같은 모델을 포함하여, 지수 및 높은 복잡도 감쇠 프로파일을 두배로 제공 한 편광 해결 형광 붕괴 프로필. 또한 고정 된 시변 신호의 배경을 고려하고있다 UTI리제 측정 된 시공간적 측량기 응답 함수 (IRF) 또는 타임 - 쉬프트 전체 실험 IRF 측정으로부터 결정된 양만큼 화소 와이즈 기초 될 수있다 이상화 IRF를 사용하여 적합 할 수있다. IRF 형광 샘플 간의 전역 시간차 (t 0) 형광 표준의 측정으로부터 결정할 수있다. 배경 신호 IRF의 공간적 변화도 고려 될 수있다. FLIMfit는 픽셀 현명한 기준으로 FLIM 데이터에 맞게 할 수 또는 완만 한 (수백)와 FLIM 데이터의 피팅을 용이하게 복잡한 붕괴 모델 번호를 광양자하는 "글로벌 비닝 (binning)"또는 "글로벌 피팅"를 사용합니다.
글로벌 비닝은 각 시점에서의 사용자 정의 된 ROI 내의 모든 화소로부터 검출 된 광자를 집계하는 복합 감쇠 모델 피팅 있도록 충분히 광자 수를 제공하기 위해 수반한다. 투자 수익 (ROI)은보기의 전체 필드 (FOV)를 할 수 있습니다, 그것은 D 수동으로 할 수있다사용자 efined, 또는 이미지 분할 도구를 사용하여 결정될 수있다. 관심 영역은 다른 이미지 분할 소프트웨어로부터 FLIMfit로 반입 마스크를 사용하여 정의 될 수있다. FRET 어플리케이션의 경우, (A)에 다시 장착하는 후 ROI 걸쳐 공간적으로 불변하는 것으로 가정 FRETing 비 FRETing 도너 형광 단에 대응하는 형광 수명의 구성 요소를 결정하기 위해 두 지수 감쇠 모델에 맞게 글로벌 비닝을 사용하는 것이 일반적이다 각 화소의 FRETing 공여체 인구 분획을 얻기 위해 고정이 수명 성분 알엇와 화소 현명 기초.
글로벌 피팅 동시에 전체 FOV- 걸쳐 또는 멀티 웰 플레이트 실험 또는 형광 수명 화상의 시계열로부터, 예를 들면 복수의 영상 범위를 포함 할 수있는 FLIM 데이터 세트에 걸쳐 수명 성분 화소 와이즈 FRETing 공여체 인구 분획 피팅 수반한다. 글로벌 피팅 공간 variati을 악용 할 수있다따라서 더 신뢰할 수있는 결과 - -이기는하지만 훨씬 더 많은 계산 (35)의 비용 구성 요소 수명 추정에 강한 제약을 제공하는 글로벌 비닝 접근 방식에서 손실 된 이미지에 인구 분수의에. FLIMfit 빠르게 예를 들어와 기존 PC 워크 스테이션에 글로벌 피팅 멀티 웰 플레이트 FLIM 데이터 세트를 분석 할 수 있습니다, 32 초 필요로하는 672 X 512 픽셀을 포함하는 394 FOV 각 각 다섯 번 게이트로 획득 한 멀티 웰 시간 문 FLIM 데이터 세트, 메모리 2GB의 이중 지수 감쇠 모델 (31)에 적합합니다. 이것은 분리 비선형 멀티 코어 프로세서와 FLIMfit 코드 메모리 사용을 최소화하기 위해 최적화 된 효과적인 스케일링을 가능하게하는 멀티 스레드 병렬 알고리즘을 사용하여 구현 된 최소 제곱 맞춤 알고리즘을 이용하여 달성되었다. 도 5는 FLIMfit의 그래픽 사용자 인터페이스의 스냅 샷을 도시더 자세한 내용은 참조 글로벌 피팅 및 글로벌 비닝 (binning)에 36 자세한 정보를 제공 웹 페이지에서 찾을 수 있습니다 참조 (31)에서 찾을 수 있습니다.
우리 openFLIM HCA-계측 및 소프트웨어를 사용 FLIM 된 HCA의 다음 프로토콜 FLIM 판독 값 세포 이미징 실험의 넓은 범위에 적합 할 수있다. 일반적으로, 멀티 웰 플레이트는 실험 연구되고 조건에 더하여 양극과 음극 생물학적 제어 복제 웰을 포함하도록 설계되어야한다 FRET. 여기서는 광학적 단면 한 FLIM을 수행 할 수있는 특정 구현을 설명 FRET 짧은 펩타이드 링커에 의해 합류 mTurquoise 형광 단백질과 형광 단백질 금성 이루어진 구조체 발현 COS 세포의 (도 3 참조). 여기에 mTq32V, mTq17V 및 mTq5V 함께 비 FRETing mTq5A는 구성과 낮은, 중간 및 높은 FRET 효율을 제공 (대표 결과 섹션에서 설명) 구조를 FRET.이 구조와이 프로토콜을 수행하는 데 필요한 다른 재료는 재료 목록에 나열되어 있습니다.
Protocol
멀티 웰 플레이트 배열 1. 준비
- 기준 측정 t 0의 결정을 사용하는 에탄올 75 μm의 쿠마린 6 (τ ~ 2.43 NS)의 용액을 준비합니다.
- 종자 15 만 왜냐하면의 6 웰 플레이트의 네 우물에 세포 배양 배지에서 하룻밤 첨부 할 수 있습니다 (자료 목록 참조).
- mTq5A, mTq5V, mTq17V 및 mTq32V 24 시간 동안 제조업체의 지침과 문화에 따라 상업 형질 전환 시약을 사용하여 잘 하나 하나를 형질.
- 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 트립신 / EDTA 용액을 이용하여 세포를 분리.
- 이전에 폴리 -L- 라이신 처리 된 # 1.5 두께의 유리 바닥 (96) 멀티 웰 플레이트의 각 웰 A1-G3에 mTq5A을 표현 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)에 현탁 피펫 5,000 왜냐하면 세포. mTq5V이 우물의 A4-G6에 세포를 표현하기위한 반복, 우물 A10-G12에 웰 A5-G9과 mTq32V에 mTq17V. 빈 H1합니다 (멀티 웰 플레이트에서 모든 정적 배경의 측정을 제공하기 위해) 잘 둡니다.
- HBSS 피펫 200 μL 만 아니라 H2로 (세포 배양 배지에서 모든 백그라운드 신호 측정을 제공하기 위해).
- 피펫은 HBSS 5,000 비 형질 전환 세포가 잘 H3로 (휴대폰 형광도에서 어떤 배경 신호의 측정을 제공한다).
- 잘 H4에 75 μM 쿠마린 염료 용액의 피펫 200 μL은 (때문에 주위 온도의 변화 또는 레이저 또는 타이밍 회로의 변동에, 예를 들어 멀티 웰 플레이트 수집, 동안 t 0의 변화에 수표를 제공합니다.
2. openFLIM-HCA 데이터 수집
참고 : 자세한 정보는 openFLIM-HCA 위키 (33)에서 볼 수 있습니다.
- 시작 μManager과 OpenFLIM-HCA 플러그인
- 딜레이 생성기 유닛의 특정 조합에 대한 교정 파일을 선택하고"지연 상자 교정 파일 : 교정 파일 FLIM 제어"에서 레이저의 반복률.
- "설정 자료 폴더 파일"데이터가 아래에 저장 될 폴더를 설정합니다.
- 전달 광파이버 그 결합을 확인하기 위해 여기 빔의 경로를 확인하면 안정적이고 커플 링 효율이 파워 미터를 이용하여 전송 광섬유를 통해 전송 된 전력을 측정함으로써 최대화된다. 5 %보다 낮은 변동이 허용됩니다.
- 트리거 GOI이 GOI 입력 트리거 신호에 의해 트리거 오실로스코프에 GOI에서 모니터 출력 신호를 표시하여 안정되어 있는지 확인합니다.
- 750 V로 게인을 설정하고 릴레이 렌즈 중 하나를 중심으로하도록 GOI의 광 음극을 포함하여 CCD 센서 상에 GOI 형광체의 영상을 확인 GOI 커버 불구하고 누출에 의한 배경 광에 드문 드문 단일 광자 이벤트 이미지 ( )이 CCD에 기록 가능한 한 날카로운.
- 샘플 있는지 확인시야 균일 이러한 커버 슬립의 참조 염료 용액 방울로 균일 한 형광 샘플을 촬상 GOI 포화되지 않도록 충분히 낮은 여기 전력 (<1 μW)을 사용하여 조명된다.
- 해당 판 정의 파일을 선택, 즉, 96 웰 플레이트 옵션을 선택 ( "파일 :로드 플레이트 속성").
- μManager GUI를 사용하여, 빈 위치를 선택하여 현미경 프레임에는 다이크로 익 빔 스플리터 큐브가 없다는 것을 보장한다.
- 수동으로 전체 실험에 대한 GOI에서 4 NS의 게이트 폭을 선택합니다.
- IRF 화상 데이터를 취득 :
- μManager GUI를 사용하여, 빈 위치를 선택하여 상기 빔 경로에 현미경 대물이 없어야합니다. 수동으로 다시 현미경 프레임에 임의의 반사를 최소화하는 레이저 광 탈출 각도 않도록 대물 터릿 위에 흑색 알루마이트 빔 블록을 배치했다. <리>는 μManager GUI를 사용하여, 회전 Nipkow 디스크로부터 산란 된 여기 광의 일부는 촬상하지만 강도가 200 시스템을 포화 불충분 보장 될 수 있도록 CSUX (여진 이색, 배기 가스)의 필터를 설정 MS CCD 통합 시간. 이 광 음극에 손상을 줄 수 있습니다 너무 많은 빛에 GOI 광 음극 노출되지 않도록하는 것입니다.
- 프로그램 가능한 빠른 지연 상자에 포함 지연의 전체 범위 찾기 maxpoint 기능을 사용하십시오. 표시되는 출력도를 확인하고 전체 IRF 프로파일이 빠른 지연 상자의 스캔 범위 내에 있도록 앞으로 버튼을 눌러 수동 코스 지연 상자를 조정합니다.
- 인수 매개 변수 (중립 밀도, 노출 시간, 프레임 축적) 때문에 CCD는 밝은 시간 문에 포화되지 않고, 효과적인 통합 시간이> 200 밀리를 조정합니다.
- 전체 지연 이상 25 P의 설정 지연 단계를 울렸다전자 ( "FLIM 제어 : 빠른 지연 상자 : 지연을 채 웁니다").
- "스냅 FLIM 이미지"를 눌러 IRF 이미지를 획득.
- 레이저 차단하여 배경 이미지를 획득 ( "빛 경로 제어를 중립 밀도 : 차단"), 지연의 수 ( "FLIM 제어 : 빠른 지연 상자 : 현재 지연 설정 (PS)을") 감소, 변경되지 않은 다른 모든 속성을 떠나 를 눌러 "스냅 FLIM 이미지".
- 잘 μManager GUI를 사용하여 H4 선택 ( "XYZ 제어 : 잘 이동 : H4"참조).
- mTqFP 이미징을위한 μManager GUI를 선택 필터 (여진 17분의 434 nm의, 다이크로 익, 배출 25분의 482의 나노 미터)를 사용.
- 빠른 지연 상자의 전체 범위 찾기 maxpoint 기능을 사용하여 전체 붕괴 프로파일이 빠른 지연 상자의 지연 범위 내에 있도록 다음 코스 지연 상자를 조정합니다.
- 지연을 설정"빠른 지연 상자 : 현재 지연 설정 (PS) FLIM 제어"를 변경하여 최대 강도의 지점. 은 CCD가 포화되지 않도록 수집 매개 변수 (감광, 노출 시간)을 조정한다.
- 전체 지연 범위에서 25 PS의 설정 지연 단계 ( "FLIM 제어 : 빠른 지연 상자를 지연 채우기).
- "스냅 FLIM 이미지"를 누르면 기준 염료 데이터를 획득.
- 여기 레이저를 차단함으로써 제 2 배경 CCD 카메라 화상을 취득 (2.11.7 참조)
- 우물이 몇 군데해야 설정 및 FOV의 숫자가 아니라 ( "XYZ 위치를 설정 HCA 시퀀스 인수")에 따라 획득 할 수 있습니다.
- 수동으로 샘플을 포함하는 모형의 FOV가 몇 군데를 선택합니다. GOI에서 최적의 감광 필터, 게이트 폭을 결정하기 위해이 FOV를 사용카메라 일체형 시간 CCD 카메라의 동적 범위의 75 %에 도달하도록.
- 설정 자동 초점 ( "XYZ 제어 : 자동 초점")을 눌러 "반환 초점 제어 만은"다음 수동으로 세포 또는 관심의 구조에 초점을 맞 춥니 다. 2000 μm의하고 Enter 키를 누르십시오 "입력"을 "자동 초점 검색 범위"를 설정합니다. 보도는 "AF는 이제"자동 초점 절차를 시작합니다. 오프셋 값은 필드 "FocusOffset (자동 초점)"에 표시됩니다.
- 자동 초점 시스템의 올바른 작동을 나타내는, "AF 오프셋"에 2.13.3에서 얻은 오프셋 값을 입력하고 오프셋 값이 지금 제로 있는지 확인하기 위해 ( "AF 지금")의 두 배 자동 초점 절차를 반복합니다.
- 지연 포인트의 로그 샘플링을 선택합니다 OpenFLIM-HCA 수집 소프트웨어의 "AutoGate"기능을 사용합니다. 또한, 이러한 수동으로 선택할 수 있습니다, 참조 참조자세한 내용은 36 줬어.
- 수율은 총 데이터 수집 시간을 요구하는 값으로 "누산 프레임"을 설정합니다. 축적 된 프레임의 수를 증가 시키면 증가 총 FLIM 데이터 획득 시간의 희생 FLIM 데이터의 신호 대 잡음 비를 증가시킨다.
- 은 "HCA 시퀀스 시작"버튼을 눌러 멀티 웰 플레이트의 FLIM 수집을 실행합니다.
3. openFLIM-HCA 데이터 분석 FLIMfit 사용
- FLIM 데이터 분석이 필요한 보조 파일이 존재 확인 (즉, IRF 참조 염료 측정).
- 빈도 (H1)에서 데이터를로드, 잘 포함하는 배지 (H2)와 문화 매체에 잘 포함 된 레이블이없는 세포 (H3) FLIMfit에( "파일 :로드 FLIM 데이터") 웰 A1-G3에, 즉, "기증자 전용"발현하는 세포에서보다 큰 1 % 신호의 배경 기여가 있는지 확인합니다.
- ( "로드 FLIM 데이터 파일") FLIMfit에 잘 문화 매체를로드하여 시간에 따라 변화하는 배경 (TVB) 파일을 준비합니다. 섹션 2.14에서 획득 한 카메라 배경 데이터로드 ( "배경 :로드 배경을")와 FLIMfit 옵션 "도구 : TVB의 강도지도 만들기"를 사용 TVB를 생성합니다. TVB에 대한 자세한 사항 31을 참조하십시오.
- 섹션 2.11에서 획득 한 IRF 데이터를로드하여 공간적으로 변화하는 IRF 시프트지도를 준비하고 절 2.11.7에서 취득 된 CCD 카메라 배경을 뺍니다. FLIMfit 옵션 "도구 : IRF 만들기지도를 Shift 키"를 사용 공간 IRF지도 시프트 변하는 계산합니다. IRF 시프트지도에 대한 세부 사항에 대한 기준 [31]을 참조하십시오.
- monoexponen를 장착섹션 2.12에서 취득한 참조 염색은 최초 데이터 붕괴. 로드 참조 염료 및 3.4 절에서 계산 된 공간적으로 변화하는 IRF지도, 설정에 맞게 매개 변수 ( "수명 : 호 특급 : 1")를 장착 매개 변수로 t에 0 세트 ( "수명 : FIT IRF 이동 : 장착"). 얻어진 t 0의 값은 "매개 변수"탭에 도시 된 표에보고된다.
- 섹션 2.13에서 획득 한 실험 FLIM 데이터를로드하여 FLIM 데이터를 분석, 공간적 변화 IRF지도 3.4 절에서 계산, 섹션 2.14에서 획득 한 카메라 배경은 TVB 파일을 얻을 t 0의 음의 값에 3.3를 입력 준비 섹션 3.5 ( "IRF : IRF 이동 : t 0"). 그런 다음, 실험 조건에 따라 36 FLIMfit 사용하여 원하는 감쇠 모델 실험 데이터를 장착한다.
Representative Results
openFLIM-HCA 계측의 기능을 설명하기 위해, 우리는 세 가지 모형 FRET 응용 프로그램을 제시한다. 첫 번째 문제는 스티븐 보겔의 실험실 (38)에 의해 개발 FRET 모델 구조에서 적응 구조를 FRET. 이들은 도너 형광 단백질 (mTurquoise)가 5, 17 및 32 개 아미노산 (mTq5V, mTq17V, mTq32V)의 짧은 제어 길이에 의해 수용체 형광 (금성)에 연결되어있는 유전자 발현 형광 구조의 시리즈를 포함한다. 도너 및 억 셉터 형광체 간의 상이한 링커 길이는 다른 FRET 효율성 때문에 다른 도너 수명 초래한다. 음의 제어를 제공하기 위해, 짧은 5 아미노산 링커 구조의 금성이 황색으로 대체는 - FRET 셉터 (38)의 역할을 할 수 YFP의 비 형광 돌연변이 (mTq5A 참조). 우리는 VECT을 소화 제한하여 원래 pCXV 및 pC5A 벡터에 세룰 리안 교체된 NheI 및 BglII에 효소와 결찰 mTurquoise 파편 ORS는 pmTurquoise-N1 벡터에서 같은 효소를 사용하여 소화. 링커 영역이 대체 비 변성했다.
도 6은 일례의 FLIM은 멀티 웰 플레이트는 3 열로 배열 된 COS 세포에서 발현이 모델 시스템을 사용하여 분석을 FRET 제시 음성 대조군 형질 각 셀 (컬럼 1-3)의 5 아미노산 링커 구성 FRET (컬럼 4-6), 17 아미노산 링커 (컬럼 7-9) 및 32 아미노산 링커 구성 (10-12 열)을 구성 FRET FRET. 행 H는 TVB 추정을위한 우물이 포함되어 있습니다. 도 6은 (a) 각각의 웰에서 볼 일반적인 필드의 자동 취득 형광 수명 이미지의 예를 도시한다. 이 음성 대조군 (컬럼 1-3)는 긴 수명을 제공하는 것이 명백하며, 도너 수명이라는 FRET 최저 최단 링커에서 LEN로 구성GTH (열 4-6). 도 6 (b) 잘 멀티 웰 플레이트에 걸쳐 변화하는 평균 수명이 각각의 모든 영상 범위에 걸쳐 평균화하는 방법이다. 도 6 (c)와 (d)는 각각 mTq5A 및 mTq17V의 FOV에 대해 모형 도너 형광 강도 병합 수명지도를 보여준다. 도 6의 (e) 상기 도너 형광 강도 감쇠 프로필 함께 단지 수 붕괴 모델합니다 (GOI 게이트 폭에 의해 지배 됨) IRF 맞추기와 A1 잘 이미지화 모든 셀에 대해 평균이다. 도 6의 (f)는 픽셀 - 방향 단지 수 피트로부터 얻어지는 멀티 웰 플레이트의 각각의 컬럼에 대한 평균 형광 수명을 나타낸다. 평균 수명 및 표준 편차 (STD)의 테이블은 아래 표 1에서 찾을 수있다. 도 6에 도시 된 이미지에 대한 데이터 수집은 취득 약 160 분 걸렸다. 분석은 10 코어와 64 G와 2.6 GHz의 컴퓨터에 (92)의했다RAM의 B.
제 모형 분석이 프로세스 25,42의 억제제를 시험하기위한 수단으로 HIV-1 비리 온의 조립시 HIV-1의 개그 올리고머를 판독하는 FLIM FRET의 적용을 예시한다. 이 HIV-1 비리 미숙 비슷 바이러스 - 유사 입자 (VLP를)의 형성을 유도 이후 적절한 숙주 세포에서 발현하는 HIV-1 개그는 HIV-1 기간이 단계를위한 모델 시스템을 제공한다. 이 분석을 위해, 우리는 HIV-1 개그 단백질 HeLa 세포에서 CFP와 융합과 개그 올리고머에서 발생시킨 FRET 신호에 미치는 영향을 통해 다른 억제제의 작용을 비교 표명했다. 사용되는 억제제의 상세 기준 (42)에 제공된다.
샘플 제조 및 실험 측정의 세부 사항은 우리가 보 판독 FLIM를 사용할 수 있다고 입증 기준 25에 포괄적으로 기재되어CFP와 YFP와 확률 적 표지, 또한 CFP 표지 만 개그를 발현하는 세포에 homoFRET 개그 단백질을 집계 사이의 일 heteroFRET. homoFRET 일반적 도너 수명 변화를 나타내지 않지만, 상기 형광 물질이 서로 다른 평균 형광 수명 40,41 두 이성질체에 존재 CFP의 특별한 경우에 대해한다. CFP 호모-FRET 판독 값은 CFP / YFP 헤테로-FRET에 비해 단순화 된 샘플 준비의 장점을 가지고 있으며, 다중 FRET 판독에 중요 할 수있는 효율적인 더 스펙트럼이다.
우리의 이전 작업은 FLIM는 N-myristoyltransferase (NMT) (42) 억제제의 존재하에 개그 올리고머를 분석하는 FRET 적용했다. 이 억제제는 세포막에 결합하는 단백질 개그 가능하고 HIV 비리 나의 형성에 필수 43 개그에 미리 스틴 산의 첨가에 책임이있는 내인성 효소를 방해VLP를. 우리는 모두 heteroFRET 및 homoFRET 판독이 NMT 억제제 투여 량 반응 연구> 0.6 Z '를 달성 할 수 있음을 보여 주었다. > 0.5 - Z '는 Z와 세이의 품질을 나타 내기 위해 제약 산업에서 사용되는 매개 변수이며 분석 품질의 단일 값 메트릭을 생성하기 위해 양극 및 음극 제어 평균값과 상대 스프레드의 차이를 나타내는' 약제 학적 분석 (44)은 "우수"로 간주된다. 우리는이 우수한 성능은 평균 도너 수명에서의 변화는 300 PS의 순서였다하는 샘플 달성되었음을 유의 - 유용한 판독 가능 세포의 다수에 대해 FLIM 데이터 분석의 통계적 힘을 보여주는 실현할 훨씬 작게하여 수동 현미경 실험 묘화 셀의 대표적인 숫자 가능한 것보다 형광 수명 변화.
여기, 우리는 멀티 웰 플레이트 FLIM는 HIV 개그 올리고머 4 억제제 화합물 (지정 ICL13, ICL14, ICL15 & ICL16)를 비교하는 설정 데이터는 FRET 제시한다. 이 실험을 위해, 우리는 일시적 개그-CFP 플라스미드로 형질 감염 HeLa 세포로 homoFRET 판독을 이용했다. 각 억제제의 9 개의 서로 다른 용량의 총 상태 당이 반복 우물을 허용 기준 (32)에 설명 된 표준 프로토콜 다음 적용되었다. 양성 대조군으로, 1 열 MYR-개그 VLPs를 형성하고 있으므로 총 억제를 시뮬레이션 할 수없는 미리스트 산 잔기를 결핍 돌연변이 개그 단백질을 발현하는 세포를 제공한다. 음성 대조군은 다른 열 (11 열)의 억제제를 제공하는 데 단지 비히클 개그-CFP 발현 세포 투여에 의해 제공되었다. 팔 FOV의 총 잘마다 획득했다.
데이터는 픽셀 단위로 하나의 지수 형 감쇠 모델 및 형광 수명 도면 되었음 붙였다(보기의 8 분야에 걸쳐 강도 임계 값 이상의 모든 픽셀 이상)도 당 평균 수명을 보여주는 전자지도는 그림 7에 아래 그림의 (a). 도 7 (b)는 억제제 농도의 함수로서 형광 수명의 대응하는 그래프를 보여준다. 개그-CFP를 발현하는 세포와 함께 배양 할 때 억제제의 세 억제 효과 (ICL13, ICL15 & ICL16)를 보여줍니다. 하나의 억제제 (ICL14)를 테스트하는 용량에 영향을 보여줍니다. 이 판에 대한 계산 Z '는 0.51이었다. 양 및 음의 컨트롤에 대해 얻어진 값은도 7에 도시되어있다 (b) 100 μM에서 0.1 nM의 검은 점에있다.
도에 도시 ICL13, ICL15 및 ICL16 대한 투여 량 반응 곡선을도 7 (b) 다음에 고정 된 최대 및 최소 수명 1 (45)에 고정 된 힐 계수 4 변수 로지스틱 비선형 회귀 모델에 장착 된양 (1 열)과 음극 (열 11)에서 얻은 값은 각각 제어한다. 세 곡선의 반환 IC (50) 값은 다음과 같다 : 38 nm의 24 nm의 116 nm의 ICL13, ICL15 및 ICL16에 대해 각각. 세포 내 FLIM을 통해 얻은 IC (50) 값과의 비교를 위해 측정 FRET, 우리는 이전에보고 된 생화학 적 효소 분석 (42)의 재조합 인간 NMT1의 효소 활성의 억제를위한 IC (50)를 결정했다. FLIM FRET에 의해 활성화 될 것으로 세 가지 화합물이 분석에서 가장 활성 (IC는 17 nM의 51 nm의, 각각 ICL13, ICL15 및 ICL16, 39 nM의 50 값) ICL14과는 유의 한 반응을 보였다없는 FLIM FRET 분석에서,되는 약 NMT1 (1,700 nm 인 IC 50)에 대해 덜 활동 100 배. 활성 화합물, 이러한 독립적 인 분석을 통해 얻어진 양상 IC 50 값은 D로 인한 가능성 사소한 변형을 현저하게 유사한흡수 또는 세포에서 화합물의 대사 ifferences.
이 작은 연구 관심 동일한 대상에 작용하는 상이한 화합물의 효능을 구별하기 FLIM 된 HCA의 능력을 강조한다. 우리는 다수의 투여 량 반응 곡선을 생성하기 위해 고 함량의 컨텍스트에서 자동 FLIM을 사용하여 스크린의 제 시연하고 스크리닝에인가 및 / 또는 유용한 치료 학적 화합물을 특성화 할 FLIM 가능성을 나타낸다 믿는다.
세 번째 모범 FLIM FRET 실험 캠프에 특이 적으로 결합하는 랩-1 구아닌 교환 요인 환상 아데노신 모노 포스페이트 (캠프 (EPAC))에 의해 활성화 교환 단백질에 대한 유전자 발현 FRET 바이오 센서에 관한 것이다. 이 EPAC FRET 바이오 센서 (EPAC S-H188)의 도너 형광 단으로 mTurquoise2 형광 단백질 (mTq2FP)를 사용하고, CO를 구현하는 두 금성-FP를 포함수용체 (46) mposite. 캠프는 유비쿼터스 두 번째 메신저 및 많은 다른 생물을 통해 세포 내 프로세스의 과다에 참여하고있다. 이것은 세포막에서 ATP의 전환에서 아데 닐 레이트 사이 클라 제에 의해 합성된다. 여기에서 우리는 판독 포스 콜린, 캠프의 세포 내 생산을 상향 조절 때문에 그 세포질 농도를 증가시키는 아데 닐 레이트 사이 클라 제 활성화의 추가를 따르는 라이브 HEK293T 세포에서 활성을 정량화 할 수있는 능력을 보여줍니다. 캠프는 바이오 센서의 개통에 이르게으로이 EPAC 센서는 비활성화 (언 바운드) 상태에서 FRET 및 캠프 농도의 기부자 수명 증가를 겪는다. mTq2FP의 단일 지수 붕괴 프로파일은 CFP 기반의 바이오 센서 (45)보다 정량적 인 수명 분석이 바이오 센서가 더 적합합니다. 우리의 변화를 플롯 한 곳에도 8은 자동화 된 멀티 웰 플레이트 FLIM 현미경을 이용하여 기록 된 시간 과정의 예를 도시평균 수명이 100 μM의 포스 콜린의 첨가 다음 시간 경과 FRETing 공여체 인구 부분에서의 변화이다. 단순성을 위해, 우리는 전체 신호가 시계열에 걸쳐 이중 지수 감쇠 프로파일 피팅 얻었다 단지 수 FRETing 비 FRETing 도너 및 활성화 EPAC FRET 바이오 센서의 인구 분획의 혼합물에 의해 설명 될 수 있다고 가정한다.
4000 P의 게이트 폭 캠프 (EPAC) 다섯 게이트 지연의 데이터 수집을 위해, 1300 PS, 4300 PS (피크 강도), 4919 (PS), 6656 (PS), 8035 (PS)를 1로 설정 한 지연 시간을 선택하고, 0391 PS 및 16,000 추신. 각각의 지연에 대한 카메라 통합 시간은 250 밀리이었다. 하나에서 잘, 우리는 10 분에 걸쳐 매 10 초를 인수 이미지와 FLIM 시간 코스를 인수했다. 포스 콜린의 첨가 그에 샘플의 초점 위치의 작은 변화를 야기하기 때문에 시간 120 초, 130 초로 취득 된 데이터 요소를 제거하고이 시점에서의 FLIM 획득 동안 기록 된 형광 강도의 예.
데이터 분석을 위해 이미지 FLIMfit에로드 셀별로 분단. 형광 수명 데이터는 IRF를 사용하여 이중 지수 감쇠 모델 및 기준 염료 (75 μM 쿠마린 6)로부터 얻어진 t 고정 값 0에 장착 하였다. 도너 형광도 8에 도시되어 수명이 모든 셀에 걸쳐 평균 된 평균 (a). 도 8 (b) 동일한 이중 지수 감쇠 모델로 FLIM 같은 데이터를 피팅함으로써 계산 시간의 경과 FRETing 인구 비율의 변화를 나타낸다
여기서 β는 FRETing 공여체 분획이다. 우리 FRETing 비 FRETing eleme의 혼합물을 가정포스 콜린을 첨가하기 전에 시간 포인트 NTS. 이러한 수명을 얻기 위해서는, 더블 지수 피팅은 FRETing 공여체 대한 비 FRETing 공여체 1 = 3964 ± 21 PS τ의 수명주기의 처음 세 시점에인가하고, τ 2 = 3022 ± 27 PS 하였다. 이 각 시점에서 β 값을 얻기 위해 설정 한 전체 데이터의 후속 맞는 고정 하였다.
요약하면, 우리는 세 가지 실험 샘플에 대한 모범 FLIM HCA의 결과를 발표했다. 첫번째 FRET는 금성 FP 수용체 황색 펩티드 링커의 길이를 변화시킴으로써 구성하는 비 형광 하나에 연결된 mTqFP 공여체를 포함하는 발현 구조체 COS 세포로 배열 된 96 웰 플레이트였다. 링커 길이 FRET에 따라서 효율 및 수명 도너의 변화는 분명히 명백 각 구조에 대한 평균 수명의 표준 편차보다 36 PS이었다. 두 번째 모범 ASSAY는 억제율 (%)은 CFP 표지 개그 단백질을 발현하는 HeLa 세포에서 측정 억제제 농도 평균 도너 형광 수명의 변화로부터 계산 된 위해 HIV 개그 단백질 미리 스토 일화 네 전위 억제제 "화면"이었다. 이 판독은 일반적으로 기증자 수명의 변화를 제시하지만,이 서로 다른 형광 수명 여러 이성질체에 존재하기 때문에 CFP의 경우와하지 않을 homoFRET 기반으로합니다. 이것은 다중 다른 FRET 판독 (25)에 대한 스펙트럼 효율, 예를 들어, 측면에서 유용 할 수 있습니다. 세 번째 모형 분석은 캠프 FRET 바이오 센서, EPAC을 표현 라이브 HEK293T 세포를 모니터링 시간의 과정이었다. 우리는 이전에 천칭 FRET의 biosen에 도시 한 바와 같이 -이 포스 콜린 치료 및 생균 촬상 상응되는 검출 된 광자의 수의 두 배 지수 감쇠 모델을 사용 FLIMfit의인가 다음 예상 응답을 보였다IP3 47 SOR.
문이 광학 이미지 인 텐시 (GOI)를 사용하여 넓은 필드 시간 문 FLIM 그림 1. 도식. 왼쪽은 실험 시스템의 개략도를 나타낸다. 오른쪽 위, 여기 펄스의 개략적 인 시간 문이 이미지와 데이터를 단지 수에 맞는 위치. 실험 시스템에 표시된 두 개체에서 형광 붕괴를 보여주는 오른쪽 아래, 만화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
문이 광학 이미지 인 텐시 (GOI)를 사용하여 넓은 필드 openFLIM-HCA 그림 2. 도식. 의 자세한 설명은 본문 참조시스템 구성 요소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 도식은 광학적으로 Nipkow 디스크 스캐너 장치와 함께 문이 광학 이미지 인 텐시 (GOI)를 사용하여 openFLIM-HCA를 구분. 시스템 구성 요소의 더 자세한 설명은 본문을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
관리자 취득 프로그램에서 화상 데이터의 흐름도 4는 회로도 분석 서버 또는 컴퓨터 디스크와 FLIMfit로를 OMERO한다. 데이터 흐름은 상단 리터에서 시작 원시 이미지 데이터는 μ-관리자 수집 소프트웨어에 취득 EFT 코너. 이러한 외부의 데이터 수집 및 저장에 대응하면서 점선 박스 내의 아이템은 FLIM 데이터 분석의 각 단계를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
FLIMfit 사용자 인터페이스 그림 5. 스크린 샷. 왼쪽 상단,보기의 필드 목록에는 현재로드 뷰의 현재 선택된 필드의 형광 강도 이미지입니다. 왼쪽 아래, 피팅 모델과 피팅 조건의 선택. 데이터에 맞게 오른쪽 위, 관심 (파란색 원)의 현재 영역에 대한 형광 붕괴, (레드 라인), IRF 아래에 맞는 잔차 (파란색 선)와 (빨간 점선).g5large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
FRET 모델의 그림 6. 멀티 웰 플레이트 FLIM는 mTq5V이 mTq17V이 mTq32V가 감옥 세포에서 발현 구성한다. (가) 각 FOV의 모범 형광 수명 이미지를 잘 텍스트에 설명 된대로 왜냐하면 세포에서 발현 다른 FRET 구조. (b) 평균 금성 형광 수명의 열지 각 웰의 모든 셀에 대하여 평균. mTurquoise 황색의 (c)에 강도 이미지는 평생지도 (스케일 바 20 μm의)와 겹쳐. mTurquoise 금성 (17 아미노산)의 (d)에 강도 이미지는 평생지도 (스케일 바 20 μm의)와 겹쳐. (마) mTq5A의 측정 강도 붕괴 프로파일 (파란색 원) (대조군)을 구성 형광이 잘 이미지화 모든 셀에 대해 평균1 함께 ㄱ 단지 수 붕괴에 데이터의 적합 (파란색 실선)와 IRF (점선 오렌지 라인)와 함께. (f)는 평균 수명의 그래프보기의 필드 사이에 형광 수명의 표준 편차를 나타내는 오차 막대과 함께 멀티 웰 플레이트에서 각 열의 평균. 에 대한 (광고) 수명 값은 피코 초에 표시된 제한 거짓 컬러 스케일을 사용하여 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
개그-CFP을 표현 헬라 세포를 이용한 개그 억제제의 그림 7. 모범 멀티 웰 플레이트 FLIM 화면. 멀티 웰 플레이트에 잘 당 평균 기증자 형광 수명의 (a)는 히트 맵은 positiv로 MYR - 개그 - CFP로 형질 컬럼 1 제시 세포와 배열 억제 용 전자 제어는 개그-CFP 형질 제시 세포 컬럼 (11)는 차량에 노출 및 저용량 칼럼 (10)에 고농도의 2 열에서의 농도 범위로 네 가지 억제제 중 하나와 함께 투여 된 웰을 나타내는 점선 색 사각형 . 거짓 색 규모는 2,200 추신에서 3100 PS에 이르기까지 평균 형광 수명을 나타냅니다. 각 오차 막대 반복 웰 사이의 표준 편차를 보여주는 억제제에 대해 (b) 형광 수명을 나타내는. 수평축 (2) -4의 검은 점은 각각 각각 열 (1) 및 (11)로부터 획득 된 양성 및 음성 통제 지점이다. 실선은 다른 억제제 용량 반응 곡선을 데이터에 맞추기를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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HEK293T 세포를 이용하여 시간 경과에 측정 EPAC FRET 바이오 센서 판독 FLIM 항 모범 사용도. (a) 형광 수명 및 녹색 막대로 나타낸 포스 콜린을 첨가 한 다음 시간의 함수로서 FRETing 도너의 (b) 부분을 의미 변화. 오류 바는 셀 당 표준 오류를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 당 음 | STD | ERR | 당 음 | STD | ERR | |||
| mT5A | (4008) | (32) | (12) | MT17V | (3004) | (26) | (10) | |
| mT5V | 2,717 | (35) | (13) | mT32V | (3133) | (30) | (11) |
프렛 구조 표 1. 평균 수명과 표준 편차 (STD).
Discussion
우리는 시간 게이트 FLIM를 사용하여 HCA 용으로 설계된 자동화 된 멀티 웰 플레이트 현미경을 설명했다. 이 악기는 FLIMfit (36), 오픈 소스 프로그램 OMERO 클라이언트 32 μManager의 도구로 매트랩 작성 및 사용할 수를 사용하여 수행되는 OMERO 서버와 FLIM 데이터 분석에 데이터를 저장하는 옵션을 μManager로 작성된 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 제어 제어 소프트웨어, openFLIM-HCA는 자신의 FLIM의 HCA 기기를 구성하는 학술 연구를 가능하게하는 시스템 구성 요소 (48)의 목록 33 온라인으로 사용할 수 있습니다.
강력한 FLIM 데이터를 획득하기 위해서는, GOI 및 CCD 취득 설정을 최적화 및 t 0에서 어떠한 변화를 고려하는 것이 필요하다. 3.8.2에 설명 된 바와 같이, GOI 이득 설정 및 CCD 카메라 적산 시간 ~ 다 CCD 동적 범위의 75 %에 도달하도록 설정하여야한다. 유마다 게이트 지연에 더 GOI 전압 복수 CCD 프레임 축적 노래하는 잡음비 (49)에 신호를 증가 시키지만 이는 적은 형광 광자는 CCD 카메라 포화 프레임 축적 너무 수가 이전 프레임마다 취득되기 때문에 총 FLIM 획득 시간 (증가 증가한다) 등이 트레이드 오프는 각 실험에 대해 결정해야한다. 딜레이 생성기의 보정은 레이저 반복률에 따라 그리고 사용 된 반복율에 대한 정확한 교정 파일을 수집 소프트웨어에 로딩되는 것을 보장하는 것이 필요하다. 지연 상자를 교정하기위한 절차는 openFLIM-HCA 위키 (33)에서 찾을 수 있습니다.
셀룰러 형광도는 형광 신호에 비해 낮은 경우, 우리는 시간에 따라 변화하는 배경 (TVB)를 제공하기 위해 잘 함유 단지 배지로부터의 신호를 사용한다. 세포 배양액으로부터 배경 형광을 최소화하기 위해 피페놀 레드를 포함하는 미디어. 셀룰러 형광도가 중요한 경우, TVB는 표지 된 세포의 측정으로부터 유도 될 수있다. 이것은 자기 형광 배경 이미지의 모든 픽셀에 대해 동일한 것으로 가정하지만,이 경우 관리에주의해야한다. 형광도 셀을 통해 또는 여기 빔 또는 검출 감도가 시야에 걸쳐 균일하지 않은 경우 상당히 다양 할 경우이 가정은 유효하지 않습니다.
산란 여기 광 펄스를 이용하여 IRF 화상의 취득 피팅 프로세스에 데이터 모델과 콘볼 루션되는 시간 IRF 프로파일을 제공하고, 또한 시야에 걸쳐 IRF의 공간적 변이지도를 제공한다. IRF는 Nipkow 디스크가 IRF의 클리너 측정을 제공로부터 산란 된 여기 광을 이용하여, 우리의 장비, 이러한 콜로이드 현탁액 비록 같은 산란 샘플을 이미지화하여 측정 할 수있다. 타이밍 오의 정확한 결정여기 및 시간 게이팅의 지연 시간의 오차가 크게 피팅 프로세스에 영향을 미칠 수 있기 때문에 주 6 IRF는 중요 특히 복소 지수 감쇠 모델 피팅. IRF는 IRF의 공간적 변화가 동일해야하지만, 그 타이밍에 영향을 미칠 수는 여기 파장에서보다는 형광 발광 파장에 기록되기 때문에, 피팅 프로세스에 필요하지 정확히 산란 여기 광을 이용하여 취득 두 파장에서. 광학적으로 단면 한 FLIM에 Nipkow 디스크에서 취득한 IRF 대한 경우와 같이 또한 산란 IRF 세계적으로 인한 산란 오브젝트로부터 서로 다른 광로 길이로 실제 IRF 시간에 대하여 시프트 될 수있다. Protoc에 나타낸 바와 같이, 취득 된 산란 여기 광 IRF 적용해야 필요한 전체 시간 시프트이다이 보정 t 0, 단지 수 기준 염료 데이터로부터 계산올 단계 4.4. 다음 염료 상이한 여기 파장에 대해 사용될 수있다 : 메탄올 중 75 μM 쿠마린 153 용액 (τ는 4.3 ~ 50 NS)가 범위 295-442 nm의 여기에서 사용될 수있다; 에탄올 중 75 μM 쿠마린 6 용액 (τ ~ 2.43 NS 37)는 430-500 nm의 범위에서 여기에 사용될 수있다; 물 75 μM 로다 민 B 용액 (τ는 1.7 ~ 37 NS)는 488-575 nm의 범위에서 여기에 사용될 수있다. 이 시스템의 각 픽셀에 대해 서로 다른 IRF를 사용 FLIMfit 가능하지만 우리는주의, 보통은 공간적으로 변화 IRF 이미지의 모든 픽셀에 대해 동일한 시간 프로파일을 갖는다는 가정을하는 것이 합리적이지만 범위를 제시 의 공간적 글로벌 t 0을 기준으로 시간 오프셋을 변화. 우리는 산란광의 IRF에서 결정되는 IRF 시프트지도로이 설명합니다. 이와 함께 IRF 프로파일, t 0와 IRF 시프트지도는 실내에 사용된다화각의 각 픽셀은 적절한 IRF 장착되어 있는지 확인합니다. 그것은 어떤 FLIM 데이터 취득 전에 측정해야하므로 중요한 t 0 시간 서서히 변할 수있다.
사용자는 형광 감쇄 정보를 샘플링하고, 시간 - 게이트 및 여진 후 상대적인 지연의 폭을 설정하는 데 필요한 방법을 결정한다. 일반적으로, 검출 된 신호를 최대화하기 위해 다양한 게이트 폭을 사용하고 일반적으로 우리가 형광 단백질 표지 세포의 FLIM 4 NS 설정된 게이트 폭을 사용하는 것이 바람직하다. 시간 - 게이트 지연의 수는 분석에 사용되는 피팅 모델의 복잡성 주어진 (단지 여기 펄스 전에 신호를 측정하도록 설정된 하나의 게이트를 포함), 형광 소멸 프로파일을 샘플링하기에 충분해야한다. 최적 값 수명 및 감쇠 요소의 상대 진폭에 의존 할 수있다. 일반적으로, 4 게이트 피팅 단지 수에 충분가있는 동안 7 개 이상의 게이트 수도 붕괴더 복잡한 감쇠 모델에 사용될.
우리 FLIM은 FRET (51)의 주파수 도메인 수명 판독을 이용하여 전체 필드 현미경 시간 도메인 또는 주파수 도메인 기술의 범위를 사용하여 구현 될 수 있고, 멀티 웰 플레이트 어레이들의 자동화 FLIM의 HCA가 먼저 (비 절편)으로 구현되었음을 주목. 넓은 필드 시간 문 영상 (28)을 이용하여 HCA의 첫 번째 자동 광학 절편의 FLIM 멀티 웰 플레이트 리더는 다음보고되었다. 이어서, 넓은 필드 (비 절편) 주파수 도메인 FLIM의 HCA가 FRET 52 이용한 유전자 라이브러리 및 시간 게이팅 FLIM의 HCA 걸쳐 번역 후 변형 (티로신 인산화)을위한 선별에 적용되었다 HIV-1 개그의 분석을 FRET에 적용된 올리고머 53 FOXM1 (54)과 Raichu에서 RhoA와 RAC1 바이오 센서 (33)의 SUMOylation의. 이는 멀티 웰 플레이트 FLIM 26하지만 날짜가 t와 일치하도록 도전 입증되었다 TCSPC를 사용하는 것도 가능하다그는 넓은 필드 검색을 이용 기술의 처리량. 이 문제를 해결 수있는 하나의 새로운 접근 방식은 SPAD 어레이 (55)로 단일 광자 계수 검출기의 배열의 사용이다.
우리는 형광 단백질을 이용하여 FRET 임의의 판독은 피팅 모델과 관련된 가정에 의존한다 FLIMfit 또는 다른 FLIM 분석 소프트웨어로부터 얻은 파라미터의 절대 값주의 것을 취급되어야 참고. 프렛 도너 상당한 초 잔광 구성 요소가 예를 들어, FRET FLIM 데이터에 맞게하는 biexponential 모델의 사용은 전형적으로해야보다 FRETing 인구가 높은 표시에 관련한 빨리 감쇠 성분의 기여가 발생할 수있다. 그러한 mTq2FP 같은 모노 지수 수명이 도너를 사용하는 것이 바람직하다. 그럼에도, 최근 연구 FRET 분석을 계속 받게 형광 단백질 또는 어두운 상태에 의해 영향을받을 수 있음을 보여 주었다발색단 때문에 다양한 각도와 형광체의 배좌의 분포와이 κ 배향 계수의 이질성 (56) 간 거리. 그럼에도 불구하고, 우리와 다른 FRET의 형광 수명 판독은 생화학 적 측정과 상관 관계 및 단백질 상호 작용을 선별하거나 바이오 센서의 역학을 수행하는 데 사용할 수있는 유용한 결과를 생성 할 수 있음을 보여 주었다. 따라서 본 openFLIM HCA 플랫폼 FRET 또는 셀룰러 형광도 8을 이용뿐만 아니라, 염료 계의 프로브 (25)의 정량적 인 판독을 제공하는 형광 수명 기반 분석의 넓은 범위에 적용될 수있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microscope frame | Olympus | IX81 | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
| optical autofocus | Olympus | ZDC | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
| motorized (x-y-z) microscope stage | Marzhauser | 00-24-565-0000 | Stage with Corvus controlle |
| excitation laser source | Fianium | SC400-4 | Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/ |
| gated optical intensifier | Kentech | High Rate Imager (HRI) | |
| delay generators | Kentech | --- | See agile delay generator and precision delay generator |
| camera | Hamamatsu | ORCA-ER-II | |
| Nipkow disc scanner unit | Yokogawa | CSU-X1 | http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/ |
| Top hat diffuser | Thorlabs | ED1-S20-MD | Engineered diffusers |
| mTq5V | Oxford Genetics | P3850 | mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker |
| mTq17V | Oxford Genetics | P3847 | mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker |
| mTq32V | Oxford Genetics | P3848 | mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker |
| mTq5A | Oxford Genetics | P3849 | mTurquoise Amber construct |
| HEK293T | --- | --- | cell type used |
| phenol red-free HBSS | Sigma Aldrich | 55021C-1000ML | imaging media |
| culture media | DMEM + 10% FBS + 0.5% Antibiotics | ||
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046-500ML | for culture media |
| FBS | Sigma Aldrich | 12003C-500ML | for culture media |
| xTremeGene9 | Sigma Aldrich | 6.37E+09 | for transfection, follow online protocol from La Roche |
| trypsin/EDTA Solution | Thermo Fischer | R001100 | for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer |
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