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Biology

ओपन सोर्स उच्च सामग्री विश्लेषण का उपयोग स्वचालित प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग माइक्रोस्कोपी

Published: January 18, 2017 doi: 10.3791/55119
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 4, 4, 3, 5, 6, 1, 4, 1,7, 1
1Photonics Group, Department of Physics, Imperial College London, 2Institute for Chemical Biology, Department of Chemistry, Imperial College London, 3MRC Clinical Sciences Centre, Hammersmith Hospital, 4Chemical Biology Section, Department of Chemistry, Imperial College London, 5Retroscreen Virology Ltd, 6Pfizer Global Research and Development, Pfizer Limited, Sandwich, Kent, UK, 7Centre for Histopathology, Imperial College London
* These authors contributed equally

Summary

हम उपयोग Förster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) आधारित readouts का उपयोग कर प्रोटीन बातचीत परख करने की क्रिया के लिए स्वचालित प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग (flim) एक खुला स्रोत उच्च सामग्री के विश्लेषण (एचसीए) साधन प्रस्तुत करते हैं। इस openFLIM-एचसीए साधन के लिए डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर μManager में लिखा है और डेटा विश्लेषण FLIMfit में किया जाता है के द्वारा नियंत्रित किया जाता है।

Introduction

परख यौगिक पुस्तकालयों के लिए दवाओं की खोज 1 में स्वचालित उच्च सामग्री के विश्लेषण (एचसीए) के बढ़ते उपयोग के व्यवस्थित अध्ययन, जैसे, siRNA पुस्तकालयों की प्ररूपी स्क्रीन के लिए के लिए स्वचालित इमेजिंग प्रयोगों की दिशा में जीवन विज्ञान अनुसंधान के क्षेत्र में बुनियादी प्रवृत्ति से पूरित है। स्वचालित एचसीए भी छोटे पैमाने जैविक अध्ययन बताते हैं कि आम तौर पर पारंपरिक माइक्रोस्कोप के साथ imaged कोशिकाओं के व्यंजन के दसियों के साथ मैनुअल प्रयोगों के साथ लागू किया गया है के लिए तेजी से महत्वपूर्ण होता जा रहा है। सांख्यिकीय देखने के क्षेत्रों के हजारों लोगों के लिए परख और सैकड़ों विश्लेषण करने की क्षमता द्वारा प्रदत्त शक्ति (सहित "जैविक शोर") और छवि डेटा अधिग्रहण और बड़ा नमूना सरणियों के विश्लेषण के स्वचालन मदद कर सकते हैं ऑपरेटर पूर्वाग्रह को खत्म करने और अक्सर प्रयोगात्मक शोर की औसत सक्षम बनाता है इस तरह के एक अधिग्रहण के दौरान आईआरएफ प्रोफ़ाइल में परिवर्तन के रूप में व्यवस्थित त्रुटियों, की घटना का पता लगाने के लिए उपयोग किया जा सकता है। प्रतिदीप्ति आधारित assaysव्यापक रूप से एचसीए में लागू कर रहे हैं सबसे अधिक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एचसीए इंस्ट्रूमेंटेशन एक या एक से अधिक वर्णक्रम चैनलों में विशेषता प्रतिदीप्ति तीव्रता इमेजिंग रिश्तेदार वितरण और लेबल प्रोटीन की सह स्थानीयकरण नक्शा करने के साथ। ऐसे प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग (flim), ध्रुवीकरण anisotropy इमेजिंग और समय हल प्रतिदीप्ति anisotropy इमेजिंग के रूप में अधिक परिष्कृत प्रतिदीप्ति इमेजिंग तौर तरीकों, व्यापक रूप से वाणिज्यिक एचसीए उपकरणों में शोषण नहीं कर रहे हैं, हालांकि वे शक्तिशाली मात्रात्मक readouts, जैसे, प्रोटीन बातचीत की पेशकश करते हैं। यहाँ हम एचसीए के लिए एक स्वचालित माइक्रोस्कोप में Flim को लागू करने के लिए एक खुला स्रोत दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं।

प्रतिदीप्ति जीवनकाल एक स्वाभाविक ratiometric स्पेक्ट्रोस्कोपी readout अलग आणविक प्रजातियों भेद या एक fluorophore के स्थानीय आणविक पर्यावरण की जांच के लिए और / उत्तेजना का पता लगाने के लिए क्षमता, fluorophore एकाग्रता के प्रति असंवेदनशील है करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदान करता है, और scatte के प्रभाव कोअंगूठी और नमूना अवशोषण 2। इसके अलावा, के बाद से प्रतिदीप्ति जीवनकाल माप एक ही वर्णक्रम चैनल में बनाया जा सकता है, वे सीधे विभिन्न उपकरणों और नमूने के बीच तुलनीय अंशांकन बिना कर रहे हैं। वे कुछ सेलुलर चयापचयों, लिपिड और बाह्य मैट्रिक्स घटकों, जैविक प्रक्रियाओं और विकृतियों के आंतरिक readouts प्रदान करने सहित अंतर्जात fluorophores, के लिए लागू किया जा सकता है। इस प्रकार लेबल मुक्त लिए flim कोशिकाओं 3,4 में चयापचय परिवर्तन नक्शा कर सकते हैं और स्टेम सेल भेदभाव 5,6 और कोलेजन scaffolds 7 के विकास पर नजर रखने के लिए लागू किया गया है। हमने हाल ही में प्रदर्शन किया है कि एचसीए लिए flim सेलुलर चयापचय autofluorescence 8 के उपयोग के स्वचालित लेबल मुक्त assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अधिक सामान्यतः, हालांकि, प्रतिदीप्ति जीवनकाल माप और exogenous लिए flim fluorophores कि विशिष्ट biomolecules लेबल करने के लिए लागू कर रहे हैं, अक्सर, मिलकर रंगों का उपयोग करने के लिए antibodie रंगों कि सेलुलर डिब्बों दाग का उपयोग कर कार्यान्वितकि तय कोशिकाओं में विशिष्ट प्रोटीन लक्ष्य, या विशिष्ट प्रोटीन के लिए युग्मित आनुवंशिक रूप से व्यक्त fluorophores का उपयोग कर। प्रतिदीप्ति जीवनकाल संवेदन अपनी शारीरिक या रासायनिक वातावरण फ्लोरोसेंट जांच के मजबूत मात्रात्मक readouts प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, रंजक सहित संकेतन अणुओं सेल की सांद्रता रिपोर्ट करने के लिए कोशिका झिल्ली 9 या सेल चिपचिपापन 10 और आनुवंशिक रूप से व्यक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन आधारित biosensors के स्थानीय लिपिड चरण भावना के लिए तैनात किया गया है विकसित किया गया है IP3 11, 12 और PIP2 calpain 13 या के रूप में जैसे कैल्शियम 14,15, पोटेशियम और क्लोराइड 16 17 के रूप में आयनों।

कई ऐसे biosensors Forster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) 18,19 का उपयोग biosensor रचना में परिवर्तन की readouts प्रदान करने के लिए। "दाता" और "स्वीकर्ता" fluorophores के बीच झल्लाहट एक कम दूरी की प्रत्यक्ष द्विध्रुवीय-द्विध्रुवीय बातचीत के माध्यम से होता हैजिसके लिए आम तौर पर fluorophores से ~ 10 एनएम कम से अलग होती है। इस प्रकार झल्लाहट का पता लगाने के उचित लेबल प्रोटीन के करीब निकटता इंगित करता है और इसलिए इस तरह के बंधन या oligomerization के रूप में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत 20, बाहर पढ़ने के लिए एक साधन प्रदान करता है - या तो लाइव के समय पाठ्यक्रम माप में तय की कोशिकाओं के रूप में या गतिशील घटनाओं में अंत अंक के रूप में कोशिकाओं। दोनों दाता और स्वीकर्ता fluorophores के साथ एक उपयुक्त आणविक निर्माण लेबल करके, यह भी संभव है गठनात्मक परिवर्तन बाहर पढ़ने के लिए - या दरार - झल्लाहट में परिवर्तन के माध्यम से निर्माण के लिए और यह कई biosensors 21 का आधार है। झल्लाहट दक्षता का मापन दाता स्वीकर्ता दूरी और झल्लाहट के दौर से गुजर दाता fluorophores की आबादी अंश के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं। इस प्रकार, झल्लाहट आधारित इमेजिंग तकनीक नक्शा और quantitate करने के लिए अंतरिक्ष और समय, उदा में आणविक बातचीत, स्पष्ट करने के लिए सेल संकेतन प्रक्रियाओं 22 का इस्तेमाल किया जा सकता है। आटोमैटिक मशीनऐसे इमेजिंग तकनीक आईएनजी रास्ते या नेटवर्क संकेत के readouts के आधार पर उच्च throughput assays प्रदान कर सकता है।

एचसीए में, झल्लाहट readout सबसे अधिक कार्यान्वित वर्णक्रम ratiometric इमेजिंग, जहां दाता तीव्रता को स्वीकर्ता के अनुपात में परिवर्तन मैप कर रहे है। हालांकि इस दृष्टिकोण को आसानी से लागू किया जाता है - और कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध multiwell थाली पाठकों में उपलब्ध है - मात्रात्मक प्रेतसंबंधी सुलझाया झल्लाहट माप प्रणाली 23 के वर्णक्रमीय प्रतिक्रिया की जांच की आवश्यकता है। इस वर्णक्रम पार बात वर्णक्रम खून के माध्यम से और प्रत्यक्ष उत्तेजना स्वीकर्ता के साथ ही उपकरण के संचरण विशेषताओं और नमूना (भीतरी फिल्टर प्रभाव) से उत्पन्न होने वाले भी शामिल है। सिद्धांत रूप में, इस अतिरिक्त "नियंत्रण" के नमूने है कि केवल दाता या स्वीकर्ता केवल किसी के साथ चिह्नित कर रहे हैं की माप पर जोर देता।

इस तरह के वर्णक्रम ratiometric झल्लाहट माप से, एक प्रभावी झल्लाहटदक्षता (वास्तविक झल्लाहट दक्षता और FRETing दाता / स्वीकर्ता अणुओं के अंश का उत्पाद) दाता और स्वीकर्ता अणुओं 24 के सापेक्ष अनुपात के साथ प्राप्त किया जा सकता है। स्पेक्ट्रल ratiometric झल्लाहट अक्सर unimolecular झल्लाहट biosensors, जहां दाता / स्वीकर्ता stoichiometry नाम से जाना माना जा सकता है के साथ प्रयोग किया जाता है। FRETing दाता और स्वीकर्ता, जैसे की आबादी अंशों का निर्धारण करने के लिए, एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र प्राप्त करने के लिए, वास्तविक झल्लाहट दक्षता का ज्ञान आवश्यक है। यह जाना जाता गुणों के साथ एक सकारात्मक झल्लाहट नियंत्रण नमूना मापने के द्वारा या किसी अन्य विधि का उपयोग करते हुए इस तरह के स्वीकर्ता photobleaching या लिए flim के रूप में, झल्लाहट क्षमता को मापने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।

प्रतिदीप्ति जीवनकाल readouts का प्रयोग, झल्लाहट का पता चला है और अकेले दाता उत्सर्जन की माप द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है - वर्णक्रमीय अंशांकन और आगे नियंत्रण के नमूने के लिए की जरूरत को हटाने। इस प्रकार, झल्लाहट लिए flim readouts उपकरणों के बीच तुलना की जा सकतीऔर विभिन्न नमूनों के बीच - एंडोस्कोपी या लाइव रोग मॉडल 25 के टोमोग्राफी से डेटा की इजाजत दी सेल आधारित assays के मापन के खिलाफ बेंचमार्क किया जाना है। एक उपयुक्त बहु घातीय क्षय मॉडल FRETing और गैर-FRETing दाता आबादी के लिए इसी को दाता प्रतिदीप्ति क्षय प्रोफाइल फिटिंग द्वारा, झल्लाहट क्षमता और जनसंख्या भिन्न, सिद्धांत रूप में, आगे माप के बिना सीधे प्राप्त किया जा सकता है। इन महत्वपूर्ण लाभ है, तथापि, प्रेतसंबंधी सुलझाया तीव्रता इमेजिंग से पिक्सेल प्रति अधिक का पता चला फोटॉनों की आवश्यकता होती लिए flim की कीमत पर आ - फोटॉनों के सैकड़ों आम तौर पर जब फिटिंग एक एकल घातीय क्षय मॉडल के लिए और जब 10% के जीवनकाल निर्धारण में एक सटीकता प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं परिसर (multiexponential क्षय) मॉडल के लिए फिटिंग प्रतिदीप्ति क्षय प्रोफाइल, पता चला फोटॉनों की संख्या अपेक्षित हजारों करने के लिए बढ़ जाती है। यह पारंपरिक सेकंड के सैकड़ों vi के क्षेत्र के लिए प्रति (दसियों लंबे अधिग्रहण के समय के लिए प्रेरित कियाईडब्ल्यू) flim के लिए, खासकर जब समय का उपयोग सहसंबद्ध एकल फोटॉन गिनती (TCSPC) लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप में अनुक्रमिक पिक्सेल अधिग्रहण के साथ लागू किया है। उच्च उत्तेजना तीव्रता का उपयोग महत्वपूर्ण photobleaching और / या phototoxicity को जन्म दे सकता द्वारा इमेजिंग की गति को बढ़ाने के लिए प्रयास करता है। साथ में उचित व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरण और सॉफ्टवेयर उपकरणों की कमी के साथ, इस दवा की खोज या सिस्टम जीव विज्ञान, जहां देखने के क्षेत्रों के हजारों सैकड़ों imaged किया जा रहे हैं के लिए एचसीए में उपयोग किया जा रहा से लिए flim रुकावट है। लेजर स्कैनिंग TCSPC लिए flim माध्यमिक मापन के लिए एक स्वचालित multiwell थाली माइक्रोस्कोप 26 में स्थिर राज्य ध्रुवीकरण हल प्रतिदीप्ति anisotropy इमेजिंग 27 है, जो वर्णक्रम ratiometric इमेजिंग 28 के साथ जो यह शेयरों के समान इमेजिंग गति तक पहुँच सकते द्वारा 'हिट' की पहचान के बाद लागू किया गया है कई फायदे और नुकसान। प्रतिदीप्ति इमेजिंग anisotropy कमी कारनामेझल्लाहट की उपस्थिति में स्वीकर्ता के प्रतिदीप्ति anisotropy में और भी वर्णक्रम पार बात (जैसे, स्वीकर्ता के प्रत्यक्ष उत्तेजना) के प्रति संवेदनशील है। यह ध्रुवीकरण पार बात के लिए खाते में अंशांकन की आवश्यकता है और झल्लाहट दक्षता का एक सीधा माप प्रदान नहीं करता है।

एचसीए के लिए लिए flim के फायदे का एहसास करने के लिए, हम छवि अधिग्रहण की गति और प्रौद्योगिकी के व्यापक उपयोग के मुद्दों का समाधान करने के लिए काम किया है। यहाँ, हम खुला स्रोत सॉफ्टवेयर और हार्डवेयर घटक है कि स्वचालित तेजी से लिए flim multiwell प्लेट रीडर है कि नीचे कापी झल्लाहट आधारित assays के साथ वर्णन किया गया है, एक साथ लागू करने के लिए उपयोग किया जा सकता है की एक पूरी सूची प्रदान करते हैं। हमारे दृष्टिकोण से 29 में, लिए flim व्यापक क्षेत्र के लिए समय-गेटेड इमेजिंग का उपयोग कर एक Gated ऑप्टिकल छवि intensifier (भारत सरकार) है, जो चित्रा 1 है कि तेजी से इमेजिंग दरों के कारण एकल बीम स्कैनिंग TCSPC की तुलना में कम photobleaching प्रदान कर सकते हैं में सचित्र है का उपयोग कर एहसास हो रहा है समानांतर पिक्सेल interrogation। हमारे openFLIM-एचसीए साधन unsupervised लिए flim प्रदान कर सकते हैं, पिक्सेल प्रति कुछ 100 फोटॉनों (नमूना की चमक के आधार पर) का पता लगाने के लिए flim डेटा प्राप्त करने के लिए केवल कुछ ही सेकंड की आवश्यकता होती है। , समय देखने के पिछले क्षेत्र से स्थानांतरित करने के लिए नमूना, अधिग्रहण सेटिंग्स समायोजित करने के लिए और ध्यान में नमूना बनाए रखने की आवश्यकता के साथ संयुक्त यह आम तौर पर multiwell थाली अधिग्रहण के समय में ~ 10 S क्षेत्र देखें प्रति 25,28 का परिणाम है। ऑप्टिकल सेक्शनिंग एक अर्ध-चौड़े क्षेत्र Nipkow ( "कताई डिस्क") स्कैनर 30 का उपयोग कर कार्यान्वित किया जा सकता है।

लिए flim डेटा विश्लेषण के लिए, हम है कि तेजी से पारंपरिक पीसी कार्यस्थानों पर multiwell थाली लिए flim डेटासेट का विश्लेषण करने में सक्षम है और एक प्लग में Omero 32 के लिए है FLIMfit 31 नामक एक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर उपकरण विकसित किया है। FLIMfit वैश्विक विश्लेषण क्षमताओं (धारा 1.2 में चर्चा की है) कि ओ के साथ जटिल मॉडल के लिए फिट होने की लिए flim डेटा सक्षम प्रदान करता हैधारणा है कि प्रतिदीप्ति जीवनकाल घटकों एक छवि या ब्याज (आरओआई) के पूरे क्षेत्र में अपरिवर्तनीय हैं अंतर्गत पिक्सेल प्रति कुछ 100 फोटॉनों nly, इसलिए आवश्यक पता चला फोटॉनों की संख्या, नमूना और छवि अधिग्रहण के समय पर प्रकाश जोखिम को कम करने। एक मानक डेस्कटॉप पीसी पर FLIMfit चल रहा है, कम्प्यूटेशनल समय के सेकंड की ही आवश्यकता है 10s FOVs के सैकड़ों जिसमें डेटा सेट का विश्लेषण करने के लिए। इस प्रकार दोनों लिए flim डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण timescales कि एचसीए के लिए व्यावहारिक हैं पर किया जा सकता है।

openFLIM-एचसीए हार्डवेयर

लिए flim एचसीए की हमारी कार्यान्वयन छह प्रमुख घटक शामिल हैं: (i) ऑप्टिकल ऑटोफोकस के साथ एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी फ्रेम; (Ii) एक मोटर चालित (xyz) खुर्दबीन मंच; (Iii) एक उत्तेजना लेजर स्रोत; (Iv) Gated ऑप्टिकल intensifier (भारत सरकार), देरी जनरेटर और कैमरे के साथ एक व्यापक क्षेत्र के लिए समय-गेटेड लिए flim प्रणाली; (V) डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण और (vi) एक Nipkow डिस्क स्कैनर के लिए एक कंप्यूटरऑप्टिकली sectioned इमेजिंग के लिए यूनिट फोकस प्रकाश से बाहर दबाने के लिए। यह महत्वपूर्ण कमजोर संकेतों, जैसे जब इमेजिंग सेल प्लाज्मा झिल्ली पर झल्लाहट biosensors, कि cytoplasmic प्रतिदीप्ति या पृष्ठभूमि coverslips या संस्कृति के माध्यम से योगदान से लादा जा सकता है, हो सकता है। समय-गेटेड लिए flim डेटा, ultrashort स्पंदित उत्तेजना विकिरण के साथ नमूना रोशन इमेजिंग भारत सरकार की photocathode करने के लिए प्रतिदीप्ति उत्सर्जन और के समय में देरी की सेटिंग्स की एक श्रृंखला के लिए भारत सरकार की भास्वर की सीसीडी छवियों की एक श्रृंखला प्राप्त करने से अधिग्रहण कर लिया है उत्तेजना दालों के आने के बाद ऑप्टिकल intensifier गेट। समय गेट देरी उत्तेजना के रूप में निम्नलिखित वृद्धि हुई है, प्रतिदीप्ति संकेत कम करने के लिए देखा जाता है और समय-गेटेड प्रतिदीप्ति तीव्रता सीसीडी पर अधिग्रहीत छवियों की श्रृंखला देखने के क्षेत्र में सभी fluorophores के क्षय प्रोफाइल विश्लेषण करने के लिए आवश्यक डेटा सेट के रूप में । भारत सरकार के gating उत्तेजना दालों को सिंक्रनाइज़ हैऔर, सीसीडी अधिग्रहण की श्रृंखला के लिए, उत्तेजना दालों के समय गेट रिश्तेदार की देरी वांछित सीमा से अधिक मूल्यों में वृद्धि की एक श्रृंखला के लिए निर्धारित है। इस तुल्यकालन देरी जनरेटर है कि एक "जल्दी देरी बॉक्स" (देरी 1 PS चरणों में 20 एनएस तक उपलब्ध कराने के) और एक "मोटे देरी बॉक्स" है कि 25 पीएस की एक न्यूनतम कदम के साथ देरी प्रदान करता है शामिल हैं का उपयोग कर हासिल की है।

Flim के लिए, उत्तेजना किसी भी ultrafast लेजर द्वारा प्रदान की जा सकती है। सुविधा के लिए, हम आम तौर पर एक फाइबर लेजर पंप supercontinuum स्रोत है कि दृश्य स्पेक्ट्रम उचित उत्तेजना विकिरण से अलग बैंड पास फिल्टर के साथ एक मोटर चालित फिल्टर पहिया का उपयोग कर किसी भी fluorophore लिए चुना जा सकता भर पीकोसैकन्ड दालों ट्यून करने योग्य प्रदान करता है रोजगार। आमतौर पर, हम 40 या 60 मेगाहर्ट्ज पुनरावृत्ति दर पर दालों के साथ नमूना ~ 100-200 μW के एक औसत बिजली का उपयोग करें। इस तरह की उत्तेजना शक्तियां भी ultrafast लेजर की आवृत्ति दोहरीकरण पर आधारित स्रोतों द्वारा प्रदान किया जा सकता हैमोड बंद टाइटेनियम डाल दिया गया नीलमणि लेज़रों। ध्यान दें कि नीचे ~ 100 पीएस एक उत्तेजना पल्स अवधि सबसे प्रयोगों के लिए पर्याप्त है। एक दूसरी मोटर चालित फिल्टर तटस्थ घनत्व फिल्टर के साथ सुसज्जित पहिया उत्तेजना तीव्रता को विनियमित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। सुरक्षा और सुविधा के लिए, उत्तेजना विकिरण एक एकल मोड ऑप्टिकल फाइबर के माध्यम से दिया जा सकता है। व्यापक क्षेत्र और ऑप्टिकली लिए flim sectioned flim के लिए विन्यास क्रमशः आंकड़े 2 और 3 में प्रस्तुत कर रहे हैं। सटीक इस्तेमाल किया घटकों की अधिक जानकारी के लिए, कृपया openFLIM-एचसीए विकि 33 पर जाएँ। वर्तमान भागों सूची की एक प्रति पूरक सामग्री में दी गई है।

व्यापक क्षेत्र flim के लिए, उत्तेजना विकिरण के रूप में समान रूप से संभव के रूप में देखने के पूरे क्षेत्र रोशन करने के लिए आवश्यक है। इसके लिए हमें एक होलोग्राफिक "शीर्ष टोपी" विसारक कि 10-50 हर्ट्ज पर समय-औसत करने के लिए लेजर बिंदु घुमाया जा रहा है करने के लिए उत्तेजना लेजर बीम प्रत्यक्ष, अलग से विमान के साथफ्यूज़र उद्देश्य माइक्रोस्कोप के लेंस के पीछे फोकल हवाई जहाज़ के लिए imaged किया जा रहा। माइक्रोस्कोप के उत्पादन बंदरगाह से प्रतिदीप्ति छवि भारत सरकार की photocathode और भारत सरकार (सक्रिय क्षेत्र विकर्ण 18 मिमी) की भास्वर पर रिले किया जाता है एक ठंडा वैज्ञानिक सीसीडी (चिप का आकार 10.2 मिमी x 8.3 मिमी) के संवेदक पर imaged है कैमरा 0.7 की एक बढ़ाई उपलब्ध कराने कैमरे के लेंस की एक जोड़ी का उपयोग कर। प्रणाली एक मानक पीसी है कि इंस्ट्रूमेंटेशन RS232 प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए interfaced है द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इसके अलावा, एक Arduino माइक्रोप्रोसेसर उत्तेजना प्रकाश रास्ते में एक शटर सिवाय इसके कि आप बंद हो जाता है जब सीसीडी कैमरा लिए flim डेटा प्राप्त कर रही है और एक photodiode कि supercontinuum प्रेतसंबंधी फ़िल्टर से औसत शक्ति को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है से संकेत रिकॉर्ड करने के लिए नियंत्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है उत्तेजना स्रोत। ऑप्टिकली sectioned flim के लिए, उत्तेजना लेजर विकिरण, एक एकल मोड ध्रुवीकरण को बनाए रखने के लिए ऑप्टिकल फाइबर कि Nipkow डिस्क स्कैनर इकाई के लिए सीधे जोड़ता में युग्मित है के रूप मेंhown चित्रा 3 में। Nipkow स्कैनर इकाई से उत्पादन प्रतिदीप्ति छवि भारत सरकार की photocathode पर रिले किया जाता है और इस प्रणाली के बाकी व्यापक क्षेत्र flim के लिए के रूप में ही है।

openFLIM-एचसीए सॉफ्टवेयर

डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर μManager 34 में लिखा है। यह पूर्ण एचसीए डाटा अधिग्रहण अनुक्रम में जो थाली के कुओं imaged हैं बदलने के लिए, किसी भी FOV के लिए समय पाठ्यक्रम प्राप्त करने के लिए, स्वचालित रूप से माप के दौरान ध्यान बनाए रखने के लिए और उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर पहियों और dichroic परिवर्तक नियंत्रित करने के लिए विकल्प सहित कार्यक्षमता प्रदान करता है स्वचालित बहुरंगा इमेजिंग के लिए। यह भी आदेश स्वतः मानदंड, जैसे, तीव्रता के आधार पर के अनुसार बाद में एक लिए flim अधिग्रहण के लिए पहचान करने और उपयुक्त FOVs के पदों को रिकॉर्ड करने के लिए में प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक "Prescan" अधिग्रहण को चलाने के लिए संभव है। एचसीए लिए flim डेटा एक श्रृंखला के रूप में बचाया जा सकता हैझगड़ा फ़ाइलों की, OME-झगड़ा फ़ाइलों की एक श्रृंखला के रूप में (यानी, FOV प्रति एक) या एक ही OME-झगड़ा फ़ाइल एक multiwell थाली से सभी डेटा को शामिल करने के रूप में। अधिक जानकारी और μManager सॉफ्टवेयर के एक विस्तृत वर्णन openFLIM-एचसीए विकि 33 पर पाया जा सकता है।

डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर, 31 FLIMfit, Omero छवि डेटा प्रबंधन मंच 32 के लिए एक खुला स्रोत MATLAB आधारित ग्राहक के रूप में चित्रा 4 में संकेत दिया है, एक Omero सर्वर से या कंप्यूटर डिस्क से लिए flim डेटा को पढ़ने में सक्षम है। यह TCSPC या व्यापक क्षेत्र के लिए समय-गेटेड लिए flim उपकरणों से डेटा का विश्लेषण करने के लिए डिजाइन किया गया है और कई क्षमताओं क्षय प्रोफाइल monoexponential के लिए फिटिंग सहित openFLIM-एचसीए से डेटा फिट करने के लिए, और जैसे मॉडल सहित घातीय और उच्च जटिलता क्षय प्रोफाइल, डबल करने के लिए प्रदान करता है ध्रुवीकरण हल प्रतिदीप्ति क्षय प्रोफाइल। यह भी तय है और समय-अलग पृष्ठभूमि संकेतों के खाते में ले जा सकते हैं और यूटीआई कर सकते हैंLize एक मापा स्थानिक-सामयिक साधन प्रतिक्रिया समारोह (आईआरएफ) या एक आर्दश आईआरएफ का उपयोग कर समय-स्थानांतरित पूर्ण प्रयोगात्मक आईआरएफ माप से निर्धारित राशि से एक पिक्सेल-वार आधार पर हो सकता है कि फिट कर सकते हैं। एक वैश्विक समय का अंतर (टी 0) आईआरएफ और एक फ्लोरोसेंट नमूना के बीच एक प्रतिदीप्ति मानक की एक माप से निर्धारित किया जा सकता है। पृष्ठभूमि संकेतों और आईआरएफ में स्थानिक विविधताओं भी ध्यान में रखा जा सकता है। FLIMfit या "वैश्विक binning" या "वैश्विक फिटिंग" का उपयोग मामूली (सैकड़ों) के साथ लिए flim डेटा की फिटिंग की सुविधा के लिए जटिल क्षय मॉडल करने के लिए संख्या फोटान एक पिक्सेल-वार आधार पर लिए flim डेटा फिट करने में सक्षम है।

वैश्विक binning हर समय बिंदु पर एक उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित रॉय के भीतर पिक्सल से सभी का पता चला फोटॉनों कुल जटिल क्षय मॉडल के लिए फिटिंग सक्षम करने के लिए पर्याप्त संख्या फोटॉन प्रदान करने पर जोर देता। रॉय (FOV) देखने के पूरे क्षेत्र हो सकता है, इसे मैन्युअल हो सकता है घउपयोगकर्ता द्वारा efined, या यह छवि विभाजन उपकरण का उपयोग निर्धारित किया जा सकता है। रॉय भी अन्य छवि विभाजन सॉफ्टवेयर से FLIMfit में आयात मास्क का उपयोग करने में परिभाषित किया जा सकता है। झल्लाहट अनुप्रयोगों के लिए, यह वैश्विक binning का उपयोग करने के लिए एक डबल घातीय क्षय मॉडल के लिए फिट करने के लिए प्रतिदीप्ति जीवनकाल FRETing और गैर-FRETing दाता fluorophores के लिए इसी घटक है कि रॉय भर स्थानिक अपरिवर्तनीय हो ग्रहण कर रहे हैं निर्धारित करने के लिए और फिर एक पर मरम्मत के लिए आम है इन आजीवन घटक Vales क्रम में प्रत्येक पिक्सेल में FRETing दाता आबादी अंश प्राप्त करने के लिए तय साथ पिक्सेल वार आधार।

वैश्विक फिटिंग एक साथ एक पूरी FOV- भर में या एक लिए flim डेटा सेट है कि कई FOVs, उदाहरण के लिए एक multiwell थाली प्रयोग या प्रतिदीप्ति जीवनकाल छवियों का एक समय श्रृंखला से, शामिल कर सकता भर में जीवन भर के घटकों और पिक्सेल वार FRETing दाता आबादी अंशों ढाले पर जोर देता। वैश्विक फिटिंग स्थानिक variati शोषण करने में सक्षम हैकाफी अधिक गणना 35 की कीमत पर यद्यपि - और इसलिए अधिक विश्वसनीय परिणाम - छवि भर में जनसंख्या अंशों कि वैश्विक दृष्टिकोण binning में खो दिया है घटक जीवन भर के आकलन पर मजबूत बाधाओं प्रदान करने के लिए की है। FLIMfit तेजी से साथ पारंपरिक पीसी कार्यस्थानों पर वैश्विक फिटिंग के साथ multiwell थाली लिए flim डेटासेट, उदाहरण के लिए विश्लेषण कर सकते हैं, एक multiwell समय-गेटेड लिए flim डेटा सेट, 394 FOV प्रत्येक 672 x 512 पिक्सल जिसमें से प्रत्येक के लिए पांच बार फाटक के साथ हासिल कर ली है, केवल 32 सेकंड की आवश्यकता होती है और स्मृति के 2 GB एक डबल घातीय क्षय मॉडल 31 को फिट करने के लिए। यह एक वियोज्य nonlinear कम से कम वर्ग फिटिंग एल्गोरिथ्म मल्टीकोर प्रोसेसर और FLIMfit कोड स्मृति के उपयोग को कम करने के लिए अनुकूलित किया गया है पर प्रभावी स्केलिंग सक्षम करने के लिए थ्रेड समानांतर एल्गोरिदम का उपयोग कर कार्यान्वित का उपयोग करके हासिल किया गया है। चित्रा 5 FLIMfit के ग्राफिकल यूजर इंटरफेस की एक स्नैपशॉट से पता चलताऔर अधिक जानकारी के संदर्भ में दिए गए वैश्विक फिटिंग और वैश्विक binning पर 36. अधिक जानकारी वेब पेज में पाया जा सकता संदर्भ 31 में पाया जा सकता है।

हमारे openFLIM-एचसीए उपकरण और सॉफ्टवेयर का उपयोग कर लिए flim एचसीए के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल लिए flim readouts के साथ सेल इमेजिंग प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। सामान्य तौर पर, multiwell थाली झल्लाहट प्रयोगों अध्ययन किया जा रहा शर्तों के अलावा सकारात्मक और नकारात्मक जैविक नियंत्रण के दोहराने कुओं शामिल करने के लिए तैयार किया जाना चाहिए। यहाँ, हम ऑप्टिकली sectioned लिए flim प्रदर्शन करने के लिए विशिष्ट कार्यान्वयन का वर्णन क्योंकि कोशिकाओं झल्लाहट mTurquoise फ्लोरोसेंट प्रोटीन और वीनस फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक छोटी पेप्टाइड लिंकर से जुड़े हुए से मिलकर constructs व्यक्त की (चित्रा 3 देखें)। यहाँ mTq32V, mTq17V और mTq5V झल्लाहट निर्माणों (प्रतिनिधि परिणाम खंड में चर्चा) एक साथ गैर FRETing mTq5A निर्माण के साथ कम, मध्यम और उच्च झल्लाहट क्षमता प्रदान करते हैं।इन निर्माणों और अन्य सामग्री इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए आवश्यक सामग्री सूची में सूचीबद्ध हैं।

Protocol

1. multiwell थाली ऐरे की तैयारी

  1. संदर्भ माप टी 0 के निर्धारण के लिए सक्षम करने के लिए इथेनॉल में 75 माइक्रोन के Coumarin 6 (τ ~ 2.43 एन एस) के एक समाधान तैयार है।
  2. बीज एक 6 अच्छी तरह से थाली में से चार कुओं में 150,000 क्योंकि कोशिकाओं और संस्कृति के माध्यम में रात भर संलग्न करने की अनुमति है (देखें सामग्री सूची)।
  3. अच्छी तरह से हर एक transfect mTq5A, mTq5V, mTq17V और mTq32V निर्माता के निर्देशों और 24 घंटे के लिए संस्कृति के अनुसार एक वाणिज्यिक अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग के साथ।
  4. एक वाणिज्यिक / trypsin EDTA निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार समाधान का उपयोग कोशिकाओं को अलग करें।
  5. हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HbSS) में निलंबित कर दिया पिपेट 5,000 क्योंकि कोशिकाओं को एक # 1.5 मोटाई गिलास तली 96 multiwell थाली है कि पहले पाली एल लाइसिन के साथ इलाज किया गया है के कुओं में से प्रत्येक A1-जी 3 में mTq5A व्यक्त। mTq5V कुओं A4-G6 में कोशिकाओं को व्यक्त करने के लिए दोहराएँ, कुओं A5-G9 और mTq32V में mTq17V कुओं A10-G12 में। अच्छी तरह से छोड़ दो एच 1 खाली (multiwell थाली से किसी भी स्थिर पृष्ठभूमि की माप प्रदान करने के लिए)।
  6. HBSS के पिपेट 200 μL केवल अच्छी तरह से एच 2 में (सेल संस्कृति के माध्यम से किसी भी पृष्ठभूमि संकेत के माप प्रदान करने के लिए)।
  7. पिपेट HBSS में 5,000 गैर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में अच्छी तरह से H3 में (सेलुलर autofluorescence से किसी भी पृष्ठभूमि संकेत के माप प्रदान करने के लिए)।
  8. अच्छी तरह से एच 4 में 75 माइक्रोन के Coumarin डाई समाधान के पिपेट 200 μL (परिवेश के तापमान में बदलाव के कारण या लेजर या समय circuitry में उतार-चढ़ाव के multiwell थाली अधिग्रहण, जैसे दौरान टी 0 के किसी भी बदलाव पर एक चेक प्रदान करने के लिए।

2. openFLIM-एचसीए डाटा अधिग्रहण

नोट: विस्तृत जानकारी openFLIM-एचसीए विकि 33 पर पाया जा सकता है।

  1. प्रारंभ μManager और OpenFLIM-एचसीए प्लगइन
  2. देरी जनरेटर इकाई के विशिष्ट संयोजन के लिए अंशांकन फ़ाइल का चयन करें और": देरी बॉक्स अंशांकन फ़ाइल: कैलिब्रेशन फ़ाइलें लिए flim नियंत्रण 'के तहत लेजर पुनरावृत्ति दर।
  3. ": सेट आधार फ़ोल्डर फ़ाइल फ़ोल्डर" जहां डाटा के तहत बचाया जाएगा सेट करें।
  4. उत्तेजना किरण पथ चेक वितरण ऑप्टिकल फाइबर में है कि युग्मन सुनिश्चित करने के लिए स्थिर है और उस युग्मन दक्षता एक बिजली मीटर का उपयोग कर वितरण फाइबर के माध्यम से प्रेषित शक्ति को मापने के द्वारा अधिकतम है। उतार चढ़ाव 5% से कम स्वीकार्य हैं।
  5. जाँच करें कि भारत सरकार को ट्रिगर एक आस्टसीलस्कप भारत सरकार इनपुट ट्रिगर संकेत से शुरू हो रहा है पर भारत सरकार से नजर रखने के उत्पादन में संकेत प्रदर्शित करके स्थिर है।
  6. भारत सरकार की photocathode कवर, कि इस तरह की 750 वी करने के लिए अपने लाभ को स्थापित करने और रिले लेंस के एक ध्यान केंद्रित करके सीसीडी सेंसर पर भारत सरकार भास्वर की इमेजिंग चेक हालांकि भारत सरकार कवर लीक विरल फोटान घटनाओं की छवियों (पृष्ठभूमि रोशनी के कारण ) सीसीडी पर दर्ज संभव के रूप में रूप में तेजी से कर रहे हैं।
  7. जाँच करें कि नमूनादेखने के क्षेत्र में समान रूप से इस तरह के एक coverslip पर संदर्भ डाई समाधान की एक बूंद के रूप में एक वर्दी फ्लोरोसेंट नमूना इमेजिंग, सुनिश्चित करना है कि भारत सरकार संतृप्त नहीं है एक पर्याप्त रूप से कम उत्तेजना शक्ति (<1 μW) का उपयोग करके प्रकाशित किया जाता है।
  8. उचित प्लेट परिभाषा फ़ाइल का चयन करें, यानी, 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए विकल्प का चयन करें ( "फ़ाइल: लोड प्लेट गुण")।
  9. ΜManager जीयूआई का उपयोग, यह सुनिश्चित करने के लिए एक खाली स्थिति का चयन करके माइक्रोस्कोप फ्रेम में कोई dichroic बीम फाड़नेवाला घन नहीं है।
  10. मैन्युअल पूरे प्रयोग के लिए भारत सरकार पर 4 एनएस के एक गेट चौड़ाई का चयन करें।
  11. मोल आईआरएफ छवि डेटा:
    1. ΜManager जीयूआई का उपयोग, यह सुनिश्चित करने के लिए एक खाली स्थिति का चयन करके किरण पथ में कोई खुर्दबीन उद्देश्य नहीं है। मैन्युअल किसी भी लेजर प्रकाश से बचने के लिए और कोण यह किसी भी प्रतिबिंब माइक्रोस्कोप फ्रेम में वापस कम करने के लिए रोकने के लिए उद्देश्य बुर्ज के ऊपर एक काला anodized किरण ब्लॉक जगह है।
      2. <li> μManager जीयूआई का उपयोग करना, CSUX (उत्तेजना, dichroic, उत्सर्जन) ऐसा है कि उत्तेजना प्रकाश कताई Nipkow डिस्क से बिखरे हुए के अंश imaged किया जा सकता है, लेकिन यह सुनिश्चित तीव्रता एक 200 के लिए प्रणाली को तर करने के लिए पर्याप्त नहीं है में फिल्टर सेट एमएस सीसीडी एकीकरण का समय है। यह बहुत ज्यादा प्रकाश है, जो photocathode को नुकसान पहुंचा सकता है भारत सरकार photocathode को प्रकाश में लाने से बचने के लिए है।
    2. प्रोग्राम तेजी से देरी बॉक्स द्वारा कवर देरी की पूरी रेंज पर मिल अधिकतम-बिंदु समारोह का प्रयोग करें। उत्पादन आरेख प्रदर्शित की जाँच करें और फिर आगे बटन धक्का इतना है कि पूर्ण आईआरएफ प्रोफ़ाइल तेजी से देरी बॉक्स की सीमा के भीतर है स्कैन द्वारा मैनुअल बेशक देरी बॉक्स समायोजित करें।
    3. अधिग्रहण के मानकों (तटस्थ घनत्व, जोखिम समय, फ्रेम संचय) तो सीसीडी प्रतिभाशाली समय-गेट में संतृप्त नहीं है और प्रभावी एकीकरण के समय> 200 एमएस है समायोजित करें।
    4. पूर्ण देरी पर 25 पीएस की देरी कदम सेट बजीई ( "लिए flim नियंत्रण: फास्ट देरी बॉक्स: देरी आबाद")।
    5. "स्नैप लिए flim छवि" दबाकर आईआरएफ छवि मोल।
    6. लेजर अवरुद्ध करके एक पृष्ठभूमि छवि मोल ( "प्रकाश पथ नियंत्रण: तटस्थ घनत्व: अवरुद्ध"), देरी की संख्या ( "लिए flim नियंत्रण: फास्ट देरी बॉक्स: वर्तमान देरी सेटिंग (पी एस)") को कम करने, अन्य सभी गुण अनछुए छोड़ दो और प्रेस "स्नैप लिए flim छवि"।
  12. मोल संदर्भ डाई डेटा:
    1. अच्छी तरह से μManager जीयूआई का उपयोग करके एच 4 का चयन करें ( "XYZ नियंत्रण: अच्छी तरह से करने के लिए जाओ: एच 4")।
    2. इमेजिंग mTqFP के लिए μManager जीयूआई, का चयन फिल्टर (उत्तेजना 434/17 एनएम, dichroic, उत्सर्जन 482/25 एनएम) का उपयोग करना।
    3. तेजी से देरी बॉक्स की पूरी रेंज पर मिल अधिकतम-बिंदु समारोह का प्रयोग करें और फिर मोटे देरी बॉक्स समायोजित इतना भरा क्षय प्रोफ़ाइल तेजी से देरी बॉक्स की देरी सीमा के भीतर है।
    4. देरी सेटबदल रहा है ": फास्ट देरी बॉक्स: वर्तमान देरी सेटिंग (पी एस) लिए flim नियंत्रण" से अधिकतम तीव्रता के मुद्दे पर। इतना है कि सीसीडी संतृप्त नहीं है अधिग्रहण मानकों (तटस्थ घनत्व, जोखिम समय) को समायोजित करें।
    5. पूर्ण देरी रेंज पर 25 पीएस की देरी कदम सेट ( "लिए flim नियंत्रण: फास्ट देरी बॉक्स: देरी आबाद)।
    6. "स्नैप लिए flim छवि" दबाकर संदर्भ डाई डेटा मोल।
    7. उत्तेजना लेजर अवरुद्ध करके एक दूसरे पृष्ठभूमि सीसीडी कैमरा छवि मोल (2.11.7 देखें)
  13. ΜManager अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर multiwell थाली नमूने के लिए flim डेटा मोल:
    1. सेट जो कुओं imaged किया जाना चाहिए और FOV की संख्या अच्छी तरह से ( ": XYZ पदों सेटअप एचसीए अनुक्रम अधिग्रहण") प्रति अधिग्रहण किया जाना है।
    2. मैन्युअल चयन एक कापी नमूना युक्त FOV imaged किया जाना है। भारत सरकार पर इष्टतम तटस्थ घनत्व फिल्टर, गेट चौड़ाई निर्धारित करने के लिए इस FOV का प्रयोग करें औरकैमरे के एकीकरण के समय के रूप में तो सीसीडी कैमरे के गतिशील रेंज के 75% तक पहुँचने के लिए।
    3. ऑटोफोकस सेट ( "XYZ नियंत्रण: ऑटोफोकस"): प्रेस "वापसी फोकस केवल नियंत्रण", और फिर स्वयं कोशिकाओं या ब्याज की संरचना पर ध्यान केंद्रित। 2000 माइक्रोन और प्रेस दर्ज करें "" "ऑटोफोकस खोज रेंज" सेट करें। "वायुसेना अब" एक ऑटोफोकस प्रक्रिया आरंभ करने के लिए प्रेस। एक ऑफसेट मूल्य मैदान "FocusOffset (ऑटोफोकस)" में दिखाई देगा।
    4. में "वायुसेना ऑफसेट" 2.13.3 में प्राप्त ऑफसेट मूल्य दर्ज करें और जांच करने के लिए है कि ऑफसेट मूल्य अब शून्य है दो बार ऑटोफोकस प्रक्रिया को दोहराने ( "वायुसेना अब"), ऑटोफोकस प्रणाली के सही कार्य का संकेत है।
    5. OpenFLIM-एचसीए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में "AutoGate" समारोह का उपयोग देरी अंक की एक लघुगणक नमूना चुनने के लिए। वैकल्पिक रूप से, इन मैन्युअल रूप से चयनित किया जा सकता है, का उल्लेख देखनाअधिक जानकारी के लिए 36 खिलाडि़यों।
    6. एक मूल्य है कि पैदावार की कुल डाटा अधिग्रहण समय वांछित करने के लिए "जमा फ्रेम्स" सेट करें। संचित तख्ते की संख्या बढ़ाने की कुल लिए flim डाटा अधिग्रहण के समय भी बढ़ रही की कीमत पर लिए flim डेटा के शोर अनुपात करने के लिए संकेत बढ़ जाती है।
    7. "प्रारंभ एचसीए अनुक्रम" बटन दबाकर multiwell प्लेट के लिए flim अधिग्रहण चलाएँ।
  14. उत्तेजना लेजर (2.11.7 देखें) समान अधिग्रहण सेटिंग्स के साथ अवरुद्ध के रूप में लिए flim डाटा अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया द्वारा एक और पृष्ठभूमि सीसीडी कैमरा छवि मोल।

3. openFLIM-एचसीए डेटा विश्लेषण का उपयोग FLIMfit

  1. चेक लिए flim डेटा विश्लेषण के लिए आवश्यक है कि सहायक फ़ाइलें मौजूद हैं (यानी, आईआरएफ और संदर्भ डाई माप)।
  2. खाली अच्छी तरह से (एच 1) से डेटा लोड, अच्छी तरह से युक्त मध्यम संस्कृति (एच 2) और FLIMfit में संस्कृति के माध्यम में अच्छी तरह से युक्त लेबल हटाया गया कोशिकाओं (H3)( "फ़ाइल: लोड लिए flim डेटा") कुओं A1-जी 3 में, व्यक्त "दाता केवल" कोशिकाओं से किसी भी पृष्ठभूमि योगदान संकेत के बड़े 1% से देखते हैं कि क्या जांच करने के लिए, अर्थात्।
  3. ( ": लोड लिए flim डेटा फ़ाइल") FLIMfit में अच्छी तरह से संस्कृति के साथ मध्यम लोड करके एक समय-अलग पृष्ठभूमि (TVB) फ़ाइल तैयार करें। खंड 2.14 में अधिग्रहण कैमरा पृष्ठभूमि डेटा लोड ( "पृष्ठभूमि: लोड पृष्ठभूमि") और FLIMfit विकल्प "उपकरण: TVB तीव्रता मानचित्र बनाएँ" का उपयोग TVB उत्पन्न करते हैं। संदर्भित 31 TVB पर और अधिक विस्तार के लिए देखें।
  4. खंड 2.11 में अधिग्रहण आईआरएफ डेटा लोड करके स्थानिक बदलती आईआरएफ शिफ्ट मानचित्र तैयार हैं और इस खंड 2.11.7 में अधिग्रहण सीसीडी कैमरा पृष्ठभूमि घटाना। का प्रयोग करें FLIMfit विकल्प "उपकरण: आईआरएफ बनाएं शिफ्ट नक्शा" की गणना करने के स्थानिक बदलती आईआरएफ शिफ्ट मानचित्र। आईआरएफ शिफ्ट मानचित्र पर और अधिक विस्तार के लिए संदर्भ [31] देखें।
  5. एक monoexponen फ़िटखंड 2.12 में अधिग्रहण संदर्भ डाई आंकड़ों के TiAl क्षय। लोड संदर्भ डाई और स्थानिक बदलती आईआरएफ मानचित्र धारा 3.4 में गणना, फिट मानकों सेट ( "लाइफटाइम: नहीं ऍक्स्प: 1") टी के साथ एक फिट पैरामीटर के रूप में 0 सेट ( "लाइफटाइम: फिट आईआरएफ शिफ्ट: सज्जित")। टी 0 प्राप्त की मूल्य तो "पैरामीटर" टैब में दिखाया गया तालिका में सूचना दी है।
  6. खंड 2.13 में अधिग्रहण प्रयोगात्मक लिए flim डेटा लोड करके लिए flim डेटा का विश्लेषण, स्थानिक बदलती आईआरएफ मानचित्र धारा 3.4 में गणना की धारा 2.14 में अधिग्रहण कैमरा पृष्ठभूमि, TVB फ़ाइल अनुभाग 3.3 और प्रकार में तैयार टी 0 के नकारात्मक मूल्य प्राप्त करने में धारा 3.5 में ( "आईआरएफ: आईआरएफ पारी: टी 0")। तब प्रयोग की आवश्यकताओं के अनुसार FLIMfit 36 का उपयोग कर वांछित क्षय मॉडल के लिए प्रयोगात्मक डेटा फिट बैठते हैं।

Representative Results

openFLIM-एचसीए इंस्ट्रूमेंटेशन की क्षमताओं का वर्णन करने के लिए, हम तीन कापी झल्लाहट आवेदन पत्र प्रस्तुत करते हैं। पहली चिंताओं निर्माणों कि झल्लाहट मॉडल निर्माणों स्टीफन वोगल की प्रयोगशाला द्वारा विकसित 38 से अनुकूलित कर रहे हैं झल्लाहट। वे आनुवंशिक रूप से व्यक्त फ्लोरोसेंट निर्माणों जिसमें एक दाता फ्लोरोसेंट प्रोटीन (mTurquoise) 5, 17 और 32 अमीनो एसिड (mTq5V, mTq17V, mTq32V) से कम नियंत्रित लंबाई से एक स्वीकर्ता fluorophore (वीनस) से जुड़ा हुआ है की एक श्रृंखला शामिल है। दाता और स्वीकर्ता fluorophores के बीच अलग अलग लंबाई लिंकर झल्लाहट क्षमता और इसलिए अलग दाता जन्मों में परिणाम। एक नकारात्मक नियंत्रण प्रदान करने, लघु 5-एमिनो एसिड लिंकर निर्माण में वीनस एम्बर द्वारा बदल दिया है - (mTq5A) YFP के एक गैर फ्लोरोसेंट उत्परिवर्तन है कि एक झल्लाहट स्वीकर्ता 38 के रूप में कार्य नहीं कर सकता। हम vect पचाने प्रतिबंध से मूल pCXV और pC5A वैक्टर में आसमानी की जगहNheI और BglII एंजाइम और ligating mTurquoise टुकड़े के साथ ओआरएस pmTurquoise-एन 1 वेक्टर से ही एंजाइमों का उपयोग कर पचा। लिंकर क्षेत्र इस प्रतिस्थापन द्वारा असंशोधित था।

चित्रा 6 एक कापी लिए flim इस मॉडल प्रणाली क्योंकि कोशिकाओं में व्यक्त की, जिसमें एक multiwell थाली 3 कॉलम के साथ arrayed है का उपयोग परख झल्लाहट प्रस्तुत नकारात्मक नियंत्रण के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में से प्रत्येक (स्तंभों 1-3), 5-एमिनो एसिड लिंकर निर्माण झल्लाहट (स्तंभों 4-6), 17 एमिनो एसिड लिंकर (स्तंभों 7-9) और 32 अमीनो एसिड का निर्माण लिंकर (स्तंभों 10-12) का निर्माण झल्लाहट झल्लाहट। पंक्ति एच TVB आकलन के लिए कुओं में शामिल है। चित्रा 6 (क) प्रत्येक कुएं में देखने के विशिष्ट क्षेत्रों के लिए स्वचालित रूप से प्राप्त कर लिया प्रतिदीप्ति जीवनकाल छवियों का उदाहरण दिखाता है। यह स्पष्ट है कि नकारात्मक नियंत्रण (स्तंभों 1-3) सबसे लंबे समय तक जीवन काल के वर्तमान और है कि दाता जीवन भर है झल्लाहट के लिए संभव सबसे कम से कम लिंकर लेन के साथ निर्माणGTH (स्तंभों 4-6)। चित्रा 6 (ख) से पता चलता है कि कैसे मतलब जीवन भर के प्रत्येक में सभी FOVs पर औसतन अच्छी तरह multiwell थाली भर में बदलता है। आंकड़े 6 (ग) और (घ) क्रमश mTq5A और mTq17V की एक FOV के लिए कापी दाता प्रतिदीप्ति तीव्रता-विलय जीवन भर के नक्शे दिखा। चित्रा 6 (ए) से पता चलता सभी कोशिकाओं में अच्छी तरह से imaged A1 से अधिक दाता प्रतिदीप्ति तीव्रता क्षय प्रोफ़ाइल औसतन, एक साथ एक monoexponential क्षय मॉडल और आईआरएफ (जो भारत सरकार के गेट चौड़ाई का प्रभुत्व है) के लिए फिट के साथ। चित्रा 6 (च) multiwell थाली एक पिक्सेल के लिहाज से फिट monoexponential से प्राप्त की प्रत्येक स्तंभ के लिए औसत प्रतिदीप्ति जीवनकाल प्रस्तुत करता है। मतलब जीवन और मानक विचलन (एसटीडी) की एक मेज के नीचे तालिका 1 में पाया जा सकता है। 6 चित्र में दिखाया छवियों के लिए डाटा अधिग्रहण के अधिग्रहण के लिए लगभग 160 मिनट लिया। विश्लेषण 10 कोर और 64 ग्राम के साथ एक 2.6 गीगा कंप्यूटर पर 92 एस ले लियाराम के बी।

दूसरी कापी परख इस प्रक्रिया 25,42 के अवरोधकों का परीक्षण करने के लिए एक साधन के रूप में एचआईवी -1 virions की विधानसभा के दौरान एचआईवी -1 झूठ oligomerization बाहर पढ़ने के लिए लिए flim झल्लाहट के आवेदन को दर्शाता है। क्योंकि यह वायरल कणों की तरह (VLPs) है कि एचआईवी -1 virions अपरिपक्व के समान हैं के गठन की ओर जताते उचित मेजबान कोशिकाओं में एचआईवी -1 चुप एचआईवी -1 जीवन चक्र के इस स्तर के लिए एक मॉडल प्रणाली प्रदान करता है। इस परख के लिए, हम एचआईवी -1 चुप प्रोटीन हेला कोशिकाओं में सीएफपी के साथ जुड़े हुए हैं और झल्लाहट संकेत है कि चुप oligomerization से हुई पर उनके प्रभाव के माध्यम से विभिन्न अवरोधकों की कार्रवाई की तुलना में व्यक्त किया। इस्तेमाल किया अवरोधकों का विवरण संदर्भ 42 में प्रदान की जाती हैं।

नमूना तैयार करने और प्रयोगात्मक माप का ब्यौरा संदर्भ 25 है, जहां हम दिखा दिया है कि हम बो बाहर पढ़ने के लिए लिए flim इस्तेमाल कर सकते हैं में व्यापक वर्णन किया गया हैंचुप प्रोटीन सीएफपी साथ और YFP साथ प्रसंभात्य लेबल, और यह भी केवल चुप सीएफपी के साथ लेबल व्यक्त कोशिकाओं में homoFRET कुल के बीच वें heteroFRET। हालांकि homoFRET आमतौर पर दाता जीवन में एक परिवर्तन मौजूद नहीं है, यह सीएफपी की विशेष मामले में जहां fluorophore अलग मतलब प्रतिदीप्ति जन्मों 40,41 के साथ दो isomers में मौजूद है के लिए करता है। सीएफपी होमो-झल्लाहट readout सरलीकृत नमूना तैयार सीएफपी / YFP असमलैंगिक झल्लाहट की तुलना में फायदे हैं और अधिक कुशल वर्णक्रम, जो मल्टिप्लेक्स झल्लाहट readouts के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है।

हमारे पिछले काम लागू किया लिए flim एक एन myristoyltransferase (NMT) अवरोध 42 की उपस्थिति में चुप oligomerization की परख के लिए झल्लाहट। इस अवरोध धोखा करने के लिए Myristic एसिड, जो चुप प्रोटीन प्लाज्मा झिल्ली के लिए बाध्य करने के लिए सक्षम बनाता है और एचआईवी virions या के गठन में एक शर्त है 43 के अलावा के लिए जिम्मेदार अंतर्जात एंजाइमों बाधितVLPs। हम जानते हैं कि दोनों heteroFRET और homoFRET readouts एक NMT अवरोध करनेवाला के साथ> 0.6 खुराक प्रतिक्रिया अध्ययन में की जेड 'को प्राप्त कर सकता दिखाया। जेड 'दवा उद्योग में इस्तेमाल एक परख की गुणवत्ता को इंगित करने के लिए एक पैरामीटर है और परख की गुणवत्ता का एक ही मूल्य मीट्रिक उत्पन्न करने के लिए मतलब है और उनके रिश्तेदार फैलता सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के मूल्यों में मतभेद का प्रतिनिधित्व करता है - जेड के साथ'> 0.5 एक दवा परख 44 के लिए "उत्कृष्ट" माना जा रहा है। महसूस किया जा करने के लिए कोशिकाओं की बड़ी संख्या है, जो उपयोगी readouts सक्षम बनाता है के लिए लिए flim डेटा का विश्लेषण के सांख्यिकीय शक्ति का प्रदर्शन बहुत छोटे का उपयोग कर - हम ध्यान दें कि इस उत्कृष्ट प्रदर्शन के नमूने जिसके लिए मतलब दाता जीवन में परिवर्तन 300 पीएस के आदेश था के साथ हासिल की थी प्रतिदीप्ति जीवनकाल में परिवर्तन से मैनुअल माइक्रोस्कोपी प्रयोगों में imaged कोशिकाओं की खासियत संख्या के साथ संभव है।

यहाँ, हम एक multiwell थाली लिए flim झल्लाहट पेश एचआईवी चुप oligomerization के लिए 4 अवरोध यौगिकों (नामित ICL13, ICL14, ICL15 और ICL16) की तुलना सेट डेटा। इस प्रयोग के लिए, हम हेला कोशिकाओं क्षणिक चुप-सीएफपी प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट साथ homoFRET readout का उपयोग किया। प्रत्येक अवरोध के नौ अलग-अलग खुराकों की कुल मानक प्रोटोकॉल संदर्भ 32 में उल्लिखित निम्नलिखित लागू किया गया, हालत प्रति दो दोहराने कुओं की इजाजत दी। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, स्तंभ 1 व्यक्त MYR-चुप, एक उत्परिवर्तित चुप प्रोटीन Myristic एसिड आधा भाग कि VLPs फार्म नहीं कर सकते और इसलिए कुल निषेध simulates कमी कोशिकाओं प्रस्तुत करता है। एक नकारात्मक नियंत्रण केवल सिर्फ दूसरे कॉलम (स्तंभ 11) में अवरोधकों को वितरित करने के लिए इस्तेमाल वाहन के साथ चुप-सीएफपी व्यक्त खुराक कोशिकाओं द्वारा प्रदान किया गया। आठ FOV की कुल प्रति अच्छी तरह से हासिल किया गया।

डाटा एक पिक्सेल द्वारा पिक्सेल आधार पर एक एकल घातीय क्षय मॉडल और प्रतिदीप्ति जीवनकाल बेनी साथ लगाया गया थाई औसत जीवनकाल प्रति अच्छी तरह से (देखने के आठ क्षेत्रों में तीव्रता सीमा से ऊपर सभी पिक्सल से अधिक) दिखा नक्शा चित्रा 7 में नीचे दिखाया गया है (क)। चित्रा 7 (ख) अवरोध एकाग्रता के एक समारोह के रूप में प्रतिदीप्ति जीवन भर के लिए इसी साजिश से पता चलता है। अवरोधकों के तीन जब चुप-सीएफपी व्यक्त कोशिकाओं के साथ incubated एक निरोधात्मक प्रभाव (ICL13, ICL15 और ICL16) दिखा। एक अवरोध करनेवाला (ICL14) का परीक्षण किसी भी खुराक पर कोई प्रभाव नहीं चलता। जेड 'इस प्लेट के लिए गणना 0.51 था। मूल्यों सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के लिए प्राप्त चित्रा 7 पर दिखाए जाते हैं (ख) 100 सुक्ष्ममापी पर काले और 0.1 एनएम में अंक के रूप में।

ICL13, ICL15 और ICL16 के लिए खुराक प्रतिक्रिया घटता चित्र में दिखाया 7 (ख) उसके बाद के लिए तय हिल गुणांक 1 45 अधिकतम और न्यूनतम जन्मों के साथ करने के लिए तय साथ 4 पैरामीटर रसद nonlinear प्रतिगमन मॉडल के लिए लगाया गया थासकारात्मक (स्तंभ 1) और नकारात्मक (स्तंभ 11) से प्राप्त मूल्यों क्रमश: नियंत्रित करता है। 38 एनएम, 24 एनएम और 116 एनएम ICL13, ICL15 और ICL16 के लिए क्रमश: तीन घटता के लिए लौट आए आईसी 50 मूल्यों फिर रहे थे। आईसी 50 intracellular लिए flim के माध्यम से प्राप्त मूल्यों के साथ तुलना के लिए माप झल्लाहट, हम आईसी 50 निर्धारित की हमारे पहले से सूचना दी जैव रासायनिक एंजाइम परख 42 में पुनः संयोजक मानव NMT1 के enzymatic गतिविधि के निषेध के लिए। तीन यौगिकों लिए flim झल्लाहट से सक्रिय हो पाया भी इस परख में सबसे अधिक सक्रिय हैं (आईसी 17 एनएम, 51 एनएम, और ICL13, ICL15 और ICL16 के लिए क्रमश: 39 एनएम के 50 मान), ICL14, साथ जो कोई महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया से पता चला झल्लाहट लिए flim परख में, सीए जा रहा है NMT1 (1700 एनएम के 50 आईसी) के खिलाफ कम सक्रिय 100 गुना। सक्रिय यौगिकों के लिए, इन स्वतंत्र परख तौर तरीकों के माध्यम से प्राप्त आईसी 50 मूल्यों, उल्लेखनीय समान मामूली बदलाव होने की संभावना घ के कारण के साथतेज या कोशिकाओं में यौगिक के चयापचय में ifferences।

इस छोटे से अध्ययन विभिन्न यौगिकों जो ब्याज का एक ही लक्ष्य पर कार्रवाई की शक्ति भेदभाव करने के लिए flim एचसीए की क्षमता पर प्रकाश डाला गया। हम मानते हैं कि यह एक स्क्रीन एक उच्च सामग्री के संदर्भ में स्वचालित लिए flim का उपयोग कर एकाधिक खुराक प्रतिक्रिया घटता उत्पन्न करने का पहला प्रदर्शन है और के लिए स्क्रीन करने के लिए आवेदन किया है और / या उपयोगी चिकित्सीय यौगिकों को चिह्नित किया जाना है flim के लिए संभावित दिखाता है।

तीसरे कापी लिए flim झल्लाहट प्रयोग एक्सचेंज प्रोटीन चक्रीय adenosine monophosphate (शिविर (EPAC)) है, जो एक रैप -1 गुआनिन विनिमय पहलू यह है कि शिविर में विशेष रूप से बांधता है से सक्रिय करने के लिए एक आनुवंशिक रूप से व्यक्त की झल्लाहट biosensor का सवाल है। इस EPAC झल्लाहट biosensor (EPAC-एस H188) दाता fluorophore के रूप में mTurquoise2 फ्लोरोसेंट प्रोटीन (mTq2FP) का इस्तेमाल करता है और एक सह लागू करने के लिए दो-वीनस एफपी शामिलस्वीकर्ता 46 mposite। शिविर एक सर्वव्यापी दूसरा दूत है और कई अलग अलग जीवों भर intracellular प्रक्रियाओं के ढेर में शामिल है। यह कोशिका झिल्ली में एटीपी के रूपांतरण से adenylate साइक्लेज द्वारा संश्लेषित है। यहाँ हम अपने बाहर पढ़ सकते हैं और forskolin, एक adenylate साइक्लेज उत्प्रेरक कि शिविर के intracellular उत्पादन upregulates और इसलिए अपनी cytoplasmic एकाग्रता बढ़ जाती है के अलावा के बाद लाइव HEK293T कोशिकाओं में अपनी गतिविधि यों करने की क्षमता प्रदर्शित करता है। इस EPAC सेंसर से होकर गुजरती है इसका निष्क्रिय (अपार) राज्य में झल्लाहट और शिविर एकाग्रता के साथ अपने जीवन भर दाता के रूप में बढ़ शिविर biosensor के उद्घाटन के लिए होता है। मोनो घातीय mTq2FP के क्षय प्रोफ़ाइल इस biosensor बेहतर सीएफपी आधारित biosensors 45 से मात्रात्मक जीवन भर के विश्लेषण के लिए अनुकूल बनाता है। चित्रा 8 स्वचालित multiwell थाली लिए flim माइक्रोस्कोप का उपयोग कर दर्ज एक समय के पाठ्यक्रम का एक उदाहरण से पता चलता है, जहां हम परिवर्तन की साजिश रची हैमतलब जीवन और 100 माइक्रोन के forskolin के अलावा के बाद समय के साथ FRETing दाता आबादी अंश में बदलने में। सादगी के लिए, हम यह मान कुल संकेत monoexponential FRETing और गैर-FRETing दाताओं और सक्रिय EPAC झल्लाहट biosensor की आबादी अंश का एक मिश्रण द्वारा वर्णित किया जा सकता है कि प्राप्त किया गया था समय श्रृंखला भर में एक डबल घातीय क्षय प्रोफ़ाइल फिटिंग द्वारा।

शिविर (EPAC) पांच गेट देरी के डाटा अधिग्रहण, 4000 पी एस के एक गेट चौड़ाई के साथ के लिए, देरी समय 1300 पी एस, 4300 पी एस (शिखर तीव्रता), 4919 पी एस, 6656 पी एस, 8035 पी एस, 1 करने के लिए सेट के साथ चुना गया था, 0391 पी एस और 16,000 भज। प्रत्येक देरी के लिए कैमरे के एकीकरण के समय 250 एमएस था। एक पर ठीक है, हम 10 मिनट पर हर 10 एस अधिग्रहीत छवियों के साथ एक लिए flim समय पाठ्यक्रम हासिल कर ली। क्योंकि forskolin के अलावा के नमूने की फोकल स्थिति में एक छोटा सा बदलाव के कारण होता है और वजह बार 120 और 130 S पर हासिल डेटा बिंदुओं को हटा दिया गयाइन बिंदुओं पर समय लिए flim अधिग्रहण के दौरान दर्ज की प्रतिदीप्ति तीव्रता के ई।

डेटा विश्लेषण के लिए छवियों FLIMfit में भरी हुई है और सेल प्रति खंडित किया गया। प्रतिदीप्ति जीवनकाल डेटा एक डबल घातीय क्षय मॉडल एक आईआरएफ का उपयोग करते हुए और एक संदर्भ डाई (75 माइक्रोन के Coumarin 6) से प्राप्त एक निश्चित टी 0 मूल्य के लिए लगाया गया था। दाता प्रतिदीप्ति जीवनकाल सभी कोशिकाओं पर औसतन मतलब चित्रा 8 में दिखाया गया है (क)। 8 चित्रा (ख) एक ही डबल घातीय क्षय मॉडल के लिए ही लिए flim डेटा फिटिंग द्वारा गणना की समय के साथ FRETing आबादी अंश में परिवर्तन को दर्शाता है

1 समीकरण

जहां β FRETing दाता अंश है। हम FRETing और गैर-FRETing Eleme का एक मिश्रण मानforskolin के अलावा करने से पहले समय बिंदुओं के लिए एनटीएस। इन जन्मों प्राप्त करने के लिए, एक डबल घातीय फिट FRETing दाता के लिए τ जन्मों दे रही है 1 = 3964 ± 21 गैर FRETing दाता के लिए पीएस पहले तीन बार के अंक के लिए लागू किया गया था, और τ 2 = 3022 ± 27 भज। ये पूरे डेटा हर समय बिंदु पर β मूल्यों को प्राप्त करने के लिए सेट के बाद फिट करने के लिए तय किया गया।

सारांश में, हम तीन प्रयोगात्मक नमूने के लिए कापी लिए flim एचसीए परिणाम प्रस्तुत किया है। पहले एक 96 अच्छी तरह से थाली क्योंकि कोशिकाओं झल्लाहट एक mTqFP दाता या तो एक वीनस एफपी स्वीकर्ता या एक गैर फ्लोरोसेंट एम्बर पेप्टाइड लिंकर की लंबाई अलग से निर्माण करने के लिए जुड़ा हुआ जिसमें constructs व्यक्त के साथ arrayed था। लिंकर लंबाई के साथ झल्लाहट दक्षता और इसलिए दाता जीवन में परिवर्तन स्पष्ट रूप से स्पष्ट है और प्रत्येक निर्माण के लिए मतलब जीवन भर के मानक विचलन कम से कम 36 पीएस था। दूसरी कापी Assay एक एचआईवी चुप प्रोटीन की myristoylation के लिए चार संभावित अवरोधकों जिसके लिए% निषेध अवरोध एकाग्रता हेला कोशिकाओं चुप प्रोटीन सीएफपी के साथ लेबल को व्यक्त करने में मापा साथ मतलब दाता प्रतिदीप्ति जीवन भर की भिन्नता से गणना की गई की "स्क्रीन" था। इस readout homoFRET, जो आमतौर पर दाता जीवन में एक परिवर्तन उपस्थित नहीं होता है, लेकिन क्योंकि यह अलग फ्लोरोसेंट जन्मों के साथ कई isomers में मौजूद सीएफपी के लिए करता है पर आधारित है। इस वर्णक्रम दक्षता, जैसे, बहुसंकेतन अलग झल्लाहट readouts 25 के संदर्भ में उपयोगी हो सकता है। तीसरे कापी परख एक समय के पाठ्यक्रम को लाइव HEK293T कोशिकाओं शिविर झल्लाहट biosensor, EPAC व्यक्त निगरानी कर रहा था। यह और forskolin के साथ इलाज का पता चला फोटॉनों लाइव सेल इमेजिंग के अनुरूप किया जा रहा है की संख्या के साथ एक डबल घातीय क्षय मॉडल का उपयोग कर FLIMfit के आवेदन के बाद उम्मीद की प्रतिक्रिया से पता चला है - जैसा कि हम पहले से तुला झल्लाहट biosen के साथ दिखाया गया हैIP3 47 के लिए Sor।

आकृति 1
एक gated ऑप्टिकल छवि intensifier (भारत सरकार) का उपयोग व्यापक क्षेत्र के लिए समय-गेटेड लिए flim की चित्रा 1. योजनाबद्ध। बाएं हाथ की ओर, प्रायोगिक प्रणाली का एक योजनाबद्ध दिखाता है। शीर्ष सही, उत्तेजना नाड़ी की योजनाबद्ध, समय-गेटेड छवियों और डेटा को monoexponential फिट की स्थिति। नीचे सही, कार्टून प्रायोगिक प्रणाली में दिखाया दो वस्तुओं से प्रतिदीप्ति क्षय को दर्शाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
एक gated ऑप्टिकल छवि intensifier (भारत सरकार) का उपयोग व्यापक क्षेत्र openFLIM-एचसीए की चित्रा 2. योजनाबद्ध। और अधिक विस्तृत विवरण के लिए मुख्य पाठ देखेंतंत्र के अंश। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. के योजनाबद्ध ऑप्टिकली एक Nipkow डिस्क स्कैनर इकाई के साथ एक gated ऑप्टिकल छवि intensifier (भारत सरकार) का उपयोग sectioned openFLIM-एचसीए। प्रणाली के घटकों का अधिक विस्तृत विवरण के लिए मुख्य पाठ देखें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. प्रबंधक अधिग्रहण कार्यक्रम से छवि डाटा प्रवाह की योजनाबद्ध विश्लेषण के लिए सर्वर या कंप्यूटर डिस्क और FLIMfit में Omero करने के लिए। डाटा प्रवाह शीर्ष एल में शुरू होता है ईएफटी कोने जहां कच्चे छवि डेटा μ-प्रबंधक अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में अधिग्रहण कर लिया है। धराशायी बॉक्स के अंदर आइटम, लिए flim डेटा विश्लेषण के चरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि बाहर उन डाटा अधिग्रहण और भंडारण के अनुरूप हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. FLIMfit यूजर इंटरफेस का स्क्रीनशॉट। ऊपर छोड़ दिया है, को देखने के क्षेत्रों की सूची वर्तमान में लोड और देखने के वर्तमान में चयनित क्षेत्र के प्रतिदीप्ति तीव्रता छवि। नीचे छोड़ दिया, फिटिंग मॉडल और फिटिंग की स्थिति का चयन। शीर्ष सही, ब्याज (नीले हलकों) की वर्तमान क्षेत्र के लिए प्रतिदीप्ति क्षय, डेटा के लिए फिट (लाल रेखा), आईआरएफ के नीचे फिट बच (नीली रेखा) के साथ (लाल रेखा धराशायी)।g5large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
झल्लाहट मॉडल की चित्रा 6 multiwell थाली लिए flim constructs mTq5V, mTq17V, mTq32V क्योंकि कोशिकाओं में व्यक्त किया। (क) प्रत्येक में FOV की कापी प्रतिदीप्ति जीवनकाल छवियों अच्छी तरह से करने के लिए विभिन्न झल्लाहट निर्माणों के रूप में पाठ में चर्चा की क्योंकि कोशिकाओं में व्यक्त किया। (ख) मतलब वीनस प्रतिदीप्ति जन्मों की गर्मी के नक्शे में अच्छी तरह से प्रत्येक में सभी कोशिकाओं पर औसतन। (ग) mTurquoise एम्बर की तीव्रता छवि लाइफटाइम नक्शा (पैमाने बार 20 माइक्रोन) से मढ़ा। (घ) mTurquoise वीनस (17 एमिनो एसिड) की तीव्रता छवि लाइफटाइम नक्शा (पैमाने बार 20 माइक्रोन) से मढ़ा। (ई) mTq5A की मापा तीव्रता क्षय प्रोफ़ाइल (नीले हलकों) निर्माण (नकारात्मक नियंत्रण) प्रतिदीप्ति सभी कोशिकाओं में अच्छी तरह से imaged एक से अधिक औसत1, एक साथ एक monoexponential क्षय करने के लिए डेटा के फिट (नीला ठोस लाइन) और आईआरएफ (धराशायी नारंगी लाइन) के साथ। (च) मतलब जीवन भर का ग्राफ multiwell थाली भर में प्रत्येक स्तंभ पर औसतन, देखने के खेतों के बीच प्रतिदीप्ति जीवनकाल में मानक विचलन दिखा त्रुटि सलाखों के साथ। के लिए (विज्ञापन) लाइफटाइम मूल्यों picoseconds में संकेत सीमा के साथ एक झूठे रंग पैमाने का उपयोग प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
7 चित्रा कापी multiwell थाली लिए flim हेला कोशिकाओं चुप-सीएफपी व्यक्त का उपयोग कर चुप अवरोधकों की स्क्रीन है। (क) में अच्छी तरह से प्रति मतलब दाता प्रतिदीप्ति जीवनकाल multiwell थाली के लिए गर्मी के नक्शे स्तंभ 1 पेश एक Positiv रूप MYR-चुप-सीएफपी साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के साथ arrayed निषेध के लिए ई नियंत्रण, स्तंभ 11 चुप-सीएफपी साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं पेश केवल वाहन से अवगत कराया, और धराशायी रंग का वर्गों कुओं कि उच्च खुराक स्तंभ 2 से कम खुराक स्तंभ 10 से लेकर सांद्रता के साथ चार अलग अलग अवरोधकों से एक के साथ dosed थे दर्शाता है । झूठी रंग पैमाने 2,200 पी एस पी एस से 3100 से लेकर मतलब प्रतिदीप्ति जीवन भर का प्रतिनिधित्व करता है। (ख) प्रतिदीप्ति जीवनकाल भूखंडों प्रत्येक त्रुटि सलाखों दोहराने कुओं के बीच मानक विचलन दिखाने के साथ अवरोध करनेवाला के लिए। क्षैतिज अक्ष पर 2 और -4 पर काले रंग में अंक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण अंक क्रमशः क्रमश कॉलम 1 और 11 से प्राप्त कर रहे हैं। ठोस लाइनों अलग अवरोधकों के लिए खुराक प्रतिक्रिया वक्र डेटा के लिए एक फिट से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8 "src =" / files / ftp_upload / 55119 / 55119fig8.jpg "/>
8 चित्रा लिए flim की कापी उपयोग HEK293T कोशिकाओं का उपयोग कर एक समय चूक माप में EPAC झल्लाहट biosensor बाहर पढ़ने के लिए। में परिवर्तन (एक) मतलब प्रतिदीप्ति जीवनकाल और (ख) के बाद हरे रंग की पट्टी ने संकेत दिया forskolin के अलावा के समय के एक समारोह के रूप में FRETing दाता के अंश। त्रुटि सलाखों सेल प्रति मानक त्रुटि दिखा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अच्छी तरह से प्रति एसटीडी अरे अच्छी तरह से प्रति एसटीडी अरे
mT5A 4008 32 12 MT17V 3004 26 10
mT5V 2717 35 13 mT32V 3133 30 1 1

तालिका 1. मतलब जीवन और मानक विचलन (एसटीडी) झल्लाहट निर्माणों की।

Discussion

हम समय-गेटेड लिए flim का उपयोग कर एचसीए के लिए बनाया गया एक स्वचालित multiwell थाली माइक्रोस्कोप का वर्णन किया है। इस उपकरण के लिए एक Omero सर्वर और लिए flim डेटा विश्लेषण के लिए डेटा को बचाने का विकल्प FLIMfit 36, एक खुला स्रोत कार्यक्रम Matlab में लिखा है और एक Omero ग्राहक 32 μManager साधन के रूप में उपलब्ध का उपयोग किया जा रहा है साथ μManager में लिखा खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग कर नियंत्रित किया जाता है नियंत्रण सॉफ्टवेयर, openFLIM-HCA, ऑनलाइन 33 उपलब्ध अपने स्वयं के लिए flim एचसीए उपकरणों का निर्माण करने के लिए अकादमिक शोधकर्ताओं सक्षम करने के लिए प्रणाली घटकों 48 की एक सूची के साथ है।

मजबूत लिए flim डेटा प्राप्त करने के क्रम में, यह भारत सरकार और सीसीडी अधिग्रहण सेटिंग्स अनुकूलन करने के लिए और टी 0 में किसी भी बदलाव के खाते में लेने के लिए आवश्यक है। 3.8.2 में वर्णित है, भारत सरकार लाभ सेटिंग और सीसीडी कैमरा एकीकरण के समय ~ तक पहुंचने के लिए सीसीडी गतिशील रेंज के 75% सेट किया जाना चाहिए। यूहर बार गेट देरी पर उच्च वोल्टेज और भारत सरकार के कई सीसीडी फ्रेम राशि गाते शोर अनुपात 49 के संकेत बढ़ जाती है लेकिन इस कुल लिए flim अधिग्रहण समय (के बाद से कम प्रतिदीप्ति फोटॉनों सीसीडी कैमरा संतृप्त और इतने फ्रेम राशि की संख्या पहले फ्रेम प्रति अर्जित कर रहे हैं बढ़ जाती है वृद्धि की जानी चाहिए) और इसलिए यह व्यापार बंद एक प्रयोग के लिए निर्णय लिया जाना चाहिए। देरी जनरेटर की जांच लेजर पुनरावृत्ति दर पर निर्भर करता है और यह सुनिश्चित करना है कि इस्तेमाल किया पुनरावृत्ति दर के लिए सही अंशांकन फ़ाइल अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में लोड किया जाता है इसलिए आवश्यक है। देरी बॉक्स औजार के लिए प्रक्रिया openFLIM-एचसीए विकि 33 पर पाया जा सकता है।

अगर सेलुलर autofluorescence प्रतिदीप्ति संकेत की तुलना में कम है, हम एक अच्छी तरह से युक्त सिर्फ संस्कृति के माध्यम से संकेत का उपयोग समय-अलग पृष्ठभूमि (TVB) प्रदान करने के लिए। सेल संस्कृति के माध्यम से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम से कम करने के लिए, हम से बचनेफिनोल लाल युक्त मीडिया। अगर सेलुलर autofluorescence महत्वपूर्ण है, तो TVB लेबल हटाया गया कोशिकाओं की माप से प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, इस मामले की देखभाल में लिया जाना चाहिए, क्योंकि यह मानता है कि autofluorescence पृष्ठभूमि छवि में हर पिक्सेल के लिए ही है। यह धारणा वैध यदि autofluorescence एक सेल भर में या यदि उत्तेजना बीम या संवेदनशीलता का पता लगाने देखने के क्षेत्र भर में एक समान नहीं है काफी भिन्न होता है नहीं होगा।

बिखरे हुए उत्तेजना प्रकाश दालों का उपयोग कर एक आईआरएफ छवि के अधिग्रहण अस्थायी आईआरएफ प्रोफ़ाइल है कि फिटिंग प्रक्रिया में डेटा मॉडल के साथ convolved है प्रदान करता है और यह भी देखने के क्षेत्र भर में आईआरएफ के स्थानिक विभिन्नता का एक नक्शा प्रदान करता है। आईआरएफ हमारे साधन में, इस तरह के एक कोलाइडयन निलंबन यद्यपि के रूप में एक बिखरने नमूना इमेजिंग द्वारा मापा जा सकता है, उत्तेजना प्रकाश बिखरे हुए Nipkow डिस्क से आईआरएफ के एक क्लीनर माप प्रदान करता है का उपयोग कर। समय ओ का सही निर्धारणएफ आईआरएफ, क्योंकि उत्तेजना और समय gating के बीच के समय में देरी में त्रुटियों को काफी फिटिंग प्रक्रिया को प्रभावित कर सकता महत्वपूर्ण है, खासकर जब जटिल घातीय क्षय मॉडल के लिए फिटिंग। आईआरएफ बिखरे उत्तेजना प्रकाश क्योंकि यह उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर बजाय प्रतिदीप्ति उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य में दर्ज की गई है कि क्या वास्तव में फिटिंग प्रक्रिया के लिए आवश्यक है नहीं है, जो अपने समय को प्रभावित कर सकते हैं का उपयोग कर, हालांकि आईआरएफ के स्थानिक विभिन्नता ही होना चाहिए अधिग्रहण किया दोनों तरंग दैर्ध्य। इसके अलावा, बिखरे हुए आईआरएफ विश्व स्तर पर सच आईआरएफ के लिए समय सापेक्ष में बिखरने वस्तु से एक भिन्न ऑप्टिकल पथ की लंबाई की वजह से स्थानांतरित किया जा सकता है एक आईआरएफ ऑप्टिकली sectioned लिए flim में Nipkow डिस्क से अधिग्रहण के लिए मामला है। यह सुधार, टी 0, जो आवश्यक वैश्विक अस्थायी बदलाव है कि अधिग्रहण किया बिखरे हुए उत्तेजना प्रकाश आईआरएफ के लिए लागू किया जाना चाहिए, monoexponential संदर्भ डाई डेटा से गणना की है के रूप में Protoc में संकेतराजभाषा कदम 4.4। निम्नलिखित रंगों अलग उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: एक 75 माइक्रोन के Coumarin 153 मेथनॉल में समाधान (τ ~ 4.3 एनएस 50) रेंज 295-442 एनएम में उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; इथेनॉल में एक 75 माइक्रोन के Coumarin 6 समाधान (τ ~ 2.43 एनएस 37) रेंज 430-500 एनएम में उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; और एक 75 माइक्रोन के पानी में Rhodamine बी समाधान (τ ~ 1.7 एनएस 37) रेंज 488-575 एनएम में उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम उस पर ध्यान दें, हालांकि यह FLIMfit प्रणाली के प्रत्येक पिक्सेल के लिए एक अलग आईआरएफ का उपयोग करने के लिए संभव है, आमतौर पर यह धारणा है कि स्थानिक बदलती आईआरएफ छवि में हर पिक्सेल के लिए ही अस्थायी प्रोफ़ाइल है बनाने के लिए उचित है, लेकिन एक श्रृंखला प्रस्तुत के स्थानिक वैश्विक टी 0 के सापेक्ष अस्थायी ऑफसेट अलग। हम आईआरएफ पारी नक्शा है, जो बिखरे हुए प्रकाश आईआरएफ से निर्धारित किया जाता है के रूप में इस का वर्णन है। साथ में, आईआरएफ प्रोफाइल, टी 0 और आईआरएफ पारी नक्शा एन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंसुनिश्चित करें कि FOV में प्रत्येक पिक्सेल एक उपयुक्त आईआरएफ के साथ फिट है। महत्वपूर्ण बात है, टी 0 समय के साथ धीरे-धीरे भिन्न हो सकते हैं तो यह किसी भी लिए flim डाटा अधिग्रहण से पहले मापा जाना चाहिए।

उपयोगकर्ता फैसला करना चाहिए प्रतिदीप्ति क्षय प्रोफाइल नमूने के लिए कैसे और समय-द्वार और उत्तेजना के बाद उनके रिश्तेदार देरी की चौड़ाई निर्धारित करने के लिए आवश्यक है। सामान्य में, यह पता लगाया संकेत अधिकतम करने के लिए व्यापक फाटक की चौड़ाई का उपयोग करने के लिए और आम तौर पर हम फाटक की चौड़ाई प्रतिदीप्ति प्रोटीन के साथ लेबल की कोशिकाओं के flim के लिए 4 एनएस करने के लिए सेट का उपयोग वांछनीय है। समय-गेट देरी की संख्या (एक गेट सिर्फ उत्तेजना नाड़ी से पहले संकेत को मापने के लिए सेट सहित) फिटिंग मॉडल की जटिलता है कि विश्लेषण में इस्तेमाल किया जाएगा दी फ्लोरोसेंट क्षय प्रोफ़ाइल नमूने के लिए पर्याप्त होना चाहिए। अधिकतम मूल्य जन्मों और क्षय घटकों के रिश्तेदार आयाम पर निर्भर कर सकते हैं। सामान्य में, 4 फाटकों फिटिंग monoexponential के लिए पर्याप्त हैं decays जबकि 7 या अधिक फाटक मईऔर अधिक जटिल क्षय मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

हम ध्यान दें कि लिए flim झल्लाहट 51 की आवृत्ति डोमेन जीवन भर readouts का उपयोग कर समय-डोमेन या आवृत्ति डोमेन तकनीक की एक सीमा का उपयोग कर कार्यान्वित किया जा सकता है और multiwell थाली सरणियों के स्वचालित लिए flim एचसीए पहली बार एक (गैर सेक्शनिंग) में लागू किया गया था व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप। पहला स्वचालित ऑप्टिकल सेक्शनिंग लिए flim multiwell थाली एचसीए के लिए उपयोग व्यापक क्षेत्र के लिए समय-गेटेड इमेजिंग 28 पाठक तो बताया गया था। बाद में, व्यापक क्षेत्र (गैर सेक्शनिंग) आवृत्ति डोमेन लिए flim एचसीए पोस्ट translational संशोधनों (tyrosine फोस्फोराइलेशन) झल्लाहट 52 का उपयोग कर एक जीन पुस्तकालय और समय-गेटेड लिए flim एचसीए भर के लिए स्क्रीन करने के लिए लागू किया गया था एचआईवी -1 झूठ assays झल्लाहट करने के लिए लागू किया गया है oligomerization 53 और 54 FOXM1 की और Raichu RhoA और Rac1 biosensors 33 के sumoylation की। यह भी multiwell थाली लिए flim 26 के लिए लेकिन आज तक यह टी मैच के लिए चुनौतीपूर्ण साबित कर दिया है TCSPC उपयोग करना संभव हैवह व्यापक क्षेत्र का पता लगाने का शोषण तकनीक के throughput। एक उभरते दृष्टिकोण है कि इस मुद्दे के समाधान हो सकता है इस तरह के SPAD सरणियों 55 के रूप में एक फोटान गिनती डिटेक्टरों की सरणियों का इस्तेमाल होता है।

हम ध्यान दें कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग झल्लाहट के किसी भी readouts सावधानी के साथ और कहा कि FLIMfit या किसी अन्य लिए flim विश्लेषण सॉफ्टवेयर से प्राप्त फिटिंग मॉडल के साथ जुड़े मान्यताओं पर निर्भर करेगा मापदंडों के निरपेक्ष मूल्यों व्यवहार किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, जहां झल्लाहट दाता एक महत्वपूर्ण दूसरे क्षय घटक है, उसके लिए एक biexponential मॉडल के उपयोग के लिए flim झल्लाहट डेटा फिट करने के लिए तेजी से क्षय घटक के योगदान, आम तौर पर FRETing आबादी की तुलना में यह चाहिए उच्च प्रदर्शित होने के साथ जुड़े हो सकती है। यह इस तरह के mTq2FP के रूप में एक मोनो घातीय जीवन भर के साथ दाताओं का उपयोग करने के लिए इसलिए वांछनीय है। फिर भी, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि झल्लाहट विश्लेषण अभी भी स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति प्रोटीन का या से अंधेरा राज्यों से प्रभावित किया जा सकता हैक्रोमोफोर कोण की एक किस्म के साथ fluorophore रचना का वितरण करने के लिए और कारण 2 κ उन्मुखीकरण कारक की विविधता 56 दूरी। फिर भी, हम और दूसरों को पता चला है कि झल्लाहट के प्रतिदीप्ति जीवनकाल readouts उपयोगी परिणाम है कि जैव रासायनिक माप के साथ सहसंबंधी और प्रोटीन बातचीत के लिए स्क्रीन या biosensors की गतिशीलता का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का उत्पादन करते हैं। इस प्रकार इस openFLIM एचसीए मंच प्रतिदीप्ति जीवनकाल आधारित assays झल्लाहट या सेलुलर autofluorescence 8 का उपयोग, साथ ही डाई आधारित जांच 25 की मात्रात्मक readouts उपलब्ध कराने की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
microscope frame Olympus IX81 http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
optical autofocus Olympus ZDC http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
motorized (x-y-z) microscope stage Marzhauser 00-24-565-0000 Stage with Corvus controlle
excitation laser source Fianium SC400-4 Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/
gated optical intensifier  Kentech High Rate Imager (HRI)
delay generators Kentech --- See agile delay generator and precision delay generator
camera Hamamatsu ORCA-ER-II
Nipkow disc scanner unit  Yokogawa CSU-X1  http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/
Top hat diffuser Thorlabs ED1-S20-MD Engineered diffusers
mTq5V  Oxford Genetics P3850 mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker
mTq17V Oxford Genetics P3847 mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker
mTq32V Oxford Genetics P3848 mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker
mTq5A Oxford Genetics P3849 mTurquoise Amber construct
HEK293T --- --- cell type used
phenol red-free HBSS Sigma Aldrich 55021C-1000ML imaging media
culture media DMEM + 10% FBS + 0.5% Antibiotics
DMEM Sigma Aldrich D6046-500ML for culture media
FBS Sigma Aldrich 12003C-500ML for culture media
xTremeGene9 Sigma Aldrich 6.37E+09 for transfection, follow online protocol from La Roche
trypsin/EDTA Solution Thermo Fischer R001100 for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer

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References

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