Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Open Source Hög innehållsanalys Använda automatiserade fluorescens Lifetime Imaging Microscopy

Published: January 18, 2017 doi: 10.3791/55119
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 4, 4, 3, 5, 6, 1, 4, 1,7, 1
1Photonics Group, Department of Physics, Imperial College London, 2Institute for Chemical Biology, Department of Chemistry, Imperial College London, 3MRC Clinical Sciences Centre, Hammersmith Hospital, 4Chemical Biology Section, Department of Chemistry, Imperial College London, 5Retroscreen Virology Ltd, 6Pfizer Global Research and Development, Pfizer Limited, Sandwich, Kent, UK, 7Centre for Histopathology, Imperial College London
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterar en öppen källkod hög innehållsanalys (HCA) instrument som använder automatiserad fluorescens livstid avbildning (FLIM) för att analysera proteininteraktioner med hjälp av Förster resonans energiöverföring (FRET) -baserade avläsningar. Datainsamlingen för denna openFLIM-HCA instrument styrs av mjukvara skriven i μManager och dataanalys genomförs i FLIMfit.

Introduction

Den ökande användningen av automatiserad hög innehållsanalys (HCA) i läkemedelsutveckling 1 till analyssubstansbibliotek kompletteras med utvecklingen inom biovetenskaplig grundforskning mot automatiserade avbildningsexperiment för systematiska studier, till exempel, för fenotypiska skärmar siRNA bibliotek. Automatiserad HCA blir också allt viktigare för småskaliga biologiska studier som vanligtvis har genomförts med manuella experiment med tiotals rätter av celler avbildade med konventionella mikroskop. Den statistiska befogenhet av förmågan att analysera och analysera hundratals till tusentals synfält möjliggör utjämning av experimentell buller (inklusive "biologiskt brus") och automatisering av bild datainsamling och analys av stora prov arrayer kan hjälpa till att eliminera operatörens partiskhet och ofta kan användas för att detektera förekomsten av systematiska fel, till exempel en förändring i IRF profilen under ett förvärv. Fluorescensbaserade analyserär allmänt genomföras i HCA, med de flesta kommersiellt tillgängliga HCA instrumentering terar fluorescensintensitet avbildning i ett eller flera spektrala kanaler för att kartlägga den relativa fördelningen och co-lokalisering av märkta proteiner. Mer sofistikerade fluorescens avbildningsmetoder, såsom fluorescens livstid avbildning (FLIM), polarisation anisotropi imaging och tidsupplöst fluorescens anisotropi avbildning, är inte allmänt utnyttjas i kommersiella HCA instrument, även om de erbjuder kraftfulla kvantitativa avläsningar, t.ex. av proteininteraktioner. Här presenterar vi en öppen källkod strategi för genomförandet FLIM i ett automatiserat mikroskop för HCA.

Fluorescens livstid ger en inneboende ratiometrisk spektroskopiska avläsning som kan användas för att särskilja olika molekylslag eller att undersöka den lokala molekylära miljön i en fluorofor och är okänslig för fluoroforen koncentration, till effektivitetsvinster excitation / upptäckt, och effekterna av scattering och prov absorption två. Vidare, eftersom fluorescenslivstid mätningar kan göras i en enda spektral kanal, de är direkt jämförbara mellan olika instrument och prover utan kalibrering. De kan appliceras på endogena fluoroforer, inklusive några cellulära metaboliter, lipider och extracellulära matrixkomponenter, för att ge inneboende avläsning av biologiska processer och sjukdomar. Etikett-fri FLIM kan alltså kartlägga metabola förändringar i celler 3,4 och har använts för att övervaka stamcellsdifferentiering 5,6 och tillväxten av kollagen ställningar 7. Vi visade nyligen att FLIM HCA kan användas för automatiserad etikettfria analyser av cellulär metabolism utnyttjar autofluorescens 8. Oftare är dock fluorescens livstid mätningar och FLIM tillämpas på exogena fluoroforer som märka specifika biomolekyler, ofta implementeras med hjälp av färgämnen som färgas cellulära avdelningar, med hjälp av färgämnena kopplade till antibodies som riktar specifika proteiner i fasta celler, eller använda genetisk information fluoroforer kopplade till specifika proteiner. Fluorescens livstid kan användas för att ge robusta kvantitativa avläsning av fluorescerande prober avkänning deras fysiska eller kemiska miljö. För exempel, har färgämnen använts för att känna den lokala lipidfasen av cellmembran 9 eller cell viskositet 10 och genetiskt uttryckta fluorescerande proteinbaserade biosensorer har utvecklats för att rapportera koncentrationer av cell signalmolekyler bland annat som IP3 11, PIP2 12 och calpain 13 eller joner såsom kalcium 14,15, kalium 16 och klorid 17.

Många sådana biosensorer utnyttjar Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 18,19 för att tillhandahålla avläsningar av förändringar i biosensorkonformation. FRET mellan "givare" och "acceptor" fluoroforer sker via en kort räckvidd direkt dipol-dipol växelverkanför vilka fluoroforer är typiskt separerade med mindre än ~ 10 nm. Således detektion av FRET indikerar närheten av lämpligt märkta proteiner och därmed ger en möjlighet att läsa ut protein-proteininteraktioner 20, såsom bindning eller oligomerisering - antingen som ändpunkter i fixerade celler eller som dynamiska händelser i tidsförlopp mätningar av levande celler. Genom att märka en lämplig molekylär konstrukt med både givare och acceptor fluoroforer, är det också möjligt att läsa ut konformationsförändringar - eller klyvning - av konstruktionen genom förändringen i FRET och detta är grunden för många biosensorer 21. Mätningar av FRET effektivitet kan ge information om donatorn-accept avstånd och befolkningen bråkdel av givar fluoroforer genomgår FRET. Sålunda kan FRET-baserade avbildningstekniker kan användas för att kartlägga och kvantifiera molekylära interaktioner i tid och rum, till exempel, för att belysa cellsignalering processer 22. automating sådana avbildningstekniker kan ge hög genomströmning analyser baserade på avläsningar av signalvägar eller nätverk.

I HCA är FRET avläsning oftast genomförts spektral ratiometrisk avbildning, där förändringar i förhållandet mellan acceptorn till givar intensitet mappas. Även om detta tillvägagångssätt är lätt genomförs - och finns i många kommersiellt tillgängliga flerkällsplatta läsare - kvantitativa spektralt upplösta mätningar FRET kräver kalibrering av den spektrala responsen hos systemet 23. Detta inkluderar spektral överhörning som härrör från spektral genomblödning och direkt excitation av acceptorn samt överföringsegenskaperna hos instrumentet och provet (inre filtereffekt). I princip innebär denna mätning av ytterligare "kontroll" prover som är märkta med antingen donator endast eller acceptor skyddad.

Från sådana spektrala ratiometriska mätningar FRET, en effektiv FRETeffektivitet (produkten av den verkliga FRET effektivitet och fraktionen av FRETing donator / acceptormolekyler) kan erhållas tillsammans med den relativa proportionen av donator- och acceptormolekyler 24. Spectral ratiometrisk FRET används ofta med unimolekylär FRET biosensorer, där kan antas givaren / acceptor stökiometri att bli känd. För att bestämma populations fraktionerna av FRETing donator och acceptor, t.ex., för att erhålla en dos-responskurva, krävs kunskap om de faktiska FRET effektivitet. Detta kan erhållas genom att mäta en positiv FRET kontrollprov med kända egenskaper eller genom att använda en annan metod för att mäta FRET effektivitet, såsom acceptor fotoblekning eller FLIM.

Använda fluorescens livstid avläsning kan FRET detekteras och kvantifieras genom mätning av utsläpp givaren ensam - eliminerar behovet av spektral kalibrering och ytterligare kontrollprover. Således kan FLIM FRET avläsningar jämföras mellan instrumentoch mellan olika prover - tillåter data från endoskopi eller tomografi av levande sjukdomsmodeller 25 för att jämföras med mätningar av cellbaserade analyser. Genom att montera givare fluorescenssönderfallsprofiler till en lämplig multi exponentiellt avtagande modell som motsvarar FRETing och icke-FRETing givarpopulationer, FRET effektivitetsvinster och befolkningsfraktioner kan i princip erhållas direkt utan ytterligare mätningar. Dessa betydande fördelar, men kommer på bekostnad av FLIM kräver mer detekterade fotoner per pixel än spektralt löst intensitet imaging - typiskt hundratals fotoner krävs för att uppnå en noggrannhet på livstid bestämningen av 10% vid montering till en enda exponentiellt avtagande modell och när montering fluorescens sönderfallsprofiler till komplexa (multiexponentiell avtagande) modeller, antalet upptäckta fotoner som krävs ökar till tusentals. Detta har konventionellt lett till långa hämtningstider (tiotals till hundratals sekunder per fält av VIew) för FLIM, särskilt när man använder tid korrelerade enda fotonräkning (TCSPC) genomförs med sekventiell pixel förvärv i laserskanningsmikroskop. Försök att öka bildhastigheten med högre exciteringsnivåer kan leda till betydande fotoblekning och / eller fototoxicitet. Tillsammans med en brist på lämpliga kommersiellt tillgängliga instrument och programvaruverktyg, har detta hindrat FLIM från att utnyttjas i HCA för läkemedelsutveckling eller systembiologi, där hundratals till tusentals synfält ska avbildas. Laserskanning TCSPC FLIM har genomförts i en automatiserad flerkällsplatta mikroskop 26 för sekundära mätningar efter identifiering av "träffar" av steady-state polarisering upplöst fluorescens anisotropi avbildning 27, som kan nå till spektral proportionerlig avbildning 28 med vilken den delar liknande avbildningshastigheter många fördelar och nackdelar. Fluorescensanisotropi avbildning utnyttjar minskningeni fluorescensanisotropi av acceptorn i närvaro av FRET och är också känslig för spektrala överhörning (t.ex. direkt excitation av acceptorn). Det kräver kalibrering för att ta hänsyn till polarisering överhörning och inte ger en direkt mätning av FRET effektivitet.

Att inse fördelarna med FLIM för HCA, har vi arbetat med att ta upp frågan om hastigheten på bildtagning och bredare tillgång till tekniken. Här ger vi en komplett lista över öppna källkod och hårdvarukomponenter som kan användas för att genomföra den automatiska snabba FLIM flerkällsplatta läsare som beskrivs nedan, tillsammans med exemplar FRET baserade-analyser. I vår strategi 29, är FLIM förverkligas genom vidvinkeltids gated avbildning med en gated optisk bildförstärkare (GOI), som visas i figur 1 som kan ge snabbare bildbehandling priser och lägre fotoblekning än enkelstrålescannings TCSPC på grund av parallella pixel interrogation. Vår openFLIM-HCA instrument kan ge utan tillsyn FLIM kräver bara några sekunder att få flim detektering av data några 100 fotoner per pixel (beroende på ljusstyrkan på provet). I kombination med den tid som krävs för att flytta provet från föregående synfältet, att justera förvärvet inställningarna och för att hålla provet i fokus, detta resulterar normalt i flerbrunnsplattan förvärvstider ~ 10 s per synfält 25,28. Optisk sektionering kan implementeras med hjälp av en kvasi-brett fält Nipkow ( "roterande skiva") scanner 30.

För FLIM dataanalys, har vi utvecklat en öppen källkod verktyg som kallas FLIMfit 31 som har förmåga att snabbt analysera flerbrunnsplatta flim dataset på konventionella PC-arbetsplatser och är en plug-in för Omero 32. FLIMfit ger globala analysfunktioner (som diskuteras i avsnitt 1.2) som gör det möjligt för flim data som ska monteras på komplexa modeller med only några 100 fotoner per pixel under antagandet att de fluorescenslivstid komponenter är invariant tvärs en bild eller regionen av intresse (ROI), vilket minskar antalet detekterade fotoner erfordras, ljusexponeringen till provet och bildinhämtningstiden. Köra FLIMfit på en vanlig stationär dator, kräver endast 10s sekunder av beräknings tid att analysera datamängder som omfattar hundratals FOVs. Således både FLIM datainsamling och analys kan utföras på tidsskalor som är praktisk för HCA.

openFLIM-HCA hårdvara

Implementeringen av FLIM HCA omfattar sex nyckelkomponenter: (i) en fluorescensmikroskopstativet med optisk autofokus; (Ii) en motoriserad (xyz) mikroskopställningen; (Iii) en exciteringslaserkälla; (Iv) ett brett fält tids gated FLIM systemet med gated optisk förstärkare (GOI), fördröjningsgeneratorn och kamera; (V) en dator för datainsamling och analys och (vi) en nipkowskiva scannerenhet för optiskt sektionerad avbildning för att undertrycka ofokuserad ljus. Detta kan vara viktigt när avbildning svaga signaler, t.ex. från FRET biosensorer på cellplasmamembranet, som kan översvämmas av bidrag från cytoplasmisk fluorescens eller bakgrund från täck eller odlingsmedium. Tids gated FLIM uppgifter förvärvas genom att belysa provet med ultra pulsade exciteringsstrålning, avbildning av fluorescensemission till fotokatoden av de indiska myndigheterna och skaffa en serie CCD bilder av fosfor av de indiska myndigheterna för en rad inställningar för tidsfördröjning den optiska förstärka grinden efter ankomsten av excitationspulsema. Eftersom den tid grinden dröjsmål efter excitation ökas, fluorescenssignalen ses att minska och den serie tidsspärrad fluorescensintensitetsbilder som förvärvats på CCD bilda datamängden som krävs för att analysera de sönderfallsprofilerna för alla fluoroforer i synfältet . Gating av de indiska myndigheterna är synkroniserad till excitationspulsemaoch, för den serie av CCD förvärv, är fördröjningen av tiden grinden relativt excitationspulsema inställd på en serie ökande värden över det önskade området. Denna synkronisering sker med hjälp av fördröjningsgenerator som innefattar en "snabb fördröjnings box" (som ger förseningar upp till 20 ns i 1 ps steg) och en "grov fördröjning låda" som ger förseningar med ett minimum steg 25 ps.

För FLIM kan excitation åstadkommas genom någon ultra laser. För enkelhetens skull använder vi typiskt en fiberlaser-pumpad supercontinuum källa som ger pikosekund pulser avstämbara över det synliga spektrumet, från vilken den lämpliga exciteringsstrålningen kan väljas för någon fluorofor med användning av en motordriven filterhjul med olika bandpassfilter. Vanligtvis använder vi en medeleffekt på ~ 100-200 iW vid provet med pulser på 40 eller 60 MHz repetitionshastighet. Sådana excitation befogenheter kan också åstadkommas genom ultralaserkällor baserade på frekvens fördubbling avmode-låst titan dopad safir laser. Observera att en exciteringspulslängd under ~ 100 ps är tillräcklig för de flesta experiment. En andra motordriven filterhjul utrustat med neutrala densitetsfilter används för att reglera den exciteringsintensitet. För säkerhet och bekvämlighet, kan exciteringsstrålningen att levereras via en optisk enkelmodfiber. De konfigurationer för brett fält FLIM och optiskt sektionerad FLIM presenteras i figurerna 2 och 3 respektive. För mer information om de exakta komponenter som används, besök openFLIM-HCA wiki 33. En kopia av den aktuella listan delar ges i den kompletterande material.

För brett fält FLIM är excitationsstrålningen som krävs för att lysa upp hela synfältet så enhetligt som möjligt. För detta hänvisar vi exciteringslaserstrålen till en holografisk "top-hat" diffusor som roteras vid 10-50 Hz till tids genomsnittliga laser speckle, med planet för diffixerings som avbildas på baksidan fokalplan målet mikroskoplinsen. Den fluorescens bild från utgången på mikroskopet förmedlas på fotokatoden av de indiska myndigheterna och fosforn i de indiska myndigheterna (aktiva område diagonal 18 mm) avbildas på sensorn av en kyld vetenskaplig CCD (chip storlek 10,2 mm x 8,3 mm) kameran med hjälp av ett par kameralinser som ger en förstoring av 0,7. Systemet styrs av en vanlig PC som är ansluten till instrumenteringen med hjälp av RS232-protokoll. Dessutom är en Arduino mikroprocessor används för att styra en slutare i exciteringsljusvägen som är stängd utom när CCD-kameran förvärvar flim data och för att spela in signalen från en fotodiod som används för att mäta den genomsnittliga effekten från spektralt filtrerade supercontinuum exciteringskälla. För att optiskt sektionerad FLIM, är exciteringslaserstrålningen kopplas in i en enkelmod polarisationsbevarande optisk fiber som ansluter direkt till nipkowskiva skannerenheten, som arhown i figur 3. Utgången fluorescens bild från Nipkow skannerenheten förmedlas på fotokatoden av de indiska myndigheterna och resten av systemet är densamma som för brett fält FLIM.

openFLIM-HCA programvara

Datainsamling programvara är skriven i μManager 34. Det ger full HCA datainsamling funktionalitet, inklusive alternativ för att ändra den ordning i vilken brunnarna i plattan avbildas att förvärva tidsförlopp för varje FOV, för att automatiskt bibehålla fokus under mätningar och för att kontrollera excitations- och emissionsfilterhjul och den dikroiska växlare för automatiserad flerfärgsbildalstring. Det är också möjligt att köra en "förscanning" förvärv av fluorescensintensitet för att automatiskt identifiera och registrera positionerna på lämpliga FOVs för en efterföljande FLIM förvärvet enligt kriterier, t.ex., på grundval av intensitet. Flim HCA data kan sparas som en serieav TIFF-filer, som en serie av OME-TIFF-filer (dvs, en per FOV) eller som en enda OME-TIFF-fil som innehåller alla data från en flerkällsplatta. Mer information och en detaljerad beskrivning av μManager programvara kan hittas på openFLIM-HCA wiki 33.

Dataanalys programvara, FLIMfit 31, en öppen källkod MATLAB-baserad klient för Omero bilddata plattform 32, kan läsa flim data från en Omero server eller från diskett, som visas i figur 4. Den har utformats för att analysera data från TCSPC eller vidvinkeltids gated flim instrument och ger många möjligheter att passa data från openFLIM-HCA inklusive montering monoexponentiellt sönderfallsprofiler, och att fördubbla exponentiell och högre komplexitet sönderfallsprofiler, inklusive modeller såsom polarisationsbevarande upplöst fluorescens sönderfallsprofiler. Det kan också ta hänsyn till fasta och tidsvarierande bakgrundssignaler och kan UVILize en uppmätt spatiotemporala instrumentets svar funktion (IRF) eller kan passa att använda en idealiserad IRF som kan vara tidsförskjuten på en pixel-wise grund av ett belopp som bestäms från den fullständiga experimentella IRF mätning. En global tidsskillnaden (t 0) mellan IRF och ett fluorescerande prov kan bestämmas från en mätning av en fluorescensstandard. Rumsliga variationer i bakgrundssignaler och IRF kan också beaktas. FLIMfit kan passa flim data på en pixel-wise eller enligt "global binning" eller "global passande" för att underlätta montering av flim data med blygsamma (hundratals) foton nummer till komplexa sönderfalls modeller.

Global binning innebär sammanläggning av alla de detekterade fotoner från pixlarna i en användardefinierad ROI vid varje tidpunkt för att ge tillräckliga fotonnummer för att möjliggöra montering på komplexa sönderfalls modeller. ROI kan vara hela synfältet (FOV), kan det vara manuellt defined av användaren, eller också kan bestämmas med användning bildsegmenteringsverktyg. ROI kan också definieras med hjälp av masker som importeras till FLIMfit från andra bildsegmente programvara. För FRET applikationer, är det vanligt att använda den globala binning för att passa till en dubbel exponentiell sönderfall modell för att bestämma fluorescens livstid komponenter motsvarande FRETing och icke-FRETing donator fluoroforer som antas vara spatialt invariant över ROI och sedan återmontera på en pixel-wise basis med dessa livstid komponent vales fastställts i syfte att erhålla FRETing donator befolkningen fraktionen i varje pixel.

Global montering innebär samtidigt montering av livstid komponenter och pixel-wise FRETing donatorpopulationsfraktioner över en hel FOV- eller över en FLIM datamängd som kan innefatta flera FOVs, t.ex. från en flerkällsplatta experiment eller en tidsserie av fluorescens livstid bilder. Global montering kan utnyttja den rumsliga variatipå befolknings fraktioner över bilden som försvinner i den globala binning strategi för att ge starkare begränsningar på komponent livstid uppskattning - och därför mer tillförlitliga resultat - om än på bekostnad av betydligt mer beräkning 35. FLIMfit kan snabbt analysera flerbrunnsplatta flim dataset med global montering på konventionella PC arbetsstationer med, till exempel, en flerkällstids gated FLIM datamängd, förvärvades med fem tids grindar för var och en av 394 FOV vardera omfattar 672 x 512 pixlar, vilket kräver bara 32 sekunder och 2 GB minne för att passa till en dubbel exponentiell sönderfall modell 31. Detta har åstadkommits genom att använda en separerbar olinjär minsta kvadratanpassningsalgoritmen implementeras med hjälp av multitrådade parallella algoritmer för att möjliggöra effektiv skalning på flerkärniga processorer och FLIMfit koden har optimerats för att minimera minnesanvändning. Figur 5 visar en ögonblicksbild av det grafiska användargränssnittet i FLIMfitoch mer information kan hittas på webbsidan ges i referens 36. Ytterligare information om global montering och global binning kan hittas i 31 referens.

Följande protokoll för FLIM HCA använda vår openFLIM-HCA instrumentering och mjukvara kan anpassas för ett brett spektrum av cell imaging experiment med flim avläsning. I allmänhet, flerkällsplatta FRET experiment bör utformas för att inkludera replikatbrunnar av positiva och negativa biologiska kontroller utöver de villkor som studeras. Här beskriver vi den specifika tillämpningen för att utföra optiskt sektionerad FLIM (se figur 3) av COS-celler som uttrycker FRET-konstruktioner bestående av mTurquoise fluorescerande protein och Venus fluorescerande protein förenade genom en kort peptidlänk. Här mTq32V, mTq17V och mTq5V FRET konstruktioner (diskuteras i Representativa resultat avsnitt) ger låg, medelhög och hög FRET effektivitet tillsammans med den icke-FRETing mTq5A konstruera.Dessa konstruktioner och andra material som krävs för att följa detta protokoll listas i materiallistan.

Protocol

1. Framställning av flerkällsplatta Array

  1. Bered en lösning av 75 pM Kumarin 6 i etanol (x ~ 2,43 ns) för referensmätningar för att möjliggöra bestämning av t 0.
  2. Seed 150.000 Cos-celler i fyra brunnar i en 6 brunnar och låt fästa över natten i odlingsmedium (se Materials List).
  3. Transfektera en väl varje med mTq5A, mTq5V, mTq17V och mTq32V användning av ett kommersiellt transfektionsreagens enligt tillverkarens anvisningar och kultur under 24 timmar.
  4. Lösgöra celler med användning av ett kommersiellt trypsin / EDTA-lösning enligt tillverkarens protokoll.
  5. Pipette 5.000 Cos-celler suspenderade i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) som uttrycker mTq5A in i var och en av brunnarna A1-G3 av en # 1,5 tjocklek glasbottnad 96 flerkällsplatta som tidigare har behandlats med poly-L-lysin. Upprepa för mTq5V uttryckande celler i brunnar A4-G6, mTq17V i brunnar A5-G9 och mTq32V i brunnar A10-G12. Lämna väl H1 tom (för att ge mätning av statisk bakgrund från flerkällsplatta).
  6. Pipettera 200 mikroliter av HBSS enbart till brunn H2 (för att åstadkomma mätning av någon bakgrundssignal från cellodlingsmediet).
  7. Pipett 5000 icke-transfekterade celler i HBSS i väl H3 (för att ge mätning av någon bakgrundssignal från cell autofluorescens).
  8. Pipettera 200 mikroliter av 75 iM Kumarin färglösning i väl H4 (för att ge en check på någon variant av t 0 under flerkällsplatta förvärv, till exempel på grund av förändringar i omgivningstemperaturen eller fluktuationer i laser eller tidskretsar.

2. openFLIM-HCA Data Acquisition

OBS! Detaljerad information kan hittas på openFLIM-HCA wiki 33.

  1. Start μManager och OpenFLIM-HCA Plugin
  2. Välj kalibreringsfilen för den specifika kombinationen av fördröjningsgeneratorenhet ochlaser repetitionshastighet under "FLIM kontroll: Fördröjning box kalibreringsfilen: kalibreringsfiler".
  3. Ställ den mapp där data sparas under "File: Set Base mapp".
  4. Kontrollera excitation strålens väg för att säkerställa att kopplingen i leveransen optiska fibern är stabil och att kopplingseffektiviteten maximeras genom att mäta kraften överförs genom leverans fiber med hjälp av en kraftmätare. Fluktuationer lägre än 5% är acceptabla.
  5. Kontrollera att de indiska myndigheterna utlösande är stabil genom att visa signal skärmutgången på de indiska myndigheterna på ett oscilloskop utlöses av de indiska myndigheterna ingångstriggsignalen.
  6. Kontrollera avbildning av de indiska myndigheterna fosfor på CCD-sensorn genom att täcka fotokatoden av de indiska myndigheterna, sätta sin vinst till 750 V och fokusera en relälinser så att bilder av glesa enda foton händelser (på grund av bakgrundsljus läcker även de indiska myndigheterna locket ) som spelats in på CCD är så skarp som möjligt.
  7. Kontrollera att provetsynfält är jämnt belyst genom att avbilda en enhetlig fluorescerande prov, såsom en droppe av referensfärglösningen på en täck, med hjälp av en tillräckligt låg excitation effekt (<1 ^ W) för att säkerställa att de indiska myndigheterna inte är mättad.
  8. Välj lämplig plattan definitionsfilen, det vill säga, välj alternativ för 96-brunnsplattor ( "Fil: lastskylt egenskaper").
  9. Med hjälp av μManager GUI, se till att det inte finns någon dikroisk stråldelare kub i mikroskopstativet genom att välja en tom position.
  10. manuellt välja en grind bredd 4 ns vid de indiska myndigheterna för hela experimentet.
  11. Förvärva IRF bilddata:
    1. Med hjälp av μManager GUI, se till att det inte finns någon mikroskopobjektiv i strålgången genom att välja en tom position. Manuellt placera en svart anodiserat balk blocket ovanför målet torn för att förhindra laserljus fly och vinkel att minimera reflektion tillbaka in mikroskopstativet.
      2. <li> Använda μManager GUI, ställa filtren i CSUX (Excitation, Dichroic, Emission), så att den del av exciteringsljus som sprids från den snurrande nipkowskiva kan avbildas men säkerställa intensiteten inte är tillräcklig för att mätta systemet för en 200 ms CCD integrationstid. Detta för att undvika att utsätta de indiska myndigheterna fotokatoden för mycket ljus, vilket kan skada fotokatoden.
    2. Använd Sök maxpoint funktionen över hela skalan av förseningarna som omfattas av den programmerbara snabbfördröjnings rutan. Kontrollera utgångs diagram visas och sedan justera den manuella kursfördröjnings rutan genom att trycka på framåt knappen så att hela IRF profil är inom scanningsområdet för snabb fördröjnings rutan.
    3. Justera förvärvsparametrar (neutral densitet, exponeringstid, bild ackumulering) så CCD inte är mättad i den ljusaste tid gate och effektiva integrationstiden är> 200 ms.
    4. Ställ fördröjningssteg av 25 ps över hela förseningen ringdee ( "FLIM kontroll: Snabb fördröjning låda: Fylla förseningar").
    5. Förvärvar IRF bild genom att trycka på "Snap FLIM bild".
    6. Skaffa en bakgrundsbild genom att blockera laser ( "Ljus väg kontroll: Neutral densitet: blockerad"), minska antalet förseningar ( "FLIM kontroll: Snabb fördröjning låda: Aktuell fördröjningsinställningen (ps)"), lämnar alla andra egenskaper oförändrade och tryck på "Snap FLIM bild".
  12. Förvärva referens färgämne data:
    1. Välj väl H4 med hjälp av μManager GUI ( "XYZ kontroll: Gå till väl: H4").
    2. Använda μManager GUI väljer filter (excitation 434/17 nm, Dichroic, Emission 482/25 nm) för avbildning mTqFP.
    3. Använd Sök maxpoint funktionen över hela skalan av den snabba fördröjnings rutan och sedan justera den grova fördröjnings rutan så full förfall profil är inom fördröjningsintervallet av den snabba fördröjnings rutan.
    4. Ställa in en fördröjningtill punkten för maximal intensitet genom att ändra "FLIM kontroll: Snabb fördröjning låda: Aktuell fördröjningsinställningen (ps)". Justera förvärvsparametrar (neutral densitet, exponeringstid) så att CCD inte är mättad.
    5. Ställ fördröjningssteg av 25 ps över hela fördröjningsintervallet ( "FLIM kontroll: Snabb fördröjning låda: Fylla förseningar).
    6. Förvärva referens färgämnes data genom att trycka på "Snap FLIM bild".
    7. Skaffa en andra bakgrunds CCD kamerabilden genom att blockera excitation laser (se 2.11.7)
  13. Förvärva flim data för flerkällsplatta provet med hjälp av μManager förvärv programvara:
    1. Ange vilka brunnar bör avbildas och antalet FOV som skall förvärvas per brunn ( "Setup HCA sekvenserat förvärv: XYZ positioner").
    2. manuellt välja ett exemplar FOV innehållande det prov som skall avbildas. Använd denna FOV att bestämma den optimala filter med neutral densitet, gate bredd på de indiska myndigheterna ochintegrationstiden för kameran så att den når 75% av det dynamiska området för CCD-kameran.
    3. Ställ autofokus ( "XYZ kontroll: Autofokus"): Tryck på "Return fokus endast kontroll", och sedan manuellt fokusera på cellerna eller struktur av intresse. Ställ in "Autofocus sökområdet" till 2000 um och tryck på "Enter". Tryck på "AF nu" för att inleda ett förfarande autofokus. Ett offsetvärde kommer att dyka upp i fältet "FocusOffset (autofokus)".
    4. Ange förskjutningsvärdet som erhållits i 2.13.3 i "AF offset" och upprepa autofokusförfarandet två gånger ( "AF nu") för att kontrollera att förskjutningsvärdet är nu noll, vilket indikerar korrekt funktion av autofokussystemet.
    5. Använd "AutoGate" -funktionen i OpenFLIM-HCA förvärv programvara för att välja en logaritmisk provtagning av fördröjningspunkter. Alternativt kan dessa väljas manuellt, se hänvisarENCE 36 för mer information.
    6. Ställ in "Accumulate Frames" till ett värde som ger önskad total datainsamlingstiden. En ökning av antalet ackumulerade ramar ökar signal-brusförhållande av flim uppgifter på bekostnad av också öka den totala FLIM datainsamlingstiden.
    7. Kör FLIM förvärv av flerkällsplatta genom att trycka på "Start HCA sekvens" -knappen.
  14. Förvärva ytterligare bakgrund CCD-kamera bild genom att blockera excitation laser (se 2.11.7) med identiska förvärvs inställningar som används för förvärvet flim uppgifter.

3. openFLIM-HCA dataanalys FLIMfit

  1. Kontrollera att nödvändiga tilläggs filer för FLIM dataanalys är närvarande (dvs. IRF och referensfärgmätning).
  2. Läsa in data från den tomma brunnen (H1), brunnen innehållande odlingsmedium (H2) och de brunn innehållande omärkta celler i odlingsmedium (H3) i FLIMfit( "Fil: Load FLIM data") för att kontrollera om det finns några bakgrunds bidrag större än 1% av signalen från celler som uttrycker "donator-only", det vill säga, i brunnar A1-G3.
  3. Förbered en tidsvarierande bakgrund (TVB) fil genom att ladda väl med odlingsmedium i FLIMfit ( "Fil: Load FLIM data"). Ladda kamera bakgrundsdata som förvärvats i avsnitt 2.14 ( "Bakgrund: Last Bakgrund") och använda FLIMfit alternativet "Verktyg: Skapa TVB Intensitet Karta" för att generera TVB. Se referens 31 för mer information om TVB.
  4. Förbered spatialt varierande IRF Shift Karta genom att ladda IRF data som samlats in i avsnitt 2.11 och subtrahera CCD-kameran bakgrund förvärvats i avsnitt 2.11.7. Använd FLIMfit alternativet "Verktyg: Skapa IRF Shift karta" för att beräkna spatialt varierande IRF Shift karta. Se referens [31] för mer information om IRF Shift Map.
  5. Montera en monoexponential förfall till referensfärg data som samlats in i avsnitt 2.12. Lastreferens färgämnet och rumsligt varierande IRF Map beräknas i avsnitt 3.4, som passar parametrar ( "Lifetime: Nej Exp: 1") med t 0 uppsättning som en monterad parameter ( "Lifetime: FIT IRF Shift: Inbyggt"). Värdet på t 0 erhållna sedan redovisas i tabellen på fliken "Parameters".
  6. Analysera flim uppgifter genom att läsa de experimentella flim data som samlats in i avsnitt 2.13, den rumsligt varierande IRF Map beräknas i avsnitt 3.4, kameran bakgrund förvärvats i avsnitt 2.14, TVB fil framställd i avsnitt 3.3 och skriv in det negativa värdet av t 0 erhålls i avsnitt 3.5 ( "IRF: IRF shift: t 0"). Montera sedan de experimentella data till önskad förfall modell med FLIMfit 36 i enlighet med kraven i experimentet.

Representative Results

För att illustrera förmågan hos den openFLIM-HCA instrumentering, presenterar vi tre exempel FRET applikationer. Den första gäller FRET konstruktioner som är anpassade från FRET modell konstruktioner som utvecklats av Stephen Vogel laboratorium 38. De innefattar en serie av genetiskt uttryckbara fluorescerande konstruktioner i vilka en donator fluorescerande protein (mTurquoise) är förbunden med en acceptorfluorofor (Venus) genom att kort kontrollerade längder av 5, 17 och 32 aminosyror (mTq5V, mTq17V, mTq32V). De olika länklängder mellan givare och acceptor fluoroforer resulterar i olika FRET effektivitetsvinster och därför olika donator livstid. För att tillhandahålla en negativ kontroll, är Venus på kort 5-aminosyralänk-konstruktionen ersätts med Amber - en icke-fluorescerande mutation av YFP (mTq5A) som inte kan fungera som en FRET-acceptor 38. Vi ersatte Cerulean i de ursprungliga pCXV och pC5A vektorer genom restriktions smälta vectorer med Nhel och Bglll enzymer och ligering mTurquoise fragment diger använder samma enzymer från pmTurquoise-N1 vektor. Länk regionen omodifierade av denna substitution.

Figur 6 presenterar en exemplar FLIM FRET-analys med användning detta modellsystem uttryckt i Cos-celler, i vilka en flerkällsplatta är klädd med 3 kolonner var och en av celler transfekterade med den negativa kontrollen (kolumnerna 1-3), den 5-aminosyralänk FRET konstruera (kolumnerna 4-6), 17-aminosyralänk FRET konstruera (kolumnerna 7-9) och 32 aminosyralänk FRET konstruera (kolumnerna 10-12). Rad H innehåller brunnar för TVB uppskattning. Figur 6 (a) visar exempel på automatiskt förvärvade fluorescenslivstid bilder av typiska synfält i varje brunn. Det är uppenbart att den negativa kontrollen (kolumnerna 1-3) presenterar de längsta livslängderna och att donatorn livstid är minst för FRET konstrukt med den kortaste linker length (kolumnerna 4-6). Figur 6 (b) visar hur den genomsnittliga livslängden genomsnitt för samtliga FOVs i varje brunn varierar över flerkällsplatta. Figurerna 6 (c) och (d) visar exempelgivarfluorescensintensitetssammanslagna livstid kartor för en FOV av mTq5A och mTq17V respektive. Figur 6 (e) visar givarfluorescensintensiteten förfall profil i genomsnitt över alla celler avbildas i väl A1, tillsammans med passformen till en monoexponentiellt förfall modellen och IRF (som domineras av de indiska myndigheterna gate bredd). Figur 6 (f) visar den genomsnittliga fluorescenslivstid för varje kolumn i flerkällsplatta som erhållits från en pixel-wise monoexponentiell passform. En tabell av medel livstid och standardavvikelse (STD) kan hittas i Tabell 1 nedan. Datainsamling för bilderna som visas i figur 6 tog ungefär 160 minuter att förvärva. Analysen tog 92 s på en 2,6 GHz dator med 10 kärnor och 64 GB RAM.

Den andra exemplar analys demonstrerar tillämpningen av FLIM FRET för att läsa ut den oligomerisering av HIV-1 Gag under monteringen av HIV-1-virioner som ett medel för att testa inhibitorer av denna process 25,42. Som uttrycker HIV-1 Gag i lämpliga värdceller ger ett modellsystem för detta skede av HIV-1 livscykel eftersom det leder till bildningen av virusliknande partiklar (VLP) som liknar omogna HIV-1-virioner. För denna analys, uttryckte vi HIV-1 gag-proteinet smält med GFP i HeLa-celler och jämfördes effekten av olika inhibitorer via deras inverkan på FRET signal som resulterade från Gag oligomerisering. Uppgifter om hämmarna används återfinns i referens 42.

Detaljerna i provberedning och experimentella mätningar beskrivs utförligt med hänvisning 25, där vi visade att vi kunde använda FLIM att läsa ut both heteroFRET mellan aggregering Gag proteiner märkta stokastiskt med GFP och YFP, och även homoFRET i celler som uttrycker endast Gag märkt med GFP. Även homoFRET vanligtvis inte utgör någon förändring i givar livstid, gör det för det särskilda fallet med GFP där fluoroforen förekommer i två isomerer med olika medelfluorescenslivs 40,41. GFP homo-FRET avläsning har fördelarna av förenklad provberedning jämfört med GFP / YFP hetero FRET och är mer spektral effektiv, vilket kan vara viktigt för multiplexerade FRET avläsningar.

Vårt tidigare arbete appliceras FLIM FRET för analys av Gag oligomerisering i närvaro av en N-myristoyltransferas (NMT) inhibitor 42. Denna inhibitor stör de endogena enzymer ansvariga för tillsats av myristinsyra till Gag, vilket gör det möjligt för gag-proteiner att binda till plasmamembranet och är en förutsättning 43 i bildningen av HIV-virioner ellerVLP. Vi visade att både heteroFRET och homoFRET avläsning skulle kunna uppnå Z "av> 0,6 i dos-responsstudier med ett NMT-hämmare. Z 'är en parameter som används inom den farmaceutiska industrin för att indikera kvaliteten hos en analys och representerar skillnaderna i medelvärdena för de positiva och negativa kontroller och deras relativa bredbara för att alstra ett enda värde metrisk analyskvalitet - med Z'> 0,5 vägs "utmärkt" för en farmaceutisk analys 44. Vi noterar att denna utmärkta prestanda uppnåddes med prov där förändringen i genomsnittlig givare livstid var i storleksordningen 300 ps - visar den statistiska kraften i att analysera flim data för ett stort antal celler, vilket möjliggör användbara avläsning skall kunna förverkligas med hjälp av mycket mindre förändringar i fluorescenslivstid än vad som är möjligt med de typiska antalet celler avbildas i manuella mikroskopi experiment.

Här presenterar vi en flerkällsplatta FLIM FRET datamängd jämföra 4 inhibitorföreningar för HIV Gag oligomerisering (betecknade ICL13, ICL14, ICL15 & ICL16). För detta experiment utnyttjade vi den homoFRET uppläsningen med HeLa-celler transient transfekterade med Gag-GFP plasmid. Totalt nio olika doser av varje inhibitor tillämpas efter standardprotokollet som beskrivs i referens 32, vilket gör att två upprepade brunnar per tillstånd. Som en positiv kontroll, kolumn 1 presenterar celler som uttrycker myr-Gag, en muterad Gag protein som saknar myristinsyra del som inte kan bilda VLP och så simulerar total inhibering. En negativ kontroll tillhandahölls genom doserings celler som uttrycker Gag-GFP endast med bara fordon som används för att leverera hämmare i de andra kolumnerna (kolumn 11). Sammanlagt åtta FOV förvärvades per brunn.

Data var utrustad med en enkel exponentiell avklingning modell på en pixel-för-pixel basis och den fluorescenslivstid plate karta som visar den genomsnittliga livslängden per brunn (över alla bildpunkter över intensitetströskel över åtta synfält) visas nedan i figur 7 (a). Figur 7 (b) visar den motsvarande plot av fluorescenslivstid som en funktion av inhibitorkoncentrationen. Tre av inhibitorer visar en hämmande effekt (ICL13, ICL15 & ICL16) vid inkubation med celler som uttrycker Gag-GFP. En inhibitor (ICL14) visar ingen effekt vid någon dos testas. Z "beräknas för denna platta var 0,51. De värden som erhölls för de positiva och negativa kontroller är visade på fig 7 (b) såsom de punkter i svart på 100 | iM och 0,1 nM.

Dosresponskurvor för ICL13, ICL15 och ICL16 visas i figur 7 (b) därefter monteras på fyra parameter logistisk olinjär regressionsmodell med Hill-koefficienten fäst vid en 45 med de maximala och minimala livs fäst vidvärden som erhållits från den positiva (kolumn 1) och negativa (kolumn 11) styr respektive. De returnerade IC 50-värden för de tre kurvorna var då: 38 nM, 24 nM och 116 nM för ICL13, ICL15 och ICL16 respektive. För jämförelse med IC 50-värden som erhållits genom intracellulär FLIM FRET mätningar, bestämde vi IC 50 för inhibering av enzymatisk aktivitet av rekombinant human NMT1 i vår tidigare rapporterade biokemiska enzymanalys 42. De tre föreningarna visat sig vara aktiv genom FLIM FRET är också de mest aktiva i denna analys (IC 50-värden av 17 nM, 51 nM och 39 nM för ICL13, ICL15 och ICL16, respektive), med ICL14, som inte visade någon signifikant svar i FLIM FRET-analysen, som är ca. 100-faldigt mindre aktiv mot NMT1 (IC50 av 1700 nM). För de aktiva föreningarna, IC 50 värden som erhölls genom dessa oberoende analys formerna är anmärkningsvärt lika, med mindre variationer sannolikt kan hänföras till differences i upptag eller metabolism av föreningen i celler.

Denna lilla studie belyser förmågan hos FLIM HCA att diskriminera styrkan hos olika föreningar som verkar på samma mål av intresse. Vi tror att det är den första demonstrationen av en skärm med hjälp av automatiserad FLIM i en hög halt sammanhang att generera flera dosresponskurvor och illustrerar potentialen för FLIM som skall tillämpas på skärmen för och / eller karakterisera användbara terapeutiska föreningar.

Den tredje exemplar FLIM FRET experiment avser en genetiskt uttryckt FRET biosensor för Exchange-proteinet aktiveras av cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP (EPAC)), som är en Rap-en guanin utbyte faktor som specifikt binder till cAMP. Denna EPAC FRET biosensor (EPAC-S H188) utnyttjar mTurquoise2 fluorescerande protein (mTq2FP) som donator fluoroforen och införlivar två Venus-FP för att genomföra en composite acceptor 46. cAMP är en allestädes närvarande andra budbärare och är involverad i en uppsjö av intracellulära processer genom många olika organismer. Det syntetiseras av adenylatcyklas från omvandlingen av ATP i cellmembranet. Här visar vi vår förmåga att läsa ut och kvantifiera dess aktivitet i levande HEK293T celler efter tillsats av forskolin, en adenylatcyklas aktivator som uppreglerar intracellulär produktion av cAMP och därför ökar dess cytoplasmiska koncentration. Detta EPAC sensorn genomgår FRET i dess inaktiverade (obunden) staten och dess donator livslängd ökar med cAMP-koncentrationen som cAMP leder till öppnandet av biosensor. Den mono-exponentiellt avtagande profil mTq2FP gör denna biosensor bättre lämpade för kvantitativ livstid analys än GFP-baserade biosensorer 45. Figur 8 visar ett exempel på ett tidsförlopp som spelats in med den automatiska flerkällsplatta FLIM mikroskop där vi har ritas ändringeni medel livstid och förändringen i FRETing donator befolkningen bråkdel över tiden efter tillsats av 100 | iM forskolin. För enkelhetens skull antar vi att den totala signalen kan beskrivas med en blandning av monoexponentiell FRETing och icke-FRETing donatorer och befolkningen fraktionen av den aktiverade EPAC FRET biosensor erhölls genom inpassning av en dubbel exponentiell avklingning profil över tidsserien.

För datainsamling av cAMP (EPAC) fem grindfördröjningar, med en grind bredd av 4000 ps, ​​valdes med fördröjningstiden satt till 1300 ps, ​​4300 ps (toppintensitet), 4919 ps, 6656 ps, 8035 ps, en, 0391 ps och 16.000 ps. Kameran integrationstiden för varje försening var 250 ms. Vid en bra förvärvade vi en FLIM tidsförlopp med bilder som förvärvats var 10 s under 10 minuter. Datapunkterna förvärvade ibland 120 s och 130 s togs bort på grund av tillsats av forskolin orsakade en liten förskjutning i fokalpositionen för provet och därföre av fluorescensintensiteten registrerades under flim förvärv vid dessa tidpunkter.

För dataanalysen bilderna laddades i FLIMfit och segmenteras per cell. Fluorescenslivstids data monterad på en dubbel exponentiell sönderfall modell med en IRF och en fast t 0 värde som erhålls från en referens färgämne (75 iM kumarin 6). Donator fluorescens innebär livstid i genomsnitt över alla celler visas i figur 8 (a). Figur 8 (b) visar förändringen i FRETing befolkningen bråkdel över tiden beräknas genom att montera samma flim data till samma dubbel exponentiellt avtagande modell

ekvation 1

där β är FRETing donator fraktionen. Vi antar en blandning av FRETing och icke-FRETing elemeNTS för tidpunkter före tillsats av forskolin. För att erhålla dessa livstid, var en dubbel exponentiell anpassning tillämpas på de första tre tidpunkter ger livstid τ 1 = 3964 ± 21 ps för icke-FRETing donator, och τ 2 = 3022 ± 27 ps för FRETing donatorn. Dessa fastställdes för den efterföljande anfall av hela datauppsättningen för att erhålla de p-värden vid varje tidpunkt.

Sammanfattningsvis har vi presenterat exempel flim HCA resultat tre experimentella prover. Den första var en 96-brunnsplatta klädd med Cos-celler som uttrycker FRET-konstruktioner innefattande en mTqFP donator länkad till antingen en Venus FP acceptor eller en icke-fluorescerande Amber konstruera genom att variera längderna av peptidlinker. Förändringen i FRET effektivitet och därför givar livstid med linkerlängden framgår tydligt och standardavvikelsen för medelvärdet livstid för varje konstruktion var mindre än 36 ps. Den andra exemplar assay var en "skärm" av fyra potentiella inhibitorer för myristoylering av HIV Gag protein för vilket den% inhibering beräknades från variationen av medelvärdet donator fluorescenslivstid med inhibitorkoncentration mätt i Hela-celler som uttrycker gag-protein märkt med GFP. Denna avläsning är baserad på homoFRET, som inte vanligtvis skulle utgöra en ändring i donator livstid men gör för CFP eftersom det förekommer i flera isomerer med olika fluorescerande livslängd. Detta kan vara användbart när det gäller spektrumeffektivitet, t.ex. för multiplexering olika FRET avläsningar 25. Den tredje exemplar analysen var ett tidsförlopp övervaka levande HEK293T celler som uttrycker cAMP FRET biosensor, EPAC. Detta visade det förväntade svaret efter behandling med forskolin och tillämpning av FLIMfit användning av en dubbel exponentiell avklingning modell med antalet detekterade fotoner vara i proportion till levande cell imaging - som vi tidigare har visat Med vågen FRET biosensor för IP3 47.

Figur 1
Figur 1. Schematisk av brett fält tids gated FLIM med hjälp av en gated optisk bildförstärkare (GOI). Vänster sida, visas en schematisk bild av det experimentella systemet. Längst upp till höger, schema över exciteringspuls, ställning tidsstyrda bilder och monoexponentiellt passning till data. Längst ner till höger, tecknad som visar fluorescens förfall från de två objekten visas i experimentella system. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Schematisk av brett fält openFLIM-HCA med hjälp av en gated optisk bildförstärkare (GOI). Se huvudtexten för mer detaljerad beskrivning avsystemkomponenter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Schematisk av optiskt sektion openFLIM-HCA med hjälp av en gated optisk bildförstärkare (GOI) med en nipkowskiva skannerenheten. Se huvudtexten för mer detaljerad beskrivning av systemkomponenter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Schematisk av bilddataflöde från Manager insamlingsprogram till Omero server eller dator disk och in FLIMfit för analys. Dataflödet börjar i toppen l eft hörn där råbilddata förvärvas i μ-Manager förvärv programvara. Objekten inuti den streckade rutan representerar stadier av analysen flim data, medan de som står utanför motsvarar datainsamling och lagring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. Skärmdump av FLIMfit användargränssnitt. Överst till vänster, lista över synfält för närvarande är laddad och fluorescensintensitetsbild av det valda synfältet. Nederst till vänster, val av passande modell och monteringsförhållanden. Överst till höger, fluorescens förfall för aktuellt område av intresse (blå cirklar), passar till data (röd linje), IRF (röd streckad linje) med lämpliga restprodukter nedan (blå linje).g5large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6. flerkällsplatta FLIM av FRET modell konstruerar mTq5V, mTq17V, mTq32V uttryckt i COS-celler. (A) exempel fluorescens livstid bilder av FOV i varje brunn för olika FRET konstruktioner som uttrycks i COS-celler som diskuteras i texten. (B) Värme karta över genomsnittliga Venus fluorescens livstid i genomsnitt över alla celler i varje brunn. (C) intensitetsbilden av mTurquoise Amber överdragen med livstids karta (skala bar 20 pm). (D) intensitetsbilden av mTurquoise Venus (17 aminosyror) överdragen med livstids karta (skala bar 20 pm). (E) uppmätt intensitet förfall profil (blå cirklar) av mTq5A konstruera (negativ kontroll) fluorescens i genomsnitt över alla celler avbildas i väl A1, tillsammans med passningen av data till en monoexponentiellt förfall (blå heldragen linje) och IRF (streckad orange linje). (F) diagram över genomsnittlig livstid medelvärde över varje kolumn tvärs över flerkällsplatta, med felstaplar som visar standardavvikelsen i fluorescenslivstid mellan synfält. För (ad) livstid värden representeras med en falsk färgskala med de angivna gränsvärdena i pikosekunder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 7
Figur 7. Exemplar flerkällsplatta FLIM skärm av Gag-inhibitorer med användning av HeLa-celler som uttrycker Gag-GFP. (A) Värme karta över medel donator fluorescens livstid per brunn för flerkällsplatta klädd med kolumn en presenterande celler transfekterade med myr-Gag-GFP som en positiv e kontroll för inhibition, kolumn 11 presenterande celler transfekterade med Gag-GFP exponerad för endast vehikel, och de streckade färgade rutor indikerar brunnarna som doserades med en av de fyra olika inhibitorer med koncentrationer varierande från hög dos kolumn 2 till lågdos-kolonn 10 . den falska färgskalan representerar medelvärdet fluorescens livstid som sträcker sig från 2200 ps till 3100 ps. (B) ritar fluorescens livstid för varje inhibitor med felstaplar visar standardavvikelsen mellan upprepade brunnar. Punkter i svart på två och -4 på den horisontella axeln är de positiva och negativa kontrollpunkter respektive erhållits från kolumnerna 1 och 11 respektive. De heldragna linjerna indikerar en passning till dosresponskurvan data för de olika inhibitorer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

gur 8 "src =" / filer / ftp_upload / 55119 / 55119fig8.jpg "/>
Figur 8. Exemplar användning av FLIM att läsa ut EPAC FRET biosensor i en time-lapse mätning med HEK293T celler. Förändring (a) betyder fluorescens livstid och (b) fraktionen av FRETing givare som en funktion av tiden efter tillsats av forskolin indikeras av det gröna fältet. Felstaplarna visar standardfelet per cell. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

per brunn STD FELA per brunn STD FELA
mT5A 4008 32 12 MT17V 3004 26 10
mT5V 2717 35 13 mT32V 3133 30 11

Tabell 1. Genomsnitt livstid och standardavvikelse (STD) av FRET-konstruktioner.

Discussion

Vi har beskrivit en automatiserad flerkällsplatta mikroskop avsedd för HCA använder tidsspärrad FLIM. Detta instrument styrs med hjälp av programvara med öppen källkod skriven i μManager med möjlighet att spara data till en Omero server och analys flim uppgifter genomförs med hjälp av FLIMfit 36, ett open source program skrivet i Matlab och tillgänglig som en Omero klient 32 μManager instrument styrprogram, openFLIM-HCA, finns tillgänglig på nätet 33 med en förteckning över de systemkomponenter 48 för att möjliggöra akademiska forskare att konstruera sina egna FLIM HCA instrument.

För att få robusta flim data är det nödvändigt att optimera förvärvsinställningar Indiens myndigheter och CCD och att ta hänsyn till eventuella variationer i t 0. Såsom beskrivits i 3.8.2 bör förstärkningsinställningen och CCD-kamera integrationstid GOI ställas in för att nå ~ 75% av CCD dynamiskt område. Usjunga högre GOI spänningar och flera CCD frame ansamlingar vid varje tidsgrindfördröjningen ökar signal-brusförhållandet 49 men detta ökar den totala FLIM uppsugningstiden (eftersom färre fluorescensfotoner förvärvas per ram före CCD-kameran mättade fettsyror och så antalet frame ansamlingar bör höjas) och så denna avvägning skall beslutas för varje experiment. Kalibreringen av fördröjningsgeneratorn beror på laserrepetitionshastighet och det är därför nödvändigt att säkerställa att den korrekta kalibreringsfilen för upprepningshastigheten som används laddas in i förvärv programvara. Proceduren för kalibrering av fördröjnings boxen kan hittas på den openFLIM-HCA wiki 33.

Om den cellulära autofluorescens är låg jämfört med fluorescenssignalen, använder vi signalen från en brunn innehållande bara odlingsmedium för att tillhandahålla den tidsvarierande bakgrunden (TVB). För att minimera bakgrundsfluorescens från cellodlingsmediet, undviker vimedia innehållande fenolrött. Om den cellulära autofluorescens är betydande, då TVB kan härledas från mätningar av de omärkta cellerna. Men i detta fall måste man vara försiktig, eftersom detta förutsätter att autofluorescens bakgrunden är densamma för varje pixel i bilden. Detta antagande kommer inte att gälla om autofluorescens varierar avsevärt mellan en cell eller om exciteringsstrålen eller detekteringskänsligheten är inte likformig över synfältet.

Förvärvet av en IRF bild med spridda excitation ljuspulser ger tids IRF profil som faltas med datamodellen i anpassningsprocessen och ger också en karta över den rumsliga variationen av IRF över synfältet. IRF kan mätas genom att avbilda en spridningsprov, såsom en kolloidal suspension även om, i vårt instrument, med användning av excitationsljus som sprids från den nipkowskiva ger en renare mätning av IRF. Noggrann bestämning av tidpunkten of IRF är viktigt eftersom fel i tidsfördröjningen mellan excitation och tidsgrind väsentligt kan påverka anpassningsprocessen, särskilt vid monteringen till komplexa exponentiella sönderfalls modeller. IRF förvärvats med hjälp spritt excitationsljus inte exakt vad som behövs för montering process eftersom det registreras vid excitationsvåglängden snarare än vid våglängden fluorescensemissions, som kan påverka dess timing, även om variationen i rummet av IRF bör vara densamma vid båda våglängderna. Dessutom kan den spridda IRF vara globalt skiftas i tid i förhållande till den verkliga IRF på grund av en skilda optisk våglängd från spridningsobjektet, vilket är fallet för en IRF förvärvats från nipkowskiva i optiskt genomskärning FLIM. Denna korrigering, t 0, vilket är den erforderliga globala tidsmässig förskjutning som ska appliceras på den förvärvade spritt excitationsljus IRF, beräknas från de monoexponentiell referensfärgämnesuppgifter såsom anges i Protocol steg 4,4. Följande färgämnen kan användas för olika exciteringsvåglängder: en 75 pM Kumarin 153-lösning i metanol (τ ~ 4,3 ns 50) kan användas för excitering inom intervallet 295-442 nm; en 75 pM Kumarin 6 lösning i etanol (x ~ 2,43 ns 37) kan användas för excitering inom intervallet 430-500 nm; och en 75 | iM rodamin B-lösning i vatten (τ ~ 1,7 ns 37) kan användas för excitering inom intervallet 488-575 nm. Vi noterar att, även om det är möjligt i FLIMfit att använda en annan IRF för varje bildpunkt i systemet, är det oftast rimligt att göra antagandet att spatiellt varierande IRF har samma temporal profil för varje pixel i bilden men utgör ett intervall spatiellt varierande tidsförskjutningar i förhållande till den globala t 0. Vi beskriver detta som IRF skiftkartan, som bestäms från spritt ljus IRF. Tillsammans är IRF profil, t 0 och IRF skift kartan som används för att enSe till att varje pixel i synfältet är utrustad med en lämplig IRF. Viktigt kan t 0 variera långsamt över tiden så det bör mätas innan FLIM datainsamling.

Användaren bör besluta hur man prov fluorescens sönderfallsprofiler och är skyldig att ställa in bredden på tidsportar och deras relativa fördröjningar efter excitation. I allmänhet, är det önskvärt att använda breda grindbredder för att maximera den detekterade signalen och typiskt vi använder grindbredder inställda på 4 ns för FLIM av celler märkta med fluorescensproteiner. Antalet tidsgrindfördröjningar bör vara tillräcklig för att ta prov på fluorescerande sönderfallsprofilen (inklusive en gate inställd för att mäta signalen precis innan excitationspulsen) tanke på komplexiteten i passande modell som kommer att användas i analysen. Det optimala värdet kan bero på de livstider och relativa amplituderna hos de sönderfallskomponenter. I allmänhet, 4 portar är tillräckliga för montering monoexponentiellt sönderfaller medan 7 eller fler portar kananvändas för mer komplexa sönderfalls modeller.

Vi noterar att FLIM kan implementeras med hjälp av en rad tids eller frekvensdomänen teknik och automatiserad FLIM HCA av flerbrunnsplattgrupper infördes först i en (icke-sektionering) brett fält mikroskop med hjälp frekvensdomänen livstid avläsning av FRET 51. Den första automatiserade optiska sektione FLIM flerkällsplatta läsare för HCA utnyttjar brett fält tids gated imaging 28 därefter rapporterats. Därefter tillsattes brett fält (icke-sektionering) frekvensdomän FLIM HCA tillämpas för att screena för posttranslationella modifieringar (tyrosinfosforylering) över ett genbibliotek med användning av FRET 52 och tidsspärrad FLIM HCA har tillämpats på FRET-analyser av HIV-1 Gag oligomerisering 53 och av SUMOylation av FOXM1 54 och av Raichu RhoA och RAC1 biosensorer 33. Det är också möjligt att använda TCSPC för flerkällsplatta FLIM 26 men hittills har det visat sig svårt att matcha than genomströmning av tekniker som utnyttjar brett fält upptäckt. En framväxande strategi som kan ta itu med denna fråga är användningen av uppsättningar av enstaka fotonräknande detektorer som SPAD arrayer 55.

Vi noterar att eventuella avläsning av FRET med fluorescerande proteiner bör behandlas med försiktighet och att de absoluta värdena av parametrar som erhållits från FLIMfit eller någon annan FLIM analysprogram kommer att bero på de antaganden som är förknippade med passande modell. Till exempel, där FRET donator har en betydande andra sönderfallskomponent, kan användningen av en biexponentiell modell för att passa de FRET flim uppgifter resultera i bidraget från den snabbare sönderfallskomponenten, typiskt associerad med FRETing befolkningen uppträder högre än det borde. Det är därför önskvärt att använda givare med en mono-exponentiell livstid såsom mTq2FP. Även då har nya studier visat att FRET-analys fortfarande kan påverkas av mörka tillstånden hos acceptor fluorescensproteiner eller genomheterogenitet orienteringsfaktorn κ 2 på grund av en fördelning av fluoroforen konforma med en mängd olika kromofora vinklar och avstånd 56. Trots detta har vi och andra visat att fluorescenslivstid avläsning av FRET do producera användbara resultat som korrelerar med biokemiska mätningar och som kan användas för att screena för proteininteraktioner eller för att följa dynamiken i biosensorer. Sålunda denna openFLIM HCA plattform kan tillämpas på ett brett spektrum av fluorescenslivstid baserade analyser som utnyttjar FRET eller cellulär autofluorescens 8, samt att tillhandahålla kvantitativa avläsningar av färgbaserade prober 25.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
microscope frame Olympus IX81 http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
optical autofocus Olympus ZDC http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
motorized (x-y-z) microscope stage Marzhauser 00-24-565-0000 Stage with Corvus controlle
excitation laser source Fianium SC400-4 Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/
gated optical intensifier  Kentech High Rate Imager (HRI)
delay generators Kentech --- See agile delay generator and precision delay generator
camera Hamamatsu ORCA-ER-II
Nipkow disc scanner unit  Yokogawa CSU-X1  http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/
Top hat diffuser Thorlabs ED1-S20-MD Engineered diffusers
mTq5V  Oxford Genetics P3850 mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker
mTq17V Oxford Genetics P3847 mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker
mTq32V Oxford Genetics P3848 mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker
mTq5A Oxford Genetics P3849 mTurquoise Amber construct
HEK293T --- --- cell type used
phenol red-free HBSS Sigma Aldrich 55021C-1000ML imaging media
culture media DMEM + 10% FBS + 0.5% Antibiotics
DMEM Sigma Aldrich D6046-500ML for culture media
FBS Sigma Aldrich 12003C-500ML for culture media
xTremeGene9 Sigma Aldrich 6.37E+09 for transfection, follow online protocol from La Roche
trypsin/EDTA Solution Thermo Fischer R001100 for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
  2. Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
  3. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton microscopy of nadh and fad redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia. PNAS. 104 (5), 19494-19499 (2007).
  4. Datta, R., Alfonso-Garcıa, A., Cinco, R., Gratton, E. Fluorescence lifetime imaging of endogenous biomarker of oxidative stress. Sci Rep. 5, 9848 (2015).
  5. König, K., Uchugonova, A., Gorjup, E. Multiphoton fluorescence lifetime imaging of 3d-stem cell spheroids during differentiation. Microsc. Res. Tech. 74 (1), 9-17 (2011).
  6. Wright, B. K., et al. Nadh distribution in live progenitor stem cells by phasor-fluorescence lifetime image microscopy. Biophys. J. 103 (1), 7-9 (2012).
  7. Fite, B. Z., et al. Noninvasive Multimodal Evaluation of Bioengineered Cartilage Constructs Combining Time-Resolved Fluorescence and Ultrasound Imaging. Tissue Eng Part C Methods. 17 (4), (2011).
  8. Kelly, D. J., et al. An automated multiwell plate reading FLIM microscope for live cell autofluorescence lifetime assays. J. Innov. Opt. Health Sci. 7 (5), 1-15 (2014).
  9. Owen, D. M., et al. Fluorescence lifetime imaging provides enhanced contrast when imaging the phase-sensitive dye di-4-ANEPPDHQ in model membranes and live cells. Biophys. J. 90 (11), 80-82 (2006).
  10. Suhling, K., et al. Imaging the environment of green fluorescent protein. Biophys. J. 83 (6), 3589-3595 (2002).
  11. Nezu, A., Tanimura, A., Morita, T., Shitara, A., Tojyo, Y. A novel fluorescent method employing the FRET-based biosensor "LIBRA" for the identification of ligands of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptors. BBA-Gen Subjects. 1760 (8), 1274-1280 (2006).
  12. Nishioka, T., et al. Rapid Turnover Rate of Phosphoinositides at the Front of Migrating MDCK Cells. Mol. Biol. Cell. 19 (10), 4213-4223 (2008).
  13. Stockholm, D., et al. Imaging Calpain ProteaseActivity by Multiphoton FRET in Living Mice. J. Mol. Biol. 346 (1), 215-222 (2005).
  14. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), http://www.nature.com/nature/journal/v388/n6645/full/388882a0.html 882-887 (1997).
  15. Mank, M., et al. FRET-Based Calcium Biosensor with Fast Signal Kinetics and High Fluorescence Change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  16. Ueyama, H., Takagi, M., Takenaka, S. A novel potassium sensing in aqueous media by synthetic oligonucleotide derivative. Fluorescence resonance energy transfer associated with guanine quartet-potassium ion complex formation. J. Am. Chem. Soc. 124 (48), 14286-14287 (2002).
  17. Kuner, T., Augustine, G. J. A Genetically Encoded Ratiometric Indicator for Chloride: Capturing Chloride Transients in Cultured Hippocampal Neurons. Neuron. 27 (3), 447-459 (2000).
  18. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (5), 409-416 (2006).
  19. Gadella, T. W. J. Editor, FRET and FLIM Techniques, Volume 33. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. , Elsevier. http://www.sciencedirect.com/science/bookseries/00757535 (2009).
  20. Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr. Opin. Biotech. 19 (4), 338-343 (2008).
  21. Aoki, K., Kiyokawa, E., Nakamura, T., Matsuda, M. Visualization of growth signal transduction cascades in living cells with genetically encoded probes based on Förster resonance energy. Phil. Trans. R. Soc. B. 363 (1500), 2143-2151 (2008).
  22. Welch, C. M., Elliott, H., Danuser, G., Hahn, K. M. Imaging the coordination of multiple signalling activities in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (11), 749-756 (2011).
  23. Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Sci. Signal. 2006 (331), 2 (2006).
  24. Hoppe, A., Christensen, K., Swanson, J. A. Fluorescence resonance energy transfer-based stoichiometry in living cells. Biophys. J. 83 (6), 3652-3664 (2002).
  25. Kumar, S., et al. FLIM FRET technology for drug discovery: automated multiwell plate high content analysis, multiplexed readouts and application in situ. ChemPhysChem. 12 (3), 627-633 (2011).
  26. Barber, P. R., et al. The Gray Institute "open" high-content, fluorescence lifetime microscopes. J. Microsc. 251 (2), 154-167 (2013).
  27. Matthews, D. R., et al. A high-content screening platform utilizing polarization anisotropy and FLIM microscopy. Proc. of SPIE. 6859, 1-12 (2008).
  28. Matthews, D. R., et al. A Multi-Functional Imaging Approach to High-Content Protein Interaction Screening. PLOS ONE. 7 (4), e33231 (2012).
  29. Talbot, C. B., et al. High speed unsupervised fluorescence lifetime imaging confocal multiwell plate reader for high content analysis. J. Biophotonics. 1 (6), 514-521 (2008).
  30. Grant, D., et al. High speed optically sectioned fluorescence lifetime imaging permits study of live cell signaling events. Opt. Express. 15 (24), 15656-15673 (2007).
  31. Warren, S. C. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PLOS ONE. 8 (8), e70687 (2013).
  32. OpenMicroscopy.org. , Available from: http://www.openmicroscopy.org/site/products/omero (2016).
  33. Github.com. , Available from: https://github.com/imperial-photonics/openFLIM-HCA/wiki (2016).
  34. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using μManager software. J. of Biol. Methods. 1 (2), 11 (2014).
  35. Pelet, S., Previte, M., Laiho, L., So, P. A fast global fitting algorithm for fluorescence lifetime imaging microscopy based on image segmentation. Biophys J. 87 (4), 2807-2817 (2004).
  36. FLIMFit webpage. , Available from: http://www.flimfit.org (2016).
  37. Kristoffersen, A. S., Erga, S. R., Hamre, B., Frette, Ø Testing Fluorescence Lifetime Standards using Two-Photon Excitation and Time-Domain Instrumentation: Rhodamine B, Coumarin 6 and Lucifer Yellow. J. Fluoresc. 24 (4), 1015-1024 (2014).
  38. Koushik, S. V., Chen, H., Thaler, C., Puhl, H. L., Vogel, S. S. Cerulean, Venus, and VenusY67C FRET Reference Standards. Biophys. J. 91 (12), 99-101 (2006).
  39. Ono, A. HIV-1 assembly at the plasma membrane: Gag trafficking and localization. Future Virol. 4 (3), 241-257 (2009).
  40. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat. Biotechnol. 22, 445-449 (2004).
  41. Koushik, S. V., Vogel, S. S. Energy migration alters the fluorescence lifetime of Cerulean: implications for fluorescence lifetime imaging Forster resonance energy transfer measurements. J. Biomed. Opt. 13 (3), 031204 (2008).
  42. Goncalves, V., et al. A fluorescence-based assay for N-myristoyltransferase activity. Anal. Biochem. 421 (1), 342-344 (2012).
  43. Lindwasser, O. W., Resh, M. D. Myristoylation as a target for inhibiting HIV assembly: Unsaturated fatty acids block viral budding. PNAS. 99 (20), 13037-13042 (2002).
  44. Iversen, P. W., Eastwood, B. J., Sittampalma, G. S., Cox, K. L. A Comparison of Assay Performance Measures in Screening Assays: Signal Window, Z'Factor, and Assay Variability Ratio. J Biomol Screen. 11 (3), (2013).
  45. Alibhai, D. Fluorescence lifetime imaging applied to multiwell plate FRET assays for high content analysis. , Imperial College London. PhD thesis, https://spiral.imperial.ac.uk:8443/handle/10044/1/26843 (2013).
  46. Klarenbeek, J., Goedhart, J., van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-Generation Epac-Based FRET Sensors for cAMP Feature Exceptional Brightness, Photostability and Dynamic Range: Characterization of Dedicated Sensors for FLIM, for Ratiometry and with High Affinity. PLOS ONE. 10 (4), 0122513 (2015).
  47. Martins, M., et al. Activity of phospholipase C epsilon contributes to chemotaxis of fibroblasts towards platelet-derived growth factor. J. Cell Sci. 125, 5758-5769 (2012).
  48. Github.com. , Available from: https://github.com/imperial-photonics/openFLIM-HCA/wiki/2-Hardware-reference (2016).
  49. McGinty, J., et al. Signal-to-noise characterization of time-gated intensifiers used for wide-field time-domain FLIM. J. Phys. D: Appl. Phys. 42, 135103 (2009).
  50. Boens, N., et al. Fluorescence Lifetime Standards for Time and Frequency Domain Fluorescence Spectroscopy. ACS. 79 (5), 2137-2149 (2007).
  51. Esposito, A., Dohm, C. P., Bähr, M., Wouters, F. S. Unsupervised Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy for High Content and High Throughput Screening. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1446-1454 (2007).
  52. Grecco, H. E., et al. In situ analysis of tyrosine phosphorylation networks by FLIM on cell arrays. Nat Meth. 7 (6), 467-472 (2007).
  53. Alibhai, D., et al. Automated fluorescence lifetime imaging plate reader and its application to Förster resonant energy transfer readout of Gag protein aggregation. J. Biophotonics. 6 (5), 398-408 (2012).
  54. Kelly, D. J., et al. Automated multiwell fluorescence lifetime imaging for Főrster resonance energy transfer assays and high content analysis. Anal. Methods. 7 (10), 4071-4089 (2015).
  55. Poland, S. P., et al. A high speed multifocal multiphoton fluorescence lifetime imaging microscope for live-cell FRET imaging. Biomed. Opt. Exp. 6 (2), 277-296 (2015).
  56. Vogel, S. S., Nguyen, T. A., Van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLOS ONE. 8 (1), e49593 (2012).

Tags

Biofysik fluorescensmikroskopi flim HCA öppen källkod FRET automatiserad mikroskopering läkemedelsutveckling
Open Source Hög innehållsanalys Använda automatiserade fluorescens Lifetime Imaging Microscopy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Görlitz, F., Kelly, D. J.,… More

Görlitz, F., Kelly, D. J., Warren, S. C., Alibhai, D., West, L., Kumar, S., Alexandrov, Y., Munro, I., Garcia, E., McGinty, J., Talbot, C., Serwa, R. A., Thinon, E., da Paola, V., Murray, E. J., Stuhmeier, F., Neil, M. A. A., Tate, E. W., Dunsby, C., French, P. M. W. Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Vis. Exp. (119), e55119, doi:10.3791/55119 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter