Summary
Vi præsenterer et open source højt indhold analyse (HCA) instrument udnytter automatiseret fluorescens levetid imaging (FLIM) til analyse protein interaktioner ved hjælp Förster resonans (FRET) baserede udlæsninger. Erhvervelse Data til denne openFLIM-HCA instrument styres af software skrevet i μManager og foretages analyse af data i FLIMfit.
Introduction
Den stigende brug af automatiserede højt indholdsanalyse (HCA) i lægemiddelforskning 1 til assay sammensatte biblioteker er suppleret med udviklingen i life science grundforskning mod automatiserede billeddannelse eksperimenter for systematiske undersøgelser, fx, for fænotypiske skærme siRNA biblioteker. Automatiseret HCA bliver også mere og mere vigtigt for mindre målestok biologiske undersøgelser, der typisk blevet gennemført med manuelle eksperimenter med snesevis af retter af celler afbildet med konventionelle mikroskoper. Den statistiske beføjelser, evnen til at analysere og analysere hundredvis til tusindvis af synsfelter muliggør gennemsnit af eksperimentel støj (herunder "biologisk støj") og automatisering af køb og analyse af store prøve arrays billeddata kan hjælpe med at fjerne operatør bias og ofte kan anvendes til at detektere forekomsten af systematiske fejl, såsom en ændring i IRF profil under en overtagelse. Fluorescens assayser blevet implementeret i HCA, med de fleste kommercielt tilgængelige HCA instrumentering featuring fluorescensintensitet billeddannelse i en eller flere spektralkomponenter kanaler til at kortlægge relative fordeling og co-lokalisering af mærkede proteiner. Mere avancerede fluorescens imaging modaliteter, såsom fluorescens levetid imaging (FLIM), polarisering anisotropi billedbehandling og tidsopløst fluorescens anisotropi billedbehandling, er ikke bredt udnyttes i kommercielle HCA instrumenter, selv om de tilbyder stærke kvantitative udlæsninger, fx af protein interaktioner. Her præsenterer vi en open source tilgang til gennemførelsen FLIM i en automatiseret mikroskop for HCA.
Fluorescenslevetid tilvejebringer en ifølge sagens natur ratiometrisk spektroskopiske udlæsning, der kan bruges til at skelne mellem forskellige molekylære art eller til at probe det lokale molekylære miljø af en fluorofor og er ufølsom over for fluorofor koncentration til excitation / detektionseffetiviteter, og at virkningen af scattering og prøve absorption 2. Da fluorescenslevetid målinger kan udføres i en enkelt spektral kanal, de er direkte sammenlignelige mellem forskellige instrumenter og prøver uden kalibrering. De kan anvendes til endogene fluoroforer, herunder nogle cellulære metabolitter, lipider og ekstracellulære matrixbestanddele, for at give iboende udlæsninger af biologiske processer og patologier. Label-fri FLIM kan således kortlægge metaboliske ændringer i cellerne 3,4 og er blevet anvendt til at overvåge stamcelledifferentiering 5,6 og væksten i kollagen stilladser 7. Vi har for nylig vist, at FLIM HCA kan anvendes til automatiserede label-free assays af cellulær metabolisme udnytte autofluorescens 8. Mere almindeligt er imidlertid fluorescenslevetid målinger og FLIM anvendes på eksogene fluoroforer, som mærker specifikke biomolekyler, ofte implementeret ved anvendelse af farvestoffer, der farves cellulære rum, ved hjælp af farvestoffer koblet til antibodies, der er målrettet specifikke proteiner i faste celler, eller ved hjælp af genetisk udtrykte fluoroforer koblet til specifikke proteiner. Fluorescenslevetid kan anvendes til at tilvejebringe robuste kvantitative udlæsninger af fluorescerende prober sensing deres fysiske eller kemiske miljø. For eksempler, er farvestoffer blevet indsat for at fornemme den lokale lipidfase af cellemembraner 9 eller celle viskositet 10 og genetisk udtrykte fluorescerende protein-baserede biosensorer er blevet udviklet til at rapportere koncentrationer af celle signalmolekyler herunder som IP3 11, PIP2 12 og calpain 13 eller såsom calcium 14,15, kalium 16 og klorid 17.
Mange sådanne biosensorer anvender Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 18,19 for at tilvejebringe udlæsninger af ændringer i biosensoren konformation. FRET mellem "donor" og "acceptor" fluoroforer sker via en kort rækkevidde direkte dipol-dipol interaktionfor hvilke fluoroforer er typisk adskilt af mindre end ~ 10 nm. Påvisning af FRET angiver således den tætte nærhed af passende mærkede proteiner og dermed giver mulighed for at udlæse protein-protein interaktioner 20, såsom binding eller oligomerisering - enten som slutpunkter i faste celler eller som dynamiske begivenheder i tidsforløbet målinger af levende celler. Ved at mærke en passende molekylær konstruktion med både donor og acceptor-fluoroforer, er det også muligt at udlæse konformationsændringer - eller spaltning - af konstruktionen på grundlag af ændringen i FRET, og dette er grundlaget for mange biosensorer 21. Målinger af FRET effektivitet kan give oplysninger om donor-acceptor afstand og befolkningen brøkdel af donor fluoroforer undergår FRET. Således kan FRET-baserede billeddiagnostiske teknikker bruges til at kortlægge og kvantificere molekylære interaktioner i tid og rum, f.eks at belyse cellesignalering processer 22. Automating sådanne billeddiagnostiske teknikker kan give høje gennemløb analyser baseret på udlæsninger af signalveje eller netværk.
I HCA, FRET udlæsning mest almindeligt gennemføres, er spektrale ratiometrisk billeddannelse, hvor ændringer i forholdet mellem acceptoren til donorens intensitet er kortlagt. Mens denne fremgangsmåde er let gennemføres - og fås i mange kommercielt tilgængelige flerbrøndspladen læsere - kvantitative spektralt opløste FRET målinger kræver kalibrering af det spektrale respons af systemet 23. Dette omfatter spektrale krydstale som følge af spektral gennemblødning og direkte excitation af acceptoren samt transmissions- instrumentets egenskaber og prøven (indre filter effekt). I princippet indebærer måling af yderligere "kontrol" prøver, der er mærket med enten donor-only eller acceptor-only.
Fra sådanne spektrale ratiometriske FRET målinger, har en effektiv FRETkan opnås effektivitet (produktet af den faktiske FRET effektivitet og brøkdel af FRETing donor / acceptor-molekyler) sammen med den relative andel af donor- og acceptormolekylerne 24. Spectral ratiometrisk FRET bruges ofte med unimolekylær FRET biosensorer, hvor der kan antages donor / acceptor støkiometri at være kendt. For at bestemme de befolkningsgrupper fraktioner af FRETing donor og acceptor, fx til opnåelse af en dosisresponskurve, er kendskab til den faktiske FRET effektivitet kræves. Dette kan opnås ved at måle en positiv FRET kontrolprøve med kendte egenskaber eller ved hjælp af en anden metode til at måle FRET effektivitet, såsom acceptor fotoblegning eller FLIM.
Brug fluorescens levetid aflæsning, kan påvises og kvantificeres ved målinger af donor emission alene FRET - fjerner behovet for spektrale kalibrering og yderligere kontrolprøver. Således kan FLIM FRET udlæsninger sammenlignes mellem instrumenterneog mellem forskellige prøver - tillader data fra endoskopi eller tomografi af levende sygdomsmodeller 25 skal benchmarkes mod målinger af cellebaserede assays. Ved at montere donor fluorescens henfald profiler til et passende multi-eksponentielt henfald model svarende til FRETing og ikke-FRETing donor befolkninger, FRET kan i princippet opnås effektivitet og befolkningsgrupper fraktioner direkte uden yderligere målinger. Disse betydelige fordele, men på bekostning af FLIM kræver mere detekterede fotoner per pixel end spektralt løst intensitet imaging - typisk hundredvis af fotoner er nødvendige for at opnå en nøjagtighed på livstid bestemmelsen af 10%, når montering på en enkelt eksponentielt henfald model, og når montering fluorescens henfald profiler til komplekse (tokompartment henfald) modeller, antallet af detekterede fotoner krævede stiger til tusinder. Dette har traditionelt ført til lange erhvervelsestider (ti til hundrede sekunder pr området VIew) for FLIM, især når du bruger tid korreleret enkelt foton tælling (TCSPC) implementeret med sekventiel pixel opkøb i laser scanning mikroskoper. Forsøg på at forøge det billeddannende hastighed ved anvendelse af højere excitations- intensiteter kan føre til betydelig fotoblegning og / eller fototoksicitet. Sammen med en mangel på egnede kommercielt tilgængelige instrumentering og software-værktøjer, har dette hindret FLIM fra at blive udnyttet i HCA for lægemiddelforskning eller systembiologi, hvor hundreder til tusinder af synsfelter skal afbildes. Laserscanning TCSPC FLIM blevet implementeret i en automatiseret flerbrøndspladen mikroskop 26 for sekundære målinger efter identifikation af "hits" ved steady-state polarisering-løst fluorescens anisotropi billedbehandling 27, som kan nå lignende imaging hastigheder til spektral ratiometrisk billeddannelse 28, som det deler mange fordele og ulemper. Fluorescensanisotropi billeddannelse udnytter faldeti fluorescensanisotropi af acceptoren i nærværelse af FRET og er også følsomme over for spektral krydstale (f.eks direkte excitation af acceptoren). Det kræver kalibrering for at tage højde for polarisering cross talk og giver ikke en direkte måling af FRET effektivitet.
For at realisere fordelene ved FLIM for HCA, har vi arbejdet på at løse problemer med hastigheden på erhvervelse billede og bredere adgang til teknologien. Her giver vi en komplet liste over open source software og hardware-komponenter, som kan udnyttes til at gennemføre den automatiserede hurtig FLIM flerbrøndspladen læser, der er beskrevet nedenfor, sammen med exemplar FRET baseret-analyser. I vores tilgang 29, er FLIM realiseres ved hjælp af bred-field tid-gated billeddannelse ved hjælp af en låge optisk billedforstærker (GOI), som er illustreret i figur 1, der kan give hurtigere billedbehandling og lavere fotoblegning end single-beam scanning TCSPC grund af parallel pixel INTERRogation. Vores openFLIM-HCA instrument kan give uovervåget FLIM, kræver kun et par sekunder til at erhverve flim data afsløre et par 100 fotoner per pixel (afhængigt af lysstyrken i prøve). Kombineret med den tid, der kræves for at flytte prøven fra tidligere synsfelt, at justere erhvervelse og opretholde prøven i fokus, resulterer typisk i flere brønde erhvervelse plade tider med ~ 10 s pr synsfeltet 25,28. Optisk sektionering kan implementeres ved hjælp af en kvasi-wide-field Nipkow ( "spinning disc") scanner 30.
For FLIM dataanalyse, har vi udviklet et open source software-værktøj kaldet FLIMfit 31, der er i stand til hurtigt at analysere flerbrøndspladen flim datasæt på konventionelle pc-arbejdspladser og er en plug-in til Omero 32. FLIMfit giver globale analysemuligheder (omtalt i afsnit 1.2), der gør det muligt flim data, der skal monteres på komplekse modeller med oNLY et par 100 fotoner per pixel under den antagelse, at fluorescens levetid komponenter er invariant over et billede eller region renter (ROI), derfor reducere antallet af detekterede fotoner påkrævet, lyset eksponering til prøven og billede erhvervelse tid. Løb FLIMfit på en standard desktop-pc, kræver kun 10s af sekunder af beregningsmæssige tid til at analysere datasæt omfatter hundredvis af FOVs. Således kan foretages både FLIM indsamling og analyse af data om tidsplaner, der er praktiske for HCA.
openFLIM-HCA hardware
Vores implementering af FLIM HCA omfatter seks vigtige komponenter: (i) et fluorescensmikroskop ramme med optisk autofokus; (Ii) en motoriseret (xyz) mikroskop fase; (Iii) en excitation laserkilde; (IV) en bred-felt tid-gated FLIM systemet med gated optisk forstærker (GOI), forsinkelse generator og kamera; (V) en computer til erhvervelse og dataanalyse og (vi) en Nipkow disk scannerenhed for optisk sektioneret imaging at undertrykke ude af fokus lys. Dette kan være vigtigt, når billeddannelse svage signaler, fx fra FRET biosensorer på cellens plasmamembran, som kunne blive oversvømmet med bidrag fra cytoplasmatisk fluorescens eller baggrund fra dækglas eller dyrkningsmediet. Time-gated FLIM data er erhvervet ved at belyse prøven med ultrakort pulserende excitation stråling billeddannelse fluorescensemissionen til fotokatoden af den indiske regering og erhverve en række CCD billeder af fosfor af den indiske regering for en række indstillinger for tidsforsinkelse af den optiske forstærker gate efter ankomsten af ekscitationsimpulserne. Da den tid portforsinkelse efter excitation forøges, fluorescenssignalet ses at falde, og den række af tid-gated fluorescensintensitet billeder optaget på CCD danne datasæt kræves for at analysere henfald profiler af alle fluoroforer i synsfeltet . Den gating af den indiske regering er synkroniseret til ekscitationsimpulserneog, for serien af CCD erhvervelser, forsinkelsen af tiden gate forhold til ekscitationsimpulserne er indstillet til en serie af stigende værdier over det ønskede område. Denne synkronisering opnås ved anvendelse forsinkelsen generator, der omfatter "fast forsinkelse box" (leverer forsinkelser på op til 20 ns i 1 ps trin) og et "grov forsinkelse box", der giver forsinkelser med et minimum trin med 25 ps.
For FLIM, kan excitation tilvejebringes ved enhver ultrahurtig laser. For nemheds skyld, vi anvender typisk en fiber-laser-pumpet superkontinuum kilde, der giver picosekund pulser afstemmelig over det synlige spektrum, hvorfra den passende excitationsstråling kan vælges til enhver fluorophor under anvendelse af en motoriseret filterhjul med forskellige båndpasfiltre. Typisk bruger vi en gennemsnitlig effekt på ~ 100-200 pW på prøven med pulser ved 40 eller 60 MHz gentagelse sats. Sådanne excitation beføjelser kunne også ydes af ultrahurtige laser kilder er baseret på frekvens fordobling aftilstand-låst titanium doteret safir lasere. Bemærk, at en magnetisering impulsvarighed under ~ 100 ps er tilstrækkelig for de fleste eksperimenter. En anden motoriseret filterhjul udstyret med neutralfiltre bruges til at regulere excitationsintensitet. Af sikkerhedsmæssige og praktiske, kan excitationsstrålingen leveres via en optisk single-mode fiber. De konfigurationer for bredt felt FLIM og optisk sektioneret FLIM præsenteres i figur 2 og 3 henholdsvis. For flere oplysninger om de præcise komponenter, der anvendes, kan du besøge openFLIM-HCA wiki 33. En kopi af den aktuelle liste dele findes i den supplerende materiale.
For wide-field FLIM er excitation stråling der kræves for at belyse hele synsfeltet så ensartet som muligt. Til dette har vi direkte excitation laserstråle til en holografisk "top-hat" diffusor, der roteres ved 10-50 Hz til anden-gennemsnittet laser speckle, med planet af diffikseringsenheden der afbildes til bagsiden brændplanet af den objektive mikroskop linse. Den fluorescens billede fra output port af mikroskopet videresendes på fotokatoden af den indiske regering og fosfor af den indiske regering (aktive område diagonal 18 mm) er afbildet på sensoren i en afkølet videnskabelig CCD (chip størrelse 10.2 mm x 8.3 mm) kameraet ved hjælp af et par af kameralinser giver et forstørrelse på 0,7. Systemet styres af en standard PC, der er grænseflader til instrumentering hjælp RS232 protokoller. Desuden er en Arduino mikroprocessor anvendes til at styre en lukker i excitationslyset sti, der er lukket, undtagen når CCD-kameraet erhverver FLIM data og registrere signalet fra en fotodiode, der anvendes til at måle den gennemsnitlige effekt fra spektralt filtreret superkontinuum excitationskilde. Til optisk snit FLIM er excitation laserstråling koblet til en single-mode polarisationsbevarende optisk fiber, der forbinder direkte til Nipkow disken scannerenheden, som shown i figur 3. Outputtet fluorescens billede fra Nipkow scannerenheden videresendes på fotokatoden af den indiske regering og resten af systemet er den samme som for bredt felt FLIM.
openFLIM-HCA software
Købet data software er skrevet i μManager 34. Det giver fuld HCA dataopsamling funktionalitet, herunder muligheder for at ændre den rækkefølge, som de pladens huller er afbildet, at erhverve tidsforløb for enhver FOV, til automatisk at fastholde fokus under målingerne og kontrollere de excitation og emission filter hjul og dichroic changer til automatiseret flerfarvet billeddannelse. Det er også muligt at køre en "præscan" erhvervelse af fluorescensintensitet for automatisk at identificere og registrere positioner egnede FOVs for en efterfølgende FLIM overtagelse i henhold til kriterier, fx baseret på intensitet. Flim HCA data kan gemmes som en serieaf TIFF-filer, som en række OME-TIFF-filer (dvs. en pr FOV), eller som en enkelt OME-TIFF-fil indeholder alle data fra et flerbrøndspladen. Flere oplysninger og en detaljeret beskrivelse af μManager software kan findes på openFLIM-HCA wiki 33.
De data analyse software, FLIMfit 31, et open source MATLAB-baserede klient for Omero billeddata management platform 32, er i stand til at læse flim data fra en Omero server eller fra computer disk, som vist i figur 4. Den er designet til at analysere data fra TCSPC eller wide-field tid-gated flim instrumenter og giver mange muligheder for at passe data fra openFLIM-HCA herunder montering på monoeksponentiel henfald profiler, og at fordoble eksponentielle og højere kompleksitet henfald profiler, herunder modeller som polarisering-fluorescens henfald profiler. Det kan også tage hensyn til faste og tidsvarierende baggrundssignaler og kan UTILize en afmålt spatio-temporale instrument respons funktion (IRF), eller kan passe bruge en idealiseret IRF, der kan være tidsforskudt på en pixel-wise basis med et beløb, bestemt ud fra den fulde eksperimentelle IRF måling. En global tidsforskel (t 0) mellem IRF og en fluorescerende prøve kan bestemmes ud fra en måling af et fluorescens-standard. kan også tages i betragtning rumlige variationer i baggrundssignaler og IRF. FLIMfit er i stand til at passe FLIM data på pixel-wise basis eller ved hjælp af "global binning" eller "global fitting" for at lette montering af FLIM-data med beskedne (hundreder) foton numre til komplekse henfald modeller.
Global Binning indebærer sammenlægning af alle de fundne fotoner fra pixel inden for et brugerdefineret ROI på hvert tidspunkt at give tilstrækkelige foton numre for at muliggøre montering på komplekse henfald modeller. ROI kan være hele synsfeltet (FOV), kan det være manuelt defined af brugeren, eller det kan bestemmes ved anvendelse billede segmenteringsværktøjer. Den ROI kan også defineres ved hjælp af masker, der importeres til FLIMfit fra andet billede segmentering software. For FRET applikationer, er det almindeligt at bruge globale Binning til at passe til en dobbelt eksponentiel henfald model til at bestemme fluorescens levetid komponenter svarende til FRETing og ikke-FRETing donor fluoroforer, der antages at være rumligt invariant over ROI og derefter genmontere på en pixel-wise basis med disse levetid komponent vales fastsat for at opnå den FRETing donorpopulationen fraktion i hver pixel.
Global montering indebærer samtidig montering af levetid komponenter og pixel-wise FRETing donorpopulation fraktioner på tværs af en hel FOV- eller på tværs af en FLIM datasæt, der kan omfatte flere FOVs, fx fra en flerbrøndspladen eksperiment eller en tidsserie af fluorescens levetid billeder. Global fitting er i stand til at udnytte den rumlige variatiom befolknings- fraktioner på tværs af billedet, der er gået tabt i den globale Binning tilgang til at give stærkere begrænsninger i komponent levetid estimering - og derfor mere pålidelige resultater - om end på bekostning af betydeligt mere beregning 35. FLIMfit kan hurtigt analysere flerbrøndspladen flim datasæt med global montering på konventionelle pc-arbejdspladser med for eksempel en flere brønde tid-gated FLIM datasæt erhvervet med fem gang porte for hver af 394 FOV som hver omfatter 672 x 512 pixels, kræver kun 32 sekunder og 2 GB hukommelse til at passe til en dobbelt eksponentiel henfald model 31. Dette er opnået ved at udnytte en adskilles lineær mindste kvadraters montering algoritme implementeres ved hjælp af flertrådede parallelle algoritmer til at muliggøre en effektiv skalering på multi-core processorer og FLIMfit koden er optimeret til at minimere hukommelsesforbruget. Figur 5 viser et øjebliksbillede af den grafiske brugergrænseflade i FLIMfitog flere detaljer kan findes på websiden i henvisning givet 36. Yderligere information om global montering og global Binning kan findes i henvisning 31.
Følgende protokol for FLIM HCA ved hjælp af vores openFLIM-HCA instrumentering og software kan tilpasses til en bred vifte af cell imaging eksperimenter med Flim udlæsninger. Generelt flerbrøndspladen FRET eksperimenter bør udformes til at omfatte replikatbrønde af positive og negative biologiske kontrol Foruden de betingelser, der undersøges. Her beskriver vi den specifikke implementering at udføre optisk gennemskåret FLIM (se figur 3) af Cos-celler, der udtrykker FRET-konstruktioner bestående af mTurquoise fluorescerende protein og Venus fluorescerende protein forbundet ved en kort peptidlinker. Her mTq32V, mTq17V og mTq5V FRET konstruktioner (diskuteret i Repræsentative resultater afsnit) giver lav, middel og høj FRET effektivitet sammen med den ikke-FRETing mTq5A konstruere.Disse konstruktioner og de øvrige nødvendige materialer til at følge denne protokol er opført på listen Materials.
Protocol
1. Fremstilling af flerbrøndsplade Array
- Forbered en opløsning af 75 pM Coumarin 6 i ethanol (T ~ 2,43 ns) for referencemålinger for at muliggøre bestemmelse af t 0.
- Seed 150.000 Cos-celler i fire brønde i en plade med 6 og tillade at vedhæfte natten over i dyrkningsmediet (se Materialer List).
- Transfektion én brønd hver med mTq5A, mTq5V, mTq17V og mTq32V anvendelse af et kommercielt transfektionsreagens i henhold til producentens anvisninger og kultur for 24 timer.
- Frigør celler under anvendelse af en kommerciel trypsin / EDTA opløsning ifølge producentens protokol.
- Pipette 5.000 Cos-celler suspenderet i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), der udtrykker mTq5A i hver af brøndene A1-G3 af en # 1.5 tykkelse glas-bund 96 flerbrøndspladen, der tidligere er behandlet med poly-L-lysin. Gentag for mTq5V udtrykker celler i brønde A4-G6, mTq17V i brønde A5-G9 og mTq32V i brønde A10-G12. Lad godt H1 tom (til at give måling af en statisk baggrund fra flerbrøndspladen).
- Pipetter 200 pi HBSS kun i godt H2 (for at tilvejebringe målinger af enhver baggrund signal fra celledyrkningsmediet).
- Pipette 5.000 ikke-transficerede celler i HBSS i brønd H3 (for at tilvejebringe måling af en baggrundssignal fra cellulær autofluorescens).
- Pipetter 200 pi af 75 uM coumarin farvestofopløsning i godt H4 (for at tilvejebringe en kontrol af enhver variation af t 0 løbet flerbrøndspladen erhvervelse, f.eks på grund af ændringer i omgivelsernes temperatur eller til udsving i laser eller timing kredsløb.
2. openFLIM-HCA datafangst
BEMÆRK: Nærmere oplysninger kan findes på openFLIM-HCA wiki 33.
- Start μManager og OpenFLIM-HCA Plugin
- Vælg kalibreringen filen for den specifikke kombination af forsinkelse generator enhed oglaser gentagelse sats under "FLIM kontrol: Forsinkelse box kalibrering fil: Kalibrering filer".
- Indstil den mappe, hvor data vil blive gemt under "Fil: Set Base mappe".
- Kontroller excitation strålegangen at sikre, at koblingen i levering optiske fiber er stabil, og at koblingseffektivitet maksimeres ved at måle effekt overføres gennem levering fiber under anvendelse af en effektmåler. Udsving lavere end 5% er acceptable.
- Kontroller, at den indiske regering udløsning er stabil ved at vise skærmens udgangssignalet fra den indiske regering på et oscilloskop udløst af den indiske regering input trigger signal.
- Kontroller billeddannelse af den indiske regerings fosfor på CCD-sensoren ved at dække fotokatoden af den indiske regering, indstilling sin gevinst til 750 V og fokusere en af relæ linser sådan at billeder af sparsomme enkelt foton begivenheder (på grund af baggrundslys lækker selvom den indiske regering dæksel ) optaget på CCD er så skarpe som muligt.
- Kontroller, at prøvensynsfelt er ensartet belyst af imaging en ensartet fluorescerende prøve, såsom en dråbe af henvisningen farveopløsning på et dækglas under anvendelse af en tilstrækkelig lav magnetiseringseffekt (<1 pW) for at sikre, at den indiske regering ikke er mættet.
- Vælg den relevante plade definition-fil, dvs vælge mulighed for 96-brønds plader ( "Fil: Load Plate egenskaber").
- Brug af μManager GUI, sikre, at der ikke er nogen dikroisk stråledeler terning i mikroskopet ramme ved at vælge en tom position.
- Vælg manuelt en port bredde på 4 ns på den indiske regering for hele forsøget.
- Erhverve IRF billeddata:
- Brug af μManager GUI, sikre, at der ikke er nogen mikroskopobjektivet i strålegangen ved at vælge en tom position. Manuelt placere en sort anodiseret stråle blokken over målet tårn for at forhindre enhver laserlys undslippe og vinkel det at minimere enhver refleksion tilbage i mikroskopet rammen. <li> Brug af μManager GUI, sætte filtrene i CSUX (Excitation, Dichroic, Emission), således at den del af excitation spredte lys fra spinning Nipkow disk kan afbildes, men sikre intensiteten ikke er tilstrækkelig til at mætte systemet til en 200 ms CCD integration tid. Dette er for at undgå at udsætte den indiske regering fotokatoden at for meget lys, som kan beskadige fotokatoden.
- Brug Find maxpoint funktion over hele spektret af de forsinkelser, der er omfattet af den programmerbare hurtigt forsinkelse kassen. Tjek output diagram vises og derefter justere den manuelle kursus forsinkelse kasse ved at skubbe fremad knap så hele IRF profil er inden scanningen vifte af den hurtige forsinkelse kassen.
- Juster parametrene erhvervelse (Neutral tæthed, eksponeringstid, Frame ophobning), så CCD ikke er mættet i den lyseste tid-gate og effektiv integration tid er> 200 ms.
- Set forsinkelse trin på 25 ps under fuld forsinkelse ringedee ( "FLIM kontrol: Hurtig forsinkelse box: Befolke forsinkelser").
- Erhverve IRF billede ved at trykke på "Snap FLIM image".
- Anskaf et baggrundsbillede ved at blokere laser ( "Light sti kontrol: Neutral tæthed: blokeret"), at reducere antallet af forsinkelser ( "FLIM kontrol: Hurtig forsinkelse box: Aktuel forsinkelse indstilling (ps)"), lade alle andre egenskaber, uændret og tryk på "Snap FLIM billede".
- Vælg godt h4 ved hjælp af μManager GUI ( "XYZ kontrol: Gå til godt: H4").
- Brug af μManager GUI vælge filtre (excitation 434/17 nm, Dichroic, Emission 482/25 nm) til billeddannelse mTqFP.
- Brug Find maxpoint funktion over hele spektret af den hurtige forsinkelse boksen og derefter justere den grove forsinkelse boksen, så den fulde henfald profil er inden forsinkelsen rækkevidde hurtige forsinkelse kassen.
- Indstil forsinkelsentil det punkt af maksimal intensitet ved at ændre "FLIM kontrol: Hurtig forsinkelse box: Aktuel forsinkelse indstilling (ps)". Juster parametrene erhvervelse (Neutral tæthed, eksponeringstid), så CCD ikke er mættet.
- Set forsinkelse trin på 25 ps under fuld forsinkelse interval ( "FLIM kontrol: Hurtig forsinkelse box: Befolke forsinkelser).
- Anskaf henvisning farvestof data ved at trykke på "Snap FLIM image".
- Anskaf en anden baggrund CCD-kamera billede ved at blokere excitation laser (se 2.11.7)
- Set som brønde skal afbildes, og antallet af FOV skal erhverves per brønd ( "Setup HCA sekventeret erhvervelse: XYZ positioner").
- manuelt vælge en eksemplarisk FOV indeholdende prøven, der skal afbildes. Brug denne FOV at bestemme den optimale gråfilter, gate bredde ved den indiske regering ogintegrationstid på kameraet for at nå 75% af det dynamiske område for CCD-kameraet.
- Set autofokus ( "XYZ kontrol: Autofokus"): Tryk på "Return fokus kun kontrol", og derefter manuelt fokusere på cellerne eller struktur af interesse. Indstil "Autofokus søgning rækkevidde" til 2000 um og tryk på "Enter". Tryk på "AF nu" for at indlede en autofokus procedure. En offset værdi vil dukke op i feltet "FocusOffset (Autofokus)".
- Indtast offset værdi opnået i 2.13.3 i "AF offset" og gentag autofokus procedure to gange ( "AF nu") for at kontrollere, at offset værdi nu nul, hvilket indikerer fungerer korrekt autofokus systemet.
- Brug "autogate" -funktionen i købet OpenFLIM-HCA software til at vælge en logaritmisk sampling af forsinkelsen point. Alternativt kan disse vælges manuelt, se henvisening 36 for flere detaljer.
- Indstil "Akkumuler Frames" til en værdi, som udbytter ønskede samlede datafangst tid. Forøgelse af antallet af akkumulerede rammer øger signal-støjforhold af de flim data på bekostning af også stigende total FLIM datafangst tid.
- Kør købet af flerbrøndspladen FLIM ved at trykke på "Start HCA sekvens" knappen.
3. openFLIM-HCA dataanalyse Brug FLIMfit
- Kontroller, at de nødvendige hjælpefunktioner filer til FLIM dataanalyse er til stede (dvs. IRF og reference farvestof måling).
- Indlæse data fra den tomme brønd (H1), den brønd, der indeholder dyrkningsmedium (H2) og brønd indeholdende umærkede celler i dyrkningsmedium (H3) i FLIMfit( "Fil: Load FLIM data") for at kontrollere, om der er nogen baggrund bidrag større end 1% af signalet fra cellerne "donor-only" udtrykker, dvs i brønde A1-G3.
- Forbered en tidsvarierende baggrund (TVB) fil ved at indlæse den godt med dyrkningsmedium i FLIMfit ( "File: Load FLIM data"). Indlæse kamera baggrundsdata erhvervet i afsnit 2.14 ( "Baggrund: Load baggrund") og bruge FLIMfit option "Funktioner: Opret TVB Intensitet Map" til at generere TVB. Se reference 31 for flere detaljer på TVB.
- Forbered rumligt varierende IRF Shift Kort ved at indlæse de IRF data indhentet i afsnit 2.11 og trække CCD-kameraet baggrund erhvervet i afsnit 2.11.7. Brug FLIMfit option "Funktioner: Opret IRF Shift Map" til at beregne den rumligt varierende IRF Shift kort. Se reference [31] for flere detaljer på IRF Shift Map.
- Monter en monoexponenoplys- henfald til henvisning farvestof data indhentet i afsnit 2.12. Load henvisning farvestof og det rumligt varierende IRF Kort beregnet i afsnit 3.4, der er fit parametre ( "Lifetime: Nej Exp: 1") med t 0 sæt som en monteret parameter ( "Lifetime: FIT IRF Shift: Fitted"). Værdien af t 0 opnåede derefter rapporteret i tabellen i fanen "Parametre".
- Analyser flim data ved at indlæse de eksperimentelle flim data indhentet i afsnit 2.13, det rumligt varierende IRF Kort beregnet i afsnit 3.4, kameraet baggrund erhvervet i afsnit 2.14, TVB-fil udarbejdet i afsnit 3.3 og type i den negative værdi af t 0 opnået i afsnit 3.5 ( "IRF: IRF shift: t 0"). Så passer de eksperimentelle data til den ønskede henfald model ved hjælp af FLIMfit 36 i henhold til kravene i eksperimentet.
Representative Results
For at illustrere mulighederne i den openFLIM-HCA instrumentering, præsenterer vi tre eksemplariske FRET applikationer. Det første vedrører FRET konstruktioner, der er tilpasset fra FRET model konstruktioner udviklet af Stephen Vogel laboratorium 38. De omfatter en række genetisk ekspressér fluorescerende konstruktioner, hvor en donor fluorescerende protein (mTurquoise) er knyttet til en acceptor fluorophor (Venus) ved kort kontrollerede længder på 5, 17 og 32 aminosyrer (mTq5V, mTq17V, mTq32V). De forskellige linker længder mellem donor- og acceptor fluoroforer resultere i forskellige FRET effektivitet og dermed forskellige donor levetid. At tilvejebringe en negativ kontrol, er Venus i kort 5-aminosyrelinker konstrukt erstattet af Amber - en ikke-fluorescerende mutation af YFP (mTq5A), som ikke kan fungere som en FRET-acceptor 38. Vi erstattet Cerulean i de oprindelige pCXV og pC5A vektorer ved begrænsning fordøje vectors med Nhel- og BglII enzymer og ligering mTurquoise fragmenter spaltet ved hjælp af de samme enzymer fra pmTurquoise-N1-vektoren. Linker-regionen blev umodificeret af denne substitution.
Figur 6 viser en eksemplarisk FLIM FRET assay under anvendelse dette modelsystem udtrykt i COS-celler, i hvilken en plade med flere brønde er klædt med 3 kolonner hver af celler transficeret med den negative kontrol (kolonne 1-3), 5-aminosyrelinkeren FRET konstruere (kolonne 4-6), 17-aminosyrelinker FRET konstruere (kolonne 7-9) og 32 aminosyrelinker FRET konstruere (søjler 10-12). Række H indeholder brønde til TVB estimering. Figur 6 (a) viser eksempler på automatisk erhvervede fluorescenslevetid billeder af typiske synsfelter i hver brønd. Det fremgår, at den negative kontrol (kolonne 1-3) præsentere de længste levetid, og at donoren levetid er lavest for FRET konstruktion med den korteste linker LENgth (kolonne 4-6). Figur 6 (b) viser, hvordan den gennemsnitlige levetid gennemsnit for alle FOVs i hver brønd varierer flerbrøndspladen. Figur 6 (c) og (d) viser eksemplariske donor fluorescensintensitet-fusionerede levetid kort til en FOV af mTq5A og mTq17V hhv. Figur 6 (e) viser donor fluorescensintensitet henfald profil gennemsnit over alle celler afbildet i godt A1 sammen med pasform til en monoeksponentiel forfald model og IRF (som er domineret af den indiske regering gate bredde). Figur 6 (f) præsenterer den gennemsnitlige fluorescens levetid for hver kolonne af flerbrøndspladen opnået fra en pixel-wise monoeksponentiel pasform. En tabel over den gennemsnitlige levetid og standardafvigelse (STD) kan findes i tabel 1 nedenfor. Købet data for billederne vist i figur 6 tog ca. 160 min at erhverve. Analysen tog 92 s på en 2,6 GHz computer med 10 kerner og 64 GB RAM.
Den anden exemplar assay demonstrerer anvendelsen af FLIM FRET for udlæsning af oligomerisering af HIV-1 Gag under samlingen af HIV-1-virioner som et middel til at teste inhibitorer af denne proces 25,42. Udtrykker HIV-1 Gag i passende værtsceller tilvejebringer et modelsystem til denne fase af HIV-1 livscyklus, da det fører til dannelse af virale partikler (VLP'er), der ligner umodne HIV-1-virioner. Til denne analyse, vi udtrykte HIV-1 Gag fusioneret med FFP i HeLa-celler og sammenlignet virkningen af forskellige inhibitorer via deres indvirkning på FRET signal, der resulterede fra Gag oligomerisering. Nærmere oplysninger om de anvendte inhibitorer er tilvejebragt i henvisning 42.
Detaljerne i prøveforberedelsen og eksperimentelle målinger er beskrevet udførligt i henvisning 25, hvor vi viste, at vi kunne bruge FLIM at udlæse both heteroFRET mellem aggregere Gag proteiner mærket stokastisk med fælles fiskeripolitik og med YFP, og også homoFRET i celler, der udtrykker kun Gag mærket med FFP. Selvom homoFRET normalt ikke udgør en ændring i donor levetid, det gør for det særlige tilfælde med FFP, hvor fluoroforen findes i to isomerer med forskellige gennemsnitlige fluorescens levetid 40,41. Den fælles fiskeripolitik homo-FRET udlæsning har fordelene ved forenklet prøveforberedelse i forhold til den fælles fiskeripolitik / YFP hetero-FRET og er mere spektral effektivt, hvilket kunne være vigtigt for multiplex FRET udlæsninger.
Vores tidligere arbejde anvendte FLIM FRET at analysere Gag oligomerisering i nærværelse af et N-myristoyltransferase (NMT) inhibitor 42. Denne inhibitor afbryder endogene enzymer ansvarlige for tilsætning af myristinsyre til Gag, som gør det muligt Gag proteiner til at binde til plasmamembranen og er en forudsætning 43 i dannelsen af HIV-virioner ellerVLP'er. Vi viste, at både heteroFRET og homoFRET udlæsninger kunne opnå Z 'på> 0,6 i dosis-respons studier med en NMT-hæmmer. Z 'er en parameter, der anvendes i den farmaceutiske industri til at angive kvaliteten af et assay og repræsenterer forskellene i de gennemsnitlige værdier af de positive og negative kontroller og deres relative opslag for at generere en enkelt værdi metrisk assay kvalitet - med Z'> 0.5 blive betragtet som "udmærket" for en farmaceutisk assay 44. Vi bemærker, at denne fremragende præstation blev opnået med prøver, hvor ændringerne i den gennemsnitlige donor levetid var i størrelsesordenen 300 ps - demonstrere statistiske styrke analysere flim data for et stort antal celler, som muliggør nyttige udlæsninger skal realiseres ved hjælp af meget mindre ændringer i fluorescens levetid end det er muligt med de typiske antal af celler afbildes i manuelle mikroskopi eksperimenter.
Her præsenteres en flerbrøndspladen FLIM FRET datasæt sammenligne 4 inhibitor forbindelser til HIV Gag oligomerisering (betegnet ICL13, ICL14, ICL15 & ICL16). Til dette forsøg anvendte vi den homoFRET udlæsning med HeLa-celler transient transficeret med Gag-CFP plasmid. Der blev anvendt i alt ni forskellige doser af hver inhibitor efter standard protokollen beskrevet med henvisning 32, så to gentagne brønde pr tilstand. Som en positiv kontrol, kolonne 1 viser celler, der udtrykker myr-Gag, et muteret gag-proteinet som mangler myristinsyre del, ikke kan danne VLP'er og så simulerer total hæmning. En negativ kontrol blev leveret af dosering celler, der udtrykker Gag-CFP kun med blot køretøj, der anvendes til at levere de inhibitorer i de andre kolonner (kolonne 11). I alt otte FOV blev erhvervet pr brønd.
Dataene blev tilpasset med en enkelt eksponentielt henfald model på en pixel-for-pixel basis og fluorescensen levetid plate kort, der viser den gennemsnitlige levetid per brønd (over alle pixels over tærsklen intensitet på tværs af de otte synsfelter) er vist nedenfor i figur 7 (a). Figur 7 (b) viser tilsvarende plot af fluorescens levetid som en funktion af inhibitorkoncentration. Tre af inhibitorerne viser en inhiberende virkning (ICL13, ICL15 & ICL16) når inkuberet med celler, der udtrykker Gag-CFP. En inhibitor (ICL14) viser ingen virkning på ethvert testede dosis. Z 'er beregnet for denne plade var 0,51. De opnåede resultater for de positive og negative kontroller værdier er vist på figur 7 (b) som de punkter i sort på 100 pM og 0,1 nM.
Dosis-respons-kurverne for ICL13, ICL15 og ICL16 vist i figur 7 (b) blev derefter monteret på 4 parameter logistisk lineær regressionsmodel med Hill-koefficient er fastsat til 1 45 med den maksimale og minimale levetider fastgjort tilværdier opnået fra den positive (kolonne 1) og negative (kolonne 11) styrer hhv. De returnerede IC50-værdier for de tre kurver blev derefter: 38 nM, 24 nM og 116 nM for ICL13, ICL15 og ICL16 hhv. Til sammenligning med IC 50 værdier opnået gennem intracellulær FLIM FRET målinger, vi bestemt IC50 for hæmning af enzymaktiviteten af rekombinant humant NMT1 i vores tidligere rapporteret biokemisk enzym assay 42. De tre forbindelser, der findes at være aktive ved FLIM FRET er også de mest aktive i dette assay (IC50-værdier på 17 nM, 51 nM, og 39 nM for ICL13, ICL15 og ICL16 henholdsvis), med ICL14, som ikke viste nogen signifikant respons i FLIM FRET-assayet, er ca. 100 gange mindre aktivt mod NMT1 (IC50 på 1700 nM). For de aktive stoffer, de IC50 værdier opnået gennem disse uafhængige assay modaliteter er bemærkelsesværdigt ens, med mindre variationer sandsynligvis henføres til differences i optagelse eller metabolisme af forbindelsen i celler.
Denne lille undersøgelse fremhæver evne FLIM HCA at skelne styrken af forskellige forbindelser, der virker på samme mål af interesse. Vi mener det er den første demonstration af en skærm ved hjælp automatiseret FLIM i et højt indhold kontekst for at generere flere dosisresponskurver og illustrerer potentialet for FLIM, der skal anvendes til screening for og / eller karakterisere nyttige terapeutiske forbindelser.
Den tredje exemplar FLIM FRET eksperiment vedrører et genetisk udtryk FRET biosensor til Exchange protein aktiveres ved cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP (EPAC)), som er en Rap-1 guanin udveksling faktor, der binder specifikt til cAMP. Dette EPAC FRET biosensor (EPAC-S H188) udnytter mTurquoise2 fluorescerende protein (mTq2FP) som donorfluorophor og inkorporerer to Venus-FP at gennemføre en composite acceptor 46. cAMP er en allestedsnærværende sekundær budbringer og er involveret i en overflod af intracellulære processer gennem mange forskellige organismer. Det syntetiseres af adenylatcyklase fra omdannelsen af ATP ved cellemembranen. Her demonstrerer vi vores evne til at læse ud og kvantificere dens aktivitet i levende HEK293T celler efter tilsætning af forskolin, en adenylatcyklaseaktivitet aktivator, der opregulerer intracellulær produktion af cAMP og øger derfor sin cytoplasmatiske koncentration. Dette EPAC sensor undergår FRET i sin inaktiverede (ubundet) stat og dens donor levetid stiger med cAMP koncentration som cAMP fører til åbningen af biosensoren. Mono-eksponentielt henfald profil mTq2FP gør denne biosensor bedre egnet til kvantitativ levetid analyse end FFP-baserede biosensorer 45. Figur 8 viser et eksempel på et tidsforløb optaget ved hjælp af automatiserede flerbrøndspladen FLIM mikroskop, hvor vi har plottet ændringeni gennemsnitlig levetid og ændringen i FRETing donorpopulation fraktionen over tid efter tilsætning af 100 uM forskolin. For enkelhed, antager vi, at det samlede signal kan beskrives ved en blanding af monoeksponentiel FRETing og ikke-FRETing donorer og befolkningen brøkdel af den aktiverede EPAC FRET biosensor blev opnået ved at montere en dobbelt eksponentiel henfald profil på tværs af tidsserier.
Ved køb af cAMP (EPAC) fem gate forsinkelser data, med en gate bredde på 4000 ps, blev valgt med forsinkelsestiden indstilles til 1300 ps, 4300 ps (peak intensitet), 4919 ps, 6656 ps, 8035 ps, 1, 0391 ps og 16.000 ps. Kameraet integration for hver forsinkelse var 250 ms. På et godt, købte vi en FLIM tidsforløbet med billeder erhvervet hver 10 s løbet af 10 min. De datapunkter erhverves til tider 120 s og 130 s blev fjernet, fordi tilsætning af forskolin forårsagede en lille forskydning i det centrale position af prøven og derfore af fluorescensintensiteten registreret under opkøbene flim på disse tidspunkter.
Til dataanalyse billederne blev indlæst i FLIMfit og segmenteret per celle. Fluorescenslevetiden Dataene blev tilpasset til en dobbelt eksponentiel henfald hvortil benyttes en IRF og en fast t 0 værdi opnået fra en reference farvestof (75 uM Coumarin 6). Donorfluorescensen betyde levetid gennemsnit for alle celler er vist i figur 8 (a). Figur 8 (b) viser ændringen i FRETing population fraktion over tid beregnet ved tilpasning af samme FLIM data til den samme dobbeltstrenget eksponentiel henfald model
hvor β er FRETing donor fraktion. Vi antager en blanding af FRETing og ikke-FRETing elemeNTS til tidspunkterne før tilsætning af forskolin. For at opnå disse livstider, blev en dobbelt eksponentiel pasform anvendes på de første tre tidspunkter giver levetider af τ 1 = 3964 ± 21 ps for den ikke-FRETing donor, og τ 2 = 3022 ± 27 ps for FRETing donor. Disse blev fastsat for den efterfølgende tilpasning af hele datasættet for at opnå p-værdier på hvert tidspunkt.
Sammenfattende har vi præsenteret eksemplariske flim HCA resultater for tre eksperimentelle prøver. Den første var en 96-brønds plade klædt med Cos-celler, der udtrykker FRET konstruktioner omfattende en mTqFP donor linket til enten en Venus FP acceptor eller en ikke-fluorescerende Amber-konstruktionen ved varierende længder af peptidlinker. Ændringen i FRET effektivitet og derfor donor levetid med linkerlængde fremgår klart og standardafvigelsen af middelværdien levetid for hver konstruktion var mindre end 36 ps. Den anden exemplar ASSAy var en "skærm" af fire potentielle inhibitorer til myristoylering af HIV Gag protein, for hvilket inhibering% blev beregnet ud fra variationen af middelværdien donor fluorescenslevetid med inhibitorkoncentration målt i Hela-celler, der udtrykker gag-proteinet mærket med FFP. Denne udlæsning er baseret på homoFRET, som ikke normalt ville udgøre en ændring i donor levetid, men gør for CFP fordi dette findes i flere isomerer med forskellige fluorescerende levetid. Dette kan være nyttigt i forhold til spektral effektivitet, fx til multiplexing forskellige FRET udlæsninger 25. Den tredje exemplar assayet var et tidsforløb overvågning levende HEK293T celler, der udtrykker cAMP FRET biosensor EPAC. Dette viste den forventede respons efter behandling med forskolin og anvendelsen af FLIMfit hjælp af en dobbelt eksponentiel henfald model med antallet af fundne fotoner bliver rimeligt forhold levende celler - som vi tidligere har vist med LIBRA FRET biosensor for IP3 47.
Figur 1. Skematisk af wide-field tid-gated FLIM ved hjælp af en låge optisk billedforstærker (GOI). Venstre siden, viser en skematisk afbildning af det eksperimentelle system. Øverst til højre, skematisk excitation puls, position tid-gated billeder og monoeksponentiel fit til data. Nederst til højre, tegneserie viser fluorescens henfald fra de to objekter, der er vist i den eksperimentelle system. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Skematisk af wide-field openFLIM-HCA ved hjælp af en låge optisk billedforstærker (GOI). Se hovedteksten for mere detaljeret beskrivelse afsystemkomponenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Skematisk af optisk sektioneret openFLIM-HCA ved hjælp af en låge optisk billedforstærker (GOI) med en Nipkow disc scannerenheden. Se hovedteksten for mere detaljeret beskrivelse af systemkomponenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Skematisk af billeddata flow fra overtagelsen manager program til Omero server eller computer disk og ind FLIMfit til analyse. Datastrømmen starter i top l eft hjørne, hvor rå billeddata er erhvervet i μ-manager erhvervelse software. De elementer inde i stiplede boks repræsenterer stadier af analyse Flim data, mens dem uden svarer til erhvervelse og lagring af data. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Skærmbillede af FLIMfit brugergrænseflade. Øverst til venstre, liste over synsfelter aktuelt indlæste og fluorescensintensitet billedet af det aktuelt valgte synsfelt. Nederst til venstre, udvælgelse af montering model og montering betingelser. Øverst til højre, fluorescens henfald til aktuelle område af interesse (blå cirkler), fit til data (rød linje), IRF (rød stiplet linie) med fit residualer nedenfor (blå linje).g5large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. flerbrøndsplade FLIM af FRET model konstruktionerne mTq5V, mTq17V, mTq32V udtrykt i COS-celler. (A) eksemplariske fluorescenslevetid billeder af FOV i hver brønd for forskellige FRET konstruktioner udtrykt i COS-celler som beskrevet i teksten. (B) opvarmes kort over gennemsnitlige Venus fluorescenslevetider gennemsnit for alle celler i hver brønd. (C) intensitet billede af mTurquoise Amber overlejret med levetid kort (målestok bar 20 pm). (D) intensitet billede af mTurquoise Venus (17 aminosyre) overlejret med levetid kort (målestok bar 20 pm). (E) målt intensitet henfald profil (blå cirkler) i mTq5A konstruere (negativ kontrol) fluorescens gennemsnit over alle celler afbildet i hul A1, sammen med tilpasning af dataene til en monoeksponentiel henfald (blå optrukket linje) og IRF (stiplet orange linje). (F) graf over gennemsnitlige levetid i gennemsnit over hver kolonne tværs flerbrøndspladen, med fejlsøjler viser standardafvigelsen i fluorescens levetid mellem synsfelter. For (ad) levetid værdier er repræsenteret ved hjælp af en falsk farveskala med de angivne grænser i picosekunder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Exemplar flerbrøndspladen FLIM skærm af Gag inhibitorer under anvendelse HeLa-celler, der udtrykker Gag-CFP. (A) Heat kort over gennemsnitlig donor fluorescens levetid pr godt for flerbrøndspladen klædt med kolonne 1 præsenterende celler transficeret med myr-Gag-fælles fiskeripolitik som en positiv e kontrol for inhibering, spalte 11 præsenterende celler transficeret med Gag-CFP eksponeret for kun vehikel, og de stiplede farvede firkanter angiver de brønde, der blev doseret med en af de fire forskellige inhibitorer med koncentrationer i området fra høj dosis kolonne 2 til kolonne 10 lavdosis . den falske farveskala repræsenterer den gennemsnitlige fluorescens levetid spænder fra 2200 ps til 3100 ps. (B) plotter fluorescens levetid for hver inhibitor med fejlsøjler viser standardafvigelsen mellem gentagne brønde. Punkter i sort ved 2 og -4 på den vandrette akse er de positive og negative kontrolpunkter henholdsvis opnået fra kolonne 1 og 11 hhv. De fuldt optrukne linjer angiver et anfald til kurven data for de forskellige inhibitorer dosisrespons. Klik her for at se en større version af dette tal.
gur 8 "src =" / files / ftp_upload / 55119 / 55119fig8.jpg "/>
Figur 8. Exemplar brug af FLIM at læse ud af EPAC FRET biosensor i en tid-lapse måling med HEK293T celler. Ændring i (a) betyder fluorescenslevetid og (b) del af FRETing donor som en funktion af tiden efter tilsætning af forskolin angivet af den grønne bar. Fejlsøjlerne viser standardfejlen per celle. Klik her for at se en større version af dette tal.
| pr Well | STD | ERR | pr Well | STD | ERR | |||
| mT5A | 4008 | 32 | 12 | MT17V | 3004 | 26 | 10 | |
| mT5V | 2717 | 35 | 13 | mT32V | 3133 | 30 | 11 |
Tabel 1. Mean levetid og standardafvigelse (STD) af FRET konstruktioner.
Discussion
Vi har beskrevet en automatiseret flerbrøndspladen mikroskop designet til HCA hjælp tid-gated FLIM. Dette instrument er kontrolleret ved hjælp af open source-software skrevet i μManager med mulighed for at gemme data til en Omero server og analysen flim data, der udføres ved hjælp af FLIMfit 36, et open source program skrevet i MatLab og fås som Omero klient 32 μManager instrument kontrol software, openFLIM-HCA, er tilgængelig online 33 med en liste over de systemkomponenter 48 for at muliggøre akademiske forskere til at konstruere deres egne FLIM HCA instrumenter.
For at erhverve robuste Flim data, er det nødvendigt at optimere den indiske regering og CCD erhvervelse og at tage hensyn til eventuelle variationer i t 0. Som beskrevet i 3.8.2, bør GOI forstærkningsindstilling og CCD kamera integrationstiden indstilles til at nå ~ 75% af CCD dynamikområde. Usynge højere GOI spændinger og flere CCD frame ophobninger på hvert tidspunkt portforsinkelse øger signal-støjforholdet 49, men dette øger den samlede erhvervelse FLIM tid (da færre fluorescensfotoner erhverves pr frame før CCD-kameraet mættede fedtsyrer og så antallet af frame ophobninger bør øges) og så denne afvejning bør besluttes for hvert forsøg. Kalibreringen af forsinkelsesgeneratoren afhænger laseren repetitionshastighed og det er derfor nødvendigt at sikre, at den korrekte kalibrering filen for gentagelseshastighed anvendes indlæses i købet software. Proceduren for kalibrering af forsinkelsen boksen kan findes på openFLIM-HCA wiki 33.
Hvis det cellulære autofluorescens er lav sammenlignet med fluorescenssignalet, bruger vi signalet fra en brønd indeholdende lige dyrkningsmedium til tilvejebringelse af tidsvarierende baggrund (TVB). For at minimere baggrundsfluorescens fra celledyrkningsmediet, undgår vimedier indeholdende phenolrødt. Hvis det cellulære autofluorescens er betydelig, så TVB kan afledes af målinger af umærkede celler. Men i dette tilfælde skal man være omhyggelig, da dette forudsætter, at autofluorescens baggrund er den samme for hver pixel i billedet. Denne antagelse er ikke gyldig, hvis autofluorescens varierer betydeligt på tværs af en celle, eller hvis excitation strålen eller afsløring følsomhed er ikke ensartet over synsfeltet.
Erhvervelsen af et IRF billede ved hjælp spredte excitation lysimpulser giver den tidsmæssige IRF profil, der er foldet med datamodellen i tilpasningsprocessen og tilvejebringer også et kort over den rumlige variation af IRF tværs af synsfeltet. IRF kan måles ved at afbilde en spredning prøve, såsom en kolloid suspension, selv efter vores instrument, ved anvendelse af excitation spredte lys fra Nipkow disk giver en renere måling af IRF. Nøjagtig bestemmelse af timingen of IRF er vigtig, fordi fejl i tidsforsinkelse mellem excitation og tidslig udelukkelse væsentligt kan påvirke tilpasningsprocessen, især når montering på komplekse eksponentielle henfald modeller. IRF erhvervet ved hjælp af spredt excitationslys er ikke præcis, hvad der er nødvendigt for tilpasningsprocessen, fordi den er optaget på excitationsbølgelængden snarere end ved fluorescens emission bølgelængde, som kan påvirke dens timing, selvom den rumlige variation af IRF bør være den samme ved begge bølgelængder. Desuden kan det spredte IRF være globalt forskudt i tid i forhold til den sande IRF grundet en forskellig optisk vejlængde fra spredningen objekt, som det er tilfældet for en IRF erhvervet fra Nipkow disk i optisk snit FLIM. Denne korrektion, t 0, hvilket er det påkrævede globale tidsmæssige skift, der skal anvendes til den erhvervede spredt excitationslyset IRF, beregnes ud fra de monoeksponentiel henvisning farvestof data som angivet i Protocol trin 4.4. Følgende farvestoffer kan anvendes til forskellige excitationsbølgelængder: en 75 uM Coumarin 153-opløsning i methanol (τ ~ 4,3 ns 50) kan anvendes til excitation i området fra 295 til 442 nm; en 75 uM Coumarin 6 opløsning i ethanol (T ~ 2,43 ns 37) kan anvendes til excitation i området fra 430 til 500 nm; og en 75 uM Rhodamin B-opløsning i vand (τ ~ 1,7 ns 37) kan anvendes til excitation i området fra 488 til 575 nm. Vi bemærker, at selv om det er muligt i FLIMfit at bruge en anden IRF for hver pixel af systemet, normalt er det rimeligt at gøre den antagelse, at det rumligt varierende IRF har samme tidsmæssige profil for hver pixel i billedet, men præsenterer en række af rumligt varierende tidsmæssige forskydninger i forhold til den globale t 0. Vi beskriver dette som IRF shift kort, som bestemmes fra det spredte lys IRF. Sammen er IRF profil, t 0 og IRF skift kortet bruges til ensikre, at hver pixel i FOV er udstyret med en passende IRF. Vigtigt er det, kan t 0 variere langsomt over tid, så det bør måles før enhver erhvervelse FLIM data.
Brugeren skal beslutte, hvordan at prøve de fluorescens henfald profiler og er forpligtet til at indstille bredden af den tid, porte og deres relative forsinkelser efter excitation. I almindelighed er det ønskeligt at anvende Broadgate bredder for at maksimere det detekterede signal og typisk bruger vi gate bredder sat til 4 ns for FLIM af celler mærket med fluorescens-proteiner. Antallet af tid-gate forsinkelser bør være tilstrækkelig til at prøve den fluorescerende henfald profil (herunder en gate indstilles til at måle signalet lige før excitationspulsen) i betragtning af kompleksiteten af fitting model, der vil blive anvendt i analysen. Den optimale værdi kan afhænge af de levetider og relative amplituder af henfaldet komponenter. Generelt 4 porte er tilstrækkelige til montering monoeksponentiel henfalder mens 7 eller flere porte kanbruges til mere komplekse henfald modeller.
Vi bemærker, at FLIM kan implementeres ved hjælp af en vifte af tid-domæne eller frekvens domæne teknikker og automatiseret FLIM HCA af flerbrøndspladen arrays blev først implementeret i en (ikke-sektionering) wide-field mikroskopet med frekvensdomænet levetid udlæsninger af FRET 51. Den første automatiserede optiske sektionering FLIM flerbrøndspladen læser til HCA udnytte bredt felt tid-gated billeddannelse 28 blev derefter rapporteret. Efterfølgende blev wide-field (ikke-sektionering) frekvensdomænet FLIM HCA ansøgt til at screene for post-translationelle modifikationer (tyrosinphosphoryleringssteder) på tværs et gen bibliotek ved hjælp FRET 52 og tid-gated FLIM HCA er blevet anvendt til at ærgre analyser af HIV-1 Gag oligomerisering 53 og af SUMOylation af FOXM1 54, Raichu RhoA og Rac1 biosensorer 33. Det er også muligt at anvende TCSPC for flerbrøndspladen FLIM 26, men til dato har det vist sig svært at matche than gennemløb af teknikker udnytter afsløring bredt felt. Et spirende strategi, der kunne løse dette problem er brugen af arrays af enkelt foton optælling detektorer såsom SPAD arrays 55.
Vi bemærker, at eventuelle udlæsninger af FRET ved hjælp af fluorescerende proteiner skal behandles med forsigtighed, og at de absolutte værdier af parametre opnået fra FLIMfit eller anden FLIM analyse software vil afhænge af antagelserne vedrørende montering model. For eksempel hvor FRET donor har en væsentlig anden henfald komponent, kan anvendelsen af en bieksponentiel model til at passe til FRET Flim data resultere i bidraget fra den hurtigere henfald komponent, typisk forbundet med FRETing befolkning optræder højere end det burde. Det er derfor ønskeligt at anvende donorer med en mono-eksponentiel levetid såsom mTq2FP. Selv da, har nylige undersøgelser vist, at FRET-analyse stadig kan påvirkes af mørke tilstande af acceptor fluorescens proteiner eller vedheterogenitet af orienteringen faktor κ 2 på grund af en fordeling af fluoroforen konformationer med en bred vifte af chromoforgrupper vinkler og afstande 56. Ikke desto mindre har vi og andre vist, at fluorescenslevetid udlæsninger af FRET do producere nyttige resultater, der korrelerer med biokemiske målinger og kan anvendes til at screene for protein-interaktioner eller følge dynamikken i biosensorer. Således denne openFLIM HCA platformen kan anvendes til en bred vifte af fluorescenslevetid assays anvender FRET eller cellulær autofluorescens 8, samt tilvejebringer kvantitative udlæsninger af farvestofbaserede prober 25.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microscope frame | Olympus | IX81 | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
| optical autofocus | Olympus | ZDC | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
| motorized (x-y-z) microscope stage | Marzhauser | 00-24-565-0000 | Stage with Corvus controlle |
| excitation laser source | Fianium | SC400-4 | Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/ |
| gated optical intensifier | Kentech | High Rate Imager (HRI) | |
| delay generators | Kentech | --- | See agile delay generator and precision delay generator |
| camera | Hamamatsu | ORCA-ER-II | |
| Nipkow disc scanner unit | Yokogawa | CSU-X1 | http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/ |
| Top hat diffuser | Thorlabs | ED1-S20-MD | Engineered diffusers |
| mTq5V | Oxford Genetics | P3850 | mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker |
| mTq17V | Oxford Genetics | P3847 | mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker |
| mTq32V | Oxford Genetics | P3848 | mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker |
| mTq5A | Oxford Genetics | P3849 | mTurquoise Amber construct |
| HEK293T | --- | --- | cell type used |
| phenol red-free HBSS | Sigma Aldrich | 55021C-1000ML | imaging media |
| culture media | DMEM + 10% FBS + 0.5% Antibiotics | ||
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046-500ML | for culture media |
| FBS | Sigma Aldrich | 12003C-500ML | for culture media |
| xTremeGene9 | Sigma Aldrich | 6.37E+09 | for transfection, follow online protocol from La Roche |
| trypsin/EDTA Solution | Thermo Fischer | R001100 | for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer |
References
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
- Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
- Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton microscopy of nadh and fad redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia. PNAS. 104 (5), 19494-19499 (2007).
- Datta, R., Alfonso-Garcıa, A., Cinco, R., Gratton, E. Fluorescence lifetime imaging of endogenous biomarker of oxidative stress. Sci Rep. 5, 9848 (2015).
- König, K., Uchugonova, A., Gorjup, E. Multiphoton fluorescence lifetime imaging of 3d-stem cell spheroids during differentiation. Microsc. Res. Tech. 74 (1), 9-17 (2011).
- Wright, B. K., et al. Nadh distribution in live progenitor stem cells by phasor-fluorescence lifetime image microscopy. Biophys. J. 103 (1), 7-9 (2012).
- Fite, B. Z., et al. Noninvasive Multimodal Evaluation of Bioengineered Cartilage Constructs Combining Time-Resolved Fluorescence and Ultrasound Imaging. Tissue Eng Part C Methods. 17 (4), (2011).
- Kelly, D. J., et al. An automated multiwell plate reading FLIM microscope for live cell autofluorescence lifetime assays. J. Innov. Opt. Health Sci. 7 (5), 1-15 (2014).
- Owen, D. M., et al. Fluorescence lifetime imaging provides enhanced contrast when imaging the phase-sensitive dye di-4-ANEPPDHQ in model membranes and live cells. Biophys. J. 90 (11), 80-82 (2006).
- Suhling, K., et al. Imaging the environment of green fluorescent protein. Biophys. J. 83 (6), 3589-3595 (2002).
- Nezu, A., Tanimura, A., Morita, T., Shitara, A., Tojyo, Y. A novel fluorescent method employing the FRET-based biosensor "LIBRA" for the identification of ligands of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptors. BBA-Gen Subjects. 1760 (8), 1274-1280 (2006).
- Nishioka, T., et al. Rapid Turnover Rate of Phosphoinositides at the Front of Migrating MDCK Cells. Mol. Biol. Cell. 19 (10), 4213-4223 (2008).
- Stockholm, D., et al. Imaging Calpain ProteaseActivity by Multiphoton FRET in Living Mice. J. Mol. Biol. 346 (1), 215-222 (2005).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), http://www.nature.com/nature/journal/v388/n6645/full/388882a0.html 882-887 (1997).
- Mank, M., et al. FRET-Based Calcium Biosensor with Fast Signal Kinetics and High Fluorescence Change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Ueyama, H., Takagi, M., Takenaka, S. A novel potassium sensing in aqueous media by synthetic oligonucleotide derivative. Fluorescence resonance energy transfer associated with guanine quartet-potassium ion complex formation. J. Am. Chem. Soc. 124 (48), 14286-14287 (2002).
- Kuner, T., Augustine, G. J. A Genetically Encoded Ratiometric Indicator for Chloride: Capturing Chloride Transients in Cultured Hippocampal Neurons. Neuron. 27 (3), 447-459 (2000).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (5), 409-416 (2006).
- Gadella, T. W. J. Editor, FRET and FLIM Techniques, Volume 33. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. , Elsevier. http://www.sciencedirect.com/science/bookseries/00757535 (2009).
- Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr. Opin. Biotech. 19 (4), 338-343 (2008).
- Aoki, K., Kiyokawa, E., Nakamura, T., Matsuda, M. Visualization of growth signal transduction cascades in living cells with genetically encoded probes based on Förster resonance energy. Phil. Trans. R. Soc. B. 363 (1500), 2143-2151 (2008).
- Welch, C. M., Elliott, H., Danuser, G., Hahn, K. M. Imaging the coordination of multiple signalling activities in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (11), 749-756 (2011).
- Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Sci. Signal. 2006 (331), 2 (2006).
- Hoppe, A., Christensen, K., Swanson, J. A. Fluorescence resonance energy transfer-based stoichiometry in living cells. Biophys. J. 83 (6), 3652-3664 (2002).
- Kumar, S., et al. FLIM FRET technology for drug discovery: automated multiwell plate high content analysis, multiplexed readouts and application in situ. ChemPhysChem. 12 (3), 627-633 (2011).
- Barber, P. R., et al. The Gray Institute "open" high-content, fluorescence lifetime microscopes. J. Microsc. 251 (2), 154-167 (2013).
- Matthews, D. R., et al. A high-content screening platform utilizing polarization anisotropy and FLIM microscopy. Proc. of SPIE. 6859, 1-12 (2008).
- Matthews, D. R., et al. A Multi-Functional Imaging Approach to High-Content Protein Interaction Screening. PLOS ONE. 7 (4), e33231 (2012).
- Talbot, C. B., et al. High speed unsupervised fluorescence lifetime imaging confocal multiwell plate reader for high content analysis. J. Biophotonics. 1 (6), 514-521 (2008).
- Grant, D., et al. High speed optically sectioned fluorescence lifetime imaging permits study of live cell signaling events. Opt. Express. 15 (24), 15656-15673 (2007).
- Warren, S. C. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PLOS ONE. 8 (8), e70687 (2013).
- OpenMicroscopy.org. , Available from: http://www.openmicroscopy.org/site/products/omero (2016).
- Github.com. , Available from: https://github.com/imperial-photonics/openFLIM-HCA/wiki (2016).
- Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using μManager software. J. of Biol. Methods. 1 (2), 11 (2014).
- Pelet, S., Previte, M., Laiho, L., So, P. A fast global fitting algorithm for fluorescence lifetime imaging microscopy based on image segmentation. Biophys J. 87 (4), 2807-2817 (2004).
- FLIMFit webpage. , Available from: http://www.flimfit.org (2016).
- Kristoffersen, A. S., Erga, S. R., Hamre, B., Frette, Ø Testing Fluorescence Lifetime Standards using Two-Photon Excitation and Time-Domain Instrumentation: Rhodamine B, Coumarin 6 and Lucifer Yellow. J. Fluoresc. 24 (4), 1015-1024 (2014).
- Koushik, S. V., Chen, H., Thaler, C., Puhl, H. L., Vogel, S. S. Cerulean, Venus, and VenusY67C FRET Reference Standards. Biophys. J. 91 (12), 99-101 (2006).
- Ono, A. HIV-1 assembly at the plasma membrane: Gag trafficking and localization. Future Virol. 4 (3), 241-257 (2009).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat. Biotechnol. 22, 445-449 (2004).
- Koushik, S. V., Vogel, S. S. Energy migration alters the fluorescence lifetime of Cerulean: implications for fluorescence lifetime imaging Forster resonance energy transfer measurements. J. Biomed. Opt. 13 (3), 031204 (2008).
- Goncalves, V., et al. A fluorescence-based assay for N-myristoyltransferase activity. Anal. Biochem. 421 (1), 342-344 (2012).
- Lindwasser, O. W., Resh, M. D. Myristoylation as a target for inhibiting HIV assembly: Unsaturated fatty acids block viral budding. PNAS. 99 (20), 13037-13042 (2002).
- Iversen, P. W., Eastwood, B. J., Sittampalma, G. S., Cox, K. L. A Comparison of Assay Performance Measures in Screening Assays: Signal Window, Z'Factor, and Assay Variability Ratio. J Biomol Screen. 11 (3), (2013).
- Alibhai, D. Fluorescence lifetime imaging applied to multiwell plate FRET assays for high content analysis. , Imperial College London. PhD thesis, https://spiral.imperial.ac.uk:8443/handle/10044/1/26843 (2013).
- Klarenbeek, J., Goedhart, J., van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-Generation Epac-Based FRET Sensors for cAMP Feature Exceptional Brightness, Photostability and Dynamic Range: Characterization of Dedicated Sensors for FLIM, for Ratiometry and with High Affinity. PLOS ONE. 10 (4), 0122513 (2015).
- Martins, M., et al. Activity of phospholipase C epsilon contributes to chemotaxis of fibroblasts towards platelet-derived growth factor. J. Cell Sci. 125, 5758-5769 (2012).
- Github.com. , Available from: https://github.com/imperial-photonics/openFLIM-HCA/wiki/2-Hardware-reference (2016).
- McGinty, J., et al. Signal-to-noise characterization of time-gated intensifiers used for wide-field time-domain FLIM. J. Phys. D: Appl. Phys. 42, 135103 (2009).
- Boens, N., et al. Fluorescence Lifetime Standards for Time and Frequency Domain Fluorescence Spectroscopy. ACS. 79 (5), 2137-2149 (2007).
- Esposito, A., Dohm, C. P., Bähr, M., Wouters, F. S. Unsupervised Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy for High Content and High Throughput Screening. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1446-1454 (2007).
- Grecco, H. E., et al. In situ analysis of tyrosine phosphorylation networks by FLIM on cell arrays. Nat Meth. 7 (6), 467-472 (2007).
- Alibhai, D., et al. Automated fluorescence lifetime imaging plate reader and its application to Förster resonant energy transfer readout of Gag protein aggregation. J. Biophotonics. 6 (5), 398-408 (2012).
- Kelly, D. J., et al. Automated multiwell fluorescence lifetime imaging for Főrster resonance energy transfer assays and high content analysis. Anal. Methods. 7 (10), 4071-4089 (2015).
- Poland, S. P., et al. A high speed multifocal multiphoton fluorescence lifetime imaging microscope for live-cell FRET imaging. Biomed. Opt. Exp. 6 (2), 277-296 (2015).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., Van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLOS ONE. 8 (1), e49593 (2012).
