Vi præsenterer et open source højt indhold analyse (HCA) instrument udnytter automatiseret fluorescens levetid imaging (FLIM) til analyse protein interaktioner ved hjælp Förster resonans (FRET) baserede udlæsninger. Erhvervelse Data til denne openFLIM-HCA instrument styres af software skrevet i μManager og foretages analyse af data i FLIMfit.
We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in µManager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.
Den stigende brug af automatiserede højt indholdsanalyse (HCA) i lægemiddelforskning 1 til assay sammensatte biblioteker er suppleret med udviklingen i life science grundforskning mod automatiserede billeddannelse eksperimenter for systematiske undersøgelser, fx, for fænotypiske skærme siRNA biblioteker. Automatiseret HCA bliver også mere og mere vigtigt for mindre målestok biologiske undersøgelser, der typisk blevet gennemført med manuelle eksperimenter med snesevis af retter af celler afbildet med konventionelle mikroskoper. Den statistiske beføjelser, evnen til at analysere og analysere hundredvis til tusindvis af synsfelter muliggør gennemsnit af eksperimentel støj (herunder "biologisk støj") og automatisering af køb og analyse af store prøve arrays billeddata kan hjælpe med at fjerne operatør bias og ofte kan anvendes til at detektere forekomsten af systematiske fejl, såsom en ændring i IRF profil under en overtagelse. Fluorescens assayser blevet implementeret i HCA, med de fleste kommercielt tilgængelige HCA instrumentering featuring fluorescensintensitet billeddannelse i en eller flere spektralkomponenter kanaler til at kortlægge relative fordeling og co-lokalisering af mærkede proteiner. Mere avancerede fluorescens imaging modaliteter, såsom fluorescens levetid imaging (FLIM), polarisering anisotropi billedbehandling og tidsopløst fluorescens anisotropi billedbehandling, er ikke bredt udnyttes i kommercielle HCA instrumenter, selv om de tilbyder stærke kvantitative udlæsninger, fx af protein interaktioner. Her præsenterer vi en open source tilgang til gennemførelsen FLIM i en automatiseret mikroskop for HCA.
Fluorescenslevetid tilvejebringer en ifølge sagens natur ratiometrisk spektroskopiske udlæsning, der kan bruges til at skelne mellem forskellige molekylære art eller til at probe det lokale molekylære miljø af en fluorofor og er ufølsom over for fluorofor koncentration til excitation / detektionseffetiviteter, og at virkningen af scattering og prøve absorption 2. Da fluorescenslevetid målinger kan udføres i en enkelt spektral kanal, de er direkte sammenlignelige mellem forskellige instrumenter og prøver uden kalibrering. De kan anvendes til endogene fluoroforer, herunder nogle cellulære metabolitter, lipider og ekstracellulære matrixbestanddele, for at give iboende udlæsninger af biologiske processer og patologier. Label-fri FLIM kan således kortlægge metaboliske ændringer i cellerne 3,4 og er blevet anvendt til at overvåge stamcelledifferentiering 5,6 og væksten i kollagen stilladser 7. Vi har for nylig vist, at FLIM HCA kan anvendes til automatiserede label-free assays af cellulær metabolisme udnytte autofluorescens 8. Mere almindeligt er imidlertid fluorescenslevetid målinger og FLIM anvendes på eksogene fluoroforer, som mærker specifikke biomolekyler, ofte implementeret ved anvendelse af farvestoffer, der farves cellulære rum, ved hjælp af farvestoffer koblet til antibodies, der er målrettet specifikke proteiner i faste celler, eller ved hjælp af genetisk udtrykte fluoroforer koblet til specifikke proteiner. Fluorescenslevetid kan anvendes til at tilvejebringe robuste kvantitative udlæsninger af fluorescerende prober sensing deres fysiske eller kemiske miljø. For eksempler, er farvestoffer blevet indsat for at fornemme den lokale lipidfase af cellemembraner 9 eller celle viskositet 10 og genetisk udtrykte fluorescerende protein-baserede biosensorer er blevet udviklet til at rapportere koncentrationer af celle signalmolekyler herunder som IP3 11, PIP2 12 og calpain 13 eller såsom calcium 14,15, kalium 16 og klorid 17.
Mange sådanne biosensorer anvender Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 18,19 for at tilvejebringe udlæsninger af ændringer i biosensoren konformation. FRET mellem "donor" og "acceptor" fluoroforer sker via en kort rækkevidde direkte dipol-dipol interaktionfor hvilke fluoroforer er typisk adskilt af mindre end ~ 10 nm. Påvisning af FRET angiver således den tætte nærhed af passende mærkede proteiner og dermed giver mulighed for at udlæse protein-protein interaktioner 20, såsom binding eller oligomerisering – enten som slutpunkter i faste celler eller som dynamiske begivenheder i tidsforløbet målinger af levende celler. Ved at mærke en passende molekylær konstruktion med både donor og acceptor-fluoroforer, er det også muligt at udlæse konformationsændringer – eller spaltning – af konstruktionen på grundlag af ændringen i FRET, og dette er grundlaget for mange biosensorer 21. Målinger af FRET effektivitet kan give oplysninger om donor-acceptor afstand og befolkningen brøkdel af donor fluoroforer undergår FRET. Således kan FRET-baserede billeddiagnostiske teknikker bruges til at kortlægge og kvantificere molekylære interaktioner i tid og rum, f.eks at belyse cellesignalering processer 22. Automating sådanne billeddiagnostiske teknikker kan give høje gennemløb analyser baseret på udlæsninger af signalveje eller netværk.
I HCA, FRET udlæsning mest almindeligt gennemføres, er spektrale ratiometrisk billeddannelse, hvor ændringer i forholdet mellem acceptoren til donorens intensitet er kortlagt. Mens denne fremgangsmåde er let gennemføres – og fås i mange kommercielt tilgængelige flerbrøndspladen læsere – kvantitative spektralt opløste FRET målinger kræver kalibrering af det spektrale respons af systemet 23. Dette omfatter spektrale krydstale som følge af spektral gennemblødning og direkte excitation af acceptoren samt transmissions- instrumentets egenskaber og prøven (indre filter effekt). I princippet indebærer måling af yderligere "kontrol" prøver, der er mærket med enten donor-only eller acceptor-only.
Fra sådanne spektrale ratiometriske FRET målinger, har en effektiv FRETkan opnås effektivitet (produktet af den faktiske FRET effektivitet og brøkdel af FRETing donor / acceptor-molekyler) sammen med den relative andel af donor- og acceptormolekylerne 24. Spectral ratiometrisk FRET bruges ofte med unimolekylær FRET biosensorer, hvor der kan antages donor / acceptor støkiometri at være kendt. For at bestemme de befolkningsgrupper fraktioner af FRETing donor og acceptor, fx til opnåelse af en dosisresponskurve, er kendskab til den faktiske FRET effektivitet kræves. Dette kan opnås ved at måle en positiv FRET kontrolprøve med kendte egenskaber eller ved hjælp af en anden metode til at måle FRET effektivitet, såsom acceptor fotoblegning eller FLIM.
Brug fluorescens levetid aflæsning, kan påvises og kvantificeres ved målinger af donor emission alene FRET – fjerner behovet for spektrale kalibrering og yderligere kontrolprøver. Således kan FLIM FRET udlæsninger sammenlignes mellem instrumenterneog mellem forskellige prøver – tillader data fra endoskopi eller tomografi af levende sygdomsmodeller 25 skal benchmarkes mod målinger af cellebaserede assays. Ved at montere donor fluorescens henfald profiler til et passende multi-eksponentielt henfald model svarende til FRETing og ikke-FRETing donor befolkninger, FRET kan i princippet opnås effektivitet og befolkningsgrupper fraktioner direkte uden yderligere målinger. Disse betydelige fordele, men på bekostning af FLIM kræver mere detekterede fotoner per pixel end spektralt løst intensitet imaging – typisk hundredvis af fotoner er nødvendige for at opnå en nøjagtighed på livstid bestemmelsen af 10%, når montering på en enkelt eksponentielt henfald model, og når montering fluorescens henfald profiler til komplekse (tokompartment henfald) modeller, antallet af detekterede fotoner krævede stiger til tusinder. Dette har traditionelt ført til lange erhvervelsestider (ti til hundrede sekunder pr området VIew) for FLIM, især når du bruger tid korreleret enkelt foton tælling (TCSPC) implementeret med sekventiel pixel opkøb i laser scanning mikroskoper. Forsøg på at forøge det billeddannende hastighed ved anvendelse af højere excitations- intensiteter kan føre til betydelig fotoblegning og / eller fototoksicitet. Sammen med en mangel på egnede kommercielt tilgængelige instrumentering og software-værktøjer, har dette hindret FLIM fra at blive udnyttet i HCA for lægemiddelforskning eller systembiologi, hvor hundreder til tusinder af synsfelter skal afbildes. Laserscanning TCSPC FLIM blevet implementeret i en automatiseret flerbrøndspladen mikroskop 26 for sekundære målinger efter identifikation af "hits" ved steady-state polarisering-løst fluorescens anisotropi billedbehandling 27, som kan nå lignende imaging hastigheder til spektral ratiometrisk billeddannelse 28, som det deler mange fordele og ulemper. Fluorescensanisotropi billeddannelse udnytter faldeti fluorescensanisotropi af acceptoren i nærværelse af FRET og er også følsomme over for spektral krydstale (f.eks direkte excitation af acceptoren). Det kræver kalibrering for at tage højde for polarisering cross talk og giver ikke en direkte måling af FRET effektivitet.
For at realisere fordelene ved FLIM for HCA, har vi arbejdet på at løse problemer med hastigheden på erhvervelse billede og bredere adgang til teknologien. Her giver vi en komplet liste over open source software og hardware-komponenter, som kan udnyttes til at gennemføre den automatiserede hurtig FLIM flerbrøndspladen læser, der er beskrevet nedenfor, sammen med exemplar FRET baseret-analyser. I vores tilgang 29, er FLIM realiseres ved hjælp af bred-field tid-gated billeddannelse ved hjælp af en låge optisk billedforstærker (GOI), som er illustreret i figur 1, der kan give hurtigere billedbehandling og lavere fotoblegning end single-beam scanning TCSPC grund af parallel pixel INTERRogation. Vores openFLIM-HCA instrument kan give uovervåget FLIM, kræver kun et par sekunder til at erhverve flim data afsløre et par 100 fotoner per pixel (afhængigt af lysstyrken i prøve). Kombineret med den tid, der kræves for at flytte prøven fra tidligere synsfelt, at justere erhvervelse og opretholde prøven i fokus, resulterer typisk i flere brønde erhvervelse plade tider med ~ 10 s pr synsfeltet 25,28. Optisk sektionering kan implementeres ved hjælp af en kvasi-wide-field Nipkow ( "spinning disc") scanner 30.
For FLIM dataanalyse, har vi udviklet et open source software-værktøj kaldet FLIMfit 31, der er i stand til hurtigt at analysere flerbrøndspladen flim datasæt på konventionelle pc-arbejdspladser og er en plug-in til Omero 32. FLIMfit giver globale analysemuligheder (omtalt i afsnit 1.2), der gør det muligt flim data, der skal monteres på komplekse modeller med oNLY et par 100 fotoner per pixel under den antagelse, at fluorescens levetid komponenter er invariant over et billede eller region renter (ROI), derfor reducere antallet af detekterede fotoner påkrævet, lyset eksponering til prøven og billede erhvervelse tid. Løb FLIMfit på en standard desktop-pc, kræver kun 10s af sekunder af beregningsmæssige tid til at analysere datasæt omfatter hundredvis af FOVs. Således kan foretages både FLIM indsamling og analyse af data om tidsplaner, der er praktiske for HCA.
openFLIM-HCA hardware
Vores implementering af FLIM HCA omfatter seks vigtige komponenter: (i) et fluorescensmikroskop ramme med optisk autofokus; (Ii) en motoriseret (xyz) mikroskop fase; (Iii) en excitation laserkilde; (IV) en bred-felt tid-gated FLIM systemet med gated optisk forstærker (GOI), forsinkelse generator og kamera; (V) en computer til erhvervelse og dataanalyse og (vi) en Nipkow disk scannerenhed for optisk sektioneret imaging at undertrykke ude af fokus lys. Dette kan være vigtigt, når billeddannelse svage signaler, fx fra FRET biosensorer på cellens plasmamembran, som kunne blive oversvømmet med bidrag fra cytoplasmatisk fluorescens eller baggrund fra dækglas eller dyrkningsmediet. Time-gated FLIM data er erhvervet ved at belyse prøven med ultrakort pulserende excitation stråling billeddannelse fluorescensemissionen til fotokatoden af den indiske regering og erhverve en række CCD billeder af fosfor af den indiske regering for en række indstillinger for tidsforsinkelse af den optiske forstærker gate efter ankomsten af ekscitationsimpulserne. Da den tid portforsinkelse efter excitation forøges, fluorescenssignalet ses at falde, og den række af tid-gated fluorescensintensitet billeder optaget på CCD danne datasæt kræves for at analysere henfald profiler af alle fluoroforer i synsfeltet . Den gating af den indiske regering er synkroniseret til ekscitationsimpulserneog, for serien af CCD erhvervelser, forsinkelsen af tiden gate forhold til ekscitationsimpulserne er indstillet til en serie af stigende værdier over det ønskede område. Denne synkronisering opnås ved anvendelse forsinkelsen generator, der omfatter "fast forsinkelse box" (leverer forsinkelser på op til 20 ns i 1 ps trin) og et "grov forsinkelse box", der giver forsinkelser med et minimum trin med 25 ps.
For FLIM, kan excitation tilvejebringes ved enhver ultrahurtig laser. For nemheds skyld, vi anvender typisk en fiber-laser-pumpet superkontinuum kilde, der giver picosekund pulser afstemmelig over det synlige spektrum, hvorfra den passende excitationsstråling kan vælges til enhver fluorophor under anvendelse af en motoriseret filterhjul med forskellige båndpasfiltre. Typisk bruger vi en gennemsnitlig effekt på ~ 100-200 pW på prøven med pulser ved 40 eller 60 MHz gentagelse sats. Sådanne excitation beføjelser kunne også ydes af ultrahurtige laser kilder er baseret på frekvens fordobling aftilstand-låst titanium doteret safir lasere. Bemærk, at en magnetisering impulsvarighed under ~ 100 ps er tilstrækkelig for de fleste eksperimenter. En anden motoriseret filterhjul udstyret med neutralfiltre bruges til at regulere excitationsintensitet. Af sikkerhedsmæssige og praktiske, kan excitationsstrålingen leveres via en optisk single-mode fiber. De konfigurationer for bredt felt FLIM og optisk sektioneret FLIM præsenteres i figur 2 og 3 henholdsvis. For flere oplysninger om de præcise komponenter, der anvendes, kan du besøge openFLIM-HCA wiki 33. En kopi af den aktuelle liste dele findes i den supplerende materiale.
For wide-field FLIM er excitation stråling der kræves for at belyse hele synsfeltet så ensartet som muligt. Til dette har vi direkte excitation laserstråle til en holografisk "top-hat" diffusor, der roteres ved 10-50 Hz til anden-gennemsnittet laser speckle, med planet af diffikseringsenheden der afbildes til bagsiden brændplanet af den objektive mikroskop linse. Den fluorescens billede fra output port af mikroskopet videresendes på fotokatoden af den indiske regering og fosfor af den indiske regering (aktive område diagonal 18 mm) er afbildet på sensoren i en afkølet videnskabelig CCD (chip størrelse 10.2 mm x 8.3 mm) kameraet ved hjælp af et par af kameralinser giver et forstørrelse på 0,7. Systemet styres af en standard PC, der er grænseflader til instrumentering hjælp RS232 protokoller. Desuden er en Arduino mikroprocessor anvendes til at styre en lukker i excitationslyset sti, der er lukket, undtagen når CCD-kameraet erhverver FLIM data og registrere signalet fra en fotodiode, der anvendes til at måle den gennemsnitlige effekt fra spektralt filtreret superkontinuum excitationskilde. Til optisk snit FLIM er excitation laserstråling koblet til en single-mode polarisationsbevarende optisk fiber, der forbinder direkte til Nipkow disken scannerenheden, som shown i figur 3. Outputtet fluorescens billede fra Nipkow scannerenheden videresendes på fotokatoden af den indiske regering og resten af systemet er den samme som for bredt felt FLIM.
openFLIM-HCA software
Købet data software er skrevet i μManager 34. Det giver fuld HCA dataopsamling funktionalitet, herunder muligheder for at ændre den rækkefølge, som de pladens huller er afbildet, at erhverve tidsforløb for enhver FOV, til automatisk at fastholde fokus under målingerne og kontrollere de excitation og emission filter hjul og dichroic changer til automatiseret flerfarvet billeddannelse. Det er også muligt at køre en "præscan" erhvervelse af fluorescensintensitet for automatisk at identificere og registrere positioner egnede FOVs for en efterfølgende FLIM overtagelse i henhold til kriterier, fx baseret på intensitet. Flim HCA data kan gemmes som en serieaf TIFF-filer, som en række OME-TIFF-filer (dvs. en pr FOV), eller som en enkelt OME-TIFF-fil indeholder alle data fra et flerbrøndspladen. Flere oplysninger og en detaljeret beskrivelse af μManager software kan findes på openFLIM-HCA wiki 33.
De data analyse software, FLIMfit 31, et open source MATLAB-baserede klient for Omero billeddata management platform 32, er i stand til at læse flim data fra en Omero server eller fra computer disk, som vist i figur 4. Den er designet til at analysere data fra TCSPC eller wide-field tid-gated flim instrumenter og giver mange muligheder for at passe data fra openFLIM-HCA herunder montering på monoeksponentiel henfald profiler, og at fordoble eksponentielle og højere kompleksitet henfald profiler, herunder modeller som polarisering-fluorescens henfald profiler. Det kan også tage hensyn til faste og tidsvarierende baggrundssignaler og kan UTILize en afmålt spatio-temporale instrument respons funktion (IRF), eller kan passe bruge en idealiseret IRF, der kan være tidsforskudt på en pixel-wise basis med et beløb, bestemt ud fra den fulde eksperimentelle IRF måling. En global tidsforskel (t 0) mellem IRF og en fluorescerende prøve kan bestemmes ud fra en måling af et fluorescens-standard. kan også tages i betragtning rumlige variationer i baggrundssignaler og IRF. FLIMfit er i stand til at passe FLIM data på pixel-wise basis eller ved hjælp af "global binning" eller "global fitting" for at lette montering af FLIM-data med beskedne (hundreder) foton numre til komplekse henfald modeller.
Global Binning indebærer sammenlægning af alle de fundne fotoner fra pixel inden for et brugerdefineret ROI på hvert tidspunkt at give tilstrækkelige foton numre for at muliggøre montering på komplekse henfald modeller. ROI kan være hele synsfeltet (FOV), kan det være manuelt defined af brugeren, eller det kan bestemmes ved anvendelse billede segmenteringsværktøjer. Den ROI kan også defineres ved hjælp af masker, der importeres til FLIMfit fra andet billede segmentering software. For FRET applikationer, er det almindeligt at bruge globale Binning til at passe til en dobbelt eksponentiel henfald model til at bestemme fluorescens levetid komponenter svarende til FRETing og ikke-FRETing donor fluoroforer, der antages at være rumligt invariant over ROI og derefter genmontere på en pixel-wise basis med disse levetid komponent vales fastsat for at opnå den FRETing donorpopulationen fraktion i hver pixel.
Global montering indebærer samtidig montering af levetid komponenter og pixel-wise FRETing donorpopulation fraktioner på tværs af en hel FOV- eller på tværs af en FLIM datasæt, der kan omfatte flere FOVs, fx fra en flerbrøndspladen eksperiment eller en tidsserie af fluorescens levetid billeder. Global fitting er i stand til at udnytte den rumlige variatiom befolknings- fraktioner på tværs af billedet, der er gået tabt i den globale Binning tilgang til at give stærkere begrænsninger i komponent levetid estimering – og derfor mere pålidelige resultater – om end på bekostning af betydeligt mere beregning 35. FLIMfit kan hurtigt analysere flerbrøndspladen flim datasæt med global montering på konventionelle pc-arbejdspladser med for eksempel en flere brønde tid-gated FLIM datasæt erhvervet med fem gang porte for hver af 394 FOV som hver omfatter 672 x 512 pixels, kræver kun 32 sekunder og 2 GB hukommelse til at passe til en dobbelt eksponentiel henfald model 31. Dette er opnået ved at udnytte en adskilles lineær mindste kvadraters montering algoritme implementeres ved hjælp af flertrådede parallelle algoritmer til at muliggøre en effektiv skalering på multi-core processorer og FLIMfit koden er optimeret til at minimere hukommelsesforbruget. Figur 5 viser et øjebliksbillede af den grafiske brugergrænseflade i FLIMfitog flere detaljer kan findes på websiden i henvisning givet 36. Yderligere information om global montering og global Binning kan findes i henvisning 31.
Følgende protokol for FLIM HCA ved hjælp af vores openFLIM-HCA instrumentering og software kan tilpasses til en bred vifte af cell imaging eksperimenter med Flim udlæsninger. Generelt flerbrøndspladen FRET eksperimenter bør udformes til at omfatte replikatbrønde af positive og negative biologiske kontrol Foruden de betingelser, der undersøges. Her beskriver vi den specifikke implementering at udføre optisk gennemskåret FLIM (se figur 3) af Cos-celler, der udtrykker FRET-konstruktioner bestående af mTurquoise fluorescerende protein og Venus fluorescerende protein forbundet ved en kort peptidlinker. Her mTq32V, mTq17V og mTq5V FRET konstruktioner (diskuteret i Repræsentative resultater afsnit) giver lav, middel og høj FRET effektivitet sammen med den ikke-FRETing mTq5A konstruere.Disse konstruktioner og de øvrige nødvendige materialer til at følge denne protokol er opført på listen Materials.
Vi har beskrevet en automatiseret flerbrøndspladen mikroskop designet til HCA hjælp tid-gated FLIM. Dette instrument er kontrolleret ved hjælp af open source-software skrevet i μManager med mulighed for at gemme data til en Omero server og analysen flim data, der udføres ved hjælp af FLIMfit 36, et open source program skrevet i MatLab og fås som Omero klient 32 μManager instrument kontrol software, openFLIM-HCA, er tilgængelig online 33 med en liste over de systemkomponenter 48 for at muliggøre akademiske forskere til at konstruere deres egne FLIM HCA instrumenter.
For at erhverve robuste Flim data, er det nødvendigt at optimere den indiske regering og CCD erhvervelse og at tage hensyn til eventuelle variationer i t 0. Som beskrevet i 3.8.2, bør GOI forstærkningsindstilling og CCD kamera integrationstiden indstilles til at nå ~ 75% af CCD dynamikområde. Usynge højere GOI spændinger og flere CCD frame ophobninger på hvert tidspunkt portforsinkelse øger signal-støjforholdet 49, men dette øger den samlede erhvervelse FLIM tid (da færre fluorescensfotoner erhverves pr frame før CCD-kameraet mættede fedtsyrer og så antallet af frame ophobninger bør øges) og så denne afvejning bør besluttes for hvert forsøg. Kalibreringen af forsinkelsesgeneratoren afhænger laseren repetitionshastighed og det er derfor nødvendigt at sikre, at den korrekte kalibrering filen for gentagelseshastighed anvendes indlæses i købet software. Proceduren for kalibrering af forsinkelsen boksen kan findes på openFLIM-HCA wiki 33.
Hvis det cellulære autofluorescens er lav sammenlignet med fluorescenssignalet, bruger vi signalet fra en brønd indeholdende lige dyrkningsmedium til tilvejebringelse af tidsvarierende baggrund (TVB). For at minimere baggrundsfluorescens fra celledyrkningsmediet, undgår vimedier indeholdende phenolrødt. Hvis det cellulære autofluorescens er betydelig, så TVB kan afledes af målinger af umærkede celler. Men i dette tilfælde skal man være omhyggelig, da dette forudsætter, at autofluorescens baggrund er den samme for hver pixel i billedet. Denne antagelse er ikke gyldig, hvis autofluorescens varierer betydeligt på tværs af en celle, eller hvis excitation strålen eller afsløring følsomhed er ikke ensartet over synsfeltet.
Erhvervelsen af et IRF billede ved hjælp spredte excitation lysimpulser giver den tidsmæssige IRF profil, der er foldet med datamodellen i tilpasningsprocessen og tilvejebringer også et kort over den rumlige variation af IRF tværs af synsfeltet. IRF kan måles ved at afbilde en spredning prøve, såsom en kolloid suspension, selv efter vores instrument, ved anvendelse af excitation spredte lys fra Nipkow disk giver en renere måling af IRF. Nøjagtig bestemmelse af timingen of IRF er vigtig, fordi fejl i tidsforsinkelse mellem excitation og tidslig udelukkelse væsentligt kan påvirke tilpasningsprocessen, især når montering på komplekse eksponentielle henfald modeller. IRF erhvervet ved hjælp af spredt excitationslys er ikke præcis, hvad der er nødvendigt for tilpasningsprocessen, fordi den er optaget på excitationsbølgelængden snarere end ved fluorescens emission bølgelængde, som kan påvirke dens timing, selvom den rumlige variation af IRF bør være den samme ved begge bølgelængder. Desuden kan det spredte IRF være globalt forskudt i tid i forhold til den sande IRF grundet en forskellig optisk vejlængde fra spredningen objekt, som det er tilfældet for en IRF erhvervet fra Nipkow disk i optisk snit FLIM. Denne korrektion, t 0, hvilket er det påkrævede globale tidsmæssige skift, der skal anvendes til den erhvervede spredt excitationslyset IRF, beregnes ud fra de monoeksponentiel henvisning farvestof data som angivet i Protocol trin 4.4. Følgende farvestoffer kan anvendes til forskellige excitationsbølgelængder: en 75 uM Coumarin 153-opløsning i methanol (τ ~ 4,3 ns 50) kan anvendes til excitation i området fra 295 til 442 nm; en 75 uM Coumarin 6 opløsning i ethanol (T ~ 2,43 ns 37) kan anvendes til excitation i området fra 430 til 500 nm; og en 75 uM Rhodamin B-opløsning i vand (τ ~ 1,7 ns 37) kan anvendes til excitation i området fra 488 til 575 nm. Vi bemærker, at selv om det er muligt i FLIMfit at bruge en anden IRF for hver pixel af systemet, normalt er det rimeligt at gøre den antagelse, at det rumligt varierende IRF har samme tidsmæssige profil for hver pixel i billedet, men præsenterer en række af rumligt varierende tidsmæssige forskydninger i forhold til den globale t 0. Vi beskriver dette som IRF shift kort, som bestemmes fra det spredte lys IRF. Sammen er IRF profil, t 0 og IRF skift kortet bruges til ensikre, at hver pixel i FOV er udstyret med en passende IRF. Vigtigt er det, kan t 0 variere langsomt over tid, så det bør måles før enhver erhvervelse FLIM data.
Brugeren skal beslutte, hvordan at prøve de fluorescens henfald profiler og er forpligtet til at indstille bredden af den tid, porte og deres relative forsinkelser efter excitation. I almindelighed er det ønskeligt at anvende Broadgate bredder for at maksimere det detekterede signal og typisk bruger vi gate bredder sat til 4 ns for FLIM af celler mærket med fluorescens-proteiner. Antallet af tid-gate forsinkelser bør være tilstrækkelig til at prøve den fluorescerende henfald profil (herunder en gate indstilles til at måle signalet lige før excitationspulsen) i betragtning af kompleksiteten af fitting model, der vil blive anvendt i analysen. Den optimale værdi kan afhænge af de levetider og relative amplituder af henfaldet komponenter. Generelt 4 porte er tilstrækkelige til montering monoeksponentiel henfalder mens 7 eller flere porte kanbruges til mere komplekse henfald modeller.
Vi bemærker, at FLIM kan implementeres ved hjælp af en vifte af tid-domæne eller frekvens domæne teknikker og automatiseret FLIM HCA af flerbrøndspladen arrays blev først implementeret i en (ikke-sektionering) wide-field mikroskopet med frekvensdomænet levetid udlæsninger af FRET 51. Den første automatiserede optiske sektionering FLIM flerbrøndspladen læser til HCA udnytte bredt felt tid-gated billeddannelse 28 blev derefter rapporteret. Efterfølgende blev wide-field (ikke-sektionering) frekvensdomænet FLIM HCA ansøgt til at screene for post-translationelle modifikationer (tyrosinphosphoryleringssteder) på tværs et gen bibliotek ved hjælp FRET 52 og tid-gated FLIM HCA er blevet anvendt til at ærgre analyser af HIV-1 Gag oligomerisering 53 og af SUMOylation af FOXM1 54, Raichu RhoA og Rac1 biosensorer 33. Det er også muligt at anvende TCSPC for flerbrøndspladen FLIM 26, men til dato har det vist sig svært at matche than gennemløb af teknikker udnytter afsløring bredt felt. Et spirende strategi, der kunne løse dette problem er brugen af arrays af enkelt foton optælling detektorer såsom SPAD arrays 55.
Vi bemærker, at eventuelle udlæsninger af FRET ved hjælp af fluorescerende proteiner skal behandles med forsigtighed, og at de absolutte værdier af parametre opnået fra FLIMfit eller anden FLIM analyse software vil afhænge af antagelserne vedrørende montering model. For eksempel hvor FRET donor har en væsentlig anden henfald komponent, kan anvendelsen af en bieksponentiel model til at passe til FRET Flim data resultere i bidraget fra den hurtigere henfald komponent, typisk forbundet med FRETing befolkning optræder højere end det burde. Det er derfor ønskeligt at anvende donorer med en mono-eksponentiel levetid såsom mTq2FP. Selv da, har nylige undersøgelser vist, at FRET-analyse stadig kan påvirkes af mørke tilstande af acceptor fluorescens proteiner eller vedheterogenitet af orienteringen faktor κ 2 på grund af en fordeling af fluoroforen konformationer med en bred vifte af chromoforgrupper vinkler og afstande 56. Ikke desto mindre har vi og andre vist, at fluorescenslevetid udlæsninger af FRET do producere nyttige resultater, der korrelerer med biokemiske målinger og kan anvendes til at screene for protein-interaktioner eller følge dynamikken i biosensorer. Således denne openFLIM HCA platformen kan anvendes til en bred vifte af fluorescenslevetid assays anvender FRET eller cellulær autofluorescens 8, samt tilvejebringer kvantitative udlæsninger af farvestofbaserede prober 25.
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.
microscope frame | Olympus | IX81 | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
optical autofocus | Olympus | ZDC | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
motorized (x-y-z) microscope stage | Marzhauser | 00-24-565-0000 | Stage with Corvus controlle |
excitation laser source | Fianium | SC400-4 | Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/ |
gated optical intensifier | Kentech | High Rate Imager (HRI) | |
delay generators | Kentech | — | See agile delay generator and precision delay generator |
camera | Hamamatsu | ORCA-ER-II | |
Nipkow disc scanner unit | Yokogawa | CSU-X1 | http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/ |
Top hat diffuser | Thorlabs | ED1-S20-MD | Engineered diffusers |
mTq5V | Oxford Genetics | P3850 | mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker |
mTq17V | Oxford Genetics | P3847 | mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker |
mTq32V | Oxford Genetics | P3848 | mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker |
mTq5A | Oxford Genetics | P3849 | mTurquoise Amber construct |
HEK293T | — | — | cell type used |
phenol red-free HBSS | Sigma Aldrich | 55021C-1000ML | imaging media |
culture media | DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics | ||
DMEM | Sigma Aldrich | D6046-500ML | for culture media |
FBS | Sigma Aldrich | 12003C-500ML | for culture media |
xTremeGene9 | Sigma Aldrich | 6.37E+09 | for transfection, follow online protocol from La Roche |
trypsin/EDTA Solution | Thermo Fischer | R001100 | for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer |