אנו מציגים ניתוח תוכן בקוד פתוח גבוה (HCA) מכשיר ניצול הדמית חי קרינה אוטומטי (FLIM) עבור assaying אינטראקציות חלבון באמצעות תהודת העברת אנרגית פורסטר (סריג) readouts המבוסס. רכישת נתונים עבור מכשיר openFLIM-HCA זו נשלטת על ידי תוכנות שנכתבו ב μManager וניתוח נתונים מבוצע FLIMfit.
We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in µManager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.
השימוש הגובר של ניתוח תוכן גבוה אוטומטי (HCA) גילוי סמים 1 לספריות מתחמות assay הוא השלים את המגמה במחקר בסיסי במדעי חיים לקראת ניסויי הדמיה אוטומטיים מחקרים שיטתיים, למשל, עבור מסך פנוטיפי של ספריות siRNA. HCA האוטומטית גם הופכת חשובה יותר ויותר עבור מחקרים ביולוגיים בקנה מידה קטן יותר, כי בדרך כלל יושמו עם ניסויים ידניים עם עשרות מנות של תאים צלמו עם מיקרוסקופים קונבנציונליים. כוחה הסטטיסטי שמעניק את היכולת assay ולנתח מאה לאלפי שדות מבט מאפשר מיצוע של רעש ניסיוני (כולל "רעש ביולוגי") ואת האוטומציה של איסוף נתוני תמונה וניתוח של מערכי מדגם גדולים יכול לסייע במיגור הטיה מפעילה ולעתים קרובות עשוי להיות מנוצל כדי לזהות את המופע של שגיאות שיטתיות, כגון שינוי פרופיל IRF במהלך רכישה. מבחני קרינה מבוססותמיושמים נרחב HCA, עם מכשור HCA ביותר זמין המסחריים שמציע הדמיה עוצמת קרינה בערוצי רפאים אחת או יותר כדי למפות את ההתפלגות ושיתוף לוקליזציה היחסית של חלבונים שכותרתו. עוד שיטות הדמית קרינה מתוחכמות, כגון הדמית חי קרינה (FLIM), הדמית אנאיזוטרופיה קיטוב והדמית אנאיזוטרופיה קרינת זמן נפתר, הם לא נצלו נרחבים במכשירי HCA מסחריים, אם כי הם מציעים readouts כמותית עצמה, למשל, של אינטראקציות חלבון. כאן אנו מציגים גישת קוד פתוחה ליישום FLIM ב מיקרוסקופ אוטומטית HCA.
חי קרינה מספקים readout ספקטרוסקופיות ratiometric מטבעו, שניתן להשתמש בם כדי להבחין מינים מולקולריים שונים או כדי לחקור את הסביבה המולקולרית המקומית של fluorophore והוא רגיש ריכוז fluorophore, יעילות עירור / זיהוי, ואת השפעת scatteקליטת טבעת מדגם 2. יתר על כן, מאז מדידות חי קרינה יכולות להתבצע ערוץ רפאים אחת, הם להשוואה ישירה בין מכשירים שונים ודוגמאות ללא כיול. הם יכולים להיות מיושמים כדי fluorophores אנדוגני, כולל כמה מטבוליטים הסלולר, שומנים ורכיבים תאי מטריקס, כדי לספק readouts הפנימי של תהליכים ביולוגיים פתולוגיות. לפיכך FLIM ללא תווית ניתן למפות שינויים מטבוליים בתאים 3,4 ו יושם לפקח תאי גזע בידול 5,6 ואת הצמיחה של פיגומים קולגן 7. אנחנו הוכחנו לאחרונה כי FLIM HCA יכול לשמש מבחנים ללא תווית אוטומטית של חילוף חומרים תאיים ניצול autofluorescence 8. נפוץ יותר, עם זאת, מדידות חי קרינת FLIM מוחלים fluorophores החיצוני בעלות תווית ביומולקולות ספציפית, מיושמים לעתים קרובות באמצעות צבעים כי להכתים תאים סלולריים, באמצעות צבעים מצמידי antibodieהים כי יעד חלבונים ספציפיים בתאים קבועים, או באמצעות fluorophores גנטית הביעה מצמידי חלבונים ספציפיים. חי קרינה יכולים לשמש כדי לספק readouts כמותיים החזק של בדיקות ניאון חישת הסביבה הפיסית או כימית שלהם. לדוגמאות, נפרסו צבעי לחוש בשלב השומנים המקומי של קרום התא 9 או צמיגות תא 10 ו biosensors חלבון מבוססי פלורסנט גנטית הביע פותחו לדווח ריכוזי התא מולקולות איתות לרבות IP3 11, PIP2 12 ו calpain 13 או יונים כגון סידן 14,15, אשלגן 16 כלוריד 17.
חיישנים ביולוגיים כגון רבים לנצל העברת אנרגיה פורסטר תהודה (סריג) 18,19 לספק מונה המציין לשינויים קונפורמציה biosensor. סריג בין "התורם" ו "acceptor" fluorophores מתרחשת דרך אינטראקציה דיפול דיפול ישיר טווח קצרעבורו fluorophores בדרך כלל מופרדת על ידי פחות מ ~ 10 ננומטר. לכן זיהוי של סריג מציין את בסמיכות של חלבונים שכותרתו כראוי ולכן מספק אמצעי הקריא אינטראקציות חלבון-חלבון 20, כגון מחייב או oligomerization – גם כנקודות קצה בתאים קבועים או כאירועים דינמיים במדידות מהלך זמן של חיה תאים. על ידי תיוג הוא מבנה מולקולרי מתאים בשני תורם fluorophores acceptor, אפשר גם לקרוא את שינויים קונפורמציה – או מחשוף – של המבנה באמצעות שינוי סריג וזה בסיס חיישנים ביולוגיים רבים 21. מדידות של הסריג יעילות יכולות לספק מידע על מרחק acceptor התורם ואת חלק אוכלוסיית fluorophores התורם עובר סריג. לפיכך, טכניקות הדמיה מבוססות סריג יכולות לשמש למיפוי לכמת אינטראקציות מולקולריות במרחב ובזמן, למשל, על מנת להבהיר איתות תא מעבדת 22. אוטומטing טכניקות הדמיה כזו יכולה לספק מבחני תפוקה גבוהה המבוססת על מונה המציין מסלולי איתות או רשתות.
בשנת HCA, את הודעת הסריג מיושמת לרוב היא הדמית ratiometric רפאים, שבו שינויים ביחס של acceptor לעוצמת תורם ממופים. בעוד גישה זו מיושמת בקלות – והוא זמין קוראי צלחת multiwell רבים זמינים מסחרי – כמוני נפתרו ספקטרלית מדידות סריג דורשות כיול של התגובה הספקטרלית של המערכת 23. זה כולל הצטלבות ספקטרלי הנובעת לדמם דרך רפאי עירור ישיר של acceptor וכן מאפייני ההולכה של המכשיר ואת המדגם (אפקט מסנן פנימי). באופן עקרוני, זה כרוך מדידה של דגימות "שליטה" נוספות מסומנות עם או תורם בלבד או acceptor בלבד.
ממדידות ספקטרלי ratiometric סריג כאלה, סריג יעיליעילות (התוצר של הסריג היעיל בפועל ופרופורציית המולקולות התורמות / acceptor FRETing) ניתן להשיג יחד עם חלקם היחסי של מולקולות תורם acceptor 24. סריג ratiometric ספקטרלית משמש לעתים קרובות עם biosensors סריג unimolecular, שבו והרכב תורם / acceptor ניתן להניח להיות ידוע. כדי לקבוע את שברי אוכלוסיית תורם FRETing ו acceptor, למשל, כדי לקבל עקומת מנת תגובה, ידע של הסריג היעיל בפועל נדרש. זה ניתן להשיג על ידי מדידת מדגם מלא סריג חיובי עם מאפיינים ידועים או באמצעות שיטה אחרת למדידת יעילות הסריג, כגון photobleaching acceptor או FLIM.
שימוש readouts בחי קרינה, סריג ניתן לאתר לכמת ידי מדידות של פליטת התורם לבד – הסרת צורך כיול ספקטרלי ודגימות בקרה נוספות. לפיכך, readouts סריג FLIM ניתן להשוות בין מכשיריםובין מדגמים שונים – נתונים המאפשרים מן אנדוסקופיה או טומוגרפיה של מודלי מחלה חיים 25 עד להיות השווה נגד מדידות של מבחנים מבוססי תאים. על ידי התאמת פרופילי ריקבון תורם קרינת מודל רב-מעריכי ריקבון מתאים המתאים FRETing והלא FRETing אוכלוסיות תורמות, סריג יעילות ושברי אוכלוסייה יכולות, באופן עקרוני, ניתן לקבל ישירות בלי מדידות נוספות. יתרונות משמעותיים אלו, לעומת זאת, מגיעים במחיר של FLIM מחייב פוטונים מזוהים יותר לפיקסל מאשר הדמיה עוצמת נפתרה ספקטרלית – בדרך כלל מאה פוטונים נדרשים להשיג דיוק בחי קביעת 10% כאשר הולם מודל דעיכה מעריכית יחיד ומתי פרופילי ריקבון קרינה הולמים מורכבים (ריקבון multiexponential) מודלים, מספר הפוטונים זוהו נדרשו מגדיל לאלפי. זה הוביל כמקובל לזמני רכישה ארוכים (עשרות עד מאות שניות לכל שדה של viEW) עבור FLIM, במיוחד בעת שימוש זמן בקורלציה ספירת פוטון יחיד (TCSPC) מיושם עם רכישת פיקסל רציפים מיקרוסקופים סריקת לייזר. ניסיונות להגדיל את מהירות ההדמיה באמצעות עוצמות עירור גבוהות יכול להוביל photobleaching ו / או phototoxicity המשמעותיים. יחד עם מחסור בכלי מכשור ותוכנה מתאימים זמינים מסחרי, זה הפריע FLIM מלהיות מנוצל HCA לביולוגית גילוי או מערכות תרופה, שבו מאה אלף שדות מבט הן להיות צלמו. סריקת ליזר TCSPC FLIM יושמה מיקרוסקופ צלחת multiwell אוטומטית 26 למדידות משניות בעקבות זיהוי של "להיטים" על ידי הדמית אנאיזוטרופיה הקרינה היציבה נפתר קיטוב 27, אשר יכול להגיע למהירות הדמיה דומה הדמית ratiometric רפאי 28 שבה הוא שותף יתרונות וחסרונות רבים. הדמית אנאיזוטרופיה הקרינה מנצלת את הירידהב אנאיזוטרופיה הקרינה של acceptor בנוכחות סריג והיא רגישה גם הצטלבות ספקטרלי (למשל, עירור ישיר של acceptor). זה דורש כיול לתת דין וחשבון על דיבורי קיטוב צלב אינו מספק מדידה ישירה של סריג יעיל.
כדי לממש את היתרונות של FLIM עבור HCA, עבדנו כדי לטפל בבעיות של מהירות של רכישת תמונת גישה רחבה יותר את הטכנולוגיה. כאן, אנו מספקים רשימה מלאה של רכיבי תוכנה וחומרת קוד פתוחים שיכול להיות מנוצל כדי ליישם את קורא צלחת multiwell FLIM המהיר האוטומטי המתואר להלן, יחד עם מבוסס מבחני סריג מופת. בגישתנו 29, FLIM מתממשת באמצעות הדמיה רחב בתחום מגודר זמן באמצעות מגבר תמונה אופטית מגודר (ממשלת ישראל), אשר מתואר באיור 1 שיכול לספק שיעורי הדמיה מהר photobleaching הנמוך יותר TCSPC לסריקת קרן יחידה בשל לקבור בה פיקסל במקבילogation. מכשיר openFLIM-HCA שלנו יכול לספק FLIM ללא השגחה, המחייב רק כמה שניות כדי לרכוש נתוני FLIM באיתור כמה 100 פוטונים לפיקסל (תלוי הבהיר של המדגם). בשילוב עם הזמן הנדרש כדי להעביר את המדגם מהשדה הקודם של תצוגה, כדי להתאים את גדרות רכישה ועל מנת לשמור על המדגם בפוקוס, זה בדרך כלל תוצאות פעמי רכישת צלחת multiwell של ~ 10 שניות לכל שדה הראיה 25,28. חתך אופטי יכול להיות מיושם באמצעות מעין-רחב בתחום ניפקוב ( "דיסק מסתובב") סורק 30.
לניתוח נתונים FLIM, פיתחנו כלי תוכנת קוד פתוח בשם FLIMfit 31 כי הוא מסוגל לנתח מערכי נתונים FLIM צלחת multiwell במהירות על תחנות עבודה PC קונבנציונאלי הוא תוסף עבור OMERO 32. FLIMfit מספק יכולות ניתוח הגלובליות (דנו בסעיף 1.2) המאפשרים נתוני FLIM להיות מצוידים צורות מורכבות only כמה 100 פוטונים לפיקסל בהנחת רכיבי חי הקרינה משתנים על פני תמונה או באזור של (ROI) ריבית, ולכן הפחתת מספר הפוטונים זוהו הנדרש, החשיפה לאור בפעם רכישת המדגם ותמונה. ריצת FLIMfit במחשב שולחני רגיל, דורש רק 10s של שניות של זמן חישובית לנתח ערכות נתונים המורכב מ מאות FOVs. כך הוא רכישת נתוני FLIM והניתוח יכולים להתבצע על לוחות זמנים כי הם מעשיים HCA.
חומרת openFLIM-HCA
יישום FLIM HCA שלנו כוללת שישה מרכיבים מרכזיים: (i) מסגרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם פוקוס אוטומטי אופטי; (Ii) הבמה מיקרוסקופ ממונע (xyz); (Iii) מקור לייזר עירור; (Iv) מערכת FLIM רחב בתחום מגודר זמן עם מגבר אופטי מגודר (ממשלת ישראל), גנרטור עיכוב מצלמה; (נ) מחשב לרכישת נתונים וניתוח (vi) סורק גלגל ניפקויחידת הדמיה מחולקת אופטי לדכא את האור להתמקד. זה יכול להיות חשוב כאשר הדמית אותות חלשים, למשל, מן biosensors סריג על הממברנה פלזמת תא, שיכול להיות מוצף על ידי תרומות קרינת cytoplasmic או רקע coverslips או בינוני תרבות. נתוני FLIM מגודר זמן נרכשו על-ידי הארת המדגם עם קרינת עירור פעמיו ultrashort, הדמית פליטת הקרינה אל photocathode של הממשלה ישראל ורכישת סדרה של תמונות CCD של זרחן של הממשלה ישראל עבור מגוון של הגדרות של השהיית זמן של שער המגבר האופטי לאחר הגעתו של פולסים העירור. כמו עיכוב השער בפעם הבא עירור הוא גדל, אות הקרינה נתפסה להקטין ואת סדרת תמונות עוצמות קרינה מגודרת זמן רכשו ב- CCD ליצור את סדרת הנתונים הדרושות כדי לנתח את פרופילי הדעיכה של כל fluorophores ב שדה הראייה . Gating של הממשלה ישראל מסונכרן עם פולסים העירורו, עבור סדרה של רכישות CCD, העיכוב של יחסי השער זמן פולסים עירור מוגדר סדרה של הגדלת ערכים מעל הטווח הרצוי. סנכרון זו מושג באמצעות גנרטור העיכוב שמהם מורכבים "תיבת עיכוב מהר" (מתן עיכובים עד 20 ננו-שניות ב 1 צעדי ps) לבין "תיבת עיכוב גסה" המספקת עיכובים בצעד מינימום של 25 ps.
עבור FLIM, עירור יכול להינתן על ידי כל ליזר מהיר. לנוחיותכם, אנו בדרך כלל להעסיק מקור supercontinuum שאוב-סיב לייזר המספק מתכונן פולסים picosecond על פני הספקטרום הנראה שממנו הקרינה עירור המתאים ניתן לבחור עבור כל fluorophore באמצעות גלגל לסנן ממונע עם מסננים הלהקה עוברים שונים. בדרך כלל, אנו משתמשים הספק ממוצע של ~ 100-200 μW על המדגם עם פעימות ב שיעור החזרה 40 או 60 MHz. סמכויות עירור כאלה יוכלו גם להיות מסופק על ידי מקורות לייזר מהירים מבוסס על הכפלת תדר שלבמצב נעול לייזרי ספיר מסומם טיטניום. שימו לב כי משך דופק עירור מתחת ps ~ 100 מספיק עבור רוב הניסויים. גלגל מסנן ממונע שני מצויד במסנני צפיפות ניטראליים משמש כדי לווסת את עוצמת העירור. עבור בטיחות ונוחות, קרינת העירור עשויה להיות מועברת באמצעות סיבים אופטיים מצב יחיד. התצורות עבור FLIM רחב בתחום ואת FLIM המחולק אופטי מוצגות איורים 2 ו -3 בהתאמה. לפרטים נוספים של הרכיבים המדויקים בשימוש, בקר ויקי openFLIM-HCA 33. העתק של רשימת החלקים הנוכחית ניתן החומר המשלים.
עבור FLIM רחב בתחום, קרינת העירור נדרשת כדי להאיר את כל השדה של נוף כמו אחיד ככל האפשר. לשם כך אנו מפנים את קרן הלייזר עירור מפזר הולוגרפית "המגבעת" כי הוא הסתובב בבית 10-50 הרץ לעת-הממוצע את לייזר רבב, עם המטוס של DIFfuser להיות הדמיה למישור המוקד האחורי של העדשה מיקרוסקופ האובייקטיבית. תמונת הקרינה מן יציאת הפלט של המיקרוסקופ מועברת על photocathode של הממשלה ישראל ואת זרחן של (האזור הפעיל אלכסון 18 מ"מ) ממשלת ישראל היא הדמיה על החיישן של CCD המדעי מקורר (גודל שבב 10.2 מ"מ x 8.3 מ"מ) מצלמה בעזרת זוג עדשות מצלמת מתן בהגדלה של 0.7. המערכת נשלטת על ידי מחשב רגיל כי הוא להתממשק המכשור באמצעות פרוטוקולים RS232. בנוסף, המיקרו Arduino משמש לשליטה על תריס נתיב אור העירור כי סגור למעט כאשר מצלמת CCD רוכשת נתוני FLIM וכדי לתעד את האות מ פוטודיודה כי משמשת למדידת ההספק הממוצע מן supercontinuum המסונן ספקטרלית מקור עירור. עבור FLIM המחולק אופטי, את קרינת ליזר העירור מצמידה לתוך במצב יחיד קיטוב שמירת סיב אופטי המתחבר ישירות יחיד סורק הגלגל נפק, כמו יםhown באיור 3. תמונת קרינת פלט מיחידת סורק ניפקוב מועברת על photocathode של הממשלה ישראל ואת שאר המערכת זהה עבור FLIM רחב בתחום.
תוכנת openFLIM-HCA
תוכנת רכישת נתונים כתובה μManager 34. הוא מספק פונקציונלי רכישת נתונים מלא HCA כולל אופציות לשנות את הרצף שבו בארות הצלחת הם צלמו, לרכוש קורסי עת ומכל FOV, לשמור על פוקוס אוטומטי במהלך מדידות ולשלוט גלגלי העירור ופליטה מסננים ואת מחליף dichroic עבור הדמיה ססגונית אוטומטית. אפשר גם להפעיל רכישה "prescan" של עוצמת קרינה על מנת לזהות באופן אוטומטי להקליט את העמדות של FOVs מתאים רכישה עוקבת FLIM פי קריטריונים, למשל, מבוססים על עצמה. נתוני HCA FLIM ניתן לשמור כסדרהשל קבצי TIFF, כסדרה של קבצים שת-TIFF (כלומר, אחד לכל FOV) או כקובץ שת-TIFF יחיד המשלב את כל הנתונים מתוך צלחת multiwell. מידע נוסף ותיאור מפורט של התוכנה μManager ניתן למצוא בוויקי openFLIM-HCA 33.
תוכנת ניתוח נתונים, FLIMfit 31, קוד פתוח MATLAB מבוסס לקוח עבור פלטפורמת ניהול נתוני תמונת OMERO 32, הוא מסוגל לקרוא נתוני FLIM משרת OMERO או מדיסק מחשב, כמצוין באיור 4. זה תוכנן כדי לנתח נתונים מ TCSPC או רחב בתחום מגודר זמן מכשירי FLIM ומספק יכולות רבות כדי להתאים נתוני openFLIM-HCA כולל הולם monoexponential פרופילי ריקבון, להכפיל מעריכים גבוהים פרופילי ריקבון מורכבים, כוללים דגמים כמו פרופילי קרינת ריקבון נפתר קיטוב. זה יכול גם לקחת בחשבון של אותות רקע קבועים המשתנה עם זמן ויכול UTILize פונקציה בתגובת מכשיר במרחב ובזמן נמדד (IRF) או יכול להתאים באמצעות IRF אידיאליזציה שעשויה להיות מוזז על בסיס פיקסל חכם בסכום שנקבע ממדידת IRF מלאת ניסיוני. פרש זמן עולמי (t0) בין IRF ו מדגם ניאון ניתן לקבוע ממדידה של תקן קרינה. וריאציות המרחבי אותות הרקע IRF יכול גם להילקח בחשבון. FLIMfit הוא מסוגל להשתלב נתוני FLIM על בסיס פיקסל-חכם או באמצעות "binning העולמי" או "הולם העולמי" כדי להקל על התאמת נתוני FLIM עם צנועים (מאה) פוטון מספרים למודלי ריקבון מורכבים.
Binning גלובל כרוך צבירה כל הפוטונים להבחין בין הפיקסלים בתוך ROI המוגדר על ידי המשתמש בכל נקודת זמן לספק מספרי פוטון מספיק כדי לאפשר התאמה למודלי ריקבון מורכבים. את ההחזר על ההשקעה יכולה להיות כל השדה של תצוגה (FOV), זה יכול להיות ידני דefined על ידי המשתמש, או שזה ניתן לקבוע באמצעות כלי פילוח התמונה. את ההחזר על ההשקעה יכולה גם להיות מוגדר באמצעות מסכות מיובאות לתוך FLIMfit מתוכנת פילוח תמונה אחרת. עבור יישומי סריג, המקובל להשתמש binning העולמי כדי להתאים למודל ריקבון כפול מעריכים כדי לקבוע את מרכיבי חי קרינה המתאימים FRETing ו fluorophores תורם הלא FRETing כי הם הניחו להיות משתנים מרחבית ברחבי ROI ולאחר מכן כדי לשפץ על בסיס פיקסל חכם עם vales מרכיב בחיים האלה קבוע על מנת לקבל את החלק היחסי באוכלוסייה התורם FRETing בכל פיקסל.
הולם עולמי כרוך התאמת רכיבים בחיים זמני ושברי אוכלוסייה תורמת FRETing חכם-פיקסל על פני כולה FOV- או על פני סט נתוני FLIM שיכול מהווה FOVs המרובה, למשל, מניסוי צלחת multiwell או סדרה עתית של תמונות לכל חי קרינה. הולם גלובל הוא מסוגל לנצל את variati מרחביתעל שברי אוכלוסייה על פני התמונה כי הוא אבד את גישת binning העולמית לספק אילוצים חזקים על הערכת חי רכיב – ולכן תוצאות אמינות יותר – אם כי במחיר של חישוב יותר באופן משמעותי 35. FLIMfit יכול במהירות לנתח מערכי נתונים FLIM צלחת multiwell עם הולם העולמי על תחנות עבודה מחשב קונבנציונאלי עם, למשל, ערכת נתונים multiwell זמן מגודרת FLIM, רכשה עם חמישה שערים הזמן שכל אחד 394 FOV כל אחת מ 672 x 512 פיקסלים, המחייב רק 32 שניות ו -2 GB של זיכרון כדי להתאים למודל דעיכה מעריכית כפול 31. זו הושגה על ידי ניצול קוי להפרדה לפחות אלגוריתם מרובע הולם מיושם באמצעות אלגוריתמים מקבילים מרובה הליכי כדי לאפשר שינוי גודל אפקטיבי על מעבדים מרובי-ליבות ואת קוד FLIMfit עבר אופטימיזציה כדי למזער את השימוש בזיכרון. איור 5 מציג תמונת מצב של ממשק המשתמש הגרפי של FLIMfitניתן למצוא את פרטים ועוד בדף האינטרנט הנתון התייחסות 36. מידע נוסף על הולם העולמי binning העולמי ניתן למצוא התייחסות 31.
הפרוטוקול הבא עבור HCA FLIM באמצעות מכשור openFLIM-HCA והתוכנה שלנו ניתן להתאים למגוון רחב של ניסויי הדמית התא מוצא במידע FLIM. באופן כללי, צלחת multiwell סריג ניסויים צריכים להיות מתוכננים לכלול בארות לשכפל בקרות ביולוגיות חיוביות ושליליות בנוסף לתנאים נלמדים. כאן, אנו מתארים את יישום ספציפי לבצע FLIM אופטית מחולק (ראה איור 3) של תאים Cos להביע סריג בונה המורכב של חלבון mTurquoise פלורסנט חלבון פלואורסצנטי ונוס מצטרפים מקשר פפטיד קצר. כאן mTq32V, mTq17V ו mTq5V הסריג בונה (דן בסעיף נציג תוצאות) מספקים נמוך, בינוני יעילות סריג גבוהה יחד עם הלא-FRETing mTq5A לבנות.שני המושגים הללו ואת החומרים אחרים הנדרשים לעקוב פרוטוקול זה מפורטים חומרי הרשימה.
תיארנו מיקרוסקופ צלחת multiwell אוטומטי המיועד HCA באמצעות FLIM מגודרת אמת. מכשיר זה נשלט באמצעות תוכנת קוד פתוח שנכתב μManager עם אפשרות של שמירת הנתונים לשרת OMERO ועל ניתוח נתונים FLIM המתבצע באמצעות 36 FLIMfit, תוכנת קוד פתוח שנכתב ב- Matlab וזמין כלקוח OMERO 32 המכשיר μManager תוכנות שליטה, openFLIM-HCA, זמינה 33 מקוונים עם רשימה של רכיבי מערכת 48 כדי לאפשר לחוקרים אקדמיים לבנות מכשירי HCA FLIM משלהם.
על מנת להשיג נתוני FLIM חזקים, יש צורך לייעל את גדרות רכישת ממשלת ישראל ו CCD, ולהביא בחשבון של הבדלים כלשהם t 0. כמתואר 3.8.2, מצלמת הגדרת רווח ממשלת ישראל ו CCD זמן האינטגרציה צריך להיות מוגדר להגיע ~ 75% של הטווח הדינמי CCD. Uלשיר מתחי הצטברויות מסגרת CCD מרובות ממשלה ישראל גבוהים בכל עיכוב שער הזמן מגדיל את יחס האות לרעש 49 אבל זה מאריך את זמן רכישת FLIM הכולל (מאז פוטוני קרינה פחות נרכשים לכל מסגרת לפני מרווית מצלמת CCD ולכן מספר הצטברויות מסגרת צריך להיות מוגבר) וכך trade-off זה יש להכריע עבור כל ניסוי. הכיול של הגנרטור עיכוב תלוי שיעור החזרת ליזר וזה לכן, יש להבטיח כי קובץ הכיול הנכון עבור שיעור ההחזרה בשימוש הוא נטען לתוך תוכנת הרכישה. הליך כיול תיבת העיכוב ניתן למצוא בוויקי openFLIM-HCA 33.
אם autofluorescence הסלולר הוא נמוך לעומת אות הקרינה, אנו משתמשים האות מ מדיום תרבות רק המכיל היטב כדי לספק את הרקע משתנה בזמן (TVB). כדי למזער קרינת רקע ממדיום תרבית תאים, נמנענומדיה המכילה פנול אדום. אם autofluorescence הסלולר הוא משמעותי, אז TVB עשויה להיגזר מדידות של תאים ללא תווית. עם זאת, בטיפול במקרה זה יש לנקוט, כמו זה מבוסס על ההנחה כי הרקע autofluorescence הוא זהה עבור כל פיקסל בתמונה. הנחה זו לא תהיה תקפה אם autofluorescence משתנה באופן משמעותי על פני תא או שקורה העירור או רגישות זיהוי אינו אחיד על פני שדה הראייה.
רכישת תמונה IRF באמצעות פולסים אור עירור מפוזרים מספק את פרופיל IRF הזמני כי הוא ומפותל עם מודל הנתונים בתהליך הולם וגם מספק מפה של וריאציה המרחבית של IRF פני שדה הראייה. IRF, ניתן למדוד על ידי הדמית מדגם פיזור כגון השעית colloidal אם כי, המכשיר שלנו, באמצעות אור העירור המפוזר מן הגלגל נפק מספק מדידה נקיה של IRF. קביעה מדויקת של עיתוי of IRF, חשוב כי טעויות השהיית הזמן בין העירור והזמן-gating יכולות להשפיע בצורה משמעותית את התהליך ההולם, במיוחד כאשר הולם מורכבי מודלי דעיכה מעריכית. IRF, רכש באמצעות אור העירור מפוזר לא בדיוק מה שדרוש עבור התהליך ההולם כי היא רשמה על גל העירור ולא על גל פליטת קרינה, אשר יכול להשפיע על עיתויה, למרות הווריאציה המרחבית של IRF צריכה להיות זהה בשני אורכי הגל. בנוסף, IRF המפוזר עשויים להיות מוזז גלובלי יחסית בזמן אל IRF הנכון בשל מרחק אופטי שונה מאובייקט הפיזור, כפי שנהוג עבור IRF רכשה מן הגלגל נפק ב FLIM המחולק אופטי. תיקון זה, t 0, המהווה את המשמרת הזמנית העולמית הדרושה שאמורים להיות מיושמת על IRF אור העירור המפוזרת רכש, מחושב מנתוני monoexponential לצבוע התייחסות כמצוין Protocol צעד 4.4. הצבעים הבאים יכולים לשמש עבור אורכי גל עירור שונים: 75 מיקרומטר Coumarin 153 פתרון מתנול (τ ~ 4.3 ns 50) יכול לשמש עירור בטווח 295-442 ננומטר; פתרון מיקרומטר Coumarin 6 75 באתנול (τ ~ 2.43 ns 37) יכול לשמש עירור בטווח 430-500 ננומטר; ופתרון Rhodamine B 75 מיקרומטר במים (τ ~ 1.7 ns 37) יכול לשמש עירור ננו בטווח 488-575. נציין כי, למרות שזה אפשרי FLIMfit להשתמש IRF שונה עבור כל פיקסל של המערכת, בדרך כלל סביר להפוך את ההנחה כי משתנה IRF מרחבית יש אותו הפרופיל זמני עבור כל פיקסל בתמונה אבל מציג מגוון של משתנה קיזוז זמני מרחבית ביחס t 0 העולמי. אנו מתארים זה כמפת משמרת IRF, אשר נקבעה בהתאם IRF האור המפוזרת. יחד, פרופיל IRF, t 0 ומפת IRF המשמרת משמשים enפיקסל בטוח שכל ב FOV מצויד IRF המתאים. חשוב לציין, t 0 יכול להשתנות באיטיות לאורך זמן כך זה צריך להימדד לפני כל רכישת נתונים FLIM.
המשתמש צריך להחליט כיצד לטעום את פרופילי ריקבון פלואורסצנטי נדרש להגדיר את הרוחב של שערים בזמן והעיכובים היחסיים לאחר עירור. באופן כללי, רצוי להשתמש רוחב שער רחב על מנת למקסם את האות זוהה ובדרך כלל אנו משתמשים רוחב שער מוגדר כ -4 ns עבור FLIM של תאים שכותרתו עם חלבוני קרינה. מספר עיכובי זמן שער צריך להיות מספיק כדי לטעום את פרופיל ריקבון הניאון (כולל שער אחד להגדיר למדוד את האות רק לפני דופק העירור) בהתחשב במורכבות של מודל ראוי כי תשמש בניתוח. הערך האופטימלי יכול לסמוך על הגלגולים ואמפליטודות יחסיים של מרכיבי הריקבון. באופן כללי, 4 שערים מספיקים monoexponential הולם דועך תוך 7 או יותר שערים רשאילשמש מודלי ריקבון מורכבים יותר.
נציין כי FLIM יכול להיות מיושם באמצעות מגוון של טכניקות תחום תחום בזמן או תדירות HCA FLIM האוטומטית של מערכי צלחת multiwell יושמה לראשונה מזה readouts (לא חתך) רחב בתחום מיקרוסקופ באמצעות חיים במישור תדר של סריג 51. קורא צלחת multiwell FLIM חתך האופטי האוטומטי הראשון עבור HCA ניצול רחב בתחום הדמית זמן מגודר 28 נמסר אז. בהמשך, רחב בתחום HCA FLIM תחום תדר (לא חתך) יושמה למסך פוסט שינויי translational (זירחון טירוזין) על פני ספרייה גן באמצעות סריג 52 ו HCA FLIM מגודר זמן הוחל על סריג מבחנים של HIV-1 Gag oligomerization 53 ושל SUMOylation של FOXM1 54 ושל Raichu RhoA ו biosensors Rac1 33. כמו כן ניתן להשתמש TCSPC עבור FLIM צלחת multiwell 26 אבל עד כה הוא הוכיח מאתגר להתאים tהוא התפוקה של טכניקות ניצול גילוי רחב בתחום. גישה המתעוררים אחד שיכול לטפל בבעיה זו היא השימוש במערכים של גלאי ספירת פוטון יחידים כגון מערכי SPAD 55.
נציין כי כל מונה המציין הסריג באמצעות חלבוני ניאון ומחייב זהירות כי הערכים המוחלטים של פרמטרים המתקבלים FLIMfit או כל תוכנה לניתוח FLIM אחרת יהיה תלויים בהנחות המשויך למודל ההולם. לדוגמא, שם תורם הסריג יש מרכיב ריקבון שני משמעותי, השימוש במודל biexponential כדי להתאים את נתוני FLIM הסריג יכול לגרום תרומה של רכיב הריקבון מהר, הקשורות בדרך כלל אוכלוסיית FRETing להופיע במיקום גבוהה יותר ממה שהוא צריך. לכן רצוי להשתמש תורמים עם חיים שלמים מונו מעריכים כגון mTq2FP. גם אז, מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי ניתוח סריג עדיין יכול להיות מושפע מדינות אפלות של חלבוני קרינת acceptor או על ידיההטרוגניות של גורם אורינטצית κ 2 עקב חלוקה של תצורות fluorophore עם מגוון רחב של זוויות כרומופור ומרחיקה 56. אף על פי כן, אנו ואחרים הראינו שקריאות חי קרינה של סריג לעשות להניב תוצאות שימושיות המתואמים עם מדידות ביוכימיות יכול לשמש מסך עבור אינטראקציות חלבון או לעקוב דינמיקה של חיישנים ביולוגיים. לפיכך פלטפורמת HCA openFLIM זה יכול להיות מיושמת על מגוון רחב של מבחני קרינה מבוסס חי ניצול סריג או הסלולר autofluorescence 8, כמו גם מתן readouts כמוני של בדיקות מבוססות צבען 25.
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.
microscope frame | Olympus | IX81 | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
optical autofocus | Olympus | ZDC | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
motorized (x-y-z) microscope stage | Marzhauser | 00-24-565-0000 | Stage with Corvus controlle |
excitation laser source | Fianium | SC400-4 | Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/ |
gated optical intensifier | Kentech | High Rate Imager (HRI) | |
delay generators | Kentech | — | See agile delay generator and precision delay generator |
camera | Hamamatsu | ORCA-ER-II | |
Nipkow disc scanner unit | Yokogawa | CSU-X1 | http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/ |
Top hat diffuser | Thorlabs | ED1-S20-MD | Engineered diffusers |
mTq5V | Oxford Genetics | P3850 | mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker |
mTq17V | Oxford Genetics | P3847 | mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker |
mTq32V | Oxford Genetics | P3848 | mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker |
mTq5A | Oxford Genetics | P3849 | mTurquoise Amber construct |
HEK293T | — | — | cell type used |
phenol red-free HBSS | Sigma Aldrich | 55021C-1000ML | imaging media |
culture media | DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics | ||
DMEM | Sigma Aldrich | D6046-500ML | for culture media |
FBS | Sigma Aldrich | 12003C-500ML | for culture media |
xTremeGene9 | Sigma Aldrich | 6.37E+09 | for transfection, follow online protocol from La Roche |
trypsin/EDTA Solution | Thermo Fischer | R001100 | for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer |