हम उपयोग Förster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) आधारित readouts का उपयोग कर प्रोटीन बातचीत परख करने की क्रिया के लिए स्वचालित प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग (flim) एक खुला स्रोत उच्च सामग्री के विश्लेषण (एचसीए) साधन प्रस्तुत करते हैं। इस openFLIM-एचसीए साधन के लिए डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर μManager में लिखा है और डेटा विश्लेषण FLIMfit में किया जाता है के द्वारा नियंत्रित किया जाता है।
We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in µManager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.
परख यौगिक पुस्तकालयों के लिए दवाओं की खोज 1 में स्वचालित उच्च सामग्री के विश्लेषण (एचसीए) के बढ़ते उपयोग के व्यवस्थित अध्ययन, जैसे, siRNA पुस्तकालयों की प्ररूपी स्क्रीन के लिए के लिए स्वचालित इमेजिंग प्रयोगों की दिशा में जीवन विज्ञान अनुसंधान के क्षेत्र में बुनियादी प्रवृत्ति से पूरित है। स्वचालित एचसीए भी छोटे पैमाने जैविक अध्ययन बताते हैं कि आम तौर पर पारंपरिक माइक्रोस्कोप के साथ imaged कोशिकाओं के व्यंजन के दसियों के साथ मैनुअल प्रयोगों के साथ लागू किया गया है के लिए तेजी से महत्वपूर्ण होता जा रहा है। सांख्यिकीय देखने के क्षेत्रों के हजारों लोगों के लिए परख और सैकड़ों विश्लेषण करने की क्षमता द्वारा प्रदत्त शक्ति (सहित "जैविक शोर") और छवि डेटा अधिग्रहण और बड़ा नमूना सरणियों के विश्लेषण के स्वचालन मदद कर सकते हैं ऑपरेटर पूर्वाग्रह को खत्म करने और अक्सर प्रयोगात्मक शोर की औसत सक्षम बनाता है इस तरह के एक अधिग्रहण के दौरान आईआरएफ प्रोफ़ाइल में परिवर्तन के रूप में व्यवस्थित त्रुटियों, की घटना का पता लगाने के लिए उपयोग किया जा सकता है। प्रतिदीप्ति आधारित assaysव्यापक रूप से एचसीए में लागू कर रहे हैं सबसे अधिक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एचसीए इंस्ट्रूमेंटेशन एक या एक से अधिक वर्णक्रम चैनलों में विशेषता प्रतिदीप्ति तीव्रता इमेजिंग रिश्तेदार वितरण और लेबल प्रोटीन की सह स्थानीयकरण नक्शा करने के साथ। ऐसे प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग (flim), ध्रुवीकरण anisotropy इमेजिंग और समय हल प्रतिदीप्ति anisotropy इमेजिंग के रूप में अधिक परिष्कृत प्रतिदीप्ति इमेजिंग तौर तरीकों, व्यापक रूप से वाणिज्यिक एचसीए उपकरणों में शोषण नहीं कर रहे हैं, हालांकि वे शक्तिशाली मात्रात्मक readouts, जैसे, प्रोटीन बातचीत की पेशकश करते हैं। यहाँ हम एचसीए के लिए एक स्वचालित माइक्रोस्कोप में Flim को लागू करने के लिए एक खुला स्रोत दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं।
प्रतिदीप्ति जीवनकाल एक स्वाभाविक ratiometric स्पेक्ट्रोस्कोपी readout अलग आणविक प्रजातियों भेद या एक fluorophore के स्थानीय आणविक पर्यावरण की जांच के लिए और / उत्तेजना का पता लगाने के लिए क्षमता, fluorophore एकाग्रता के प्रति असंवेदनशील है करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदान करता है, और scatte के प्रभाव कोअंगूठी और नमूना अवशोषण 2। इसके अलावा, के बाद से प्रतिदीप्ति जीवनकाल माप एक ही वर्णक्रम चैनल में बनाया जा सकता है, वे सीधे विभिन्न उपकरणों और नमूने के बीच तुलनीय अंशांकन बिना कर रहे हैं। वे कुछ सेलुलर चयापचयों, लिपिड और बाह्य मैट्रिक्स घटकों, जैविक प्रक्रियाओं और विकृतियों के आंतरिक readouts प्रदान करने सहित अंतर्जात fluorophores, के लिए लागू किया जा सकता है। इस प्रकार लेबल मुक्त लिए flim कोशिकाओं 3,4 में चयापचय परिवर्तन नक्शा कर सकते हैं और स्टेम सेल भेदभाव 5,6 और कोलेजन scaffolds 7 के विकास पर नजर रखने के लिए लागू किया गया है। हमने हाल ही में प्रदर्शन किया है कि एचसीए लिए flim सेलुलर चयापचय autofluorescence 8 के उपयोग के स्वचालित लेबल मुक्त assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अधिक सामान्यतः, हालांकि, प्रतिदीप्ति जीवनकाल माप और exogenous लिए flim fluorophores कि विशिष्ट biomolecules लेबल करने के लिए लागू कर रहे हैं, अक्सर, मिलकर रंगों का उपयोग करने के लिए antibodie रंगों कि सेलुलर डिब्बों दाग का उपयोग कर कार्यान्वितकि तय कोशिकाओं में विशिष्ट प्रोटीन लक्ष्य, या विशिष्ट प्रोटीन के लिए युग्मित आनुवंशिक रूप से व्यक्त fluorophores का उपयोग कर। प्रतिदीप्ति जीवनकाल संवेदन अपनी शारीरिक या रासायनिक वातावरण फ्लोरोसेंट जांच के मजबूत मात्रात्मक readouts प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, रंजक सहित संकेतन अणुओं सेल की सांद्रता रिपोर्ट करने के लिए कोशिका झिल्ली 9 या सेल चिपचिपापन 10 और आनुवंशिक रूप से व्यक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन आधारित biosensors के स्थानीय लिपिड चरण भावना के लिए तैनात किया गया है विकसित किया गया है IP3 11, 12 और PIP2 calpain 13 या के रूप में जैसे कैल्शियम 14,15, पोटेशियम और क्लोराइड 16 17 के रूप में आयनों।
कई ऐसे biosensors Forster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) 18,19 का उपयोग biosensor रचना में परिवर्तन की readouts प्रदान करने के लिए। "दाता" और "स्वीकर्ता" fluorophores के बीच झल्लाहट एक कम दूरी की प्रत्यक्ष द्विध्रुवीय-द्विध्रुवीय बातचीत के माध्यम से होता हैजिसके लिए आम तौर पर fluorophores से ~ 10 एनएम कम से अलग होती है। इस प्रकार झल्लाहट का पता लगाने के उचित लेबल प्रोटीन के करीब निकटता इंगित करता है और इसलिए इस तरह के बंधन या oligomerization के रूप में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत 20, बाहर पढ़ने के लिए एक साधन प्रदान करता है – या तो लाइव के समय पाठ्यक्रम माप में तय की कोशिकाओं के रूप में या गतिशील घटनाओं में अंत अंक के रूप में कोशिकाओं। दोनों दाता और स्वीकर्ता fluorophores के साथ एक उपयुक्त आणविक निर्माण लेबल करके, यह भी संभव है गठनात्मक परिवर्तन बाहर पढ़ने के लिए – या दरार – झल्लाहट में परिवर्तन के माध्यम से निर्माण के लिए और यह कई biosensors 21 का आधार है। झल्लाहट दक्षता का मापन दाता स्वीकर्ता दूरी और झल्लाहट के दौर से गुजर दाता fluorophores की आबादी अंश के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं। इस प्रकार, झल्लाहट आधारित इमेजिंग तकनीक नक्शा और quantitate करने के लिए अंतरिक्ष और समय, उदा में आणविक बातचीत, स्पष्ट करने के लिए सेल संकेतन प्रक्रियाओं 22 का इस्तेमाल किया जा सकता है। आटोमैटिक मशीनऐसे इमेजिंग तकनीक आईएनजी रास्ते या नेटवर्क संकेत के readouts के आधार पर उच्च throughput assays प्रदान कर सकता है।
एचसीए में, झल्लाहट readout सबसे अधिक कार्यान्वित वर्णक्रम ratiometric इमेजिंग, जहां दाता तीव्रता को स्वीकर्ता के अनुपात में परिवर्तन मैप कर रहे है। हालांकि इस दृष्टिकोण को आसानी से लागू किया जाता है – और कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध multiwell थाली पाठकों में उपलब्ध है – मात्रात्मक प्रेतसंबंधी सुलझाया झल्लाहट माप प्रणाली 23 के वर्णक्रमीय प्रतिक्रिया की जांच की आवश्यकता है। इस वर्णक्रम पार बात वर्णक्रम खून के माध्यम से और प्रत्यक्ष उत्तेजना स्वीकर्ता के साथ ही उपकरण के संचरण विशेषताओं और नमूना (भीतरी फिल्टर प्रभाव) से उत्पन्न होने वाले भी शामिल है। सिद्धांत रूप में, इस अतिरिक्त "नियंत्रण" के नमूने है कि केवल दाता या स्वीकर्ता केवल किसी के साथ चिह्नित कर रहे हैं की माप पर जोर देता।
इस तरह के वर्णक्रम ratiometric झल्लाहट माप से, एक प्रभावी झल्लाहटदक्षता (वास्तविक झल्लाहट दक्षता और FRETing दाता / स्वीकर्ता अणुओं के अंश का उत्पाद) दाता और स्वीकर्ता अणुओं 24 के सापेक्ष अनुपात के साथ प्राप्त किया जा सकता है। स्पेक्ट्रल ratiometric झल्लाहट अक्सर unimolecular झल्लाहट biosensors, जहां दाता / स्वीकर्ता stoichiometry नाम से जाना माना जा सकता है के साथ प्रयोग किया जाता है। FRETing दाता और स्वीकर्ता, जैसे की आबादी अंशों का निर्धारण करने के लिए, एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र प्राप्त करने के लिए, वास्तविक झल्लाहट दक्षता का ज्ञान आवश्यक है। यह जाना जाता गुणों के साथ एक सकारात्मक झल्लाहट नियंत्रण नमूना मापने के द्वारा या किसी अन्य विधि का उपयोग करते हुए इस तरह के स्वीकर्ता photobleaching या लिए flim के रूप में, झल्लाहट क्षमता को मापने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।
प्रतिदीप्ति जीवनकाल readouts का प्रयोग, झल्लाहट का पता चला है और अकेले दाता उत्सर्जन की माप द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है – वर्णक्रमीय अंशांकन और आगे नियंत्रण के नमूने के लिए की जरूरत को हटाने। इस प्रकार, झल्लाहट लिए flim readouts उपकरणों के बीच तुलना की जा सकतीऔर विभिन्न नमूनों के बीच – एंडोस्कोपी या लाइव रोग मॉडल 25 के टोमोग्राफी से डेटा की इजाजत दी सेल आधारित assays के मापन के खिलाफ बेंचमार्क किया जाना है। एक उपयुक्त बहु घातीय क्षय मॉडल FRETing और गैर-FRETing दाता आबादी के लिए इसी को दाता प्रतिदीप्ति क्षय प्रोफाइल फिटिंग द्वारा, झल्लाहट क्षमता और जनसंख्या भिन्न, सिद्धांत रूप में, आगे माप के बिना सीधे प्राप्त किया जा सकता है। इन महत्वपूर्ण लाभ है, तथापि, प्रेतसंबंधी सुलझाया तीव्रता इमेजिंग से पिक्सेल प्रति अधिक का पता चला फोटॉनों की आवश्यकता होती लिए flim की कीमत पर आ – फोटॉनों के सैकड़ों आम तौर पर जब फिटिंग एक एकल घातीय क्षय मॉडल के लिए और जब 10% के जीवनकाल निर्धारण में एक सटीकता प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं परिसर (multiexponential क्षय) मॉडल के लिए फिटिंग प्रतिदीप्ति क्षय प्रोफाइल, पता चला फोटॉनों की संख्या अपेक्षित हजारों करने के लिए बढ़ जाती है। यह पारंपरिक सेकंड के सैकड़ों vi के क्षेत्र के लिए प्रति (दसियों लंबे अधिग्रहण के समय के लिए प्रेरित कियाईडब्ल्यू) flim के लिए, खासकर जब समय का उपयोग सहसंबद्ध एकल फोटॉन गिनती (TCSPC) लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप में अनुक्रमिक पिक्सेल अधिग्रहण के साथ लागू किया है। उच्च उत्तेजना तीव्रता का उपयोग महत्वपूर्ण photobleaching और / या phototoxicity को जन्म दे सकता द्वारा इमेजिंग की गति को बढ़ाने के लिए प्रयास करता है। साथ में उचित व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरण और सॉफ्टवेयर उपकरणों की कमी के साथ, इस दवा की खोज या सिस्टम जीव विज्ञान, जहां देखने के क्षेत्रों के हजारों सैकड़ों imaged किया जा रहे हैं के लिए एचसीए में उपयोग किया जा रहा से लिए flim रुकावट है। लेजर स्कैनिंग TCSPC लिए flim माध्यमिक मापन के लिए एक स्वचालित multiwell थाली माइक्रोस्कोप 26 में स्थिर राज्य ध्रुवीकरण हल प्रतिदीप्ति anisotropy इमेजिंग 27 है, जो वर्णक्रम ratiometric इमेजिंग 28 के साथ जो यह शेयरों के समान इमेजिंग गति तक पहुँच सकते द्वारा 'हिट' की पहचान के बाद लागू किया गया है कई फायदे और नुकसान। प्रतिदीप्ति इमेजिंग anisotropy कमी कारनामेझल्लाहट की उपस्थिति में स्वीकर्ता के प्रतिदीप्ति anisotropy में और भी वर्णक्रम पार बात (जैसे, स्वीकर्ता के प्रत्यक्ष उत्तेजना) के प्रति संवेदनशील है। यह ध्रुवीकरण पार बात के लिए खाते में अंशांकन की आवश्यकता है और झल्लाहट दक्षता का एक सीधा माप प्रदान नहीं करता है।
एचसीए के लिए लिए flim के फायदे का एहसास करने के लिए, हम छवि अधिग्रहण की गति और प्रौद्योगिकी के व्यापक उपयोग के मुद्दों का समाधान करने के लिए काम किया है। यहाँ, हम खुला स्रोत सॉफ्टवेयर और हार्डवेयर घटक है कि स्वचालित तेजी से लिए flim multiwell प्लेट रीडर है कि नीचे कापी झल्लाहट आधारित assays के साथ वर्णन किया गया है, एक साथ लागू करने के लिए उपयोग किया जा सकता है की एक पूरी सूची प्रदान करते हैं। हमारे दृष्टिकोण से 29 में, लिए flim व्यापक क्षेत्र के लिए समय-गेटेड इमेजिंग का उपयोग कर एक Gated ऑप्टिकल छवि intensifier (भारत सरकार) है, जो चित्रा 1 है कि तेजी से इमेजिंग दरों के कारण एकल बीम स्कैनिंग TCSPC की तुलना में कम photobleaching प्रदान कर सकते हैं में सचित्र है का उपयोग कर एहसास हो रहा है समानांतर पिक्सेल interrogation। हमारे openFLIM-एचसीए साधन unsupervised लिए flim प्रदान कर सकते हैं, पिक्सेल प्रति कुछ 100 फोटॉनों (नमूना की चमक के आधार पर) का पता लगाने के लिए flim डेटा प्राप्त करने के लिए केवल कुछ ही सेकंड की आवश्यकता होती है। , समय देखने के पिछले क्षेत्र से स्थानांतरित करने के लिए नमूना, अधिग्रहण सेटिंग्स समायोजित करने के लिए और ध्यान में नमूना बनाए रखने की आवश्यकता के साथ संयुक्त यह आम तौर पर multiwell थाली अधिग्रहण के समय में ~ 10 S क्षेत्र देखें प्रति 25,28 का परिणाम है। ऑप्टिकल सेक्शनिंग एक अर्ध-चौड़े क्षेत्र Nipkow ( "कताई डिस्क") स्कैनर 30 का उपयोग कर कार्यान्वित किया जा सकता है।
लिए flim डेटा विश्लेषण के लिए, हम है कि तेजी से पारंपरिक पीसी कार्यस्थानों पर multiwell थाली लिए flim डेटासेट का विश्लेषण करने में सक्षम है और एक प्लग में Omero 32 के लिए है FLIMfit 31 नामक एक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर उपकरण विकसित किया है। FLIMfit वैश्विक विश्लेषण क्षमताओं (धारा 1.2 में चर्चा की है) कि ओ के साथ जटिल मॉडल के लिए फिट होने की लिए flim डेटा सक्षम प्रदान करता हैधारणा है कि प्रतिदीप्ति जीवनकाल घटकों एक छवि या ब्याज (आरओआई) के पूरे क्षेत्र में अपरिवर्तनीय हैं अंतर्गत पिक्सेल प्रति कुछ 100 फोटॉनों nly, इसलिए आवश्यक पता चला फोटॉनों की संख्या, नमूना और छवि अधिग्रहण के समय पर प्रकाश जोखिम को कम करने। एक मानक डेस्कटॉप पीसी पर FLIMfit चल रहा है, कम्प्यूटेशनल समय के सेकंड की ही आवश्यकता है 10s FOVs के सैकड़ों जिसमें डेटा सेट का विश्लेषण करने के लिए। इस प्रकार दोनों लिए flim डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण timescales कि एचसीए के लिए व्यावहारिक हैं पर किया जा सकता है।
openFLIM-एचसीए हार्डवेयर
लिए flim एचसीए की हमारी कार्यान्वयन छह प्रमुख घटक शामिल हैं: (i) ऑप्टिकल ऑटोफोकस के साथ एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी फ्रेम; (Ii) एक मोटर चालित (xyz) खुर्दबीन मंच; (Iii) एक उत्तेजना लेजर स्रोत; (Iv) Gated ऑप्टिकल intensifier (भारत सरकार), देरी जनरेटर और कैमरे के साथ एक व्यापक क्षेत्र के लिए समय-गेटेड लिए flim प्रणाली; (V) डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण और (vi) एक Nipkow डिस्क स्कैनर के लिए एक कंप्यूटरऑप्टिकली sectioned इमेजिंग के लिए यूनिट फोकस प्रकाश से बाहर दबाने के लिए। यह महत्वपूर्ण कमजोर संकेतों, जैसे जब इमेजिंग सेल प्लाज्मा झिल्ली पर झल्लाहट biosensors, कि cytoplasmic प्रतिदीप्ति या पृष्ठभूमि coverslips या संस्कृति के माध्यम से योगदान से लादा जा सकता है, हो सकता है। समय-गेटेड लिए flim डेटा, ultrashort स्पंदित उत्तेजना विकिरण के साथ नमूना रोशन इमेजिंग भारत सरकार की photocathode करने के लिए प्रतिदीप्ति उत्सर्जन और के समय में देरी की सेटिंग्स की एक श्रृंखला के लिए भारत सरकार की भास्वर की सीसीडी छवियों की एक श्रृंखला प्राप्त करने से अधिग्रहण कर लिया है उत्तेजना दालों के आने के बाद ऑप्टिकल intensifier गेट। समय गेट देरी उत्तेजना के रूप में निम्नलिखित वृद्धि हुई है, प्रतिदीप्ति संकेत कम करने के लिए देखा जाता है और समय-गेटेड प्रतिदीप्ति तीव्रता सीसीडी पर अधिग्रहीत छवियों की श्रृंखला देखने के क्षेत्र में सभी fluorophores के क्षय प्रोफाइल विश्लेषण करने के लिए आवश्यक डेटा सेट के रूप में । भारत सरकार के gating उत्तेजना दालों को सिंक्रनाइज़ हैऔर, सीसीडी अधिग्रहण की श्रृंखला के लिए, उत्तेजना दालों के समय गेट रिश्तेदार की देरी वांछित सीमा से अधिक मूल्यों में वृद्धि की एक श्रृंखला के लिए निर्धारित है। इस तुल्यकालन देरी जनरेटर है कि एक "जल्दी देरी बॉक्स" (देरी 1 PS चरणों में 20 एनएस तक उपलब्ध कराने के) और एक "मोटे देरी बॉक्स" है कि 25 पीएस की एक न्यूनतम कदम के साथ देरी प्रदान करता है शामिल हैं का उपयोग कर हासिल की है।
Flim के लिए, उत्तेजना किसी भी ultrafast लेजर द्वारा प्रदान की जा सकती है। सुविधा के लिए, हम आम तौर पर एक फाइबर लेजर पंप supercontinuum स्रोत है कि दृश्य स्पेक्ट्रम उचित उत्तेजना विकिरण से अलग बैंड पास फिल्टर के साथ एक मोटर चालित फिल्टर पहिया का उपयोग कर किसी भी fluorophore लिए चुना जा सकता भर पीकोसैकन्ड दालों ट्यून करने योग्य प्रदान करता है रोजगार। आमतौर पर, हम 40 या 60 मेगाहर्ट्ज पुनरावृत्ति दर पर दालों के साथ नमूना ~ 100-200 μW के एक औसत बिजली का उपयोग करें। इस तरह की उत्तेजना शक्तियां भी ultrafast लेजर की आवृत्ति दोहरीकरण पर आधारित स्रोतों द्वारा प्रदान किया जा सकता हैमोड बंद टाइटेनियम डाल दिया गया नीलमणि लेज़रों। ध्यान दें कि नीचे ~ 100 पीएस एक उत्तेजना पल्स अवधि सबसे प्रयोगों के लिए पर्याप्त है। एक दूसरी मोटर चालित फिल्टर तटस्थ घनत्व फिल्टर के साथ सुसज्जित पहिया उत्तेजना तीव्रता को विनियमित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। सुरक्षा और सुविधा के लिए, उत्तेजना विकिरण एक एकल मोड ऑप्टिकल फाइबर के माध्यम से दिया जा सकता है। व्यापक क्षेत्र और ऑप्टिकली लिए flim sectioned flim के लिए विन्यास क्रमशः आंकड़े 2 और 3 में प्रस्तुत कर रहे हैं। सटीक इस्तेमाल किया घटकों की अधिक जानकारी के लिए, कृपया openFLIM-एचसीए विकि 33 पर जाएँ। वर्तमान भागों सूची की एक प्रति पूरक सामग्री में दी गई है।
व्यापक क्षेत्र flim के लिए, उत्तेजना विकिरण के रूप में समान रूप से संभव के रूप में देखने के पूरे क्षेत्र रोशन करने के लिए आवश्यक है। इसके लिए हमें एक होलोग्राफिक "शीर्ष टोपी" विसारक कि 10-50 हर्ट्ज पर समय-औसत करने के लिए लेजर बिंदु घुमाया जा रहा है करने के लिए उत्तेजना लेजर बीम प्रत्यक्ष, अलग से विमान के साथफ्यूज़र उद्देश्य माइक्रोस्कोप के लेंस के पीछे फोकल हवाई जहाज़ के लिए imaged किया जा रहा। माइक्रोस्कोप के उत्पादन बंदरगाह से प्रतिदीप्ति छवि भारत सरकार की photocathode और भारत सरकार (सक्रिय क्षेत्र विकर्ण 18 मिमी) की भास्वर पर रिले किया जाता है एक ठंडा वैज्ञानिक सीसीडी (चिप का आकार 10.2 मिमी x 8.3 मिमी) के संवेदक पर imaged है कैमरा 0.7 की एक बढ़ाई उपलब्ध कराने कैमरे के लेंस की एक जोड़ी का उपयोग कर। प्रणाली एक मानक पीसी है कि इंस्ट्रूमेंटेशन RS232 प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए interfaced है द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इसके अलावा, एक Arduino माइक्रोप्रोसेसर उत्तेजना प्रकाश रास्ते में एक शटर सिवाय इसके कि आप बंद हो जाता है जब सीसीडी कैमरा लिए flim डेटा प्राप्त कर रही है और एक photodiode कि supercontinuum प्रेतसंबंधी फ़िल्टर से औसत शक्ति को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है से संकेत रिकॉर्ड करने के लिए नियंत्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है उत्तेजना स्रोत। ऑप्टिकली sectioned flim के लिए, उत्तेजना लेजर विकिरण, एक एकल मोड ध्रुवीकरण को बनाए रखने के लिए ऑप्टिकल फाइबर कि Nipkow डिस्क स्कैनर इकाई के लिए सीधे जोड़ता में युग्मित है के रूप मेंhown चित्रा 3 में। Nipkow स्कैनर इकाई से उत्पादन प्रतिदीप्ति छवि भारत सरकार की photocathode पर रिले किया जाता है और इस प्रणाली के बाकी व्यापक क्षेत्र flim के लिए के रूप में ही है।
openFLIM-एचसीए सॉफ्टवेयर
डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर μManager 34 में लिखा है। यह पूर्ण एचसीए डाटा अधिग्रहण अनुक्रम में जो थाली के कुओं imaged हैं बदलने के लिए, किसी भी FOV के लिए समय पाठ्यक्रम प्राप्त करने के लिए, स्वचालित रूप से माप के दौरान ध्यान बनाए रखने के लिए और उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर पहियों और dichroic परिवर्तक नियंत्रित करने के लिए विकल्प सहित कार्यक्षमता प्रदान करता है स्वचालित बहुरंगा इमेजिंग के लिए। यह भी आदेश स्वतः मानदंड, जैसे, तीव्रता के आधार पर के अनुसार बाद में एक लिए flim अधिग्रहण के लिए पहचान करने और उपयुक्त FOVs के पदों को रिकॉर्ड करने के लिए में प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक "Prescan" अधिग्रहण को चलाने के लिए संभव है। एचसीए लिए flim डेटा एक श्रृंखला के रूप में बचाया जा सकता हैझगड़ा फ़ाइलों की, OME-झगड़ा फ़ाइलों की एक श्रृंखला के रूप में (यानी, FOV प्रति एक) या एक ही OME-झगड़ा फ़ाइल एक multiwell थाली से सभी डेटा को शामिल करने के रूप में। अधिक जानकारी और μManager सॉफ्टवेयर के एक विस्तृत वर्णन openFLIM-एचसीए विकि 33 पर पाया जा सकता है।
डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर, 31 FLIMfit, Omero छवि डेटा प्रबंधन मंच 32 के लिए एक खुला स्रोत MATLAB आधारित ग्राहक के रूप में चित्रा 4 में संकेत दिया है, एक Omero सर्वर से या कंप्यूटर डिस्क से लिए flim डेटा को पढ़ने में सक्षम है। यह TCSPC या व्यापक क्षेत्र के लिए समय-गेटेड लिए flim उपकरणों से डेटा का विश्लेषण करने के लिए डिजाइन किया गया है और कई क्षमताओं क्षय प्रोफाइल monoexponential के लिए फिटिंग सहित openFLIM-एचसीए से डेटा फिट करने के लिए, और जैसे मॉडल सहित घातीय और उच्च जटिलता क्षय प्रोफाइल, डबल करने के लिए प्रदान करता है ध्रुवीकरण हल प्रतिदीप्ति क्षय प्रोफाइल। यह भी तय है और समय-अलग पृष्ठभूमि संकेतों के खाते में ले जा सकते हैं और यूटीआई कर सकते हैंLize एक मापा स्थानिक-सामयिक साधन प्रतिक्रिया समारोह (आईआरएफ) या एक आर्दश आईआरएफ का उपयोग कर समय-स्थानांतरित पूर्ण प्रयोगात्मक आईआरएफ माप से निर्धारित राशि से एक पिक्सेल-वार आधार पर हो सकता है कि फिट कर सकते हैं। एक वैश्विक समय का अंतर (टी 0) आईआरएफ और एक फ्लोरोसेंट नमूना के बीच एक प्रतिदीप्ति मानक की एक माप से निर्धारित किया जा सकता है। पृष्ठभूमि संकेतों और आईआरएफ में स्थानिक विविधताओं भी ध्यान में रखा जा सकता है। FLIMfit या "वैश्विक binning" या "वैश्विक फिटिंग" का उपयोग मामूली (सैकड़ों) के साथ लिए flim डेटा की फिटिंग की सुविधा के लिए जटिल क्षय मॉडल करने के लिए संख्या फोटान एक पिक्सेल-वार आधार पर लिए flim डेटा फिट करने में सक्षम है।
वैश्विक binning हर समय बिंदु पर एक उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित रॉय के भीतर पिक्सल से सभी का पता चला फोटॉनों कुल जटिल क्षय मॉडल के लिए फिटिंग सक्षम करने के लिए पर्याप्त संख्या फोटॉन प्रदान करने पर जोर देता। रॉय (FOV) देखने के पूरे क्षेत्र हो सकता है, इसे मैन्युअल हो सकता है घउपयोगकर्ता द्वारा efined, या यह छवि विभाजन उपकरण का उपयोग निर्धारित किया जा सकता है। रॉय भी अन्य छवि विभाजन सॉफ्टवेयर से FLIMfit में आयात मास्क का उपयोग करने में परिभाषित किया जा सकता है। झल्लाहट अनुप्रयोगों के लिए, यह वैश्विक binning का उपयोग करने के लिए एक डबल घातीय क्षय मॉडल के लिए फिट करने के लिए प्रतिदीप्ति जीवनकाल FRETing और गैर-FRETing दाता fluorophores के लिए इसी घटक है कि रॉय भर स्थानिक अपरिवर्तनीय हो ग्रहण कर रहे हैं निर्धारित करने के लिए और फिर एक पर मरम्मत के लिए आम है इन आजीवन घटक Vales क्रम में प्रत्येक पिक्सेल में FRETing दाता आबादी अंश प्राप्त करने के लिए तय साथ पिक्सेल वार आधार।
वैश्विक फिटिंग एक साथ एक पूरी FOV- भर में या एक लिए flim डेटा सेट है कि कई FOVs, उदाहरण के लिए एक multiwell थाली प्रयोग या प्रतिदीप्ति जीवनकाल छवियों का एक समय श्रृंखला से, शामिल कर सकता भर में जीवन भर के घटकों और पिक्सेल वार FRETing दाता आबादी अंशों ढाले पर जोर देता। वैश्विक फिटिंग स्थानिक variati शोषण करने में सक्षम हैकाफी अधिक गणना 35 की कीमत पर यद्यपि – और इसलिए अधिक विश्वसनीय परिणाम – छवि भर में जनसंख्या अंशों कि वैश्विक दृष्टिकोण binning में खो दिया है घटक जीवन भर के आकलन पर मजबूत बाधाओं प्रदान करने के लिए की है। FLIMfit तेजी से साथ पारंपरिक पीसी कार्यस्थानों पर वैश्विक फिटिंग के साथ multiwell थाली लिए flim डेटासेट, उदाहरण के लिए विश्लेषण कर सकते हैं, एक multiwell समय-गेटेड लिए flim डेटा सेट, 394 FOV प्रत्येक 672 x 512 पिक्सल जिसमें से प्रत्येक के लिए पांच बार फाटक के साथ हासिल कर ली है, केवल 32 सेकंड की आवश्यकता होती है और स्मृति के 2 GB एक डबल घातीय क्षय मॉडल 31 को फिट करने के लिए। यह एक वियोज्य nonlinear कम से कम वर्ग फिटिंग एल्गोरिथ्म मल्टीकोर प्रोसेसर और FLIMfit कोड स्मृति के उपयोग को कम करने के लिए अनुकूलित किया गया है पर प्रभावी स्केलिंग सक्षम करने के लिए थ्रेड समानांतर एल्गोरिदम का उपयोग कर कार्यान्वित का उपयोग करके हासिल किया गया है। चित्रा 5 FLIMfit के ग्राफिकल यूजर इंटरफेस की एक स्नैपशॉट से पता चलताऔर अधिक जानकारी के संदर्भ में दिए गए वैश्विक फिटिंग और वैश्विक binning पर 36. अधिक जानकारी वेब पेज में पाया जा सकता संदर्भ 31 में पाया जा सकता है।
हमारे openFLIM-एचसीए उपकरण और सॉफ्टवेयर का उपयोग कर लिए flim एचसीए के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल लिए flim readouts के साथ सेल इमेजिंग प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। सामान्य तौर पर, multiwell थाली झल्लाहट प्रयोगों अध्ययन किया जा रहा शर्तों के अलावा सकारात्मक और नकारात्मक जैविक नियंत्रण के दोहराने कुओं शामिल करने के लिए तैयार किया जाना चाहिए। यहाँ, हम ऑप्टिकली sectioned लिए flim प्रदर्शन करने के लिए विशिष्ट कार्यान्वयन का वर्णन क्योंकि कोशिकाओं झल्लाहट mTurquoise फ्लोरोसेंट प्रोटीन और वीनस फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक छोटी पेप्टाइड लिंकर से जुड़े हुए से मिलकर constructs व्यक्त की (चित्रा 3 देखें)। यहाँ mTq32V, mTq17V और mTq5V झल्लाहट निर्माणों (प्रतिनिधि परिणाम खंड में चर्चा) एक साथ गैर FRETing mTq5A निर्माण के साथ कम, मध्यम और उच्च झल्लाहट क्षमता प्रदान करते हैं।इन निर्माणों और अन्य सामग्री इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए आवश्यक सामग्री सूची में सूचीबद्ध हैं।
हम समय-गेटेड लिए flim का उपयोग कर एचसीए के लिए बनाया गया एक स्वचालित multiwell थाली माइक्रोस्कोप का वर्णन किया है। इस उपकरण के लिए एक Omero सर्वर और लिए flim डेटा विश्लेषण के लिए डेटा को बचाने का विकल्प FLIMfit 36, एक खुला स्रोत कार्यक्रम Matlab में लिखा है और एक Omero ग्राहक 32 μManager साधन के रूप में उपलब्ध का उपयोग किया जा रहा है साथ μManager में लिखा खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग कर नियंत्रित किया जाता है नियंत्रण सॉफ्टवेयर, openFLIM-HCA, ऑनलाइन 33 उपलब्ध अपने स्वयं के लिए flim एचसीए उपकरणों का निर्माण करने के लिए अकादमिक शोधकर्ताओं सक्षम करने के लिए प्रणाली घटकों 48 की एक सूची के साथ है।
मजबूत लिए flim डेटा प्राप्त करने के क्रम में, यह भारत सरकार और सीसीडी अधिग्रहण सेटिंग्स अनुकूलन करने के लिए और टी 0 में किसी भी बदलाव के खाते में लेने के लिए आवश्यक है। 3.8.2 में वर्णित है, भारत सरकार लाभ सेटिंग और सीसीडी कैमरा एकीकरण के समय ~ तक पहुंचने के लिए सीसीडी गतिशील रेंज के 75% सेट किया जाना चाहिए। यूहर बार गेट देरी पर उच्च वोल्टेज और भारत सरकार के कई सीसीडी फ्रेम राशि गाते शोर अनुपात 49 के संकेत बढ़ जाती है लेकिन इस कुल लिए flim अधिग्रहण समय (के बाद से कम प्रतिदीप्ति फोटॉनों सीसीडी कैमरा संतृप्त और इतने फ्रेम राशि की संख्या पहले फ्रेम प्रति अर्जित कर रहे हैं बढ़ जाती है वृद्धि की जानी चाहिए) और इसलिए यह व्यापार बंद एक प्रयोग के लिए निर्णय लिया जाना चाहिए। देरी जनरेटर की जांच लेजर पुनरावृत्ति दर पर निर्भर करता है और यह सुनिश्चित करना है कि इस्तेमाल किया पुनरावृत्ति दर के लिए सही अंशांकन फ़ाइल अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में लोड किया जाता है इसलिए आवश्यक है। देरी बॉक्स औजार के लिए प्रक्रिया openFLIM-एचसीए विकि 33 पर पाया जा सकता है।
अगर सेलुलर autofluorescence प्रतिदीप्ति संकेत की तुलना में कम है, हम एक अच्छी तरह से युक्त सिर्फ संस्कृति के माध्यम से संकेत का उपयोग समय-अलग पृष्ठभूमि (TVB) प्रदान करने के लिए। सेल संस्कृति के माध्यम से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम से कम करने के लिए, हम से बचनेफिनोल लाल युक्त मीडिया। अगर सेलुलर autofluorescence महत्वपूर्ण है, तो TVB लेबल हटाया गया कोशिकाओं की माप से प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, इस मामले की देखभाल में लिया जाना चाहिए, क्योंकि यह मानता है कि autofluorescence पृष्ठभूमि छवि में हर पिक्सेल के लिए ही है। यह धारणा वैध यदि autofluorescence एक सेल भर में या यदि उत्तेजना बीम या संवेदनशीलता का पता लगाने देखने के क्षेत्र भर में एक समान नहीं है काफी भिन्न होता है नहीं होगा।
बिखरे हुए उत्तेजना प्रकाश दालों का उपयोग कर एक आईआरएफ छवि के अधिग्रहण अस्थायी आईआरएफ प्रोफ़ाइल है कि फिटिंग प्रक्रिया में डेटा मॉडल के साथ convolved है प्रदान करता है और यह भी देखने के क्षेत्र भर में आईआरएफ के स्थानिक विभिन्नता का एक नक्शा प्रदान करता है। आईआरएफ हमारे साधन में, इस तरह के एक कोलाइडयन निलंबन यद्यपि के रूप में एक बिखरने नमूना इमेजिंग द्वारा मापा जा सकता है, उत्तेजना प्रकाश बिखरे हुए Nipkow डिस्क से आईआरएफ के एक क्लीनर माप प्रदान करता है का उपयोग कर। समय ओ का सही निर्धारणएफ आईआरएफ, क्योंकि उत्तेजना और समय gating के बीच के समय में देरी में त्रुटियों को काफी फिटिंग प्रक्रिया को प्रभावित कर सकता महत्वपूर्ण है, खासकर जब जटिल घातीय क्षय मॉडल के लिए फिटिंग। आईआरएफ बिखरे उत्तेजना प्रकाश क्योंकि यह उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर बजाय प्रतिदीप्ति उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य में दर्ज की गई है कि क्या वास्तव में फिटिंग प्रक्रिया के लिए आवश्यक है नहीं है, जो अपने समय को प्रभावित कर सकते हैं का उपयोग कर, हालांकि आईआरएफ के स्थानिक विभिन्नता ही होना चाहिए अधिग्रहण किया दोनों तरंग दैर्ध्य। इसके अलावा, बिखरे हुए आईआरएफ विश्व स्तर पर सच आईआरएफ के लिए समय सापेक्ष में बिखरने वस्तु से एक भिन्न ऑप्टिकल पथ की लंबाई की वजह से स्थानांतरित किया जा सकता है एक आईआरएफ ऑप्टिकली sectioned लिए flim में Nipkow डिस्क से अधिग्रहण के लिए मामला है। यह सुधार, टी 0, जो आवश्यक वैश्विक अस्थायी बदलाव है कि अधिग्रहण किया बिखरे हुए उत्तेजना प्रकाश आईआरएफ के लिए लागू किया जाना चाहिए, monoexponential संदर्भ डाई डेटा से गणना की है के रूप में Protoc में संकेतराजभाषा कदम 4.4। निम्नलिखित रंगों अलग उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: एक 75 माइक्रोन के Coumarin 153 मेथनॉल में समाधान (τ ~ 4.3 एनएस 50) रेंज 295-442 एनएम में उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; इथेनॉल में एक 75 माइक्रोन के Coumarin 6 समाधान (τ ~ 2.43 एनएस 37) रेंज 430-500 एनएम में उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; और एक 75 माइक्रोन के पानी में Rhodamine बी समाधान (τ ~ 1.7 एनएस 37) रेंज 488-575 एनएम में उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम उस पर ध्यान दें, हालांकि यह FLIMfit प्रणाली के प्रत्येक पिक्सेल के लिए एक अलग आईआरएफ का उपयोग करने के लिए संभव है, आमतौर पर यह धारणा है कि स्थानिक बदलती आईआरएफ छवि में हर पिक्सेल के लिए ही अस्थायी प्रोफ़ाइल है बनाने के लिए उचित है, लेकिन एक श्रृंखला प्रस्तुत के स्थानिक वैश्विक टी 0 के सापेक्ष अस्थायी ऑफसेट अलग। हम आईआरएफ पारी नक्शा है, जो बिखरे हुए प्रकाश आईआरएफ से निर्धारित किया जाता है के रूप में इस का वर्णन है। साथ में, आईआरएफ प्रोफाइल, टी 0 और आईआरएफ पारी नक्शा एन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंसुनिश्चित करें कि FOV में प्रत्येक पिक्सेल एक उपयुक्त आईआरएफ के साथ फिट है। महत्वपूर्ण बात है, टी 0 समय के साथ धीरे-धीरे भिन्न हो सकते हैं तो यह किसी भी लिए flim डाटा अधिग्रहण से पहले मापा जाना चाहिए।
उपयोगकर्ता फैसला करना चाहिए प्रतिदीप्ति क्षय प्रोफाइल नमूने के लिए कैसे और समय-द्वार और उत्तेजना के बाद उनके रिश्तेदार देरी की चौड़ाई निर्धारित करने के लिए आवश्यक है। सामान्य में, यह पता लगाया संकेत अधिकतम करने के लिए व्यापक फाटक की चौड़ाई का उपयोग करने के लिए और आम तौर पर हम फाटक की चौड़ाई प्रतिदीप्ति प्रोटीन के साथ लेबल की कोशिकाओं के flim के लिए 4 एनएस करने के लिए सेट का उपयोग वांछनीय है। समय-गेट देरी की संख्या (एक गेट सिर्फ उत्तेजना नाड़ी से पहले संकेत को मापने के लिए सेट सहित) फिटिंग मॉडल की जटिलता है कि विश्लेषण में इस्तेमाल किया जाएगा दी फ्लोरोसेंट क्षय प्रोफ़ाइल नमूने के लिए पर्याप्त होना चाहिए। अधिकतम मूल्य जन्मों और क्षय घटकों के रिश्तेदार आयाम पर निर्भर कर सकते हैं। सामान्य में, 4 फाटकों फिटिंग monoexponential के लिए पर्याप्त हैं decays जबकि 7 या अधिक फाटक मईऔर अधिक जटिल क्षय मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
हम ध्यान दें कि लिए flim झल्लाहट 51 की आवृत्ति डोमेन जीवन भर readouts का उपयोग कर समय-डोमेन या आवृत्ति डोमेन तकनीक की एक सीमा का उपयोग कर कार्यान्वित किया जा सकता है और multiwell थाली सरणियों के स्वचालित लिए flim एचसीए पहली बार एक (गैर सेक्शनिंग) में लागू किया गया था व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप। पहला स्वचालित ऑप्टिकल सेक्शनिंग लिए flim multiwell थाली एचसीए के लिए उपयोग व्यापक क्षेत्र के लिए समय-गेटेड इमेजिंग 28 पाठक तो बताया गया था। बाद में, व्यापक क्षेत्र (गैर सेक्शनिंग) आवृत्ति डोमेन लिए flim एचसीए पोस्ट translational संशोधनों (tyrosine फोस्फोराइलेशन) झल्लाहट 52 का उपयोग कर एक जीन पुस्तकालय और समय-गेटेड लिए flim एचसीए भर के लिए स्क्रीन करने के लिए लागू किया गया था एचआईवी -1 झूठ assays झल्लाहट करने के लिए लागू किया गया है oligomerization 53 और 54 FOXM1 की और Raichu RhoA और Rac1 biosensors 33 के sumoylation की। यह भी multiwell थाली लिए flim 26 के लिए लेकिन आज तक यह टी मैच के लिए चुनौतीपूर्ण साबित कर दिया है TCSPC उपयोग करना संभव हैवह व्यापक क्षेत्र का पता लगाने का शोषण तकनीक के throughput। एक उभरते दृष्टिकोण है कि इस मुद्दे के समाधान हो सकता है इस तरह के SPAD सरणियों 55 के रूप में एक फोटान गिनती डिटेक्टरों की सरणियों का इस्तेमाल होता है।
हम ध्यान दें कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग झल्लाहट के किसी भी readouts सावधानी के साथ और कहा कि FLIMfit या किसी अन्य लिए flim विश्लेषण सॉफ्टवेयर से प्राप्त फिटिंग मॉडल के साथ जुड़े मान्यताओं पर निर्भर करेगा मापदंडों के निरपेक्ष मूल्यों व्यवहार किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, जहां झल्लाहट दाता एक महत्वपूर्ण दूसरे क्षय घटक है, उसके लिए एक biexponential मॉडल के उपयोग के लिए flim झल्लाहट डेटा फिट करने के लिए तेजी से क्षय घटक के योगदान, आम तौर पर FRETing आबादी की तुलना में यह चाहिए उच्च प्रदर्शित होने के साथ जुड़े हो सकती है। यह इस तरह के mTq2FP के रूप में एक मोनो घातीय जीवन भर के साथ दाताओं का उपयोग करने के लिए इसलिए वांछनीय है। फिर भी, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि झल्लाहट विश्लेषण अभी भी स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति प्रोटीन का या से अंधेरा राज्यों से प्रभावित किया जा सकता हैक्रोमोफोर कोण की एक किस्म के साथ fluorophore रचना का वितरण करने के लिए और कारण 2 κ उन्मुखीकरण कारक की विविधता 56 दूरी। फिर भी, हम और दूसरों को पता चला है कि झल्लाहट के प्रतिदीप्ति जीवनकाल readouts उपयोगी परिणाम है कि जैव रासायनिक माप के साथ सहसंबंधी और प्रोटीन बातचीत के लिए स्क्रीन या biosensors की गतिशीलता का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का उत्पादन करते हैं। इस प्रकार इस openFLIM एचसीए मंच प्रतिदीप्ति जीवनकाल आधारित assays झल्लाहट या सेलुलर autofluorescence 8 का उपयोग, साथ ही डाई आधारित जांच 25 की मात्रात्मक readouts उपलब्ध कराने की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.
microscope frame | Olympus | IX81 | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
optical autofocus | Olympus | ZDC | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
motorized (x-y-z) microscope stage | Marzhauser | 00-24-565-0000 | Stage with Corvus controlle |
excitation laser source | Fianium | SC400-4 | Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/ |
gated optical intensifier | Kentech | High Rate Imager (HRI) | |
delay generators | Kentech | — | See agile delay generator and precision delay generator |
camera | Hamamatsu | ORCA-ER-II | |
Nipkow disc scanner unit | Yokogawa | CSU-X1 | http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/ |
Top hat diffuser | Thorlabs | ED1-S20-MD | Engineered diffusers |
mTq5V | Oxford Genetics | P3850 | mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker |
mTq17V | Oxford Genetics | P3847 | mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker |
mTq32V | Oxford Genetics | P3848 | mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker |
mTq5A | Oxford Genetics | P3849 | mTurquoise Amber construct |
HEK293T | — | — | cell type used |
phenol red-free HBSS | Sigma Aldrich | 55021C-1000ML | imaging media |
culture media | DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics | ||
DMEM | Sigma Aldrich | D6046-500ML | for culture media |
FBS | Sigma Aldrich | 12003C-500ML | for culture media |
xTremeGene9 | Sigma Aldrich | 6.37E+09 | for transfection, follow online protocol from La Roche |
trypsin/EDTA Solution | Thermo Fischer | R001100 | for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer |