우리는 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 기초 판독하여 단백질 상호 작용을 분석 자동화 형광 수명 이미징 (FLIM)을 이용하는 오픈 소스 고 함량 분석 (HCA) 기기를 제시한다. 이 openFLIM-HCA 기기에 대한 데이터 수집은 소프트웨어 μManager 작성 및 데이터 분석 FLIMfit에 착수에 의해 제어된다.
We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in µManager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.
분석 화합물 라이브러리에 대한 신약 개발 1 자동화 된 고 함량 분석 (HCA)의 사용 증가는 siRNA를 라이브러리의 표현형 화면에 대한 체계적인 연구, 예를 들어, 자동화 된 이미징 실험으로 생명 과학 기초 연구의 경향에 의해 보완된다. 자동화 된 HCA는 일반적으로 기존의 현미경으로 몇 군데 세포의 요리 수십와 수동 실험으로 구현 된 작은 규모의 생물학적 연구에 점점 더 중요 해지고있다. 보기의 필드의 수천 수백을 분석하고 분석 할 수있는 능력에 의해 부여 된 통계 전력 및 운영자 편견을 제거하고 자주 도움이 될 수 있습니다 이미지 데이터 수집 및 대형 샘플 배열 분석의 자동화 ( "생물학적 잡음"포함) 실험 잡음의 평균 수 이러한 취득시 IRF 프로파일의 변경으로 체계적인 오류의 발생을 검출하는데 사용될 수있다. 형광 기반의 분석가장 널리 시판 HCA 계측 상대적 분포 표지 단백질의 공동 지역화 매핑하는 하나 이상의 분광 채널에서 형광 강도를 갖춘 촬상와 HCA에 구현된다. 그들은 단백질 상호 작용의 예를 들어 강력한 양적 판독을 제공하지만, 이러한 형광 수명 이미징 (FLIM), 편광 이방성 이미징 및 시간 해결 형광 이방성 이미징과 같은 더 정교한 형광 이미징의 양식은, 널리, 상업 HCA 기기에서 악용되지 않습니다. 여기에서 우리는 HCA위한 자동화 현미경에 FLIM을 구현하는 오픈 소스 접근 방식을 제시한다.
형광 수명은 상이한 분자 화학 종을 구별 또는 형광의 로컬 분자 환경을 조사하고, 여기 / 검출 효율로 형광 농도에 민감하지 사용될 수있는 본질적으로 비율 적 광학적 판독을 제공하고, scatte의 영향링 및 샘플 흡수 2. 형광 수명 측정은 단일 채널 스펙트럼 할 수 때문에, 이들은 교정없이 다른 악기 샘플과 직접 비교된다. 이들은 생물학적 과정과 병리 극한 판독을 제공하는 일부 세포 대사, 지질 및 세포 외 매트릭스 성분을 포함 내인성 형광체에도 적용 할 수있다. 따라서, 라벨없는 FLIM 셀 3,4- 대사 변화를 매핑 할 수 있으며 줄기 세포의 분화 5,6- 콜라겐 지지체 (7)의 성장을 모니터링하기 위해 적용되었다. 최근 FLIM HCA는 형광도 8을 이용하여 세포 대사의 자동 라벨없는 분석을 위해 사용될 수 있음을 보여 주었다. 더 일반적으로, 그러나, 형광 수명 측정 및 FLIM 종종 antibodie하도록 결합 된 염료를 사용하여, 세포 구획 착색 염료를 사용하여 구현 특정 생체 분자를 형광 라벨 외인성에 적용특정 단백질에 결합 유전자 발현 형광체를 사용하여 고정 된 세포에서 특정 단백질을 대상으로, 또는의. 형광 수명은 물리적 또는 화학적 환경을 감지하는 형광 프로브 강력한 정량 판독을 제공하는데 사용될 수있다. 예를 들어, 염료를 포함한 신호 분자 세포 농도를보고하기 위해 개발 된 세포막 9 셀 점도 10 유전자 발현 형광 단백질 기반 바이오 센서의 로컬 지질 위상을 감지하도록 배치 된 IP3 11 PIP2 12, 카르 파인 13 또는 칼슘 14, 15, 칼륨 (16)과 염소 (17) 이온.
많은 이러한 바이오 센서는 바이오 센서의 형태 변화의 판독을 제공하기 위해 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) (18, 19)을 이용한다. '공여체'및 '수용체'형광체 간의 FRET은 단거리 직접 쌍극자 – 쌍극자 상호 작용을 통해 발생하는 형광은 일반적으로 ~ 10 나노 미터 이하로 구분됩니다. 따라서 FRET 검출 적절히 표지 된 단백질의 근접을 나타내며, 따라서 이러한 결합 또는 올리고머로서 단백질 – 단백질 상호 작용 (20)을 판독 할 수있는 수단을 제공한다 – 하나 라이브의 시간 경과 측정 고정 된 세포 또는 동적 이벤트의 종료 지점으로서 세포. 또는 절단 – – 공여체 및 형광 수용체 모두 적합한 분자 구조를 라벨링함으로써, 구조적 변화를 판독하는 것도 가능하다 FRET의 변화를 통해 구조체와이 많은 바이오 센서 (21)의 기초가된다. 프렛 효율 측정은 도너 – 억 셉터 거리 FRET을받은 도너 형광 인구 분획에 대한 정보를 제공 할 수있다. 따라서, FRET 기반 이미징 기술은 세포 신호 (22)를 처리 해명 시공간 예 : 분자 상호 작용을 매핑하고 정량하는데 사용될 수있다. 자동 판매기보내고 그러한 이미징 기술은 네트워크 경로 또는 신호의 판독에 기초하여 높은 처리량 분석을 제공 할 수있다.
HCA에서 가장 일반적으로 구현 FRET 판독은 도너 강도 수용체의 비의 변화가 매핑되는 분광 화상 비율 적이다. 이 방법은 쉽게 구현되어 있지만 – 많은 상업적으로 이용 가능한 멀티 웰 플레이트 리더로 사용할 수 있습니다 – 양적 스펙트럼 해결 FRET 측정 시스템 (23)의 스펙트럼 응답의 교정이 필요합니다. 이것은 스펙트럼 블리드 스루 직접 자극 수용체뿐만 아니라 기기의 전송 특성 및 시료 (내부 필터 효과)로 인한 스펙트럼 크로스 토크 (cross-talk)를 포함한다. 원칙적으로,이 중 공여체 또는 수용체 만 전용으로 표시되는 추가 "컨트롤"샘플의 측정을 수반한다.
이러한 스펙트럼 비율 계량 FRET 측정에서, 효과적인 FRET효율 (실제 FRET 효율성 FRETing 도너 / 억 셉터 분자 분획의 제조) 공여체 및 수용체 분자 (24)의 상대적인 비율을 함께 얻을 수있다. 스펙트럼 비율 적 FRET 종종 도너 / 억 셉터 화학량 알려진 것으로 가정 될 수있는 단 분자 FRET 바이오 센서와 함께 사용된다. 투여 량 반응 곡선을 얻기 위해 상기 FRETing 공여체 및 수용체, 예를 들어 인구 분획을 확인하기 위해 실제 FRET 효율성의 기술이 요구된다. 이는 공지 된 특성을 갖는 포지티브 FRET 제어 샘플을 측정함으로써, 또는 수용체 또는 광표백 FLIM 같이 FRET 효율성을 측정하는 다른 방법을 사용하여 얻을 수있다.
형광 수명 판독을 사용하여, FRET은 감지 형 도너 발광 측정에 의해 정량화 될 수있다 – 스펙트럼 보정 및 상기 대조 시료에 대한 필요성을 제거하는 단계를 포함한다. 따라서, FLIM FRET 판독은 악기 사이에 비교 될 수있다다른 샘플 사이 – 내시경 또는 라이브 질병 모델 (25)의 단층 촬영에서 허용하는 데이터 셀 기반 분석의 측정에 대해 벤치마킹한다. FRETing 비 FRETing 공여체 집단에 대응하는 적절한 멀티 지수 감쇠 모델 도너 형광 감쇠 프로파일 피팅함으로써 효율성과 인구 분획 원칙적으로, 상기 측정하지 않고 직접 얻을 수있다 FRET. 장착시 때 단일 지수 감쇠 모델로 10 %의 수명 판정의 정확도를 달성하기 위해 필요한 일반적으로 광자 수백 -이 중요한 장점이 있지만, 스펙트럼 해결 강도 화상보다 화소 당 검출 된 광자를 필요로 FLIM 비용에서 올 착체 (multiexponential 감쇠) 모델 피팅 형광 감쇄 정보는 검출 된 광자의 수는 수천 증가를 요구했다. 이것은 종래 (수십 VI의 필드 당 초 수백 긴 획득 시간을 주도하고있다EW) FLIM 위해, 시간을 사용하여 특히 레이저 스캐닝 현미경의 연속 픽셀 인수로 구현 단일 광자 계산 (TCSPC)를 상관 관계. 상당한 광표백 및 / 또는 광독성을 초래할 수 이상 여진 강도를 사용하여 영상화 속도를 증가하려고 시도. 함께 적절한 상업적으로 이용 가능한 장비 및 소프트웨어 도구의 부족이 수백보기의 필드의 수천을 이미지화 할 수있는 신약 개발이나 시스템 생물학에 대한 HCA에 사용되는 FLIM을 방해하고있다. 레이저 스캐닝 TCSPC FLIM은이 공유되는 스펙트럼 비율 적 이미지 (28)와 유사한 묘화 속도에 도달 할 수 정상 편광 – 분해 형광 이방성 영상 (27)에 의해 "히트"의 식별 후에 이차 측정 자동화 멀티 웰 플레이트 현미경 (26)에 구현 된 많은 장점과 단점. 형광 이방성 이미징은 감소 활용FRET의 존재하에 수용체 형광 이방성 또한 스펙트럼 크로스 토크 (수용체의 예를 들면, 직접 여기)에 민감하다. 이는 편파 크로스 토크를 고려하는 캘리브레이션이 필요하며 FRET 효율의 직접적인 측정을 제공하지 않는다.
HCA위한 FLIM의 이점을 실현하기 위해 화상 취득의 속도 및 기술 넓은 액세스 문제를 해결하기 위해 노력하고있다. 여기서는 모형 FRET – 기반 분석법과 함께, 후술하는 자동 급 FLIM 멀티 웰 플레이트 판독기를 구현하는데 이용 될 수있는 오픈 소스 소프트웨어 및 하드웨어 구성 요소의 전체 목록을 제공한다. 우리의 방법 29에서, FLIM 인해에 단일 빔 주사 TCSPC보다 빠르게 촬상 요금 및 하부 광표백을 제공 할 수있는도 1에 도시 된 게이트 형 광학 이미지 인 텐시 파이어 (GOI)를 사용하여 넓은 필드 시간 게이팅 이미징을 사용하여 실현 병렬 픽셀 INTERRogation. 우리 openFLIM HCA-악기 (샘플의 휘도)에 따라 픽셀 당 몇 백 광자 검출 FLIM 데이터를 획득하기 위해 단지 수 초를 필요 자율 FLIM을 제공 할 수있다. , 인수 설정을 조정하고 초점 샘플을 유지하기 위해,보기의 이전 필드에서 샘플을 이동하는 데 필요한 시간과 결합이 일반적으로보기 25, 28의 필드 당 ~의 멀티 웰 플레이트 수집 시간에 10 초를 초래한다. 광학 절편은 준 와이드 필드 Nipkow ( "스피닝 디스크") 스캐너 (30)를 이용하여 구현 될 수있다.
FLIM 데이터 분석을 위해, 우리는 빠른 속도로 기존 PC 워크 스테이션에서 멀티 웰 플레이트 FLIM 데이터 세트를 분석 할 수 있으며, 플러그인 OMERO 32입니다 FLIMfit (31)라는 오픈 소스 소프트웨어 도구를 개발했습니다. FLIMfit은 오와 복잡한 모델에 장착 될 FLIM 데이터를 사용 (1.2 절에서 논의) 글로벌 분석 기능을 제공합니다따라서 필요한 검출 된 광자의 수의 샘플 이미지 획득 시간으로 노광을 감소 형광 수명 성분 화상 또는 관심 (ROI)의 영역에 걸쳐 불변한다는 가정하에 화소 당 몇 백 광자 할수 있답니다. 표준 데스크톱 PC에 FLIMfit 실행, 영상 범위의 수백을 포함하는 데이터 세트를 분석하는 계산 시간 (초)의 10 초를 필요로한다. 따라서 두 FLIM 데이터 수집 및 분석 HCA에 대한 실용적인 시간 척도에서 수행 할 수 있습니다.
openFLIM-HCA 하드웨어
FLIM 된 HCA의 본 구현 예는 6 개 주요 구성 요소를 포함 : (ⅰ) 광학적 자동 초점 형광 현미경 프레임; (ⅱ) 전동 (XYZ) 현미경 단계; (ⅲ) 여기 레이저 광원; (ⅳ) 문이 광 증강 (GOI), 지연 발생기와 카메라 넓은 필드 시간 문 FLIM 시스템; (ⅴ) 데이터 수집 및 분석, (VI)를 Nipkow 디스크 스캐너 컴퓨터광학적으로 구분 이미징 유닛 포커스 빛 억제. 커버 슬립 또는 배양 배지로부터 세포질 형광 또는 배경의 기여에 의해 압도 될 수있는 세포의 원형질막 FRET 바이오 센서에서, 예를 들면 약한 신호를 촬상 할 때 중요 할 수있다. 타임 게이팅 FLIM 데이터는 초단 펄스 여기 방사선 샘플을 조명하는 GOI의 광 음극의 형광 방출을 이미징의 시간 지연의 설정의 범위의 GOI의 형광체의 CCD 이미지의 시리즈를 취득하여 취득 상기 여기 펄스의 도착 후 광 증강 게이트. 여기 다음 시간 게이트 지연이 증가함에 따라, 형광 신호가 감소하는 것으로되고, CCD에 취득 시간 게이트 된 형광 세기의 일련의 이미지는 시야에있는 모든 형광의 붕괴 정보를 분석하기 위해 필요한 상기 데이터 세트를 형성 . GOI의 게이팅은 여기 펄스에 동기화그리고, CCD 취득 일련 위해 여기 펄스까지의 시간 게이트 상대적인 지연은 원하는 범위의 값을 증가하는 일련으로 설정된다. 이 동기는 "빠르고 지연 상자"(1 PS 단계에서 20 ns의에 지연을 제공하는) 25 ps의 최소 단계 지연을 제공하는 "거친 지연 상자"를 포함하는 지연 발생기를 사용하여 달성된다.
FLIM 들어, 여기 모든 초고속 레이저에 의해 제공 될 수있다. 편의를 위해, 우리는 일반적으로 적절한 자극 방사선이 다른 대역 통과 필터를 전동 필터 휠을 사용하는 형광으로 선정 할 수있는 가시 광선 영역에 걸쳐 피코 초 펄스 동조를 제공하는 파이버 레이저 펌핑 초 연속 소스를 이용한다. 일반적으로, 우리는 40 또는 60 MHz의 반복율에서 펄스를 시료에 ~ 100-200 μW의 평균 전력을 사용한다. 이러한 여기 전력은 주파수의 두배에 기반 초고속 레이저 소스에 의해 제공 될 수있다모드 잠금 티타늄 도핑 된 사파이어 레이저. ~ 100 ps의 아래 여기 펄스 지속 시간은 대부분의 실험에 충분합니다. 감광 필터를 구비 한 제 전동식 필터 휠 여진 강도를 조절하는 데 사용된다. 안전과 편의를 위해, 여기 방사선은 단일 모드 광섬유를 통해 전달 될 수있다. 넓은 필드 FLIM 및 광학적으로 구분 FLIM의 구성은 각각 그림 2와 3에 제시되어있다. 사용 된 정확한 구성 요소에 대한 자세한 내용은 openFLIM-HCA 위키 (33)를 참조하십시오. 현재 부품 목록의 사본은 보충 자료에 나와있다.
넓은 필드 FLIM 들어, 여기 방사선은 가능한 한 균일 뷰 필드 전체를 조명 할 필요가있다. 이를 위해, 우리는 DIF의면에, 시간 평균 10-50 Hz에서 레이저 스펙 클 회전 홀로그램 "탑 햇"확산기의 여기 레이저 빔을 지향정착은 현미경 대물 렌즈의 초점면에 결상된다. 현미경의 출력 포트에서 형광 화상은 냉각 과학 CCD (칩 크기 10.2 mm X 8.3 mm)의 센서로 촬상 된 GOI의 광 음극 및 GOI (활성 영역 대각선 18mm)의 형광체에 중계된다 0.7의 배율을 제공하는 카메라 렌즈의 쌍을 사용하는 카메라. 시스템은 RS232 프로토콜을 사용하여 계측에 인터페이스되는 표준 PC에 의해 제어된다. 또한, Arduino를 마이크로 프로세서는 CCD 카메라 FLIM 데이터를 취득하고, 상기 스펙트럼 필터 초 연속의 평균 전력을 측정하는 데 사용되는 포토 다이오드로부터의 신호를 기록하는 경우를 제외하고는 폐쇄된다 여기 광 경로에서 셔터를 제어하는 데 사용 여기 원. 광학적으로 단면 한 FLIM 들어, 여기 레이저 방사선 (S)과 같이 Nipkow 디스크 스캐너 장치를 직접 연결하는 단일 모드 편광 유지 광섬유로 연결되고hown 그림 3인치 Nipkow 스캐너 유닛으로부터 출력 형광 화상은 GOI의 광 음극에 전달하고, 나머지 시스템 와이드 FLIM 필드와 동일하다.
openFLIM-HCA 소프트웨어
데이터 수집 소프트웨어 μManager (34)에 기입된다. 자동 측정하는 동안 초점을 유지하고, 여기 및 방사 필터 휠과 이색 체인저를 제어하는 임의의 FOV 시간 코스를 획득하기 위해 플레이트의 웰에 이미징되는 순서를 변경하는 옵션을 포함하여 전체 HCA 데이터 획득 기능을 제공 자동화 된 여러 가지 빛깔의 이미징. 자동 강도에 기초하여 예를 들어 기준에 따른 후속 FLIM 취득 적합한 영상 범위의 위치를 식별하고 기록하기 위해 형광 강도의 "프리 스캔"획득을 실행하는 것도 가능하다. FLIM HCA 데이터는 시리즈로 저장할 수 있습니다TIFF 파일, OME-TIFF 파일의 일련의 (즉, FOV 하나씩) 또는 멀티 웰 플레이트로부터의 모든 데이터를 포함하는 단일 – OME TIFF 파일로. 더 많은 정보와 μManager 소프트웨어에 대한 자세한 설명은 openFLIM-HCA 위키 (33)에서 찾을 수 있습니다.
데이터 분석 소프트웨어 (31)는 상기 OMERO 화상 데이터 관리 플랫폼 (32)의 오픈 소스 MATLAB 기반 클라이언트 FLIMfit,도 4에 나타내는 등의 OMERO 서버 또는 컴퓨터 디스크 FLIM 데이터를 판독 할 수있다. TCSPC 또는 와이드 필드 시간 게이팅 FLIM 기기로부터 데이터를 분석하도록 설계된 많은 기능을 붕괴 정보를 단지 수 피팅을 포함 openFLIM-HCA에서 데이터를 적합하고, 다음과 같은 모델을 포함하여, 지수 및 높은 복잡도 감쇠 프로파일을 두배로 제공 한 편광 해결 형광 붕괴 프로필. 또한 고정 된 시변 신호의 배경을 고려하고있다 UTI리제 측정 된 시공간적 측량기 응답 함수 (IRF) 또는 타임 – 쉬프트 전체 실험 IRF 측정으로부터 결정된 양만큼 화소 와이즈 기초 될 수있다 이상화 IRF를 사용하여 적합 할 수있다. IRF 형광 샘플 간의 전역 시간차 (t 0) 형광 표준의 측정으로부터 결정할 수있다. 배경 신호 IRF의 공간적 변화도 고려 될 수있다. FLIMfit는 픽셀 현명한 기준으로 FLIM 데이터에 맞게 할 수 또는 완만 한 (수백)와 FLIM 데이터의 피팅을 용이하게 복잡한 붕괴 모델 번호를 광양자하는 "글로벌 비닝 (binning)"또는 "글로벌 피팅"를 사용합니다.
글로벌 비닝은 각 시점에서의 사용자 정의 된 ROI 내의 모든 화소로부터 검출 된 광자를 집계하는 복합 감쇠 모델 피팅 있도록 충분히 광자 수를 제공하기 위해 수반한다. 투자 수익 (ROI)은보기의 전체 필드 (FOV)를 할 수 있습니다, 그것은 D 수동으로 할 수있다사용자 efined, 또는 이미지 분할 도구를 사용하여 결정될 수있다. 관심 영역은 다른 이미지 분할 소프트웨어로부터 FLIMfit로 반입 마스크를 사용하여 정의 될 수있다. FRET 어플리케이션의 경우, (A)에 다시 장착하는 후 ROI 걸쳐 공간적으로 불변하는 것으로 가정 FRETing 비 FRETing 도너 형광 단에 대응하는 형광 수명의 구성 요소를 결정하기 위해 두 지수 감쇠 모델에 맞게 글로벌 비닝을 사용하는 것이 일반적이다 각 화소의 FRETing 공여체 인구 분획을 얻기 위해 고정이 수명 성분 알엇와 화소 현명 기초.
글로벌 피팅 동시에 전체 FOV- 걸쳐 또는 멀티 웰 플레이트 실험 또는 형광 수명 화상의 시계열로부터, 예를 들면 복수의 영상 범위를 포함 할 수있는 FLIM 데이터 세트에 걸쳐 수명 성분 화소 와이즈 FRETing 공여체 인구 분획 피팅 수반한다. 글로벌 피팅 공간 variati을 악용 할 수있다따라서 더 신뢰할 수있는 결과 – -이기는하지만 훨씬 더 많은 계산 (35)의 비용 구성 요소 수명 추정에 강한 제약을 제공하는 글로벌 비닝 접근 방식에서 손실 된 이미지에 인구 분수의에. FLIMfit 빠르게 예를 들어와 기존 PC 워크 스테이션에 글로벌 피팅 멀티 웰 플레이트 FLIM 데이터 세트를 분석 할 수 있습니다, 32 초 필요로하는 672 X 512 픽셀을 포함하는 394 FOV 각 각 다섯 번 게이트로 획득 한 멀티 웰 시간 문 FLIM 데이터 세트, 메모리 2GB의 이중 지수 감쇠 모델 (31)에 적합합니다. 이것은 분리 비선형 멀티 코어 프로세서와 FLIMfit 코드 메모리 사용을 최소화하기 위해 최적화 된 효과적인 스케일링을 가능하게하는 멀티 스레드 병렬 알고리즘을 사용하여 구현 된 최소 제곱 맞춤 알고리즘을 이용하여 달성되었다. 도 5는 FLIMfit의 그래픽 사용자 인터페이스의 스냅 샷을 도시더 자세한 내용은 참조 글로벌 피팅 및 글로벌 비닝 (binning)에 36 자세한 정보를 제공 웹 페이지에서 찾을 수 있습니다 참조 (31)에서 찾을 수 있습니다.
우리 openFLIM HCA-계측 및 소프트웨어를 사용 FLIM 된 HCA의 다음 프로토콜 FLIM 판독 값 세포 이미징 실험의 넓은 범위에 적합 할 수있다. 일반적으로, 멀티 웰 플레이트는 실험 연구되고 조건에 더하여 양극과 음극 생물학적 제어 복제 웰을 포함하도록 설계되어야한다 FRET. 여기서는 광학적 단면 한 FLIM을 수행 할 수있는 특정 구현을 설명 FRET 짧은 펩타이드 링커에 의해 합류 mTurquoise 형광 단백질과 형광 단백질 금성 이루어진 구조체 발현 COS 세포의 (도 3 참조). 여기에 mTq32V, mTq17V 및 mTq5V 함께 비 FRETing mTq5A는 구성과 낮은, 중간 및 높은 FRET 효율을 제공 (대표 결과 섹션에서 설명) 구조를 FRET.이 구조와이 프로토콜을 수행하는 데 필요한 다른 재료는 재료 목록에 나열되어 있습니다.
우리는 시간 게이트 FLIM를 사용하여 HCA 용으로 설계된 자동화 된 멀티 웰 플레이트 현미경을 설명했다. 이 악기는 FLIMfit (36), 오픈 소스 프로그램 OMERO 클라이언트 32 μManager의 도구로 매트랩 작성 및 사용할 수를 사용하여 수행되는 OMERO 서버와 FLIM 데이터 분석에 데이터를 저장하는 옵션을 μManager로 작성된 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 제어 제어 소프트웨어, openFLIM-HCA는 자신의 FLIM의 HCA 기기를 구성하는 학술 연구를 가능하게하는 시스템 구성 요소 (48)의 목록 33 온라인으로 사용할 수 있습니다.
강력한 FLIM 데이터를 획득하기 위해서는, GOI 및 CCD 취득 설정을 최적화 및 t 0에서 어떠한 변화를 고려하는 것이 필요하다. 3.8.2에 설명 된 바와 같이, GOI 이득 설정 및 CCD 카메라 적산 시간 ~ 다 CCD 동적 범위의 75 %에 도달하도록 설정하여야한다. 유마다 게이트 지연에 더 GOI 전압 복수 CCD 프레임 축적 노래하는 잡음비 (49)에 신호를 증가 시키지만 이는 적은 형광 광자는 CCD 카메라 포화 프레임 축적 너무 수가 이전 프레임마다 취득되기 때문에 총 FLIM 획득 시간 (증가 증가한다) 등이 트레이드 오프는 각 실험에 대해 결정해야한다. 딜레이 생성기의 보정은 레이저 반복률에 따라 그리고 사용 된 반복율에 대한 정확한 교정 파일을 수집 소프트웨어에 로딩되는 것을 보장하는 것이 필요하다. 지연 상자를 교정하기위한 절차는 openFLIM-HCA 위키 (33)에서 찾을 수 있습니다.
셀룰러 형광도는 형광 신호에 비해 낮은 경우, 우리는 시간에 따라 변화하는 배경 (TVB)를 제공하기 위해 잘 함유 단지 배지로부터의 신호를 사용한다. 세포 배양액으로부터 배경 형광을 최소화하기 위해 피페놀 레드를 포함하는 미디어. 셀룰러 형광도가 중요한 경우, TVB는 표지 된 세포의 측정으로부터 유도 될 수있다. 이것은 자기 형광 배경 이미지의 모든 픽셀에 대해 동일한 것으로 가정하지만,이 경우 관리에주의해야한다. 형광도 셀을 통해 또는 여기 빔 또는 검출 감도가 시야에 걸쳐 균일하지 않은 경우 상당히 다양 할 경우이 가정은 유효하지 않습니다.
산란 여기 광 펄스를 이용하여 IRF 화상의 취득 피팅 프로세스에 데이터 모델과 콘볼 루션되는 시간 IRF 프로파일을 제공하고, 또한 시야에 걸쳐 IRF의 공간적 변이지도를 제공한다. IRF는 Nipkow 디스크가 IRF의 클리너 측정을 제공로부터 산란 된 여기 광을 이용하여, 우리의 장비, 이러한 콜로이드 현탁액 비록 같은 산란 샘플을 이미지화하여 측정 할 수있다. 타이밍 오의 정확한 결정여기 및 시간 게이팅의 지연 시간의 오차가 크게 피팅 프로세스에 영향을 미칠 수 있기 때문에 주 6 IRF는 중요 특히 복소 지수 감쇠 모델 피팅. IRF는 IRF의 공간적 변화가 동일해야하지만, 그 타이밍에 영향을 미칠 수는 여기 파장에서보다는 형광 발광 파장에 기록되기 때문에, 피팅 프로세스에 필요하지 정확히 산란 여기 광을 이용하여 취득 두 파장에서. 광학적으로 단면 한 FLIM에 Nipkow 디스크에서 취득한 IRF 대한 경우와 같이 또한 산란 IRF 세계적으로 인한 산란 오브젝트로부터 서로 다른 광로 길이로 실제 IRF 시간에 대하여 시프트 될 수있다. Protoc에 나타낸 바와 같이, 취득 된 산란 여기 광 IRF 적용해야 필요한 전체 시간 시프트이다이 보정 t 0, 단지 수 기준 염료 데이터로부터 계산올 단계 4.4. 다음 염료 상이한 여기 파장에 대해 사용될 수있다 : 메탄올 중 75 μM 쿠마린 153 용액 (τ는 4.3 ~ 50 NS)가 범위 295-442 nm의 여기에서 사용될 수있다; 에탄올 중 75 μM 쿠마린 6 용액 (τ ~ 2.43 NS 37)는 430-500 nm의 범위에서 여기에 사용될 수있다; 물 75 μM 로다 민 B 용액 (τ는 1.7 ~ 37 NS)는 488-575 nm의 범위에서 여기에 사용될 수있다. 이 시스템의 각 픽셀에 대해 서로 다른 IRF를 사용 FLIMfit 가능하지만 우리는주의, 보통은 공간적으로 변화 IRF 이미지의 모든 픽셀에 대해 동일한 시간 프로파일을 갖는다는 가정을하는 것이 합리적이지만 범위를 제시 의 공간적 글로벌 t 0을 기준으로 시간 오프셋을 변화. 우리는 산란광의 IRF에서 결정되는 IRF 시프트지도로이 설명합니다. 이와 함께 IRF 프로파일, t 0와 IRF 시프트지도는 실내에 사용된다화각의 각 픽셀은 적절한 IRF 장착되어 있는지 확인합니다. 그것은 어떤 FLIM 데이터 취득 전에 측정해야하므로 중요한 t 0 시간 서서히 변할 수있다.
사용자는 형광 감쇄 정보를 샘플링하고, 시간 – 게이트 및 여진 후 상대적인 지연의 폭을 설정하는 데 필요한 방법을 결정한다. 일반적으로, 검출 된 신호를 최대화하기 위해 다양한 게이트 폭을 사용하고 일반적으로 우리가 형광 단백질 표지 세포의 FLIM 4 NS 설정된 게이트 폭을 사용하는 것이 바람직하다. 시간 – 게이트 지연의 수는 분석에 사용되는 피팅 모델의 복잡성 주어진 (단지 여기 펄스 전에 신호를 측정하도록 설정된 하나의 게이트를 포함), 형광 소멸 프로파일을 샘플링하기에 충분해야한다. 최적 값 수명 및 감쇠 요소의 상대 진폭에 의존 할 수있다. 일반적으로, 4 게이트 피팅 단지 수에 충분가있는 동안 7 개 이상의 게이트 수도 붕괴더 복잡한 감쇠 모델에 사용될.
우리 FLIM은 FRET (51)의 주파수 도메인 수명 판독을 이용하여 전체 필드 현미경 시간 도메인 또는 주파수 도메인 기술의 범위를 사용하여 구현 될 수 있고, 멀티 웰 플레이트 어레이들의 자동화 FLIM의 HCA가 먼저 (비 절편)으로 구현되었음을 주목. 넓은 필드 시간 문 영상 (28)을 이용하여 HCA의 첫 번째 자동 광학 절편의 FLIM 멀티 웰 플레이트 리더는 다음보고되었다. 이어서, 넓은 필드 (비 절편) 주파수 도메인 FLIM의 HCA가 FRET 52 이용한 유전자 라이브러리 및 시간 게이팅 FLIM의 HCA 걸쳐 번역 후 변형 (티로신 인산화)을위한 선별에 적용되었다 HIV-1 개그의 분석을 FRET에 적용된 올리고머 53 FOXM1 (54)과 Raichu에서 RhoA와 RAC1 바이오 센서 (33)의 SUMOylation의. 이는 멀티 웰 플레이트 FLIM 26하지만 날짜가 t와 일치하도록 도전 입증되었다 TCSPC를 사용하는 것도 가능하다그는 넓은 필드 검색을 이용 기술의 처리량. 이 문제를 해결 수있는 하나의 새로운 접근 방식은 SPAD 어레이 (55)로 단일 광자 계수 검출기의 배열의 사용이다.
우리는 형광 단백질을 이용하여 FRET 임의의 판독은 피팅 모델과 관련된 가정에 의존한다 FLIMfit 또는 다른 FLIM 분석 소프트웨어로부터 얻은 파라미터의 절대 값주의 것을 취급되어야 참고. 프렛 도너 상당한 초 잔광 구성 요소가 예를 들어, FRET FLIM 데이터에 맞게하는 biexponential 모델의 사용은 전형적으로해야보다 FRETing 인구가 높은 표시에 관련한 빨리 감쇠 성분의 기여가 발생할 수있다. 그러한 mTq2FP 같은 모노 지수 수명이 도너를 사용하는 것이 바람직하다. 그럼에도, 최근 연구 FRET 분석을 계속 받게 형광 단백질 또는 어두운 상태에 의해 영향을받을 수 있음을 보여 주었다발색단 때문에 다양한 각도와 형광체의 배좌의 분포와이 κ 배향 계수의 이질성 (56) 간 거리. 그럼에도 불구하고, 우리와 다른 FRET의 형광 수명 판독은 생화학 적 측정과 상관 관계 및 단백질 상호 작용을 선별하거나 바이오 센서의 역학을 수행하는 데 사용할 수있는 유용한 결과를 생성 할 수 있음을 보여 주었다. 따라서 본 openFLIM HCA 플랫폼 FRET 또는 셀룰러 형광도 8을 이용뿐만 아니라, 염료 계의 프로브 (25)의 정량적 인 판독을 제공하는 형광 수명 기반 분석의 넓은 범위에 적용될 수있다.
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.
microscope frame | Olympus | IX81 | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
optical autofocus | Olympus | ZDC | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
motorized (x-y-z) microscope stage | Marzhauser | 00-24-565-0000 | Stage with Corvus controlle |
excitation laser source | Fianium | SC400-4 | Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/ |
gated optical intensifier | Kentech | High Rate Imager (HRI) | |
delay generators | Kentech | — | See agile delay generator and precision delay generator |
camera | Hamamatsu | ORCA-ER-II | |
Nipkow disc scanner unit | Yokogawa | CSU-X1 | http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/ |
Top hat diffuser | Thorlabs | ED1-S20-MD | Engineered diffusers |
mTq5V | Oxford Genetics | P3850 | mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker |
mTq17V | Oxford Genetics | P3847 | mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker |
mTq32V | Oxford Genetics | P3848 | mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker |
mTq5A | Oxford Genetics | P3849 | mTurquoise Amber construct |
HEK293T | — | — | cell type used |
phenol red-free HBSS | Sigma Aldrich | 55021C-1000ML | imaging media |
culture media | DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics | ||
DMEM | Sigma Aldrich | D6046-500ML | for culture media |
FBS | Sigma Aldrich | 12003C-500ML | for culture media |
xTremeGene9 | Sigma Aldrich | 6.37E+09 | for transfection, follow online protocol from La Roche |
trypsin/EDTA Solution | Thermo Fischer | R001100 | for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer |