Nós apresentamos uma análise (HCA) instrumento de alto conteúdo open source utilizando imagens de fluorescência vida automatizado (FLIM) para ensaiar interações proteína usando Förster transferência de energia de ressonância (FRET) leituras base. Aquisição de dados para este instrumento openFLIM-HCA é controlada por software escrito em μManager e análise de dados é realizado em FLIMfit.
We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in µManager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.
O uso crescente de alta análise de conteúdo automatizado (HCA) na descoberta de medicamentos 1 a bibliotecas de compostos de ensaio é complementada pela evolução das ciências da vida investigação de base no sentido de experimentos de imagem automáticos de estudos sistemáticos, por exemplo, para telas fenotípicas de bibliotecas de siRNA. HCA automatizada também está se tornando cada vez mais importante para os estudos de menor escala biológica que normalmente têm sido implementados com experimentos manuais com dezenas de pratos de células fotografada com microscópios convencionais. O poder estatístico conferido pela capacidade de testar e analisar centenas a milhares de campos de visão permite a média do ruído experimental (incluindo o "ruído biológico") e a automação de aquisição e análise de grandes conjuntos de amostras de dados de imagem pode ajudar a eliminar o preconceito de operador e, muitas vezes pode ser utilizada para detectar a ocorrência de erros sistemáticos, tais como uma alteração no perfil de IRF durante uma aquisição. ensaios de fluorescência baseadasão amplamente implementados em HCA, com mais comercialmente disponíveis instrumentação HCA caracteriza imagiologia de fluorescência de intensidade em um ou mais canais espectrais para mapear a distribuição relativa e de co-localização de proteínas marcadas. Modalidades de imagem de fluorescência mais sofisticadas, como imagens de fluorescência vida (FLIM), imagiologia anisotropia de polarização e imagens de fluorescência anisotropia resolvida no tempo, não são amplamente explorados em instrumentos HCA comerciais, embora eles oferecem poderosas leituras quantitativos, por exemplo, de interações proteína. Aqui apresentamos uma abordagem de fonte aberta para a implementação FLIM em um microscópio automatizado para HCA.
Fluorescência vida fornece uma leitura espectroscópica inerentemente raciométrica que podem ser usadas para distinguir as espécies moleculares diferentes ou para sondar o ambiente molecular local de um fluoróforo e é insensível à concentração de fluoróforo, a eficiência de excitação / detecção, e ao impacto de scatteanel e amostra de absorção 2. Além disso, uma vez que as medições de fluorescência ao longo da vida pode ser feito num único canal espectral, são directamente comparáveis entre os diferentes instrumentos e as amostras sem calibração. Eles podem ser aplicados a fluoróforos endógenos, incluindo alguns metabolitos celulares, lípidos e componentes da matriz extracelular, para fornecer leituras intrínsecas de processos biológicos e patologias. Assim FLIM livre rótulo pode mapear as alterações metabólicas em células de 3,4 e foi aplicado para controlar a diferenciação de células estaminais 5,6 e o crescimento de andaimes de colagénio 7. Recentemente, demonstrou que FLIM HCA pode ser utilizado para ensaios livres de rótulo automatizados do metabolismo celular utilizando autofluorescência 8. Mais comumente, no entanto, as medições de fluorescência ao longo da vida e FLIM são aplicadas a fluoróforos exógenos que rotulam biomoléculas específicas, muitas vezes implementado usando corantes que mancham compartimentos celulares, usando corantes acoplado a antibodies que alvejar proteínas específicas em células fixadas, ou fluoróforos usando expressão genética acoplados a proteínas específicas. tempo de vida de fluorescência pode ser utilizado para fornecer leituras quantitativas robustas de sondas fluorescentes detecção seu ambiente físico ou químico. Para exemplos, os corantes tenham sido implantado para detectar a fase lipídica local das membranas celulares 9 ou viscosidade da célula 10 e biossensores baseados em proteínas fluorescentes expressão genética têm sido desenvolvidos para relatar as concentrações de células moléculas de sinalização incluindo como IP3 11, PIP2 12 e calpaína 13 ou íons, como cálcio 14,15, potássio e cloreto de 16 17.
Muitos desses biossensores utilizar transferência ressonante de energia por fluorescência (FRET) 18,19 para fornecer leituras de alterações na conformação biossensor. FRET entre "doadores" e fluoróforos "aceitador" ocorre através de um curto intervalo de interação dipolo-dipolo diretapara que os fluoróforos são tipicamente separados por menos de ~ 10 nm. Assim, a detecção de FRET indica a proximidade de proteínas devidamente rotulados e, portanto, fornece um meio para ler interações proteína-proteína 20, tais como ligação ou oligomerização – como pontos finais em células fixas ou eventos como dinâmicas em medições de tempo de curso do vivo células. Ao classificar uma construção molecular apropriado com o dador e o aceitador fluoróforos, também é possível ler alterações conformacionais – ou clivagem – da construção através da mudança de FRET e esta é a base de muitos bio-sensores 21. As medições da eficiência de TERF pode fornecer informações sobre a distância dador-aceitador e a fracção de população de dadores fluoróforos submetidos a FRET. Assim, as técnicas de imagiologia baseados em FRET pode ser utilizado para mapear e quantificar interacções moleculares no espaço e no tempo, por exemplo, para elucidar a sinalização celular processa 22. Automáticoing essas técnicas de imagem poderia fornecer ensaios de alto rendimento com base em leituras de vias de sinalização ou redes.
Em HCA, a leitura de FRET mais comummente implementada é raciométrica imagiologia espectral, em que as alterações na razão entre a intensidade aceitador doador são mapeados. Enquanto esta abordagem é prontamente implementada – e está disponível em muitos leitores de placas com múltiplas cavidades disponíveis comercialmente – quantitativos medições FRET espectralmente resolvidos requerem calibração da resposta espectral do sistema 23. Isto inclui a diafonia espectral resultantes de espectral a infiltração e excitação directa do aceitador, bem como as características de transmissão do instrumento e a amostra (efeito de filtro interno). Em princípio, isso implica a medição de amostras adicionais de "controle" que são rotulados com qualquer doador-only ou receptor-only.
A partir de tais medições espectrais raciométrica FRET, uma FRET eficazeficiência (o produto da eficiência real de FRET e fracção de moléculas dador / aceitador FRETing) pode ser obtido, juntamente com a proporção relativa das moléculas dadora e aceitadora 24. FRET ratiometric Spectral é usado frequentemente com biossensores FRET unimolecular, onde a estequiometria doador / receptor podem ser assumidos para ser conhecido. Para determinar as fracções das populações de dador e aceitador FRETing, por exemplo, para obter uma curva de resposta à dose, o conhecimento da eficiência real de FRET é necessária. Isto pode ser obtido por medição de uma amostra de controlo positivo de FRET com propriedades conhecidas ou através da utilização de um método diferente para medir a eficiência de FRET, tal como aceitador de fotobranqueamento ou FLIM.
Usando leituras de fluorescência ao longo da vida, a FRET pode ser detectada e quantificada por meio de medições de emissão do dador sozinho – eliminando a necessidade de calibração espectral e outras amostras de controlo. Assim, leituras FLIM FRET pode ser comparado entre os instrumentose entre diferentes amostras – permitindo que os dados de endoscopia ou tomografia de modelos de doença em directo 25 para ser aferido contra as medições de ensaios baseados em células. Ajustando perfis de decaimento doador de fluorescência a um modelo de decaimento multi-exponencial adequado correspondente ao FRETing e populações de dadores não-FRETing, FRET eficiências e frações da população pode, em princípio, ser obtidos diretamente sem as medições posteriores. Estas vantagens significativas, no entanto, vêm com o custo de FLIM exigindo fótons mais detectados por pixel de imagem intensidade espectralmente resolvido – geralmente centenas de fótons são necessários para atingir uma precisão na determinação do tempo de vida de 10%, quando apropriado para um único modelo de decaimento exponencial e quando perfis de fluorescência de decaimento de montagem para modelos complexos (degradação multiexponencial), o número de fótons detectados necessária aumenta para milhares de pessoas. Isto tem conduzido convencionalmente para tempos de aquisição longo (dezenas a centenas de segundos por campo de VIew) para FLIM, especialmente quando se utiliza o tempo correlacionados contagem de fóton único (TCSPC) implementado com a aquisição de pixel sequencial em microscópios de varredura a laser. As tentativas para aumentar a velocidade de imagem usando intensidades de excitação mais elevadas podem conduzir a fotodegradação e / ou fototoxicidade significativa. Juntamente com a falta de ferramentas de instrumentação e software disponíveis comercialmente apropriados, este tem dificultado FLIM de ser utilizado em HCA para a descoberta ou sistemas de drogas biologia, onde centenas de milhares de campos de visão estão a ser trabalhada. Varredura a laser TCSPC FLIM foi implementado em um microscópio placa com múltiplas cavidades automatizado 26 para medições secundárias após a identificação de "hits" por steady-state resolvido-polarização imagens de fluorescência anisotropia 27, que pode atingir velocidades de imagem semelhante à imagem raciométrica espectral 28 com o qual compartilha muitas vantagens e desvantagens. imagiologia Anisotropia de fluorescência explora a diminuiçãoem anisotropia de fluorescência do aceitador na presença de FRET e também é sensível a conversa cruzada espectral (por exemplo, excitação directa do aceitador). Ele requer calibração para explicar conversas cruzadas polarização e não fornece uma medida direta da eficiência FRET.
Para perceber as vantagens de FLIM para HCA, temos trabalhado para resolver os problemas de velocidade de aquisição de imagem e maior acesso à tecnologia. Aqui, nós fornecemos uma lista completa de componentes de software de código e hardware abertos que podem ser utilizados para implementar o leitor FLIM rápida automatizada com vários poços placa que está descrito abaixo, juntamente com baseados em ensaios de FRET exemplar. Em nossa abordagem 29, FLIM é realizado usando todo o campo de imagem fechado em tempo usando um fechado intensificador de imagem óptico (GOI), que é ilustrada na Figura 1, que pode fornecer taxas de imagem mais rápidas e menor fotodegradação do que de feixe único TCSPC digitalização devido à interr pixels paralelaogation. O nosso instrumento openFLIM-HCA pode fornecer FLIM sem supervisão, necessitando apenas de alguns segundos para adquirir dados de FLIM detectar alguns 100 fotões por pixel (dependendo do brilho da amostra). Combinado com o tempo necessário para mover a amostra do campo de vista anterior, para ajustar as configurações de aquisição e para manter a amostra no foco, isso normalmente resulta em tempos de aquisição placa de poços múltiplos de 10 ~ s por campo de visão 25,28. Seccionamento óptica pode ser implementado usando um quasi-de campo amplo Nipkow ( "disco rotativo") do scanner 30.
Para análise dos dados FLIM, desenvolvemos uma ferramenta de software de código aberto chamado FLIMfit 31 que é capaz de analisar rapidamente conjuntos de dados placa FLIM múltiplos poços em estações de trabalho de PC convencionais e é um plug-in para OMERO 32. FLIMfit fornece capacidades de análise globais (discutido na Seção 1.2) que permitem dados FLIM a ser montados em modelos complexos com oomente alguns 100 fótons por pixel sob o pressuposto de que os componentes de fluorescência ao longo da vida são constantes ao longo de uma imagem ou região de interesse (ROI), reduzindo assim o número de fótons detectados necessário, a exposição à luz com o tempo de amostra e de aquisição de imagem. Correndo FLIMfit em um PC desktop padrão, requer apenas 10s de segundos de tempo computacional para analisar conjuntos de dados que compreendem centenas de FOVs. Assim, tanto a aquisição de dados FLIM e análise pode ser realizada em escalas de tempo que são práticas para HCA.
hardware openFLIM-HCA
Nossa implementação de HCA FLIM compreende seis componentes principais: (i) um quadro microscópio de fluorescência com autofocus óptico; (Ii) a (xyz) estágio do microscópio motorizado; (Iii) uma fonte de laser de excitação; (Iv) um sistema de FLIM fechado em tempo de campo amplo com intensificador fechado óptico (GOI), gerador de atraso e câmera; (V) um computador de aquisição de dados e análise e (vi) um scanner disco Nipkowunidade para geração de imagens opticamente seccionado para suprimir fora de foco de luz. Isso pode ser importante quando imagiologia sinais fracos, por exemplo, de biossensores FRET na membrana plasmática das células, que poderiam ser inundados por contribuições de fluorescência citoplasmática ou o fundo de lamelas ou meio de cultura. dados FLIM fechado em tempo é adquirido por iluminar a amostra com a radiação de excitação ultrashort pulsada, imagem da emissão de fluorescência para o fotocátodo do GI e aquisição de uma série de imagens CCD de fósforo do GI para uma variedade de configurações de tempo de atraso o portão intensificador óptica após a chegada dos impulsos de excitação. À medida que o atraso de porta de tempo seguinte de excitação é aumentado, o sinal de fluorescência é vista a diminuir e a série de imagens intensidade de fluorescência fechado em tempo adquiridos no CCD formar o conjunto de dados necessários para analisar os perfis de decaimento de todos os fluoróforos no campo de visão . A propagação do GI é sincronizada com os pulsos de excitaçãoe, para a série de aquisições CCD, o atraso da porta do tempo em relação aos impulsos de excitação é definida como um conjunto de valores a aumentar ao longo do intervalo desejado. Essa sincronização é conseguida usando o gerador de atraso que compreende uma "caixa rápido delay" (fornecimento de atrasos até 20 ns em passos de 1 PS) e uma "caixa de atraso grosso" que fornece atrasos com um passo mínimo de 25 ps.
Para FLIM, excitação pode ser fornecida por qualquer de laser ultra-rápida. Por conveniência, empregam tipicamente uma fonte de fibra supercontínuo bombeado por laser que fornece impulsos de picossegundo sintonizável em todo o espectro visível a partir da qual a radiação de excitação apropriada pode ser seleccionada para qualquer fluoróforo usando uma roda de filtro motorizado com diferentes filtros passa-banda. Normalmente, usamos uma potência média de ~ 100-200 mW na amostra com pulsos na taxa de repetição de 40 ou 60 MHz. Tais poderes de excitação também pode ser fornecida por fontes de laser ultra-rápidos baseados na duplicação da frequênciade modo bloqueado de titânio dopado com lasers de safira. Note-se que uma duração de pulso de excitação abaixo de 100 ~ ps é suficiente para a maioria das experiências. Uma segunda roda de filtro motorizado equipado com filtros de densidade neutra e é usado para regular a intensidade de excitação. Por razões de segurança e conveniência, a radiação de excitação pode ser entregue através de uma fibra óptica de modo simples. As configurações de FLIM de campo amplo e FLIM opticamente segmentado são apresentados nas Figuras 2 e 3, respectivamente. Para mais detalhes sobre os componentes usados precisas, visite o wiki openFLIM-HCA 33. Uma cópia da lista de peças atual é dada no material suplementar.
Para FLIM de campo amplo, a radiação de excitação é necessária para iluminar todo o campo de vista tão uniformemente quanto possível. Para isso, dirigir o feixe de laser de excitação para um difusor holográfico "cartola" que é rodado a 10-50 Hz e a média de tempo de manchas de laser, com o plano da DIFfusor a ser trabalhada para o plano focal posterior da lente da objectiva de microscópio. A imagem de fluorescência a partir do porto do microscópio de saída é retransmitida para o fotocátodo do Governo da Índia e o fósforo de GOI (área ativa diagonal 18 mm) o é fotografada no sensor de CCD científica arrefecida (tamanho do chip 10,2 mm x 8,3 mm) câmera usando um par de lentes de câmeras que fornecem uma ampliação de 0,7. O sistema é controlado por um PC padrão que faz interface com a instrumentação usando protocolos RS232. Além disso, um microprocessador Arduino é utilizado para controlar um obturador no caminho da luz de excitação que é fechada, excepto quando a câmara CCD é a aquisição de dados FLIM e para gravar o sinal a partir de um fotodíodo que é usado para medir a potência média do supercontínuo espectralmente filtrada fonte de excitação. Para FLIM opticamente seccionado, a radiação laser de excitação é acoplado em uma fibra óptica monomodo polarização-manutenção que conecta diretamente para a unidade de digitalização disco de Nipkow, como shown na Figura 3. A imagem de fluorescência de saída a partir da unidade de digitalização Nipkow é retransmitida para o fotocátodo do GI e o resto do sistema é o mesmo como para FLIM de campo amplo.
software openFLIM-HCA
O software de aquisição de dados está escrito em μManager 34. Ele oferece total HCA funcionalidade de aquisição de dados, incluindo opções para mudar a sequência em que os poços da placa são gravadas, para adquirir cursos de tempo para qualquer FOV, para manter automaticamente o foco durante as medições e controlar as rodas excitação e filtro de emissão e o trocador dicróicas para imagens de multicolor automatizado. É também possível executar uma aquisição "prédigitalização" de intensidade de fluorescência, a fim de identificar automaticamente e registar as posições dos FOVs adequados para uma aquisição de FLIM subsequente de acordo com critérios, por exemplo, com base na intensidade. dados HCA FLIM pode ser salvo como uma sériede arquivos TIFF, como uma série de arquivos OME-TIFF (ou seja, um por FOV) ou como um único arquivo OME-TIFF incorporando todos os dados a partir de uma placa com múltiplas cavidades. Mais informações e uma descrição detalhada do software μManager podem ser encontradas no wiki openFLIM-HCA 33.
O software de análise de dados, FLIMfit 31, um cliente de código aberto baseado em MATLAB para a imagem OMERO plataforma de gestão de dados 32, é capaz de ler dados FLIM a partir de um servidor OMERO ou a partir do disco do computador, como indicado na Figura 4. Ele foi projetado para analisar dados de TCSPC ou instrumentos FLIM fechado em tempo de campo amplo e oferece muitos recursos para atender os dados de openFLIM-HCA incluindo a instalação de monoexponencial perfis de decaimento, e dobrar perfis de decaimento de complexidade exponencial e superiores, incluindo modelos como perfis de fluorescência de decaimento resolvido-polarização. Ele também pode ter em conta sinais de fundo fixos e variáveis no tempo e pode UTIlize uma função medido espaço-temporal resposta do instrumento (IRF) ou pode caber usando um IRF idealizado que pode ser feita numa base de pixel-wise por um montante determinado a partir da medição IRF experimental completa deslocado no tempo. Uma diferença de tempo global (T 0) entre o IRF e uma amostra fluorescente pode ser determinada a partir de uma medição de um padrão de fluorescência. As variações espaciais de sinais de fundo e de IRF também pode ser tida em conta. FLIMfit é capaz de ajustar os dados de FLIM em uma base de pixel-wise ou usando "binning global" ou "ajuste global" para facilitar o ajuste dos dados FLIM com modestos (centenas) fóton números para modelos de decaimento complexas.
Binning global implica agregar todos os fotões detectados a partir dos pixels dentro de uma ROI definida pelo utilizador em cada ponto de tempo para fornecer números de fótons suficientes para permitir a adaptação a modelos de decaimento complexas. O ROI pode ser todo o campo de visão (FOV), que pode ser manualmente defined pelo utilizador, ou pode ser determinada utilizando ferramentas de segmentação de imagem. O ROI também pode ser definida usando máscaras importados para FLIMfit de outro software de segmentação de imagens. Para aplicações de FRET, é comum o uso de binning mundial para atender a um modelo duplo decaimento exponencial para determinar os componentes de fluorescência de vida correspondentes a FRETing e dadores de fluor�oros não FRETing que são assumidos para ser espacialmente invariantes em todo o ROI e depois para recolocar em um base de pixel a gota com estes vales componentes Tempo de vida fixos, a fim de se obter a fracção da população FRETing doador em cada pixel.
Encaixe global implica encaixe simultaneamente os componentes da vida e frações da população FRETing doador de pixel-wise através de uma FOV- todo ou em um conjunto de dados FLIM que poderia incluir vários FOVs, por exemplo, a partir de um experimento placa com múltiplas cavidades ou uma série temporal de imagens de fluorescência ao longo da vida. montagem global é capaz de explorar o Variati espacialna de frações da população em toda a imagem que é perdido na abordagem binning global para fornecer restrições mais fortes sobre a estimativa de vida componente – e os resultados, portanto, mais confiável – embora à custa de muito mais computação 35. FLIMfit pode rapidamente analisar conjuntos de dados placa FLIM múltiplos poços com encaixe mundial em estações de trabalho de PC convencionais com, por exemplo, um com vários poços conjunto de dados FLIM fechado em tempo, adquirida com cinco portais de tempo para cada um dos 394 FOV cada um compreendendo 672 x 512 pixels, exigindo apenas 32 segundo e 2 GB de memória para se ajustar a um modelo de decaimento exponencial dupla 31. Isto foi conseguido através da utilização de um não-linear separável menos algoritmo de ajuste quadrado implementado usando algoritmos paralelos de vários segmentos para ativar a escala eficaz em processadores multicore e o código FLIMfit foi optimizado para minimizar o uso de memória. A Figura 5 mostra um instantâneo da interface gráfica do usuário de FLIMfite mais detalhes podem ser encontradas na página web dado em referência 36. Mais informações sobre a montagem global e binning global pode ser encontrado na referência 31.
O seguinte protocolo para HCA FLIM, usando o nosso instrumentação openFLIM-HCA e software pode ser adaptado para uma ampla gama de experimentos com imagens de células com leituras FLIM. Em geral, a placa com múltiplas cavidades FRET experiências deve ser concebido para incluir poços em replicado de controlos positivos e negativos biológicas para além das condições a ser estudada. Aqui, nós descrevemos a aplicação específica para executar FLIM opticamente seccionada (ver Figura 3) de células COS que exprimem a FRET construções que consiste da proteína fluorescente mTurquoise e proteína fluorescente Vénus unidos por um curto ligante peptídico. Aqui o mTq32V, mTq17V e mTq5V FRET construções (discutido na Seção Resultados representativos) proporcionará maior eficiência elevados FRET baixa, média e, juntamente com o não-FRETing mTq5A construir.Estas construções e outros materiais necessários para seguir este protocolo estão listados na Lista de Materiais.
Nós descrevemos um microscópio placa com múltiplas cavidades automatizado projetado para HCA usando FLIM fechado em tempo. Este instrumento é controlado através de software de código aberto escrito em μManager com a opção de salvar os dados para um servidor OMERO ea análise dos dados FLIM sendo realizado usando FLIMfit 36, um programa de código aberto escrito em Matlab e disponível como um cliente OMERO 32 O instrumento μManager software de controle, openFLIM-HCA, está disponível on-line 33 com uma lista dos componentes do sistema 48 para permitir que pesquisadores acadêmicos para construir seus próprios instrumentos FLIM HCA.
A fim de adquirir dados FLIM robustos, é necessário para otimizar as configurações de aquisição de Governo indiano e CCD e para ter em conta as variações de t 0. Tal como descrito em 3.8.2, e o ajuste de ganho câmara CCD GI tempo de integração deverá ser ajustada para atingir ~ 75% da gama dinâmica do CCD. vocêcantar mais elevadas tensões GOI e várias acumulações de quadro CCD em cada atraso porta do tempo aumenta a relação sinal-ruído 49, mas isso aumenta o tempo total de aquisição FLIM (já que menos fótons de fluorescência são adquiridos por quadro antes de os ácidos gordos saturados de câmera CCD e por isso o número de acumulações de quadro deve ser aumentada) e por isso este trade-off deve ser decidido para cada experimento. A calibração do gerador de atraso depende da taxa de repetição do laser e é, portanto, necessário para assegurar que o ficheiro de calibração correcta para a taxa de repetição utilizado é carregado para o software de aquisição. O procedimento para calibrar a caixa de atraso pode ser encontrado no wiki openFLIM-HCA 33.
Se a autofluorescência celular é baixo quando comparado com o sinal de fluorescência, que utilizam o sinal a partir de um meio de cultura apenas uma das cavidades contendo a fornecer o fundo variável no tempo (TVB). Para minimizar a fluorescência de fundo do meio de cultura celular, evitamosmídia contendo vermelho de fenol. Se a autofluorescência celular é significativo, em seguida, o TVB podem ser derivadas a partir de medições das células não marcadas. No entanto, neste caso, deve ser tomado cuidado, já que esta assume que a autofluorescência fundo é a mesma para cada pixel na imagem. Esta suposição não será válida se a autofluorescência varia significativamente entre uma célula ou se o feixe de excitação ou sensibilidade de detecção não é uniforme ao longo do campo de visão.
A aquisição de uma imagem de IRF usando pulsos de luz de excitação espalhadas fornece o perfil de IRF temporal que é convolvido com o modelo de dados no processo de adaptação e também fornece um mapa da variação espacial da IRF em todo o campo de vista. O IRF pode ser medida por imagiologia de uma amostra de espalhamento, tais como uma suspensão coloidal, embora, no nosso instrumento, usando a luz de excitação espalhada a partir do disco de Nipkow fornece uma medição de líquido de limpeza do IRF. A determinação precisa do momento of IRF é importante porque os erros no tempo de atraso entre o tempo de excitação e-gating pode impactar significativamente o processo de adaptação, particularmente na altura da montagem de complexos modelos de decaimento exponencial. O IRF adquiridos utilizando luz de excitação dispersa não é exatamente o que é necessário para o processo de adaptação, porque ele é gravado no comprimento de onda de excitação ao invés de no comprimento de onda de emissão de fluorescência, o que pode afetar o seu calendário, embora a variação espacial da IRF deve ser o mesmo em ambos os comprimentos de onda. Além disso, o IRF dispersa pode ser deslocado em todo o mundo no tempo em relação à verdadeira IRF devido a um comprimento do percurso óptico diferindo do objecto dispersão, como é o caso para um IRF adquirida a partir do disco de Nipkow em FLIM opticamente seccionada. Esta correcção, t 0, que é o deslocamento temporais mundial necessário que deve ser aplicada ao IRF luz de excitação espalhada adquirida, é calculado a partir dos dados de referência monoexponencial corante tal como indicado na Protocetapa ol 4.4. Os seguintes corantes podem ser usados para diferentes comprimentos de onda de excitação: 75 uM um Cumarina 153 solução em metanol (τ ~ 4.3 NS 50) pode ser usado para a excitação na gama de 295-442 nm; uma solução de 75 uM Cumarina 6 em etanol (t ~ 2,43 NS 37) pode ser usado para a excitação na gama de 430-500 nm; e uma solução 75 | iM rodamina B em água (τ ~ 1.7 NS 37) pode ser usado para a excitação na gama de 488-575 nm. Fazemos notar que, embora seja possível, em FLIMfit usar um IRF diferente para cada pixel do sistema, geralmente, é razoável assumir que o IRF espacialmente variável tem o mesmo perfil temporal para cada pixel da imagem, mas apresenta uma gama de espacialmente variando deslocamentos temporais relativos ao global a T 0. Descrevemos deste como o mapa de IRF mudança, a qual é determinada a partir da luz dispersa IRF. Juntos, o perfil de IRF, t 0 e o mapa deslocamento IRF são usados para PTCertifique-se de que cada pixel no campo de visão é equipado com um IRF apropriado. Importante, t 0 pode variar lentamente ao longo do tempo por isso deve ser medido antes de qualquer aquisição de dados FLIM.
O usuário deve decidir como provar os perfis de decaimento de fluorescência e é necessário para definir a largura dos tempos portões e seus atrasos relativos após excitação. Em geral, é desejável usar grandes larguras de porta para maximizar o sinal detectado e normalmente usamos larguras de porta configurada para 4 ns para FLIM de células marcadas com proteínas de fluorescência. O número de atrasos de tempo de porta deve ser suficiente para provar o perfil de decaimento de fluorescência (incluindo um portão definido para medir o sinal imediatamente antes do pulso de excitação) dada a complexidade do modelo adequado que vai ser utilizado na análise. O valor óptimo pode depender de os tempos de vida e amplitudes relativas dos componentes de decaimento. Em geral, 4 portas são suficientes para monoexponencial montagem decai enquanto 7 ou mais portas podemser usado para mais modelos de decaimento complexas.
Notamos que FLIM pode ser implementado usando uma variedade de técnicas no domínio do tempo ou no domínio da frequência e HCA FLIM automatizada de arranjos de placas de múltiplos poços foi implementado pela primeira vez em um (não-corte) microscópio de campo amplo usando leituras ao longo da vida no domínio da frequência de FRET 51. O primeiro leitor de placas de poços múltiplos óptico seccionamento FLIM automatizado para HCA utilizando todo o campo de imagem fechado em tempo 28 foi então relatada. Subsequentemente, toda a área (não de corte) no domínio da frequência de FLIM HCA foi aplicado para o rastreio de translacionais pós (fosforilação de tirosina) ao longo de uma biblioteca de genes usando FRET 52 e HCA FLIM-gated tempo tem sido aplicada a FRET ensaios de HIV-1 Gag oligomerização 53 e de SUMOilação de FOXM1 54 e de Raichu RhoA e Rac1 biossensores 33. É também possível utilizar TCSPC FLIM para placa de poços múltiplos 26, mas até à data não tenha sido um desafio para combinar tele taxa de transferência de técnicas que exploram a detecção de campo amplo. Uma abordagem emergente que poderia resolver este problema é o uso de matrizes de detectores de contagem de fótons individuais, tais como matrizes SPAD 55.
Fazemos notar que quaisquer leituras de FRET utilizando proteínas fluorescentes devem ser tratados com precaução e que os valores absolutos dos parâmetros obtidos a partir FLIMfit ou qualquer outro software de análise de FLIM dependerá das hipóteses associadas com o modelo de ajustamento. Por exemplo, onde o dador de FRET tem uma componente significativa segundo decaimento, a utilização de um modelo biexponencial para ajustar os dados de FRET FLIM pode resultar na contribuição do componente mais rápida deterioração, tipicamente associados com a população FRETing aparecendo maior do que deveria. Por conseguinte, é desejável utilizar doadores com um tempo de vida de mono-exponencial, tais como mTq2FP. Mesmo então, os estudos recentes têm demonstrado que a análise de FRET pode ainda ser afectado por estados escuras de proteínas aceitador de fluorescência ou porheterogeneidade do factor de orientação κ 2 devido a uma distribuição de conformações fluoróforo com uma variedade de ângulos e distâncias cromóforos 56. No entanto, nós e outros mostraram que as leituras de fluorescência ao longo da vida de FRET produzem resultados úteis que se correlacionam com as medições bioquímicas e pode ser utilizado para pesquisar as interacções proteína ou para acompanhar a dinâmica de biossensores. Assim, esta plataforma openFLIM HCA pode ser aplicado a uma vasta gama de ensaios à base de tempo de vida de fluorescência utilizando FRET ou autofluorescência celular 8, bem como proporcionando leituras quantitativas de sondas à base de corante 25.
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.
microscope frame | Olympus | IX81 | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
optical autofocus | Olympus | ZDC | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
motorized (x-y-z) microscope stage | Marzhauser | 00-24-565-0000 | Stage with Corvus controlle |
excitation laser source | Fianium | SC400-4 | Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/ |
gated optical intensifier | Kentech | High Rate Imager (HRI) | |
delay generators | Kentech | — | See agile delay generator and precision delay generator |
camera | Hamamatsu | ORCA-ER-II | |
Nipkow disc scanner unit | Yokogawa | CSU-X1 | http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/ |
Top hat diffuser | Thorlabs | ED1-S20-MD | Engineered diffusers |
mTq5V | Oxford Genetics | P3850 | mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker |
mTq17V | Oxford Genetics | P3847 | mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker |
mTq32V | Oxford Genetics | P3848 | mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker |
mTq5A | Oxford Genetics | P3849 | mTurquoise Amber construct |
HEK293T | — | — | cell type used |
phenol red-free HBSS | Sigma Aldrich | 55021C-1000ML | imaging media |
culture media | DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics | ||
DMEM | Sigma Aldrich | D6046-500ML | for culture media |
FBS | Sigma Aldrich | 12003C-500ML | for culture media |
xTremeGene9 | Sigma Aldrich | 6.37E+09 | for transfection, follow online protocol from La Roche |
trypsin/EDTA Solution | Thermo Fischer | R001100 | for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer |