Vi presenterar en öppen källkod hög innehållsanalys (HCA) instrument som använder automatiserad fluorescens livstid avbildning (FLIM) för att analysera proteininteraktioner med hjälp av Förster resonans energiöverföring (FRET) -baserade avläsningar. Datainsamlingen för denna openFLIM-HCA instrument styrs av mjukvara skriven i μManager och dataanalys genomförs i FLIMfit.
We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in µManager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.
Den ökande användningen av automatiserad hög innehållsanalys (HCA) i läkemedelsutveckling 1 till analyssubstansbibliotek kompletteras med utvecklingen inom biovetenskaplig grundforskning mot automatiserade avbildningsexperiment för systematiska studier, till exempel, för fenotypiska skärmar siRNA bibliotek. Automatiserad HCA blir också allt viktigare för småskaliga biologiska studier som vanligtvis har genomförts med manuella experiment med tiotals rätter av celler avbildade med konventionella mikroskop. Den statistiska befogenhet av förmågan att analysera och analysera hundratals till tusentals synfält möjliggör utjämning av experimentell buller (inklusive "biologiskt brus") och automatisering av bild datainsamling och analys av stora prov arrayer kan hjälpa till att eliminera operatörens partiskhet och ofta kan användas för att detektera förekomsten av systematiska fel, till exempel en förändring i IRF profilen under ett förvärv. Fluorescensbaserade analyserär allmänt genomföras i HCA, med de flesta kommersiellt tillgängliga HCA instrumentering terar fluorescensintensitet avbildning i ett eller flera spektrala kanaler för att kartlägga den relativa fördelningen och co-lokalisering av märkta proteiner. Mer sofistikerade fluorescens avbildningsmetoder, såsom fluorescens livstid avbildning (FLIM), polarisation anisotropi imaging och tidsupplöst fluorescens anisotropi avbildning, är inte allmänt utnyttjas i kommersiella HCA instrument, även om de erbjuder kraftfulla kvantitativa avläsningar, t.ex. av proteininteraktioner. Här presenterar vi en öppen källkod strategi för genomförandet FLIM i ett automatiserat mikroskop för HCA.
Fluorescens livstid ger en inneboende ratiometrisk spektroskopiska avläsning som kan användas för att särskilja olika molekylslag eller att undersöka den lokala molekylära miljön i en fluorofor och är okänslig för fluoroforen koncentration, till effektivitetsvinster excitation / upptäckt, och effekterna av scattering och prov absorption två. Vidare, eftersom fluorescenslivstid mätningar kan göras i en enda spektral kanal, de är direkt jämförbara mellan olika instrument och prover utan kalibrering. De kan appliceras på endogena fluoroforer, inklusive några cellulära metaboliter, lipider och extracellulära matrixkomponenter, för att ge inneboende avläsning av biologiska processer och sjukdomar. Etikett-fri FLIM kan alltså kartlägga metabola förändringar i celler 3,4 och har använts för att övervaka stamcellsdifferentiering 5,6 och tillväxten av kollagen ställningar 7. Vi visade nyligen att FLIM HCA kan användas för automatiserad etikettfria analyser av cellulär metabolism utnyttjar autofluorescens 8. Oftare är dock fluorescens livstid mätningar och FLIM tillämpas på exogena fluoroforer som märka specifika biomolekyler, ofta implementeras med hjälp av färgämnen som färgas cellulära avdelningar, med hjälp av färgämnena kopplade till antibodies som riktar specifika proteiner i fasta celler, eller använda genetisk information fluoroforer kopplade till specifika proteiner. Fluorescens livstid kan användas för att ge robusta kvantitativa avläsning av fluorescerande prober avkänning deras fysiska eller kemiska miljö. För exempel, har färgämnen använts för att känna den lokala lipidfasen av cellmembran 9 eller cell viskositet 10 och genetiskt uttryckta fluorescerande proteinbaserade biosensorer har utvecklats för att rapportera koncentrationer av cell signalmolekyler bland annat som IP3 11, PIP2 12 och calpain 13 eller joner såsom kalcium 14,15, kalium 16 och klorid 17.
Många sådana biosensorer utnyttjar Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 18,19 för att tillhandahålla avläsningar av förändringar i biosensorkonformation. FRET mellan "givare" och "acceptor" fluoroforer sker via en kort räckvidd direkt dipol-dipol växelverkanför vilka fluoroforer är typiskt separerade med mindre än ~ 10 nm. Således detektion av FRET indikerar närheten av lämpligt märkta proteiner och därmed ger en möjlighet att läsa ut protein-proteininteraktioner 20, såsom bindning eller oligomerisering – antingen som ändpunkter i fixerade celler eller som dynamiska händelser i tidsförlopp mätningar av levande celler. Genom att märka en lämplig molekylär konstrukt med både givare och acceptor fluoroforer, är det också möjligt att läsa ut konformationsförändringar – eller klyvning – av konstruktionen genom förändringen i FRET och detta är grunden för många biosensorer 21. Mätningar av FRET effektivitet kan ge information om donatorn-accept avstånd och befolkningen bråkdel av givar fluoroforer genomgår FRET. Sålunda kan FRET-baserade avbildningstekniker kan användas för att kartlägga och kvantifiera molekylära interaktioner i tid och rum, till exempel, för att belysa cellsignalering processer 22. automating sådana avbildningstekniker kan ge hög genomströmning analyser baserade på avläsningar av signalvägar eller nätverk.
I HCA är FRET avläsning oftast genomförts spektral ratiometrisk avbildning, där förändringar i förhållandet mellan acceptorn till givar intensitet mappas. Även om detta tillvägagångssätt är lätt genomförs – och finns i många kommersiellt tillgängliga flerkällsplatta läsare – kvantitativa spektralt upplösta mätningar FRET kräver kalibrering av den spektrala responsen hos systemet 23. Detta inkluderar spektral överhörning som härrör från spektral genomblödning och direkt excitation av acceptorn samt överföringsegenskaperna hos instrumentet och provet (inre filtereffekt). I princip innebär denna mätning av ytterligare "kontroll" prover som är märkta med antingen donator endast eller acceptor skyddad.
Från sådana spektrala ratiometriska mätningar FRET, en effektiv FRETeffektivitet (produkten av den verkliga FRET effektivitet och fraktionen av FRETing donator / acceptormolekyler) kan erhållas tillsammans med den relativa proportionen av donator- och acceptormolekyler 24. Spectral ratiometrisk FRET används ofta med unimolekylär FRET biosensorer, där kan antas givaren / acceptor stökiometri att bli känd. För att bestämma populations fraktionerna av FRETing donator och acceptor, t.ex., för att erhålla en dos-responskurva, krävs kunskap om de faktiska FRET effektivitet. Detta kan erhållas genom att mäta en positiv FRET kontrollprov med kända egenskaper eller genom att använda en annan metod för att mäta FRET effektivitet, såsom acceptor fotoblekning eller FLIM.
Använda fluorescens livstid avläsning kan FRET detekteras och kvantifieras genom mätning av utsläpp givaren ensam – eliminerar behovet av spektral kalibrering och ytterligare kontrollprover. Således kan FLIM FRET avläsningar jämföras mellan instrumentoch mellan olika prover – tillåter data från endoskopi eller tomografi av levande sjukdomsmodeller 25 för att jämföras med mätningar av cellbaserade analyser. Genom att montera givare fluorescenssönderfallsprofiler till en lämplig multi exponentiellt avtagande modell som motsvarar FRETing och icke-FRETing givarpopulationer, FRET effektivitetsvinster och befolkningsfraktioner kan i princip erhållas direkt utan ytterligare mätningar. Dessa betydande fördelar, men kommer på bekostnad av FLIM kräver mer detekterade fotoner per pixel än spektralt löst intensitet imaging – typiskt hundratals fotoner krävs för att uppnå en noggrannhet på livstid bestämningen av 10% vid montering till en enda exponentiellt avtagande modell och när montering fluorescens sönderfallsprofiler till komplexa (multiexponentiell avtagande) modeller, antalet upptäckta fotoner som krävs ökar till tusentals. Detta har konventionellt lett till långa hämtningstider (tiotals till hundratals sekunder per fält av VIew) för FLIM, särskilt när man använder tid korrelerade enda fotonräkning (TCSPC) genomförs med sekventiell pixel förvärv i laserskanningsmikroskop. Försök att öka bildhastigheten med högre exciteringsnivåer kan leda till betydande fotoblekning och / eller fototoxicitet. Tillsammans med en brist på lämpliga kommersiellt tillgängliga instrument och programvaruverktyg, har detta hindrat FLIM från att utnyttjas i HCA för läkemedelsutveckling eller systembiologi, där hundratals till tusentals synfält ska avbildas. Laserskanning TCSPC FLIM har genomförts i en automatiserad flerkällsplatta mikroskop 26 för sekundära mätningar efter identifiering av "träffar" av steady-state polarisering upplöst fluorescens anisotropi avbildning 27, som kan nå till spektral proportionerlig avbildning 28 med vilken den delar liknande avbildningshastigheter många fördelar och nackdelar. Fluorescensanisotropi avbildning utnyttjar minskningeni fluorescensanisotropi av acceptorn i närvaro av FRET och är också känslig för spektrala överhörning (t.ex. direkt excitation av acceptorn). Det kräver kalibrering för att ta hänsyn till polarisering överhörning och inte ger en direkt mätning av FRET effektivitet.
Att inse fördelarna med FLIM för HCA, har vi arbetat med att ta upp frågan om hastigheten på bildtagning och bredare tillgång till tekniken. Här ger vi en komplett lista över öppna källkod och hårdvarukomponenter som kan användas för att genomföra den automatiska snabba FLIM flerkällsplatta läsare som beskrivs nedan, tillsammans med exemplar FRET baserade-analyser. I vår strategi 29, är FLIM förverkligas genom vidvinkeltids gated avbildning med en gated optisk bildförstärkare (GOI), som visas i figur 1 som kan ge snabbare bildbehandling priser och lägre fotoblekning än enkelstrålescannings TCSPC på grund av parallella pixel interrogation. Vår openFLIM-HCA instrument kan ge utan tillsyn FLIM kräver bara några sekunder att få flim detektering av data några 100 fotoner per pixel (beroende på ljusstyrkan på provet). I kombination med den tid som krävs för att flytta provet från föregående synfältet, att justera förvärvet inställningarna och för att hålla provet i fokus, detta resulterar normalt i flerbrunnsplattan förvärvstider ~ 10 s per synfält 25,28. Optisk sektionering kan implementeras med hjälp av en kvasi-brett fält Nipkow ( "roterande skiva") scanner 30.
För FLIM dataanalys, har vi utvecklat en öppen källkod verktyg som kallas FLIMfit 31 som har förmåga att snabbt analysera flerbrunnsplatta flim dataset på konventionella PC-arbetsplatser och är en plug-in för Omero 32. FLIMfit ger globala analysfunktioner (som diskuteras i avsnitt 1.2) som gör det möjligt för flim data som ska monteras på komplexa modeller med only några 100 fotoner per pixel under antagandet att de fluorescenslivstid komponenter är invariant tvärs en bild eller regionen av intresse (ROI), vilket minskar antalet detekterade fotoner erfordras, ljusexponeringen till provet och bildinhämtningstiden. Köra FLIMfit på en vanlig stationär dator, kräver endast 10s sekunder av beräknings tid att analysera datamängder som omfattar hundratals FOVs. Således både FLIM datainsamling och analys kan utföras på tidsskalor som är praktisk för HCA.
openFLIM-HCA hårdvara
Implementeringen av FLIM HCA omfattar sex nyckelkomponenter: (i) en fluorescensmikroskopstativet med optisk autofokus; (Ii) en motoriserad (xyz) mikroskopställningen; (Iii) en exciteringslaserkälla; (Iv) ett brett fält tids gated FLIM systemet med gated optisk förstärkare (GOI), fördröjningsgeneratorn och kamera; (V) en dator för datainsamling och analys och (vi) en nipkowskiva scannerenhet för optiskt sektionerad avbildning för att undertrycka ofokuserad ljus. Detta kan vara viktigt när avbildning svaga signaler, t.ex. från FRET biosensorer på cellplasmamembranet, som kan översvämmas av bidrag från cytoplasmisk fluorescens eller bakgrund från täck eller odlingsmedium. Tids gated FLIM uppgifter förvärvas genom att belysa provet med ultra pulsade exciteringsstrålning, avbildning av fluorescensemission till fotokatoden av de indiska myndigheterna och skaffa en serie CCD bilder av fosfor av de indiska myndigheterna för en rad inställningar för tidsfördröjning den optiska förstärka grinden efter ankomsten av excitationspulsema. Eftersom den tid grinden dröjsmål efter excitation ökas, fluorescenssignalen ses att minska och den serie tidsspärrad fluorescensintensitetsbilder som förvärvats på CCD bilda datamängden som krävs för att analysera de sönderfallsprofilerna för alla fluoroforer i synfältet . Gating av de indiska myndigheterna är synkroniserad till excitationspulsemaoch, för den serie av CCD förvärv, är fördröjningen av tiden grinden relativt excitationspulsema inställd på en serie ökande värden över det önskade området. Denna synkronisering sker med hjälp av fördröjningsgenerator som innefattar en "snabb fördröjnings box" (som ger förseningar upp till 20 ns i 1 ps steg) och en "grov fördröjning låda" som ger förseningar med ett minimum steg 25 ps.
För FLIM kan excitation åstadkommas genom någon ultra laser. För enkelhetens skull använder vi typiskt en fiberlaser-pumpad supercontinuum källa som ger pikosekund pulser avstämbara över det synliga spektrumet, från vilken den lämpliga exciteringsstrålningen kan väljas för någon fluorofor med användning av en motordriven filterhjul med olika bandpassfilter. Vanligtvis använder vi en medeleffekt på ~ 100-200 iW vid provet med pulser på 40 eller 60 MHz repetitionshastighet. Sådana excitation befogenheter kan också åstadkommas genom ultralaserkällor baserade på frekvens fördubbling avmode-låst titan dopad safir laser. Observera att en exciteringspulslängd under ~ 100 ps är tillräcklig för de flesta experiment. En andra motordriven filterhjul utrustat med neutrala densitetsfilter används för att reglera den exciteringsintensitet. För säkerhet och bekvämlighet, kan exciteringsstrålningen att levereras via en optisk enkelmodfiber. De konfigurationer för brett fält FLIM och optiskt sektionerad FLIM presenteras i figurerna 2 och 3 respektive. För mer information om de exakta komponenter som används, besök openFLIM-HCA wiki 33. En kopia av den aktuella listan delar ges i den kompletterande material.
För brett fält FLIM är excitationsstrålningen som krävs för att lysa upp hela synfältet så enhetligt som möjligt. För detta hänvisar vi exciteringslaserstrålen till en holografisk "top-hat" diffusor som roteras vid 10-50 Hz till tids genomsnittliga laser speckle, med planet för diffixerings som avbildas på baksidan fokalplan målet mikroskoplinsen. Den fluorescens bild från utgången på mikroskopet förmedlas på fotokatoden av de indiska myndigheterna och fosforn i de indiska myndigheterna (aktiva område diagonal 18 mm) avbildas på sensorn av en kyld vetenskaplig CCD (chip storlek 10,2 mm x 8,3 mm) kameran med hjälp av ett par kameralinser som ger en förstoring av 0,7. Systemet styrs av en vanlig PC som är ansluten till instrumenteringen med hjälp av RS232-protokoll. Dessutom är en Arduino mikroprocessor används för att styra en slutare i exciteringsljusvägen som är stängd utom när CCD-kameran förvärvar flim data och för att spela in signalen från en fotodiod som används för att mäta den genomsnittliga effekten från spektralt filtrerade supercontinuum exciteringskälla. För att optiskt sektionerad FLIM, är exciteringslaserstrålningen kopplas in i en enkelmod polarisationsbevarande optisk fiber som ansluter direkt till nipkowskiva skannerenheten, som arhown i figur 3. Utgången fluorescens bild från Nipkow skannerenheten förmedlas på fotokatoden av de indiska myndigheterna och resten av systemet är densamma som för brett fält FLIM.
openFLIM-HCA programvara
Datainsamling programvara är skriven i μManager 34. Det ger full HCA datainsamling funktionalitet, inklusive alternativ för att ändra den ordning i vilken brunnarna i plattan avbildas att förvärva tidsförlopp för varje FOV, för att automatiskt bibehålla fokus under mätningar och för att kontrollera excitations- och emissionsfilterhjul och den dikroiska växlare för automatiserad flerfärgsbildalstring. Det är också möjligt att köra en "förscanning" förvärv av fluorescensintensitet för att automatiskt identifiera och registrera positionerna på lämpliga FOVs för en efterföljande FLIM förvärvet enligt kriterier, t.ex., på grundval av intensitet. Flim HCA data kan sparas som en serieav TIFF-filer, som en serie av OME-TIFF-filer (dvs, en per FOV) eller som en enda OME-TIFF-fil som innehåller alla data från en flerkällsplatta. Mer information och en detaljerad beskrivning av μManager programvara kan hittas på openFLIM-HCA wiki 33.
Dataanalys programvara, FLIMfit 31, en öppen källkod MATLAB-baserad klient för Omero bilddata plattform 32, kan läsa flim data från en Omero server eller från diskett, som visas i figur 4. Den har utformats för att analysera data från TCSPC eller vidvinkeltids gated flim instrument och ger många möjligheter att passa data från openFLIM-HCA inklusive montering monoexponentiellt sönderfallsprofiler, och att fördubbla exponentiell och högre komplexitet sönderfallsprofiler, inklusive modeller såsom polarisationsbevarande upplöst fluorescens sönderfallsprofiler. Det kan också ta hänsyn till fasta och tidsvarierande bakgrundssignaler och kan UVILize en uppmätt spatiotemporala instrumentets svar funktion (IRF) eller kan passa att använda en idealiserad IRF som kan vara tidsförskjuten på en pixel-wise grund av ett belopp som bestäms från den fullständiga experimentella IRF mätning. En global tidsskillnaden (t 0) mellan IRF och ett fluorescerande prov kan bestämmas från en mätning av en fluorescensstandard. Rumsliga variationer i bakgrundssignaler och IRF kan också beaktas. FLIMfit kan passa flim data på en pixel-wise eller enligt "global binning" eller "global passande" för att underlätta montering av flim data med blygsamma (hundratals) foton nummer till komplexa sönderfalls modeller.
Global binning innebär sammanläggning av alla de detekterade fotoner från pixlarna i en användardefinierad ROI vid varje tidpunkt för att ge tillräckliga fotonnummer för att möjliggöra montering på komplexa sönderfalls modeller. ROI kan vara hela synfältet (FOV), kan det vara manuellt defined av användaren, eller också kan bestämmas med användning bildsegmenteringsverktyg. ROI kan också definieras med hjälp av masker som importeras till FLIMfit från andra bildsegmente programvara. För FRET applikationer, är det vanligt att använda den globala binning för att passa till en dubbel exponentiell sönderfall modell för att bestämma fluorescens livstid komponenter motsvarande FRETing och icke-FRETing donator fluoroforer som antas vara spatialt invariant över ROI och sedan återmontera på en pixel-wise basis med dessa livstid komponent vales fastställts i syfte att erhålla FRETing donator befolkningen fraktionen i varje pixel.
Global montering innebär samtidigt montering av livstid komponenter och pixel-wise FRETing donatorpopulationsfraktioner över en hel FOV- eller över en FLIM datamängd som kan innefatta flera FOVs, t.ex. från en flerkällsplatta experiment eller en tidsserie av fluorescens livstid bilder. Global montering kan utnyttja den rumsliga variatipå befolknings fraktioner över bilden som försvinner i den globala binning strategi för att ge starkare begränsningar på komponent livstid uppskattning – och därför mer tillförlitliga resultat – om än på bekostnad av betydligt mer beräkning 35. FLIMfit kan snabbt analysera flerbrunnsplatta flim dataset med global montering på konventionella PC arbetsstationer med, till exempel, en flerkällstids gated FLIM datamängd, förvärvades med fem tids grindar för var och en av 394 FOV vardera omfattar 672 x 512 pixlar, vilket kräver bara 32 sekunder och 2 GB minne för att passa till en dubbel exponentiell sönderfall modell 31. Detta har åstadkommits genom att använda en separerbar olinjär minsta kvadratanpassningsalgoritmen implementeras med hjälp av multitrådade parallella algoritmer för att möjliggöra effektiv skalning på flerkärniga processorer och FLIMfit koden har optimerats för att minimera minnesanvändning. Figur 5 visar en ögonblicksbild av det grafiska användargränssnittet i FLIMfitoch mer information kan hittas på webbsidan ges i referens 36. Ytterligare information om global montering och global binning kan hittas i 31 referens.
Följande protokoll för FLIM HCA använda vår openFLIM-HCA instrumentering och mjukvara kan anpassas för ett brett spektrum av cell imaging experiment med flim avläsning. I allmänhet, flerkällsplatta FRET experiment bör utformas för att inkludera replikatbrunnar av positiva och negativa biologiska kontroller utöver de villkor som studeras. Här beskriver vi den specifika tillämpningen för att utföra optiskt sektionerad FLIM (se figur 3) av COS-celler som uttrycker FRET-konstruktioner bestående av mTurquoise fluorescerande protein och Venus fluorescerande protein förenade genom en kort peptidlänk. Här mTq32V, mTq17V och mTq5V FRET konstruktioner (diskuteras i Representativa resultat avsnitt) ger låg, medelhög och hög FRET effektivitet tillsammans med den icke-FRETing mTq5A konstruera.Dessa konstruktioner och andra material som krävs för att följa detta protokoll listas i materiallistan.
Vi har beskrivit en automatiserad flerkällsplatta mikroskop avsedd för HCA använder tidsspärrad FLIM. Detta instrument styrs med hjälp av programvara med öppen källkod skriven i μManager med möjlighet att spara data till en Omero server och analys flim uppgifter genomförs med hjälp av FLIMfit 36, ett open source program skrivet i Matlab och tillgänglig som en Omero klient 32 μManager instrument styrprogram, openFLIM-HCA, finns tillgänglig på nätet 33 med en förteckning över de systemkomponenter 48 för att möjliggöra akademiska forskare att konstruera sina egna FLIM HCA instrument.
För att få robusta flim data är det nödvändigt att optimera förvärvsinställningar Indiens myndigheter och CCD och att ta hänsyn till eventuella variationer i t 0. Såsom beskrivits i 3.8.2 bör förstärkningsinställningen och CCD-kamera integrationstid GOI ställas in för att nå ~ 75% av CCD dynamiskt område. Usjunga högre GOI spänningar och flera CCD frame ansamlingar vid varje tidsgrindfördröjningen ökar signal-brusförhållandet 49 men detta ökar den totala FLIM uppsugningstiden (eftersom färre fluorescensfotoner förvärvas per ram före CCD-kameran mättade fettsyror och så antalet frame ansamlingar bör höjas) och så denna avvägning skall beslutas för varje experiment. Kalibreringen av fördröjningsgeneratorn beror på laserrepetitionshastighet och det är därför nödvändigt att säkerställa att den korrekta kalibreringsfilen för upprepningshastigheten som används laddas in i förvärv programvara. Proceduren för kalibrering av fördröjnings boxen kan hittas på den openFLIM-HCA wiki 33.
Om den cellulära autofluorescens är låg jämfört med fluorescenssignalen, använder vi signalen från en brunn innehållande bara odlingsmedium för att tillhandahålla den tidsvarierande bakgrunden (TVB). För att minimera bakgrundsfluorescens från cellodlingsmediet, undviker vimedia innehållande fenolrött. Om den cellulära autofluorescens är betydande, då TVB kan härledas från mätningar av de omärkta cellerna. Men i detta fall måste man vara försiktig, eftersom detta förutsätter att autofluorescens bakgrunden är densamma för varje pixel i bilden. Detta antagande kommer inte att gälla om autofluorescens varierar avsevärt mellan en cell eller om exciteringsstrålen eller detekteringskänsligheten är inte likformig över synfältet.
Förvärvet av en IRF bild med spridda excitation ljuspulser ger tids IRF profil som faltas med datamodellen i anpassningsprocessen och ger också en karta över den rumsliga variationen av IRF över synfältet. IRF kan mätas genom att avbilda en spridningsprov, såsom en kolloidal suspension även om, i vårt instrument, med användning av excitationsljus som sprids från den nipkowskiva ger en renare mätning av IRF. Noggrann bestämning av tidpunkten of IRF är viktigt eftersom fel i tidsfördröjningen mellan excitation och tidsgrind väsentligt kan påverka anpassningsprocessen, särskilt vid monteringen till komplexa exponentiella sönderfalls modeller. IRF förvärvats med hjälp spritt excitationsljus inte exakt vad som behövs för montering process eftersom det registreras vid excitationsvåglängden snarare än vid våglängden fluorescensemissions, som kan påverka dess timing, även om variationen i rummet av IRF bör vara densamma vid båda våglängderna. Dessutom kan den spridda IRF vara globalt skiftas i tid i förhållande till den verkliga IRF på grund av en skilda optisk våglängd från spridningsobjektet, vilket är fallet för en IRF förvärvats från nipkowskiva i optiskt genomskärning FLIM. Denna korrigering, t 0, vilket är den erforderliga globala tidsmässig förskjutning som ska appliceras på den förvärvade spritt excitationsljus IRF, beräknas från de monoexponentiell referensfärgämnesuppgifter såsom anges i Protocol steg 4,4. Följande färgämnen kan användas för olika exciteringsvåglängder: en 75 pM Kumarin 153-lösning i metanol (τ ~ 4,3 ns 50) kan användas för excitering inom intervallet 295-442 nm; en 75 pM Kumarin 6 lösning i etanol (x ~ 2,43 ns 37) kan användas för excitering inom intervallet 430-500 nm; och en 75 | iM rodamin B-lösning i vatten (τ ~ 1,7 ns 37) kan användas för excitering inom intervallet 488-575 nm. Vi noterar att, även om det är möjligt i FLIMfit att använda en annan IRF för varje bildpunkt i systemet, är det oftast rimligt att göra antagandet att spatiellt varierande IRF har samma temporal profil för varje pixel i bilden men utgör ett intervall spatiellt varierande tidsförskjutningar i förhållande till den globala t 0. Vi beskriver detta som IRF skiftkartan, som bestäms från spritt ljus IRF. Tillsammans är IRF profil, t 0 och IRF skift kartan som används för att enSe till att varje pixel i synfältet är utrustad med en lämplig IRF. Viktigt kan t 0 variera långsamt över tiden så det bör mätas innan FLIM datainsamling.
Användaren bör besluta hur man prov fluorescens sönderfallsprofiler och är skyldig att ställa in bredden på tidsportar och deras relativa fördröjningar efter excitation. I allmänhet, är det önskvärt att använda breda grindbredder för att maximera den detekterade signalen och typiskt vi använder grindbredder inställda på 4 ns för FLIM av celler märkta med fluorescensproteiner. Antalet tidsgrindfördröjningar bör vara tillräcklig för att ta prov på fluorescerande sönderfallsprofilen (inklusive en gate inställd för att mäta signalen precis innan excitationspulsen) tanke på komplexiteten i passande modell som kommer att användas i analysen. Det optimala värdet kan bero på de livstider och relativa amplituderna hos de sönderfallskomponenter. I allmänhet, 4 portar är tillräckliga för montering monoexponentiellt sönderfaller medan 7 eller fler portar kananvändas för mer komplexa sönderfalls modeller.
Vi noterar att FLIM kan implementeras med hjälp av en rad tids eller frekvensdomänen teknik och automatiserad FLIM HCA av flerbrunnsplattgrupper infördes först i en (icke-sektionering) brett fält mikroskop med hjälp frekvensdomänen livstid avläsning av FRET 51. Den första automatiserade optiska sektione FLIM flerkällsplatta läsare för HCA utnyttjar brett fält tids gated imaging 28 därefter rapporterats. Därefter tillsattes brett fält (icke-sektionering) frekvensdomän FLIM HCA tillämpas för att screena för posttranslationella modifieringar (tyrosinfosforylering) över ett genbibliotek med användning av FRET 52 och tidsspärrad FLIM HCA har tillämpats på FRET-analyser av HIV-1 Gag oligomerisering 53 och av SUMOylation av FOXM1 54 och av Raichu RhoA och RAC1 biosensorer 33. Det är också möjligt att använda TCSPC för flerkällsplatta FLIM 26 men hittills har det visat sig svårt att matcha than genomströmning av tekniker som utnyttjar brett fält upptäckt. En framväxande strategi som kan ta itu med denna fråga är användningen av uppsättningar av enstaka fotonräknande detektorer som SPAD arrayer 55.
Vi noterar att eventuella avläsning av FRET med fluorescerande proteiner bör behandlas med försiktighet och att de absoluta värdena av parametrar som erhållits från FLIMfit eller någon annan FLIM analysprogram kommer att bero på de antaganden som är förknippade med passande modell. Till exempel, där FRET donator har en betydande andra sönderfallskomponent, kan användningen av en biexponentiell modell för att passa de FRET flim uppgifter resultera i bidraget från den snabbare sönderfallskomponenten, typiskt associerad med FRETing befolkningen uppträder högre än det borde. Det är därför önskvärt att använda givare med en mono-exponentiell livstid såsom mTq2FP. Även då har nya studier visat att FRET-analys fortfarande kan påverkas av mörka tillstånden hos acceptor fluorescensproteiner eller genomheterogenitet orienteringsfaktorn κ 2 på grund av en fördelning av fluoroforen konforma med en mängd olika kromofora vinklar och avstånd 56. Trots detta har vi och andra visat att fluorescenslivstid avläsning av FRET do producera användbara resultat som korrelerar med biokemiska mätningar och som kan användas för att screena för proteininteraktioner eller för att följa dynamiken i biosensorer. Sålunda denna openFLIM HCA plattform kan tillämpas på ett brett spektrum av fluorescenslivstid baserade analyser som utnyttjar FRET eller cellulär autofluorescens 8, samt att tillhandahålla kvantitativa avläsningar av färgbaserade prober 25.
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.
microscope frame | Olympus | IX81 | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
optical autofocus | Olympus | ZDC | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
motorized (x-y-z) microscope stage | Marzhauser | 00-24-565-0000 | Stage with Corvus controlle |
excitation laser source | Fianium | SC400-4 | Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/ |
gated optical intensifier | Kentech | High Rate Imager (HRI) | |
delay generators | Kentech | — | See agile delay generator and precision delay generator |
camera | Hamamatsu | ORCA-ER-II | |
Nipkow disc scanner unit | Yokogawa | CSU-X1 | http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/ |
Top hat diffuser | Thorlabs | ED1-S20-MD | Engineered diffusers |
mTq5V | Oxford Genetics | P3850 | mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker |
mTq17V | Oxford Genetics | P3847 | mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker |
mTq32V | Oxford Genetics | P3848 | mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker |
mTq5A | Oxford Genetics | P3849 | mTurquoise Amber construct |
HEK293T | — | — | cell type used |
phenol red-free HBSS | Sigma Aldrich | 55021C-1000ML | imaging media |
culture media | DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics | ||
DMEM | Sigma Aldrich | D6046-500ML | for culture media |
FBS | Sigma Aldrich | 12003C-500ML | for culture media |
xTremeGene9 | Sigma Aldrich | 6.37E+09 | for transfection, follow online protocol from La Roche |
trypsin/EDTA Solution | Thermo Fischer | R001100 | for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer |