Biz Förster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı readouts kullanarak protein etkileşimleri tahlil için otomatik floresans ömrü görüntüleme (Flim) kullanan açık kaynak kodlu bir yüksek içerik analizi (HCA) aleti sunuyoruz. Bu openFLIM-HCA cihaz için veri toplama yazılımı μManager yazılır ve veri analizi FLIMfit üstlenilmiştir tarafından kontrol edilir.
We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in µManager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.
Tahlil bileşik kütüphanelerine ilaç keşfi 1 otomatik yüksek içerik analizi (HCA) artan kullanımı siRNA kütüphanelerinin fenotipik ekranlar için sistematik çalışmalar, örneğin, için otomatik görüntüleme deneyleri doğru yaşam bilimleri temel araştırma trendi ile tamamlanmaktadır. Otomatik HCA ayrıca tipik olarak geleneksel mikroskoplar ile görüntülendi hücrelerin yemekleri onlarca manuel deneyler ile uygulanmakta olan daha küçük ölçekli biyolojik çalışmalar için giderek önem kazanmaktadır. Görüş alanları binlerce yüzlerce tahlil ve analiz yeteneği ile tanınan istatistiksel güç ve operatör önyargı ortadan kaldırmak ve sık sık yardımcı olabilir görüntü veri toplama ve geniş örneklem dizilerin analizi otomasyonu ( "biyolojik gürültü" dahil), deneysel gürültü ortalamasını sağlayan bu tür bir devir sırasında IRF profilinde bir değişiklik olarak, sistematik hatalar oluşumunu tespit etmek için de kullanılabilir. Floresans dayalı tahlilleryaygın olarak piyasada bulunan HCA aletleri nispi dağılım ve etiketli protein ko-lokalizasyonunu harita bir veya daha fazla spektral kanal flüoresans yoğunluğu görüntüleme özelliğine sahip olan, HCA uygulanmaktadır. Onlar protein etkileşimleri, örneğin güçlü nicel readouts, teklif olmasına rağmen böyle bir floresan ömrü görüntüleme (Flim), polarizasyon anizotropi görüntüleme ve zamana bağımlı floresan anizotropi görüntüleme gibi daha sofistike floresan görüntüleme yöntemleri, yaygın, ticari HCA aletleri istismar edilmez. Burada HCA için otomatik mikroskop flim uygulamak için bir açık kaynak yaklaşımı sunuyoruz.
Floresan süresi, farklı moleküler türler ayırt etmek ya da fluorofor lokal moleküler ortam prob ve uyarım / algılama verimliliği için, florofor konsantrasyonunun hassas olmayan kullanılabilecek bir doğal rasyometrik spektroskopik okunmasını sağlar ve scatte etkisiylehalka ve örnek emilimi 2. floresans ömrü ölçümleri tek bir spektral kanal yapılabilir Dahası, onlar kalibrasyon olmadan farklı enstrümanlar ve örnekler arasındaki doğrudan karşılaştırılabilir. Bunlar, biyolojik süreçleri ve patolojilerin iç readouts sağlamak için bazı hücresel metabolitleri, lipidler ve hücre dışı matris bileşenleri de dahil olmak üzere, endojen fluoroforlar, uygulanabilir. Böylece etiket ücretsiz Flim hücrelerinde 3,4 metabolik değişiklikler harita ve kök hücre farklılaşması 5,6 ve kollajen iskeleleri 7 büyümesini izlemek için uygulanmıştır. Son zamanlarda FLIM HCA otoflüoresanı 8 kullanan hücresel metabolizmanın otomatik etiket bilgilerini deneyleri için kullanılabileceğini gösterdi. Daha genel olarak, ancak, floresans süresi ölçümleri ve FLIM genellikle Antikorların bağlanmış boyalar kullanarak, hücre bölmeleri leke boyalar kullanılarak uygulanan, belirli bir biyomoleküllerin etiket eksojen fluorophores uygulanırBelirli proteinlerine bağlanmış genetik olarak ifade florofor ile tespit hücrelerde spesifik proteinlerin hedef ya da S. Floresan süresi fiziksel ya da kimyasal bir ortam algılama flüoresan sağlam bir nicel readouts sağlamak için kullanılabilir. Örnekler için, boyalar dahil olmak üzere, sinyal molekülleri hücre konsantrasyonlarının rapor geliştirilmiştir hücre zarları 9 veya hücre viskozitesi 10 ve genetik olarak ifade floresan protein bazlı biyosensör lokal lipid fazın anlamda dağıtılan edilmiştir IP3 11 PIP2 12 ve kalpain 13 ya da kalsiyum 14,15, potasyum 16 ve klorür 17 gibi iyonlar.
Bu tür birçok biyosensörler biyosensör yapısındaki değişikliklerin readouts sağlamak için Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) 18,19 kullanmaktadır. "Donör" ve "alıcı" fluorophores arasında FRET bir kısa menzilli doğrudan dipol-dipol etkileşimi ile oluşurolan flüoroforlar, tipik olarak ~ 10 nM'nin altındadır ayrılır. Böylece FRET tespiti uygun şekilde etiketlenmiş proteinlerin yakın gösterir ve dolayısıyla bu tür bağlayıcı veya oligomerization olarak protein-protein etkileşimleri 20, okumak için bir araç sağlar – ya canlı zaman ders ölçümlerinde sabit hücreler ya da dinamik olaylara uç noktaları olarak hücreler. Veya bölünme – – verici ve alıcı floroforlar hem uygun bir moleküler yapı etiketleyerek konformasyonel değişiklikleri okumak mümkündür FRET değişikliği yoluyla yapının ve bu birçok biyosensörler 21 temelini oluşturur. FRET verimliliği ölçümleri verici-alıcı mesafesi ve FRET geçiren donör fluorophores nüfus fraksiyonu hakkında bilgi verebilir. Böylece, FRET tabanlı görüntüleme teknikleri, hücre sinyal 22 süreçleri aydınlatmak için, uzay ve zamanda, örneğin moleküler etkileşimler harita ve ölçmek için kullanılabilir. otomating gibi görüntüleme teknikleri yolları veya sinyalizasyon ağları okumalanna dayalı yüksek verim deneyleri sağlayabilir.
HCA, en sık uygulanan FRET okuma donör yoğunluğu alıcısı oranında değişiklikler eşleştirilir spektral oranlı metrik görüntüleme vardır. Bu yaklaşım kolayca uygulanır iken – ve birçok piyasada mevcut multiwell plaka okuyucu mevcuttur – nicel Işıksal çözülmesi FRET ölçümleri sisteminin 23 spektral tepki kalibrasyon gerektirir. Bu spektral boşaltma-through ve doğrudan uyarma alıcısının yanı sıra aracın şanzıman özellikleri ve örnek (iç filtre etkisi) kaynaklanan spektral çapraz konuşma içerir. Prensip olarak, bu da donör yalnızca ya da alıcı sadece ile etiketlenmiş ek "kontrol" numune ölçümü gerektirir.
Böyle spektral oranlı metrik FRET ölçümlerinden, etkili bir FRETverim (gerçek FRET verimliliği ve FRETing verici / alıcı moleküllerden fraksiyon ürünü), verici ve alıcı moleküller 24 nispi oranı ile elde edilebilir. Spektral oranlı metrik FRET genellikle verici / alıcı stokiyometri bilinen kabul edilebilir unimolecular FRET biyosensörler, kullanılır. Bir doz-yanıt eğrisi elde etmek için, FRETing verici ve alıcı, örneğin toplum fraksiyonları belirlemek için, gerçek bir FRET verimliliği bilgisi gereklidir. Bilinen bu özelliklere sahip olan bir pozitif FRET kontrol örneğini ölçerek veya akseptor ışıkla ağartma ya Flim olarak, FRET etkinliğini ölçmek için farklı bir yöntem kullanılarak elde edilebilir.
floresans ömrü okumalarını kullanarak, FRET tespit edilir ve tek donör emisyon ölçümleri ile tayin edilebilir – spektral kalibrasyon ve daha fazla kontrol örnekleri ihtiyacını ortadan kaldırır. Böylece, Flim FRET readouts enstrümanlar arasında mukayese edilebilirve farklı numuneler arasında – endoskopi ya da canlı hastalık modellerinde 25 tomografi sağlayan veri hücre bazlı deneyler ölçümleri ile kıyaslanabilir için. FRETing olmayan FRETing donör birikmeye tekabül eden uygun bir multi-eksponansiyel bozunma modeli verici floresans bozunma profilleri takılarak, verimlilik ve nüfus fraksiyonlar, ilke olarak, daha ölçümleri doğrudan elde edilebilir FRET. takılmasında zaman tek bir üstel bozulma modeli ve% 10 ömür boyu tespitinde bir doğruluk elde etmek için gerekli olan tipik foton yüzlerce – Bunlar önemli avantajlar, spektral çözülmesi yoğunluk görüntülemeden daha piksel başına daha tespit fotonları gerektiren Flim pahasına gelip karmaşık (çoklu eksponansiyel eksilme) modelleri uydurma floresan çürüme profilleri, tespit edilen fotonların sayısı binlerce artar gerekli. Bu, geleneksel olarak (onlarca vi alan başına saniye yüzlerce uzun kazanma zamanlan yol açmıştırew) Flim için, saati kullanarak özellikle lazer tarama mikroskopları sıralı piksel edinimi ile uygulanan tek foton sayma (TCSPC) korelasyon. önemli photobleaching ve / veya fototoksisite yol açabilir yüksek uyarma yoğunlukları kullanarak görüntüleme hızını artırmak için çalışır. Birlikte uygun piyasada mevcut enstrümantasyon ve yazılım araçları eksikliği ile, bu yüzlerce görüş alanlarına binlerce görüntülü edilecek ilaç keşif veya sistem biyolojisi için HCA kullanılan olmaktan flim engellemiştir. Lazer tarama TCSPC Flim paylaştığı hangi ile spektral oranlı metrik görüntüleme 28 benzer görüntüleme hızlara ulaşabilir kararlı durum polarizasyon bağımlı floresans anizotropi görüntüleme 27 ile "hit" belirlenmesi aşağıdaki ikincil ölçümler için otomatik multiwell plaka mikroskop 26 uygulamaya konmuştur birçok avantaj ve dezavantajları. Floresans anisotropi görüntüleme azalma patlatırFRET mevcudiyetinde alıcısı flüoresan anizotropi ve ayrıca spektrum çapraz konuşma (alıcısı örneğin doğrudan uyarma) karşı duyarlıdır. Bu polarizasyon çapraz konuşma için hesap kalibrasyon gerektirir ve FRET verimliliği doğrudan ölçümünü sağlamaz.
HCA Flim avantajlarını gerçekleştirmek için, biz görüntü elde hızına ve teknolojiye daha geniş erişim sorunları gidermek için çalıştık. Burada, örnek FRET esaslı tahliller ile birlikte, aşağıda tarif edilmektedir otomatik hızlı Flim multiwell plaka okuyucu uygulamak için kullanılabilir açık kaynak yazılım ve donanım bileşenlerinin tam listesini sağlar. Bizim yaklaşımımız 29, Flim nedeniyle tek ışınlı tarama TCSPC daha hızlı görüntüleme oranları ve daha düşük photobleaching sağlayabilir Şekil 1'de gösterilmiştir bir kapı optik görüntü yoğunlaştırıcı (GOI) kullanarak geniş alan zaman kapılı görüntüleme kullanarak gerçekleştirilmektedir paralel piksel içerisinde birbirineogation. Bizim openFLIM-HCA enstrüman (örneğin parlaklığına bağlı olarak) piksel başına bir kaç 100 fotonları tespit Flim verileri elde etmek için sadece birkaç saniye gerektiren, denetimsiz flim sağlayabilir. , Satın alma ayarlarını yapmak ve odak örnek korumak için, görüş önceki alanından örnek hareket ettirmek için gerekli süre ile kombine bu genellikle bakış 25,28 alanı başına ~ ve multiwell plaka toplama zamanlarında 10 sn sonuçlanır. Optik kesit yarı-geniş alan Nipkow ( "dönen disk") Tarayıcı 30 kullanılarak uygulanabilir.
Flim veri analizi için, hızla geleneksel PC iş istasyonları üzerinde multiwell plaka Flim veri setlerini analiz edebilir ve bir plug-in omero 32 için FLIMfit 31 adlı bir açık kaynak kodlu bir yazılım aracı geliştirdik. FLIMfit o karmaşık modellere monte edilecek Flim verileri sağlayacak (Bölüm 1.2'de ele alınmıştır) global analiz yetenekleri sağlarBu nedenle gerekli tespit fotonların sayısını, örnek ve görüntü elde etme süresi ışığa maruz azaltarak, floresan ömrü bileşenleri bir görüntü veya ilgi (ROI) bölgede değişmez olduğu varsayımı altında piksel başına bir kaç 100 fotonlar nLy. Standart bir masaüstü bilgisayarda FLIMfit Koşu, FOVs yüzlerce içeren veri setleri analiz etmek için hesaplamalı zaman saniye sadece 10s gerektirir. Böylece hem Flim veri toplama ve analiz HCA için pratik timescales üzerinde yapılabilir.
openFLIM-HCA donanım
Flim HCA Bizim uygulanması altı temel bileşenleri içerir: (i) optik otofokus ile bir floresan mikroskop çerçevesi; (Ii) motorlu (xyz) mikroskop sahne; (Iii) bir uyarım lazer kaynağı; (Iv) kapı optik yoğunlaştırıcı (GOI), gecikme jeneratör ve kamera ile bir geniş alan zaman kapılı Flim sistemi; (V) veri toplama ve analiz ve (vi) bir Nipkow disk tarayıcı için bir bilgisayaroptik kesitli görüntüleme için birim odak ışık dışarı bastırmak için. Lamelleri veya kültür ortamından sitoplazmik floresan veya arka plan katkılarıyla gömülmek olabilir hücre plazma membranında FRET biyosensörler, gelen, örneğin zayıf sinyalleri, görüntüleme Bu önemli olabilir. Zaman kapılı Flim verileri, ultra darbeli uyarma radyasyon ile örnek aydınlatıcı GOI photocathode floresan emisyonu görüntüleme ve zaman gecikmesi ayarları bir dizi için GOI fosfor CCD görüntüleri bir dizi kazanarak elde edilir uyarma bakliyat geldikten sonra optik yoğunlaştırıcı kapısı. uyarma aşağıdaki zaman kapısı gecikmesi arttıkça, floresan sinyali azaltmak için görülür ve CCD edinilen zaman kapılı floresan yoğunluğu görüntüleri serisi görüş alanında tüm fluorophores çürüme profillerini analiz etmek için gerekli olan veri seti oluşturmak . GOI yolluk uyarma darbeleri eşitlenirve CCD satın alma dizisi için, uyarılma atımlarına kadar zaman kapısı nisbetle geciktirmek istenen aralığın üzerindeki değerleri artan bir dizi olarak ayarlanır. Bu senkronizasyon bir "fast gecikme kutusu" (1 ps adımlarla 20 ns gecikmelere kadar sağlayan) ve 25 ps minimum adım gecikmeleri sağlayan bir "kaba gecikme kutusu" içermektedir gecikme jeneratörü kullanılarak elde edilir.
Flim için, uyarma bir ultra lazer ile sağlanabilir. kolaylık sağlamak için, tipik olarak uygun bir uyarım radyasyon, farklı bant geçiş filtresi olan bir motorlu filtre tekerleği kullanarak herhangi bir fluorofor için seçilebileceği görünür yelpazesinde pikosaniye darbeleri ayarlanabilir sağlayan bir fiber lazer pompalı supercontinuum kaynağı kullanır. Tipik olarak, biz 40 veya 60 MHz tekrarlama oranı darbeleri ile örnek de ~ 100-200 uW ortalama güç kullanımı. Böyle bir uyarma yetkileri de frekans iki katına dayalı ultra hızlı lazer kaynaklarından temin edilebilirmod-kilitli titanyum katkılı safir lazerler. ~ 100 ps altında bir uyarım darbe süresi en deneyler için yeterli olduğuna dikkat edin. nötr yoğunluk filtrelerle donatılmış ikinci bir motorlu filtre tekerleği uyarım yoğunluğunu ayarlamak için kullanılır. güvenlik ve rahatlık için, uyarma radyasyon bir tek modlu fiber optik ile teslim edilebilir. Geniş alan Flim optik olarak bölümlere ayrılmış Flim için yapılandırmalar, sırasıyla Şekiller 2 ve 3'te sunulmuştur. Kullanılan hassas bileşenlerin daha fazla ayrıntı için, openFLIM-HCA wiki 33 ziyaret ediniz. Geçerli parça listesi bir kopyası Ek Malzeme verilmiştir.
geniş alan Flim için, uyarım radyasyon mümkün olduğu kadar eşit bir görünüm bütün alanını aydınlatmak için gereklidir. Bunun için dif düzlemi ile, zaman ortalama ile 10-50 Hz lazer benek döndürüldüğünde bir holografik "üst şapka" difüzör uyarma lazer ışını doğrudanIsıtıcı objektif mikroskop lens arka odak düzlemine görüntülü. mikroskop çıkış limanından floresan görüntü soğutulmuş bilimsel CCD (çip boyutu 10.2 mm x 8.3 mm) sensör üzerine görüntülü GOI photocathode ve GOI (aktif alan çapraz 18 mm) fosfor üzerine geçirilen 0.7 büyütme sağlayan kamera lensleri bir çift kullanarak kamera. Sistem RS232 protokollerini kullanarak enstrümantasyon için arabirim standart bir PC tarafından kontrol edilir. Buna ek olarak, bir çok çaba isteyen mikro işlemci CCD kamera FLIM veri edinme ve spektral filtre supercontinuum ortalama güç ölçümü için kullanılan bir fotodiyot sinyal kaydetmek için hariç kapalı uyarım ışık yolundaki bir kapı kontrol etmek için kullanılır uyarım kaynağı. optik kesitli Flim için, uyarma lazer radyasyonu s olarak, Nipkow disk tarayıcı ünitesine doğrudan bağlanan bir tek modlu kutuplaşma sürdürmek fiber optik içine bağlanmıştırhown Şekil 3'te. Nipkow tarayıcı birimden gelen çıktı floresan görüntü Goa Fotokatod üzerine geçirilen ve sistemin geri kalanı geniş alan Flim aynıdır.
openFLIM-HCA yazılım
Veri toplama yazılımı μManager 34 yazılır. Otomatik ölçümler sırasında odağı korumak ve uyarma ve emisyon filtre jantlar ve dikroik değiştirici kontrol etmek için, herhangi bir FOV için zaman kursları elde etmek için, plakanın kuyu görüntülü sırayı değiştirmek için seçenekler dahil olmak üzere tam HCA veri toplama işlevselliği sağlar otomatik çok renkli görüntüleme için. Otomatik olarak yoğunluğuna dayalı olarak, örneğin kriterlerine göre, bir sonraki FLIM elde edilmesi için uygun bir FOVs konumlarını tespit etmek ve kaydetmek için floresan yoğunluğu, bir "ön tarama" satın alma çalıştırmak da mümkündür. Flim HCA verileri bir dizi olarak kaydedilebilirTIFF dosyalar, OME-TIFF dosyaları bir dizi olarak (yani, FOV başına bir) ya da bir multiwell plaka tüm verileri içeren tek bir OME-TIFF dosyası olarak. Daha fazla bilgi ve μManager yazılımı ayrıntılı bir açıklama openFLIM-HCA wiki 33 bulunabilir.
Veri analiz yazılımı, 31, omero görüntü veri yönetimi platformu 32 için bir açık kaynak MATLAB tabanlı istemci FLIMfit, Şekil 4'te gösterildiği gibi, bir omero sunucusundan veya bilgisayar diskten Flim verileri okuyabilir. TCSPC veya geniş alan zaman kapılı Flim araçlardan gelen verileri analiz etmek için tasarlanmıştır ve birçok yetenekleri çürüme profilleri monoexponential uydurma dahil openFLIM-HCA verileri sığdırmak için, ve gibi modelleri dahil olmak üzere üstel ve yüksek karmaşıklık çürüme profilleri, iki katına sağlar olmuştur polarizasyon bağımlı floresans çürüme profilleri. Aynı zamanda sabit ve zamanla değişen arka plan sinyalleri dikkate alabilir ve İYE olabilirlizedirler ölçülen uzay-zamansal enstrüman tepki fonksiyonu (IRF) veya zaman kaydırmalı tam deneysel IRF ölçümü belirlenen bir miktarda bir piksel akıllıca bazda olabilir idealize edilmiş bir IRF kullanarak sığabilir. IRF bir floresan örnek arasında genel bir zaman farkı (t = 0) bir floresan standart bir ölçümünden tespit edilebilir. Arka plan sinyalleri ve IRF Mekansal değişimler de dikkate alınabilir. FLIMfit bir piksel akıllıca bazda Flim verileri sığdırmak mümkün ya da mütevazı (yüz) ile Flim verileri takılmasını kolaylaştırmak karmaşık çürüme modellerine numaraları foton "küresel binning" ya da "küresel uydurma" kullanıyor.
Küresel binning her zaman noktasında bir kullanıcı tanımlı ROI içinde piksel algılanan tüm fotonları toplayarak karmaşık çürüme modellerine uygun sağlamak için yeterli foton numaraları sağlamak için gerektirir. ROI görüş alanın tamamını (FOV) olabilir, d manuel olabilirKullanıcı tarafından efined ya da görüntü bölümleme araçları kullanılarak belirlenebilir. ROI ayrıca diğer görüntü segmentasyonu yazılım FLIMfit ithal maskeleri kullanılarak tanımlanabilir. FRET uygulamalarda, bir üzerine yerine takmak için daha sonra ROI genelinde mekansal değişmez olduğu varsayılır FRETing ve non-FRETing donör fluorophores karşılık gelen floresan ömrü bileşenlerini belirlemek için bir çift üstel çürüme modeline uyacak şekilde küresel binning kullanın ve yaygındır her piksel FRETing donör nüfus fraksiyonu elde etmek için sabit bu ömür boyu bileşeni vales piksel akıllıca temeli.
Genel bağlantı aynı zamanda bütün FOV- üzerinden veya çok oyuklu bir plaka deney veya floresan süresi görüntüleri bir zaman serisi, örneğin, birden fazla FOVs ihtiva olabilecek bir FLIM veri kümesi üzerinde süresi bileşenleri ve piksel-bazlı FRETing verici popülasyon fraksiyonlar montaj gerektirir. Küresel uydurma mekansal VARIATI istismar edebilirve bu nedenle daha güvenilir sonuçlar – – olsa önemli ölçüde daha fazla hesaplama 35 pahasına bileşen ömrü tahmini daha güçlü kısıtlamalar sağlamak için küresel binning yaklaşımı kaybolur görüntü boyunca nüfus kesirler üzerinde. FLIMfit hızla örneğin geleneksel PC iş istasyonları üzerinde küresel montaj ile multiwell plaka Flim veri kümelerini, analiz edebilir, sadece 32 saniye gerektiren 672 x 512 piksel içeren 394 FOV her biri için beş zaman kapıları ile edinilen bir multiwell zaman kapılı Flim veri seti, ve 2 GB bellek, çift üstel çürüme modeli 31 sığdırmak için. Bu ayrılabilir doğrusal olmayan çok çekirdekli işlemciler ve FLIMfit kod bellek kullanımını en aza indirmek için optimize edilmiştir etkili ölçeklendirme sağlamak için okuyuculu paralel algoritmalar kullanılarak uygulanan en küçük kareler uydurma algoritması kullanılarak elde edilmiştir. Şekil 5 FLIMfit grafik kullanıcı arayüzü anlık gösterirve daha fazla ayrıntı referans global uydurma ve küresel binning 36. Ek bilgi verilen web sayfasında bulunabilir referans 31 bulunabilir.
Bizim openFLIM-HCA aletleri ve yazılım kullanılarak FLIM HCA Aşağıdaki protokol FLIM okumalarla hücre görüntüleme deneyleri geniş bir aralığı için uyarlanabilir. Genel olarak, çok oyuklu bir plaka deneyleri çalışılan koşullarına ek olarak, pozitif ve negatif bir biyolojik kontrol tekrarlanan kuyu içerecek şekilde dizayn edilmelidir FRET. Burada, optik kesit flim gerçekleştirmek için belirli bir uygulama tarif FRET kısa bir peptid bağlayıcı ile birleştirildiği mTurquoise floresan protein ve Venüs floresan protein oluşan yapıları ifade COS hücrelerinin (bakınız Şekil 3). İşte mTq32V, mTq17V ve mTq5V birlikte olmayan FRETing mTq5A inşa düşük, orta ve yüksek FRET verimliliği sağlamak (Temsilcisi Sonuçlar bölümünde ele alınmıştır) yapıları FRET.Bu yapılar ve bu protokolü takip için gerekli diğer malzemeler Malzeme Listesi'nde yer almaktadır.
Biz zaman kapılı flim kullanarak HCA için tasarlanmış bir otomatik multiwell plaka mikroskobu tarif var. Bu alet FLIMfit 36, açık kaynak kodlu bir programı, bir omero istemcisi 32 μManager enstrüman olarak MatLab yazılmıştır ve mevcut kullanarak üstlenilen bir omero sunucusu ve Flim veri analizi için veri kaydetme seçeneği ile μManager yazılmış açık kaynak yazılımı kullanılarak kontrol edilir kontrol yazılımı, openFLIM-HCA, kendi Flim HCA aletleri oluşturmak için akademik araştırmacılar etkinleştirmek için sistem bileşenlerinin 48 bir liste ile 33 online olarak kullanılabilir.
Sağlam Flim verileri elde etmek amacıyla, GOI ve CCD edinme ayarlarını optimize etmek için ve t 0 oluşabilecek değişiklikleri dikkate almak gerekmektedir. 3.8.2 açıklandığı gibi, GOI kazanç ayarı ve CCD kamera entegrasyon süresi ~ CCD dinamik aralık% 75 ulaşmak için ayarlanmalıdır. UHer zaman kapısı gecikme daha yüksek GOI gerilim ve çoklu CCD çerçeve birikimleri şarkı gürültü oranı 49 sinyal artırır ancak bu daha az floresan fotonlar CCD kamera Doymuş ve çerçeve birikimleri bu yüzden numarasından önce kare başına elde edilen bu yana toplam Flim toplama süresini (artar yükseltilmelidir) ve böylece bu değiş tokuş her bir deney için belirlenmelidir. Gecikme jeneratör kalibrasyon lazer tekrarlama oranı bağlıdır ve kullanılan tekrarlanma oranının doğru kalibrasyon dosyası elde etme yazılımı yüklenir sağlamak için gereklidir. Gecikme kutusu kalibre edilmesi için prosedür openFLIM-HCA wiki 33 bulunabilir.
Hücresel otofloresan floresan sinyali ile karşılaştırıldığında düşük durumunda, zamana göre değişen bir arka plan (TVS) temin etmek üzere iyi olarak ihtiva eden, sadece kültür ortamından sinyali kullanılır. Hücre kültür ortamından arka floresan en aza indirmek için, bilmekfenol kırmızısı içeren medya. Hücresel otofloresansı önemli ise, TVS etiketlenmemiş hücrelerden ölçümlerinden elde edilebilir. Bu otofloresans arka plan görüntüdeki her piksel için aynı olduğunu varsayar Ancak, bu durumda bakım, alınmalıdır. otofloresans bir hücrenin üzerinde veya uyarma kiriş veya algılama hassasiyeti görüş alanı üzerinde üniforma değilse önemli ölçüde değişir, bu varsayım geçerli olmayacaktır.
dağınık uyarma ışık darbeleri kullanarak bir IRF görüntüsünün elde edilmesi uydurma sürecinde veri modeli ile convolved olan zamansal IRF profili sağlar ve aynı zamanda görüş alanının karşısında IRF mekansal değişimi bir harita sağlar. IRF Nipkow diski IRF temiz bir ölçüm sağlar saçılan uyarma ışık kullanılarak, bizim enstrüman, bir koloidal süspansiyon, ancak bir saçılma örnek görüntüleme ile ölçülebilir. Zamanlama o doğru belirlenmesiuyarma ve zaman yolluk arasındaki zaman gecikmesi hataları önemli ölçüde uydurma sürecini etkileyebilir çünkü f IRF, önemli olan özellikle karmaşık üstel bozunma modelleri uydurma. IRF IRF uzaysal değişimini aynı olmalıdır, ancak zamanlaması etkileyebilir Bu uyarma dalga boyunda yerine floresans emisyon dalga boyunda kaydedildi için uygun işlem için gerekli olan tam olarak hangi dağınık uyarma ışık kullanılarak elde edilen Her iki dalga boyu. optik kesitli Flim içinde Nipkow diskten edilen IRF olduğu gibi ek olarak, dağınık IRF küresel nedeniyle saçılma nesneden farklılaşan optik yol uzunluğu gerçek IRF zaman göreceli olarak kaydırılmış olabilir. Protoc belirtildiği şekilde elde edilen dağılmış uyarım ışık IRF uygulanmalıdır gerekli genel zamansal kayması Bu düzeltme, t = 0,, monoexponential referans boya verilerinden hesaplanmaktadırol adımı 4.4. Aşağıdaki boya farklı uyarma dalga boyları için kullanılabilir: metanol içinde 75 uM Kumarin 153 çözeltisi (τ ~ 4.3 NS 50) aralığı 295-442 nm uyarım için kullanılabilir; etanol içinde 75 uM Kumarin 6 solüsyonu (τ ~ 2.43 ns 37) aralığı 430-500 nm uyarım için kullanılabilir; ve su içinde 75 uM Rodamin B çözeltisi (T ~ 1.7 NS 37) aralığı 488-575 nm eksitasyon için kullanılabilir. Sistemin her bir piksel için farklı bir IRF kullanmak FLIMfit mümkün olmasına rağmen biz, unutmayın, genellikle mekansal değişen IRF görüntüdeki her piksel için aynı zamansal profile sahip olduğu varsayımı yapmak makul ama bir dizi sunuyor uzamsal olarak küresel t 0 göreli zamansal uzaklıklar değişen. Biz dağınık ışık IRF belirlenir IRF vardiya haritası olarak bu tarif. Birlikte, IRF profili, t 0 ve IRF vardiya haritası tr için kullanılırFOV her piksel, uygun bir IRF ile donatılmış olduğundan emin olun. Herhangi bir Flim veri toplama öncesi ölçülmelidir yüzden önemlisi, t 0 zaman içinde yavaş yavaş değişebilir.
Kullanıcı floresan çürüme profillerini örnek ve zaman kapıları ve uyarım sonrasında göreli gecikmeler genişliğini ayarlamak için gerekli nasıl karar vermelidir. Genel olarak, saptanan sinyali artırmak için geniş bir kapı genişliği kullanırlar ve tipik olarak biz floresan proteinleri ile etiketlenmiş hücrelerin Flim 4 ns ayarlı kapak genişliği kullanmak arzu edilir. Zaman kapısı gecikmeler sayısı analizinde kullanılacak montaj modelin karmaşıklığı verilen (sadece uyarma darbe öncesi sinyalini ölçmek için ayarlanmış bir kapısı dahil) floresan çürüme profilini örneklemek için yeterli olmalıdır. Optimum değer yaşam süreleri ve çürüme bileşenlerin bağıl genlikleri bağlı olabilir. Genel olarak, 4 kapıları bağlantı monoexponential için yeterli iken, 7 ya da daha fazla giriş kapıları olabilir bozunurDaha karmaşık çürüme modelleri için kullanılabilir.
Biz Flim FRET 51 frekans ömrü okumalarını kullanarak geniş alan mikroskobu zaman domeni veya frekans alanı teknikleri bir dizi kullanarak uygulanabilir ve multiwell plaka dizileri otomatik Flim HCA ilk (non-kesit) uygulanmıştır unutmayın. Geniş alan zaman kapılı görüntüleme 28 kullanan HCA için ilk otomatik optik kesit Flim multiwell plaka okuyucu sonra bildirilmiştir. Daha sonra, geniş alan (non-kesit) frekans Flim HCA FRET 52 kullanılarak gen kütüphanesi ve zaman-kapılı Flim HCA karşısında post-translasyonel modifikasyonlar (tirozin fosforilasyonu) taramak için uygulanmıştır HIV-1 Gag ve deneyleri FRET uygulanmıştır oligomerizasyon 53 ve FOXM1 54 ve Raichu RhoA ve Rac1 biyosensörler 33 SUMOylation arasında. Çukurlu levha Flim 26 için değil, bugüne kadar, T eşleştirmek için zor olduğu kanıtlanmıştır TCSPC kullanmak da mümkündüro geniş alan algılama istismar teknikleri throughput. Bu sorunu gidermek olabilir biri gelişmekte olan yaklaşım, SPAD diziler 55 olarak tek foton sayma dedektörleri dizilerin kullanımıdır.
Biz floresan proteinleri kullanarak FRET herhangi readouts uydurma modeli ile ilişkili varsayımlar bağlıdır FLIMfit veya başka herhangi bir Flim analiz yazılımı elde edilen parametrelerin mutlak değerler dikkatle ve tedavi edilmelidir olduğunu unutmayın. FRET donör önemli ikinci çürüme bileşeni vardır, örneğin, FRET Flim veri sığdırmak için bir bieksponensiyel modelinin kullanımı genellikle olması gerekenden daha FRETing nüfusu yüksek görünen ilişkili hızlı çürüme bileşenin katkısı, neden olabilir. Böyle mTq2FP bir mono- üstel ömrü olan vericilere kullanımı arzu edilmektedir. Hatta daha sonra, son çalışmalar FRET analizi hala alıcı floresan protein veya karanlık devletler tarafından etkilenmiş olabilir göstermiştirnedeniyle kromofor açılardan çeşitli florofor yapılardan bir dağıtım ve 2 κ oryantasyon faktörü heterojenite 56 mesafeler. Yine de, biz ve diğerleri FRET floresan ömrü readouts biyokimyasal ölçümleri ile korelasyon ve protein etkileşimleri için ekran veya biyosensörler dinamiklerini takip etmek için kullanılabilecek faydalı sonuçlar üretmek yapmak olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, bu openFLIM HCA platformu FRET veya hücresel otoflüoresanı 8 kullanılarak, hem de boya bazlı prob 25 kantitatif readouts sağlayan flüoresan süresi tabanlı tahlillerde geniş uygulanabilir.
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.
microscope frame | Olympus | IX81 | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
optical autofocus | Olympus | ZDC | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
motorized (x-y-z) microscope stage | Marzhauser | 00-24-565-0000 | Stage with Corvus controlle |
excitation laser source | Fianium | SC400-4 | Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/ |
gated optical intensifier | Kentech | High Rate Imager (HRI) | |
delay generators | Kentech | — | See agile delay generator and precision delay generator |
camera | Hamamatsu | ORCA-ER-II | |
Nipkow disc scanner unit | Yokogawa | CSU-X1 | http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/ |
Top hat diffuser | Thorlabs | ED1-S20-MD | Engineered diffusers |
mTq5V | Oxford Genetics | P3850 | mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker |
mTq17V | Oxford Genetics | P3847 | mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker |
mTq32V | Oxford Genetics | P3848 | mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker |
mTq5A | Oxford Genetics | P3849 | mTurquoise Amber construct |
HEK293T | — | — | cell type used |
phenol red-free HBSS | Sigma Aldrich | 55021C-1000ML | imaging media |
culture media | DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics | ||
DMEM | Sigma Aldrich | D6046-500ML | for culture media |
FBS | Sigma Aldrich | 12003C-500ML | for culture media |
xTremeGene9 | Sigma Aldrich | 6.37E+09 | for transfection, follow online protocol from La Roche |
trypsin/EDTA Solution | Thermo Fischer | R001100 | for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer |