Summary

בידוד מהיר של BMPR-IB + השומן שמקורם בתאי סטרומה לשימוש במודל ריפוי פגם calvarial

Published: February 24, 2017
doi:

Summary

Adipose-derived stromal cells may be useful for engineering new tissue from a patient’s own cells. We present a protocol for the isolation of a subpopulation of human adipose-derived stromal cells (ASCs) with increased osteogenic potential, followed by application of the cells in an in vivo calvarial healing assay.

Abstract

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient’s own body. The ability to grow bone de novo using a patient’s own cells would allow bony defects to be filled with adequate tissue without the morbidity of harvesting native bone. There is interest in the use of adipose-derived stromal cells (ASCs) as a source for tissue engineering because these are obtained from an abundant source: the patient’s own adipose tissue. However, ASCs are a heterogeneous population and some subpopulations may be more effective in this application than others. Isolation of the most osteogenic population of ASCs could improve the efficiency and effectiveness of a bone engineering process. In this protocol, ASCs are obtained from subcutaneous fat tissue from a human donor. The subpopulation of ASCs expressing the marker BMPR-IB is isolated using FACS. These cells are then applied to an in vivo calvarial defect healing assay and are found to have improved osteogenic regenerative potential compared with unsorted cells.

Introduction

פגמי עצם סרן כתוצאה מפגיעה, זיהום, או סרטן פולשני להיות השפעה משמעותית על ההתאוששות ואיכות החיים של מטופל. טכניקות קיימות למלא פגמים אלה עם עצם בריא ממקום אחר בגוף החולה עצמו, אך העברה זו נושאת תחלואה סיכון משלה לסיבוכי 1, 2, 3. יתר על כן, פגמים מסוימים הם כל כך גדולים או מורכבים כי עצם מתורם מספיק גדול אינו זמין כדי למלא את הפגם. פרוטזות הן אפשרות פוטנציאל למילוי פגמים גרמיים אבל אלה קשורים עם מספר חסרונות כולל זיהומים, כשל חומרה, ותגובת גוף זר 4.

מסיבות אלה יש עניין רב באפשרות של הנדסת תחליפי עצם ביולוגי באמצעות תאים של החולה עצמו 5. שומן שמקורם בתאי סטרומה (ASCs)יש פוטנציאל יישום זה כי הם בשפע זמינים ברקמת השומן של החולה עצמו והם הדגימו את היכולת לרפא פגמי עצם על ידי יצירת רקמת עצם חדשה 6, 7. ASCs הוא אוכלוסייה מגוונת של תאים וכמה מחקרים הראתה כי בחירה עבור סמנים פני תא מסוימים יכולה לייצר אוכלוסיות תאים עם פעילות osteogenic משופרת 8, 9. בחירת ASCs עם פוטנציאל osteogenic הגבוה ביותר תגדיל את הסבירות כי פיגום זורע עם תאים אלה יכול להתחדש פגם עצם גדול.

חלבון עצם המוךפו"גנטי שהולך (BMP) איתות היא קריטית להסדרת עצם בידול היווצרות 10 ואת סוג קולטן BMP IB (BMPR-IB) ידוע להיות חשוב עבור osteogenesis ב ASCs 11. לאחרונה, הראינו ביטוי של BMPR-IB יכול בדואר המשמש כדי לבחור עבור ASCs עם פעילות osteogenic משופרת 12. כאן אנו מדגימים פרוטוקול לבידוד של BMPR-IB להביע ASCs משומן אדם ואחריו assay פעילות osteogenic שלהם באמצעות מודל פגם in vivo calvarial.

Protocol

הערה: דוגמאות התקבלו ממטופלים אשר נתנו הסכמה מדעת. כל הפרוטוקולים היו נבדקו ואושרו על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי המתאים אונ' סטנפורד. בעוד טיפול רקמות ותאי אדם, תמיד לדבוק 2 רמת בטיחות ביולוגית (BSL2) אמצעי זהירות, כפי שצוין על ידי המוסד שלך. <p class="jove_title" style=";text-align:r…

Representative Results

CT מיקרו סריקה נעשה ביום הניתוח יציג את פגם הגולגולת בבירור. בשלב זה לא יהיה ingrowth לתוך פגם 4 מ"מ. סריקות אחריו מתקבלות לאורך הזמן לכמת את גודל הפגם לאורך זמן בהשוואה לקו הבסיס. פגמים זורעים עם BMPR-IB + תאים צריכים להפגין סגר מהיר יותר של הפגם בהשוואת BMPR-I…

Discussion

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול

בזמן הקציר של ASCs, השלב הקריטי הוא אכול נאות של שומן עם collagenase. עיכול לקוי יגרום בתשואה נמוכה של ASCs. במהלך FACS מיון של תאי BMPR-IB +, חשוב להגדיר את השער בזהירות חיובית. הגדרת שערים מדי רופפת עלולה לגרום אוכלוסי…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

C.D.M. was supported by the American College of Surgeons (ACS) Resident Research Scholarship. M.S.H. was supported by the California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Clinical Fellow training grant TG2-01159. M.S.H., H.P.L., and M.T.L. were supported by the American Society of Maxillofacial Surgeons (ASMS)/Maxillofacial Surgeons Foundation (MSF) Research Grant Award. H.P.L. was supported by NIH grant R01 GM087609 and a gift from Ingrid Lai and Bill Shu in honor of Anthony Shu. H.P.L. and M.T.L. were supported by the Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine and The Oak Foundation. M.T.L. was supported by NIH grants U01 HL099776, R01 DE021683-01, and RC2 DE020771. D.C.W. was supported by NIH grant 1K08DE024269, the Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, and the Stanford University Child Health Research Institute Faculty Scholar Award.

Materials

100 micron cell strainer Falcon 352360
15 blade scalpel Miltex 4-515
24 well plate Corning 3524
40 micron cell strainer Falcon 352340
50 mL conical centrifuge tubes Falcon 352098
6-0 Ethilon nylon suture, 18", P-3 needle,  Ethicon 1698G
Anti-BMPR-IB primary antibody R&D systems FAB5051A
BioGel PI surgical gloves Mölnlycke Health Care ALA42675Z
Buprenorphine SR ZooPharm
Castro-Viejo needle driver Fine Science Tools 12565-14
CD1 nude mouse Charles River 086
Collagenase Type II powder Gibco 17101-015
DMEM medium Gibco 10564-011
Drill: Circular knife 4.0 mm Xemax Surgical CK40
Drill: Z500 Brushless Micromotor NSK NSKZ500
FBS Gicbo 10437-077
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24" Fisher Scientific 14-206-62
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4" Fisher Scientific 22-415-469
Heating pad Kent Scientific DCT-20
Hyclone 199/EBSS medium GE  Life Sciences SH30253.01
Isothesia isoflurane Henry Schein  050033
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Paraffin film (Parafilm) Bemis PM996
PBS Gibco 10010-023
Pen-Strep Gibco 15140-122
PLGA scaffolds Proprietary Formulation
Poloxamer 188, 10% Sigma P5556-100ML
Polylined Sterile Field, 18" x 24" Busse Hospital Disposables 696 Cut a rectangular hole of the appropriate size
Polysucrose Solution: Histopaque 1119 Sigma 11191
Povidone Iodine Prep Solution Medline MDS093944H
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube Dechra Veterinary Products
RBC lysis buffer Sigma 11814389001
Webcol alcohol prep swabs Covidien 6818

References

  1. Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
  2. Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: an update. Injury. 36, S20-S27 (2005).
  3. Laurencin, C., Khan, Y., El-Amin, S. F. Bone graft substitutes. Expert Rev Med Devices. 3 (1), 49-57 (2006).
  4. Walmsley, G. G., et al. Nanotechnology in bone tissue engineering. Nanomedicine. 11 (5), 1253-1263 (2015).
  5. Chapekar, M. S. Tissue engineering: challenges and opportunities. J Biomed Mater Res. 53 (6), 617-620 (2000).
  6. Levi, B., et al. Human adipose derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defects. PLoS One. 5 (6), e11177 (2010).
  7. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100 (9), 1249-1260 (2007).
  8. Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. J Biol Chem. 286 (45), 39497-39509 (2011).
  9. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1)-positive selection enhances osteogenic capacity of human adipose-derived stromal cells. Tissue Eng Part A. 19 (7-8), 989-997 (2013).
  10. Wozney, J. M., et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science. 242 (4885), 1528-1534 (1988).
  11. Wan, D. C., et al. Osteogenic differentiation of mouse adipose-derived adult stromal cells requires retinoic acid and bone morphogenetic protein receptor type IB signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (33), 12335-12340 (2006).
  12. McArdle, A., et al. Positive selection for bone morphogenetic protein receptor type-IB promotes differentiation and specification of human adipose-derived stromal cells toward an osteogenic lineage. Tissue Eng Part A. 20 (21-22), 3031-3040 (2014).
  13. Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (71), e4425 (2013).
  14. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. J Vis Exp. (68), (2012).
  15. Lester, S. C. . Manual of surgical pathology. , (2010).
  16. Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).

Play Video

Cite This Article
Marshall, C. D., Zielins, E. R., Brett, E. A., Blackshear, C. P., Hu, M. S., Leavitt, T., Barnes, L. A., Lorenz, H. P., Longaker, M. T., Wan, D. C. Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model. J. Vis. Exp. (120), e55120, doi:10.3791/55120 (2017).

View Video