Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Rapid Isolatie van BMPR-IB + Adipose-afgeleide stromacellen voor gebruik in een calvarial Defect Healing Model

doi: 10.3791/55120 Published: February 24, 2017

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Grote botdefecten als gevolg van letsel, infectie of invasieve kanker hebben een aanzienlijke invloed op het herstel en de kwaliteit van het leven van een patiënt. Technieken bestaan om deze gebreken gezond bot vulling van elders in lichaam van de patiënt, maar deze overdracht draagt zijn eigen morbiditeit en risico van complicaties 1, 2, 3. Bovendien zijn sommige gebreken zo omvangrijk of complex die voldoende donorbot beschikbaar is om het defect te vullen. Protheses zijn een mogelijke optie voor het vullen van botdefecten, maar deze zijn geassocieerd met een aantal nadelen waaronder infectierisico werkende hardware en vreemd lichaam reactie 4.

Om deze redenen is er grote belangstelling voor de mogelijkheid van engineering van biologische botvervangers behulp van eigen cellen van de patiënt 5. -Vet-afgeleide stromale cellen (ASC)hebben potentieel voor deze toepassing, omdat zij overvloedig aanwezig in de eigen vetweefsel van de patiënt en ze hebben het vermogen om botdefecten te helen door het genereren van nieuw botweefsel 6, 7 getoond. ASC's zijn een diverse populatie van cellen en verscheidene studies hebben aangetoond dat het selecteren van specifieke celoppervlak markers celpopulaties met verhoogde osteogene activiteit 8, 9 kan produceren. ASC selecteren met het hoogste osteogeen potentieel zou de waarschijnlijkheid toenemen dat een scaffold bezaaid met deze cellen een grote botdefecten kan regenereren.

Bone morfogenetisch eiwit (BMP) signalering is essentieel voor het reguleren van differentiatie en bot- vorming 10 en het BMP receptor type IB (BMPR-IB) is bekend belangrijk voor osteogenese in ASCs 11 zijn. Onlangs hebben we aangetoond dat expressie van BMPR-IB kan be gebruikt om te selecteren voor het ASC met verhoogde osteogene activiteit 12. Hier laten we een protocol voor de isolatie van BMPR-IB tot expressie ASC's uit menselijk vet, gevolgd door een analyse van hun osteogene activiteit met een in vivo model calvarial defect.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

LET OP: Monsters werden verkregen van patiënten die geïnformeerde toestemming gaf. Alle protocollen zijn beoordeeld en door de passende Stanford University Institutional Review Board goedgekeurd. Terwijl de behandeling van menselijke weefsels en cellen, altijd houden aan Biosafety Level 2 (BSL2) voorzorgsmaatregelen, zoals gespecificeerd door uw instelling.

1. Bereiding van reagentia

  1. Bereid FACS-buffer: Voeg 10 ml FBS, 5 ml Poloxameer 188 en 5 ml Pen-Strep tot 500 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  2. Bereid verteren mengsel: Voeg 0,375 g C. hemolyticum collagenase type II poeder en 5 ml Poloxamer 188-500 ml steriele 199 / EBSS medium.
  3. Bereid standaardmedium Voeg 50 ml FBS en 5 ml Pen-Strep 500 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium.

2. Oogsten en isolatie van ASC

OPMERKING: Zorg dat adequate institutionele goedkeuringen zijn in de plaats voor het gebruik van menselijk weefsel en voor het isoleren van human stamcellen. Het verkrijgen van menselijke buik, flank, of dij onderhuids vet van een gezonde donor electieve liposuctie ondergaan. Houd het vet in een plastic zuigkracht bus.

  1. Voeg steriel PBS in een 1: 1 verhouding tot het vet in de originele plastic bus. (Als er 500 ml vet, voeg 500 ml PBS). Meng door zacht schudden gedurende 30 s. Laat de waterlaag om naar de bodem (figuur 1) en vervolgens aspireren en gooi de waterlaag met een 10 ml plastic pipet verbonden afzuiging.
  2. Giet het vet in een grote plastic container en voeg verteren mengsel in een 1: 1 ratio. Het vat en de buitenkant met 70% ethanol reinigen. Dicht de dop met paraffine film.
  3. Schud verpakking in een orbitale schudder bij 180 rpm bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
  4. Neutraliseer de vertering door toevoeging standaardmedium in een 1: 1 ratio. (Als er 1000 ml vetmengsel, voeg 1000 ml standaard medium).
  5. Verdeel het mengsel gelijkmatig in een even aantal 250 ml plastic conische centrifugebuizen en gecentrifugeerd mengsel bij 300 xg gedurende 20 min bij 4 ° C
  6. Zuig het supernatant en wees voorzichtig om de pellet intact te laten. Resuspendeer pellets in 5 ml standaardmedium per conische buis.
  7. Filtreer de suspensie door een 100 micron filter in een 50 ml conische centrifugebuis. Vervolgens centrifuge bij 300 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
  8. Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 5 ml kamertemperatuur RBC lysisbuffer. Laat het mengsel zitten 5 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer bij 300 xg gedurende 15 min bij kamertemperatuur (RT).
  9. Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 15 ml standaard medium. Opnieuw filteren door een 100 micron filter in een 50 ml conische centrifugebuis.
  10. In een nieuwe 50 ml conische, voeg 15 ml polysucrose oplossing die is ontworpen voor de dichtheid gebaseerde scheiding (zie lijst van de reagentia). Vervolgens, die de buis bij 45 ° voorzichtig pipet de cellen op de zijkant vande buis zodat de celsuspensie voorzichtig lagen bovenop de polysucrose oplossing (figuur 2).
    Opmerking: Het is belangrijk pipet cellen op het oppervlak van de oplossing. Mis polysucrose oplossing aan een suspensie van cellen als deze een onomkeerbare mengsel zal maken. Ook niet de cellen pipet in het midden van de polysucrose oplossing.
  11. Centrifugeer dit mengsel bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Gebruik een lage versnelling (2 - 3 van de 10) en stel de remfunctie van de centrifuge tot nul voor deze stap.
    LET OP: helder op de bodem, bewolkt in het midden, en zalmkleurige op de top: Drie lagen zichtbaar. De middelste laag bevat de cellen van belang.
  12. Met behulp van een 10 ml pipet verwijder voorzichtig de middelste laag en over te dragen aan een nieuwe 50 ml conische buis.
    Opmerking: Het is beter om de middelste laag volledig overdragen en in het proces neemt een deel van de bovenste en onderste lagen dan achter een deel van de middelste laag.
  13. <li> Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en het bepalen van het totale levend aantal cellen.
    OPMERKING: We gebruiken meestal trypan blue toegevoegd aan het celmengsel tot een uiteindelijke concentratie van 0,8% om te helpen bij het tellen van cellen. Levensvatbare levende cellen zal niet nemen van de blauwe kleurstof en zal verschijnen wit.

3. FACS sorteren voor BMPR-IB positieve cellen en bereiding van-Cell met steigers

  1. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Resuspendeer de cellen in FACS buffer bij een concentratie van 1 miljoen cellen per 100 pl (gebaseerd op het aantal cellen gedaan in stap 2.13).
  2. Transfer ten minste 10 miljoen cellen een plastic centrifugebuis label "BMPR-IB." Afzonderlijk overdracht één miljoen cellen in 100 gl FACS buffer tot een aparte plastic centrifugebuis label "Ongekleurde." Voeg 1 ml FACS buffer om de "Ongekleurde" tube. Houd de rest van de cellen in FACS-buffer op ijs terwijl de FACS sortering gedeelte van de experrimentele wordt gedaan. Label deze cellen "Unsorted." Gebruik deze als controles later in het experiment.
  3. Voeg een geschikte hoeveelheid van een fluorescerend anti-humaan BMPR-IB antilichaam aan de "BMPR-IB" beeldbuis volgens de instructies van de fabrikant. Pipet het mengsel op en neer voorzichtig aan het antilichaam te verdelen.
    LET OP: Wij maken gebruik van een Human BMPR-IB / ALK-6 APC-geconjugeerd antilichaam tegen een 1:10 verdunning (zie de lijst van reagentia voor details). Echter, antilichamen van verschillende fabrikanten verschillende aanbevolen concentraties.
  4. Bedek de ijsemmer op een manier die buiten houdt licht. De zonnecel / antilichaam mengsel zitten gedurende 30 minuten (of volgens de instructies van de fabrikant antilichaam).
    Opmerking: Als de anti-BMPR-IB antilichaam wordt geleverd als een primaire ongeconjugeerde antilichaam dat een secundair antilichaam vereist, voert een afzonderlijke stap kleuring op ijs met het secundaire antilichaam volgens instructies van de fabrikant.
  5. Centrifugeer beide buisjes300 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Zuig het supernatant, zorg dat u de pellet niet te zuigen. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in 1 ml FACS buffer. Weer Centrifugeer de buizen bij 300 g gedurende 5 min. Zorgvuldig aspireren het supernatant en resuspendeer de cellen in FACS-buffer tot een concentratie van 1 miljoen cellen per 1 ml.
  6. Filter "BMPR-IB," "Ongekleurde" en "gesorteerde" cellen door 40 micron cel zeven in nieuwe gemerkte glazen buizen FACS. Spoel de filters met 500 pi FACS-buffer zodat cellen niet achterblijven in het filter. Voeg ook 2 ml standaard medium om twee afzonderlijke plastic centrifugebuizen label "BMPR-IB-positieve" en "BMPR-IB-negatief." Met deze twee om de gesorteerde cellen te verzamelen in de FACS machine.
  7. Op de FACS-machine, gebruikt u de ongekleurde cellen om een ​​negatieve poort definiëren voor de fluorescente merker.
  8. Met een 100 micron nozzle rangschikken BMPR-IB positieve en negatieve cellen in de respectievelijke buizen conTaining standaard medium. Houd deze buizen gekoeld bij 4 ° C gedurende de soort als de FACS-machine heeft dit vermogen.
    LET OP: Raadpleeg de JOVE artikel 13 van Sharon et al. een uitstekende protocol voor FACS-sortering.
  9. Met behulp van een hemocytometer, tellen de cellen in elke buis. Centrifugeer de "BMPR-IB-positief," "BMPR-IB-negatieve," en "gesorteerde" buizen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C en zuig de supernatant voorzichtig de cel pellet te verstoren. resuspendeer dan de cellen in standaard medium tot een concentratie van 1 miljoen cellen per 250 pl.
  10. Verkrijgen voorgesneden 4 mm PLGA (poly [melkzuur-co-glycolzuur]) steigers bekleed met hydroxyapatiet. Plaats elke steiger in een putje van een 24-wells plaat. Bedek elk steiger met 50 pi celsuspensie uit een van de drie groepen (i .e, 200.000 cellen.): Ongesorteerd, BMPR-IB-positieve en BMPR-IB-negatief (Figuur 3).
    OPMERKING: GelieveRaadpleeg de JOVE artikel 14 van Lo et al. voor meer informatie over de bouw van PLGA steigers.
  11. Gedeeltelijk In de onmiddellijke lege putjes met standaard medium (om uitdrogen van de steigers te voorkomen), bedekken de plaat met het deksel en incubeer in een cel incubator bij 37 ° C gedurende 30 minuten.

4. Oprichting van calvarial Gebreken en toepassing van de ACS-bevattende Steiger

OPMERKING: Zorg dat adequate institutionele goedkeuringen zijn in de plaats voor de creatie van calvarial defecten in levende muizen. Dit protocol werd goedgekeurd door de Stanford University Institutional Animal Care en gebruik Comite.

  1. Verdoven van een CD-1 naakt muis met behulp van geïnhaleerde isofluraan gas of een geïnjecteerde langwerkende verdoving cocktail.
    1. Om gas alleen te gebruiken, plaatst u de muis in een verdoving kamer en start de toevoer van zuurstof bij 2-3 l / min met een concentratie van isofluraan 2%. Zodra de muis fully bewusteloos, plaats het naar voren gebogen op een warm water recirculatie deken met een absorberend kussen en plaats zijn snuit in een verdoving neuskegel met dezelfde concentratie van zuurstof en isofluraan. nauwlettend de ademhaling en pas de concentratie van isofluraan als dat nodig is.
    2. Een geïnjecteerde langwerkende verdoving cocktail gebruik verdoven de muis in een anesthesie geplaatst zoals hierboven beschreven en injecteer het anestheticum cocktail. Verwijder de muis uit de narcose kamer en zijn gedrag observeren.
      OPMERKING: De muis kan kortstondig ontstaan ​​uit narcose maar binnen enkele minuten opnieuw moet volledig verdoofd onder invloed van de geïnjecteerde narcose. Breng de muis naar een warm water recirculatie deken bedekt met een absorberende pad.
      LET OP: Voor een anestheticum cocktail, raden wij een mengsel dat ketamine 10 mg / ml en xylazine 1 mg / ml in fysiologische zoutoplossing, intraperitoneaal afgeleverd. De standaarddosis van dit mengsel is300 ul van een 30 g muis, wat overeenkomt met 100 mg / kg en xylazine 10 mg / kg ketamine. Zie de discussie sectie voor meer informatie over de injecteerbare verdoving.
    3. Gebruik een teen knijpen manoeuvre om de diepte van de anesthesie te bepalen. Een voldoende verdoofd muis zal zijn poot niet terug te trekken als het licht wordt geknepen door de chirurg.
    4. Toepassen oogzalf uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
    5. Dien 1 mg / kg buprenorfine SR subcutaan.
      LET OP: Het verstrekken van pijnstilling voorafgaand aan de operatie resulteert in een superieure pijnbestrijding.
    6. Tijdens de gehele procedure controleren de ademhaling van de muis.
      LET OP: - 100 ademhalingen / min Een muis goed verdoofd onder isofluraan zou een ademfrequentie van 50 hebben. Een versnelde ademhaling aangeeft dat anesthesie te licht, terwijl een verminderde ademhalingsfrequentie kunnen aangeven dat verdoving te diep.
  2. Prep de huid van de dorsale zijde van de schedel met povidon-IODine oplossing gevolgd door 70% ethanol driemaal. Draperen met steriele doeken, waardoor de operatieplaats blootgesteld.
    LET OP: Draag steriele chirurgische handschoenen en een steriele techniek te houden tijdens de procedure. Raak alleen steriele oppervlakken en voorwerpen, zoals de steriele laken en geautoclaveerd instrumenten. Heb je al een assistent belichting aanpassen, geopend hechtdraad pakketten, etc.
  3. Met behulp van een 15-blad scalpel een sagittale middellijn incisie die zich over het grootste deel van de dorsale schedel. Met een fijn getande tang, trek de huid aan de rechterkant van de incisie naar rechts pariëtale bot bloot.
  4. Het gebruik van een boor met een geautoclaveerd 4 mm diamantgecoate trephine boor, boor een defect door de pariëtale bot. Heeft het gebrek verleden bot niet uit te breiden naar de dura mater laag. (Figuur 4)
  5. Plaats een steiger in het defect, en sluit de huid incisie met het runnen van nylon hechtdraad.
  6. Bewaken van de muis en bieden standaard postoperatieve zorg eenolgens de institutionele richtlijnen.
    1. Houd de muis op een schone papieren handdoek in een schone kooi, terwijl het zich herstelt. De helft van de kooi moet over een warm water recirculatie deken geplaatst en de muis moeten eerst Deze helft geplaatst.
    2. Laat een muis zonder toezicht totdat het voldoende bewustzijn ambulate heeft herwonnen. Heeft een muis die een operatie heeft ondergaan om een ​​kooi met andere muizen totdat deze volledig is hersteld niet meer terug.
  7. Herhaal de bovenstaande stappen met een nieuwe muis voor elke steiger die getest moet worden. Steriliseren chirurgische instrumenten tussen operaties met een hete kraal sterilisator of andere geschikte methode.
  8. Kort na de procedure, en vervolgens bij 2, 4, 6 en 8 weken gebruiken micro CT scan om de snelheid van calvarial sluiten van defecte analyseren.
    OPMERKING: Zie het artikel van Levi et al. 6 voor een beschrijving van micro CT-scan van calvariale defecten.
  9. Wanneer het experiment complete, euthanaseren de muizen door ze in een schone kamer euthanasie en een stroom van kooldioxidegas in de kamer met een snelheid van 2 l / min gestart. Na ademhaling volledig hebben opgehouden (na ongeveer 10 min) uit te voeren cervicale dislocatie om euthanasie te bevestigen.
  10. Eventueel na het experiment voltooid is, gebruik snijden en histologische kleuring botvorming binnen het defect te evalueren.
    OPMERKING: Zie het artikel van McArdle et al. 12 voor meer informatie over de voorbereiding van het bot specimens voor histologie. Voor een overzicht van histologische en vlekken technieken, zie je een histologische handleiding, zoals het Handboek Surgical Pathology 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Micro CT scan uitgevoerd op de dag van de operatie zal duidelijk de schedel defect. Op dit moment is er geen ingroei in de 4 mm defect. Latere scans worden verkregen in de tijd om de grootte van het defect kwantificeren in tijd ten opzichte van de basislijn. Defecten geënt met BMPR-IB + cellen moeten aantonen snellere sluiting van het defect vergelijking met BMPR-IB en gesorteerde cellen (Figuur 5). Bovendien kan het deel van de schedel dat het defect wordt ontkalkt en verwerkt voor histologie gebruik van standaard werkwijzen 12. Secties gekleurd met Movat's Pentachrome vlek groter zal botregeneratie onthullen het defect behandeld met BMPR-IB-cellen in vergelijking met de andere celpopulaties (figuur 6).

Figuur 1
Figuur 1: Lipoaspirate na PBS Wash. strong> Een bus van lipoaspirate na PBS wordt toegevoegd en het mengsel bezinken. De bovenste weefsellaag is het vetweefsel die ASC gastheer, terwijl de onderste laag is de waterlaag voornamelijk uit zoutoplossing en bloed. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Plaatsing van Cell Suspension op Polysucrose Solution. (a) De celsuspensie moet zeer voorzichtig gepipetteerd op de zijkant van de buis, zodat het laag bovenop de polysucrose oplossing. (b) dit is de correcte weergave van een celsuspensie laag bovenop de polysucrose vóór centrifugatie."> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: Het zaaien van cellen op de steiger. (a) Op het oppervlak van een steriel putje van een 24-well celcultuur plaat, laadt een droge scaffold met ongeveer 50 pi celsuspensie. (b) Incubeer de steiger in een celkweek incubator gedurende 30 min celadhesie mogelijk. Let op: In de figuur, is een 10-cm plaat gebruikt voor demonstratiedoeleinden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4: Oprichting van de calvarial Defect. De calvarial defect (pijlen) zichtbaar is binnen degeopend incisie in de huid. Let op de intacte durale bloedvaten (pijlpunten), wat aangeeft dat het boren de dura niet heeft geschonden. Schaal bar, 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5: genezing van Critical-sized calvarial Gebreken met verschillende ASC subpopulaties. (A) drie-dimensionale micro-CT-reconstructies werden uitgevoerd voor calvarial gebreken re- gepaard met ongesorteerd, BMPR-IB (+) of BMPR-IB (-) ASC. (B) Kwantificering van genezing na 8 weken significant grotere botherstel met BMPR-IB (+) ASC (92%) vergeleken met ongesorteerd en BMPR-IB (-) ASC (58% en 46%, respectievelijk, ** p < 0,01). Significante verschillen in genezing werden ook gezien bij 2 weeks (** p <0,01), 4 weken (*** p <0,001) en 6 weken (*** p <0,001). Micro-CT, micro-computertomografie. Overgenomen met toestemming van McArdle et al. 12. Fout balken geven standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 6
Figuur 6: Histologische kleuring van Bone regenereren. (A) Movat's Pentachrome kleuring van het bot te regenereren in gebreken gerepareerd met ongesorteerd, BMPR-IB (+) of BMPR-IB (-) ASC bij 5x vergroting met behulp van helderveld microscopie. Opmerking robuuster botvorming in BMPR-IB (+) groep in vergelijking met BMPR-IB (-) groep. De gestippelde lijn geeft de omvang van het defect gebied. Het gebied binnen de zwarte rechthoek wordt op hogere magnificatie gebruikt (B) 10x en (C) 40X helderveld microscopie van deficiënte gebied. Overgenomen met toestemming van McArdle et al. 12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kritische stappen in het protocol

Tijdens de oogst van ASC, de kritische stap is voldoende vertering van vet met collagenase. Onvoldoende vertering leidt tot een lage opbrengst van ASC. Tijdens FACS sortering van BMPR-IB + cellen, is het belangrijk om de poort zorgvuldig definiëren positiviteit. Het definiëren poorten te los kan resulteren in gesorteerde populaties die niet zuiver zijn. Tijdens het maken van de calvarial defect, is het essentieel om het defect te boren door het bot van de schedel maar niet verder in de dura mater. Dit zal overvloedig bloeden en blootstelling van de hersenen, die euthanasie van het dier noodzakelijk leiden.

Wijzigingen en problemen oplossen

Betreffende verdoving voor calvarial defect operatie, ons lab liever geïnhaleerde isofluraan gebruiken, maar een andere optie is het intraperitoneaal injecteren van een mengsel dat een uiteindelijke concentratie van ketamine 10 mg / ml xylazine en 1 mg / ml in normale salijn. De standaarddosis van dit mengsel wordt 300 pi van een 30 g muis. Dit verschaft ongeveer 30 min betrouwbare anesthesie die de muis hoeft te worden in de isofluraan neuskegel tijdens chirurgie. Een nadeel van het gebruik geïnjecteerde anesthetic is dat het niet mogelijk is om de dosis te verlagen nadat de injectie is gegeven. In tegenstelling, kan geïnhaleerd isofluraan gemakkelijk worden getitreerd naar boven of beneden in real time.

Bij het toevoegen celsuspensie aan de steiger kan onderzoekers vinden dat het fluïdumvolume te klein en wordt gedeeltelijk verdampt in 30 min incubatie. Verdamping kan celdood, die een bijzonder schadelijk confounder in botgenezing experimenten veroorzaken. Om dit te bestrijden, laadt het schavot in een putje van een plaat met 24 putjes. Vul het direct omliggende putten met duidelijke medium. Dit zal een vochtige micro-omgeving die ervoor zorgt dat de geladen steiger tegen uitdrogen te creëren.

Histologische kleuring van het bot is predicated op correcte en grondige ontkalking van de calvarium voorafgaand aan het inbedden en snijden. Het is algemeen aanvaard dat de schedels van verschillende leeftijden vereisen uiteenlopende duur van de ontkalking, van oudsher gedaan in een EDTA-oplossing

Beperkingen van de Techniek

Dit protocol maakt gebruik van een 4 mm calvarial defect naar het vermogen van een populatie van cellen om sluiting van het defect versterken beoordelen. Dit model kan geen genezing die optreedt in een complexe omgeving, zoals een lang bot fractuur of tumor resectie simuleren. Daarom mogen andere diermodellen gebruikt moeten worden om de bijdrage van ASC om botgenezing in deze instellingen begrijpen.

Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / Alternative Methods

Middels flowcytometrie specifieke ASC populaties isoleren is een veelbelovende techniek voor het verbeteren van genezing en regeneratie in het kader van meerdere weefsels enjury modellen, zoals angiogenese, adipogenese en osteogenesis. De bruikbaarheid van pro-osteogene cellen is onderzocht in deze studie, die een diepgaand effect met cellen positief geselecteerd voor BMPR-IB in een genezende calvarial defect.

Voorafgaande protocollen voor het isoleren van ASC omvatten het kweken van de cellen gedurende verscheidene dagen op celkweekplaten 16. Echter, kunnen cellen significante fenotypische drift terwijl in cultuur te ervaren. Daarom gebruiken we een ASC isolatieprotocol dat zorgt voor snelle isolatie van deze cellen, gevolgd door verdere zuivering met gebruik van FACS subpopulatie. De gehele procedure wordt uitgevoerd in minder dan een dag, het minimaliseren van de effecten van celoppervlaktemarker of fenotypische drift.

Toekomstige toepassingen en routebeschrijvingen

We hebben aangetoond dat ASC sterk tot expressie BMPR-IB tonen een groter vermogen om regeneratieve botdefecten genezing verbeteren vergeleken met andere ASC. De mechanismen die ten grondslag liggening dit fenomeen zijn niet bekend. Zo is het niet duidelijk of de cellen zelf direct differentiëren tot botvormende cellen, of dat zij produceren factoren die andere cellen stimuleren om te doen. Toekomstige studies moeten worden uitgevoerd om deze vragen te beantwoorden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 micron cell strainer Falcon 352360
15 blade scalpel Miltex 4-515
24 well plate Corning 3524
40 micron cell strainer Falcon 352340
50 mL conical centrifuge tubes Falcon 352098
6-0 Ethilon nylon suture, 18", P-3 needle,  Ethicon 1698G
Anti-BMPR-IB primary antibody R&D systems FAB5051A
BioGel PI surgical gloves Mölnlycke Health Care ALA42675Z
Buprenorphine SR ZooPharm
Castro-Viejo needle driver Fine Science Tools 12565-14
CD1 nude mouse Charles River 086
Collagenase Type II powder Gibco 17101-015
DMEM medium Gibco 10564-011
Drill: Circular knife 4.0 mm Xemax Surgical CK40
Drill: Z500 Brushless Micromotor NSK NSKZ500
FBS Gicbo 10437-077
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24" Fisher Scientific 14-206-62
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4" Fisher Scientific 22-415-469
Heating pad Kent Scientific DCT-20
Hyclone 199/EBSS medium GE  Life Sciences SH30253.01
Isothesia isoflurane Henry Schein  050033
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Paraffin film (Parafilm) Bemis PM996
PBS Gibco 10010-023
Pen-Strep Gibco 15140-122
PLGA scaffolds Proprietary Formulation
Poloxamer 188, 10% Sigma P5556-100ML
Polylined Sterile Field, 18" x 24" Busse Hospital Disposables 696 Cut a rectangular hole of the appropriate size
Polysucrose Solution: Histopaque 1119 Sigma 11191
Povidone Iodine Prep Solution Medline MDS093944H
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube Dechra Veterinary Products
RBC lysis buffer Sigma 11814389001
Webcol alcohol prep swabs Covidien 6818

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28, (2), 134-139 (2003).
  2. Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: an update. Injury. 36, S20-S27 (2005).
  3. Laurencin, C., Khan, Y., El-Amin, S. F. Bone graft substitutes. Expert Rev Med Devices. 3, (1), 49-57 (2006).
  4. Walmsley, G. G., et al. Nanotechnology in bone tissue engineering. Nanomedicine. 11, (5), 1253-1263 (2015).
  5. Chapekar, M. S. Tissue engineering: challenges and opportunities. J Biomed Mater Res. 53, (6), 617-620 (2000).
  6. Levi, B., et al. Human adipose derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defects. PLoS One. 5, (6), e11177 (2010).
  7. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100, (9), 1249-1260 (2007).
  8. Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. J Biol Chem. 286, (45), 39497-39509 (2011).
  9. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1)-positive selection enhances osteogenic capacity of human adipose-derived stromal cells. Tissue Eng Part A. 19, (7-8), 989-997 (2013).
  10. Wozney, J. M., et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science. 242, (4885), 1528-1534 (1988).
  11. Wan, D. C., et al. Osteogenic differentiation of mouse adipose-derived adult stromal cells requires retinoic acid and bone morphogenetic protein receptor type IB signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (33), 12335-12340 (2006).
  12. McArdle, A., et al. Positive selection for bone morphogenetic protein receptor type-IB promotes differentiation and specification of human adipose-derived stromal cells toward an osteogenic lineage. Tissue Eng Part A. 20, (21-22), 3031-3040 (2014).
  13. Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (71), e4425 (2013).
  14. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. J Vis Exp. (68), (2012).
  15. Lester, S. C. Manual of surgical pathology. Saunders/Elsevier. (2010).
  16. Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45, (2), 115-120 (2008).
Rapid Isolatie van BMPR-IB + Adipose-afgeleide stromacellen voor gebruik in een calvarial Defect Healing Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marshall, C. D., Zielins, E. R., Brett, E. A., Blackshear, C. P., Hu, M. S., Leavitt, T., Barnes, L. A., Lorenz, H. P., Longaker, M. T., Wan, D. C. Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model. J. Vis. Exp. (120), e55120, doi:10.3791/55120 (2017).More

Marshall, C. D., Zielins, E. R., Brett, E. A., Blackshear, C. P., Hu, M. S., Leavitt, T., Barnes, L. A., Lorenz, H. P., Longaker, M. T., Wan, D. C. Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model. J. Vis. Exp. (120), e55120, doi:10.3791/55120 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter