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Developmental Biology

Schnelle Isolierung von BMPR-IB + Fettgewebe gewonnene Stromazellen für die Verwendung in einem Schädeldachdefektheilung Modell

doi: 10.3791/55120 Published: February 24, 2017

Introduction

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Wichtige Knochendefekten aus der Verletzung, Infektion oder invasiven Krebs haben einen erheblichen Einfluss auf eines Patienten Erholung und Lebensqualität. Es gibt Techniken , um diese Defekte mit gesunden Knochen von einer anderen Stelle des Patienten eigenen Körper, aber diese Übertragung trägt seine eigene Morbidität und das Risiko von Komplikationen 1, 2, 3 zu füllen. Darüber hinaus sind einige Mängel so groß oder komplex, dass genügend Spenderknochen vorliegt, um den Defekt zu füllen. Prosthetic Geräte sind eine mögliche Option für Knochendefekte Füllung , aber diese sind mit mehreren Nachteilen , einschließlich Infektionsrisiko, Hardware - Fehler zugeordnet ist , und Fremdkörperreaktion 4.

Aus diesen Gründen besteht ein großes Interesse an der Möglichkeit von Engineering biologischen Knochenersatzmaterialien von patienteneigenen Zellen 5 verwendet wird . Adipöse abgeleiteten Stromazellen (ASC)haben das Potenzial für diese Anwendung , da sie reichlich vorhanden in den patienteneigenen Fettgewebe sind , und sie haben die Fähigkeit zu heilen Knochendefekte nachgewiesen durch die Generierung neuer Knochengewebe 6, 7. ASCs sind eine heterogene Population von Zellen , und mehrere Studien haben gezeigt , dass für bestimmte Zelloberflächenmarker 8 Auswählen Zellpopulationen mit einer verbesserten osteogenen Aktivität produzieren kann, 9. ASCS mit dem höchsten osteogene Potenzial Auswahl würde die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass ein Gerüst mit diesen Zellen ausgesät könnte einen großen Knochendefekt zu regenerieren.

Bone morphogenetic protein (BMP) Signalisierungs ist kritisch für die Regulierung Knochendifferenzierung und die Bildung 10 und den BMP - Rezeptor Typ IB (BMPR-IB) ist bekannt für die Osteogenese in ASCs 11 wichtig. Vor kurzem haben wir, dass die Expression von BMPR-IB gezeigt, kann be 12 verwendet für ASCS mit verbesserten osteogenen Aktivität auszuwählen. Hier zeigen wir ein Protokoll für die Isolierung von ASCs aus menschlichem Fett durch einen Test ihrer osteogene Aktivität gefolgt BMPR-IB-exprimierenden unter Verwendung eines in vivo Calvaria Defektmodell.

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Protocol

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HINWEIS: Die Proben wurden von Patienten erhalten, die informierte Zustimmung gegeben hat. Alle Protokolle wurden von der entsprechenden Stanford University Institutional Review Board überprüft und genehmigt. Während menschliche Gewebe und Zellen Handhabung, immer an Biosafety Level 2 (BSL2) Vorsichtsmaßnahmen, wie von Ihrer Einrichtung angegeben.

1. Vorbereitung der Reagenzien

  1. Vorbereitung FACS-Puffer: Füge 10 ml FBS, 5 ml Poloxamer 188 und 5 ml Pen-Strep und 500 ml sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS).
  2. Bereiten Sie Mischung zu verdauen: In 0.375 g C. hemolyticum Kollagenase Typ II - Pulver und 5 ml Poloxamer 188 auf 500 mL sterile 199 / EBSS Medium.
  3. Bereiten Standardmedium: In 50 ml FBS und 5 ml Pen-Strep bis 500 ml Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium.

2. Ernte und Isolierung von ASCS

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass eine angemessene institutionelle Genehmigungen vorhanden sind, für die Verwendung von menschlichem Gewebe und zur Isolierung von human Stammzellen. Erhalten menschlichen Bauch, flankieren oder Oberschenkel subkutanes Fett von einem gesunden Spender elektiven Fettabsaugung. Halten Sie das Fett in einem Kunststoff-Saug-Kanister.

  1. In steriler PBS in einem Verhältnis 1: 1, um das Fett in der ursprünglichen Plastikkanister. (Wenn es 500 ml Fett, 500 ml PBS). Mix durch vorsichtiges Schütteln für 30 s. Lassen Sie die wässrige Schicht auf den Boden (Abbildung 1) und dann absaugen und verwerfen die wässrige Phase mit einer 10 - ml Plastikpipette abgesaugt angebracht zu begleichen.
  2. Dekantieren, das Fett in einen großen Plastikbehälter und fügen Sie Mischung in einem 1 verdauen: 1-Verhältnis. Schließen Sie den Behälter und reinigen Sie die Außenseite mit 70% Ethanol. Verschließen Sie die Kappe mit Paraffinfilm.
  3. Agitieren diesen Behälter in einem Orbitalschüttler bei 180 Upm bei 37 ° C für 30 min.
  4. Neutralisieren Sie die Verdauung durch Zugabe von Standardmedium in einem Verhältnis 1: 1. (Wenn es 1000 ml Fett Mischung, fügen Sie 1000 ml Standardmedium).
  5. Verteilen der Mischung gleichmäßig in einer geraden Anzahl von 250 ml Kunststoff konische Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge die Mischung bei 300 g für 20 min bei 4 ° C
  6. Saugen Sie den Überstand und vorsichtig sein, um das Pellet intakt zu lassen. Resuspendieren Pellets in 5 ml Standardmedium für jeden konischen Röhrchen.
  7. Filtern der Suspension durch ein 100-Mikrometer-Filter in ein 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen. Dann Zentrifuge bei 300 × g für 15 min bei 4 ° C.
  8. Den Überstand aspirieren und das Pellet in 5 ml Raumtemperatur Puffer RBC-Lyse. Lassen Sie die Mischung für 5 min bei Raumtemperatur stehen dann für 15 min bei Raumtemperatur (RT) bei 300 xg zentrifugiert.
  9. Den Überstand aspirieren und das Pellet in 15 ml Standardmedium. Filter wieder durch ein 100-Mikrometer-Filter in ein 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen.
  10. In einer neuen 50 ml konischen, 15 ml Polysucrose Lösung für die Dichte-basierte Trennung entworfen (siehe Liste der Reagenzien). Dann wird das Rohr in einem Winkel von 45 ° hält, pipettieren sorgfältig die Zellen auf der Seite derdas Rohr , so daß die Zellsuspension sanft Schichten auf der Oberseite der Polysaccharose - Lösung (Abbildung 2).
    HINWEIS: Es ist wichtig zu Pipette Zellen auf der Oberfläche der Lösung. Nicht Polysucrose Lösung zu einer Suspension von Zellen hinzuzufügen, da dies eine irreversible Mischung erstellen. Ebenso pipettieren nicht die Zellen in der Mitte der Polysaccharose Lösung.
  11. Zentrifugieren diese Mischung bei 300 xg für 10 min bei RT. Verwenden Sie niedrige Beschleunigung (2 - 3 von 10) und stellen Sie die Bremsfunktion der Zentrifuge auf Null für diesen Schritt.
    HINWEIS: Drei Schichten werden sichtbar: klar auf dem Boden, bedeckt in der Mitte, und lachsfarbene auf der Oberseite. Die mittlere Schicht enthält die Zellen von Interesse.
  12. Mit entfernen, um eine 10-ml-Pipette vorsichtig die mittlere Schicht und Transfer in ein neues 50 ml konischen Röhrchen.
    HINWEIS: Es ist besser, vollständig die Mittelschicht zu übertragen und dabei einige der oberen und unteren Schichten nehmen, als hinter einigen der mittleren Schicht zu verlassen.
  13. <li> Zählen Sie die Zellen, die eine Zählkammer und Gesamtlebendzellzahl zu bestimmen.
    HINWEIS: Wir verwenden typischerweise Trypanblau zu dem Zellgemisch in einer Endkonzentration von 0,8% in Zählen Zellen zu unterstützen. Tragfähige lebenden Zellen wird der blaue Farbstoff nicht aufnehmen und weiß erscheint.

3. FACS-Sortierung für BMPR-IB Positive-Zellen und Herstellung von zellhaltigen Scaffolds

  1. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Resuspendieren der Zellen in FACS-Puffer bei einer Konzentration von 1 Million Zellen pro 100 & mgr; l (bezogen auf die Zellzahl in Schritt getan 2.13).
  2. Übertragung von mindestens 10 Millionen Zellen auf ein Kunststoffzentrifugenröhrchen mit "BMPR-IB". Getrennt davon übertragen eine Million Zellen in 100 & mgr; l FACS-Puffer zu einem separaten Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff mit "Unstained." 1 ml FACS-Puffer zum "Unstained" Rohr. Halten Sie den Rest der Zellen in FACS-Puffer auf Eis, während die FACS Teil der exper SortierBeispiel wird getan. Beschriften Sie diese Zellen "unsortiert". Verwenden Sie diese als Kontrollen später im Experiment.
  3. Füge eine geeignete Menge eines fluoreszierenden anti-human BMPR-IB-Antikörpers auf die "BMPR-IB" Röhre gemäß der Anweisungen des Herstellers. Pipette, um die Mischung nach oben und unten sanft um den Antikörper zu verteilen.
    HINWEIS: Wir verwenden ein Mensch BMPR-IB / ALK-6 APC-konjugierte Antikörper bei einer Verdünnung von 1:10 (siehe Liste der Reagenzien für weitere Details). Allerdings wird Antikörper von verschiedenen Herstellern haben unterschiedliche Konzentrationen verwendet.
  4. Decken Sie den Eisbehälter in einer Weise, die Licht abhält. Erlauben der Zelle / Antikörpergemisch 30 min (oder entsprechend den Anweisungen des Herstellers Antikörper) zu sitzen.
    HINWEIS: Wenn die Anti BMPR-IB-Antikörper als primäre unkonjugierten Antikörper kommt, der einen zweiten Antikörper erfordert, führen eine separate Färbeschritt auf Eis mit dem sekundären Antikörper gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  5. Zentrifugieren Sie beide Schläuche an300 × g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand aspirieren, darauf achten, daß das Pellet abzusaugen. Resuspendieren der pelletierten Zellen in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge wieder die Röhrchen bei 300 g für 5 min. aspirieren sorgfältig den Überstand und Resuspendieren der Zellen in FACS-Puffer auf eine Konzentration von 1 Million Zellen pro 1 ml.
  6. Filtern Sie die "BMPR-IB", "Unstained" und "unsortiert" Zellen durch 40 Mikron Zelle strainers in neue markierte Glas FACS-Röhrchen. Spülen der Filter mit 500 & mgr; l FACS-Puffer, um sicherzustellen, dass Zellen nicht in den Filter zurückgelassen. Fügen Sie auch 2 ml Standardmedium zu zwei getrennten Kunststoff-Zentrifugenröhrchen mit "BMPR-IB-positiv" und "BMPR-IB-negativ." Verwenden Sie diese zwei die sortierten Zellen in der FACS-Maschine zu sammeln.
  7. Auf der FACS-Maschine, die ungefärbte Zellen verwenden, um eine negative Gate für den Fluoreszenzmarker zu definieren.
  8. Mit einer 100 Mikron Düse, sortieren BMPR-IB positiven und negativen Zellen in die jeweiligen Rohre conTaining Standardmedium. Bewahren Sie diese Röhrchen bei 4 ° C während der Art gekühlt, wenn die FACS-Maschine hat diese Fähigkeit.
    HINWEIS: Bitte beachten Sie die JOVE Artikel 13 von Sharon et al. für ein ausgezeichnetes Protokoll für FACS-Sortierung.
  9. Verwendung eines Hämocytometer, zähle die Zellen in jedem Röhrchen. Zentrifugieren Sie die "BMPR-IB-positiv", "BMPR-IB-negativ" und "unsortiert" Röhrchen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C und den Überstand aspirieren, wobei darauf geachtet, nicht das Zellpellet zu stören. Dann Resuspendieren der Zellen in Standardmedium auf eine Konzentration von 1 Million Zellen pro 250 & mgr; l.
  10. Erhalten, vorgeschnitten 4 mm PLGA (Poly [milch-co-glykolsäure]) Gerüste mit Hydroxylapatit beschichtet. Legen Sie jedes Gerüst in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte. Cover jede Gerüst mit 50 & mgr; l der Zellsuspension aus einer der drei Gruppen (i .e, 200.000 Zellen.): Unsortiert, BMPR-IB-positiv, und BMPR-IB-negativ (Abbildung 3).
    HINWEIS: Bittebeziehen sich auf die JOVE Artikel 14 von Lo et al. Einzelheiten über den Bau von PLGA Scaffolds.
  11. füllen teilweise die umliegenden leeren Brunnen mit Standardmedium, decken Sie die Platte mit dem Deckel (Austrocknung der Gerüste zu verhindern), und in einer Zellkultur-Inkubator bei 37 ° C für 30 min inkubiert.

4. Schaffung von Schädeldach Mängel und Anwendung von ACS-haltigen Scaffold

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass eine angemessene institutionelle Genehmigungen liegen vor für die Schaffung von Kalvariamodell Defekte in lebenden Mäusen. Dieses Protokoll wurde von der Stanford University Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.

  1. Anesthetize eine CD-1-Nacktmaus entweder inhalativen Isofluran Gas oder eines injizierten lang wirkendes Anästhetikum Cocktail verwendet wird.
    1. So verwenden Sie Gas allein, legen Sie die Maus in eine Anästhesie Kammer und starten die Zufuhr von Sauerstoff bei 2 - 3 l / min bei einer Konzentration von 2% Isofluran. Sobald die Maus fully bewusstlos, legen Sie sie anfällig auf eine Warmwasserumlauf Decke mit einem saugfähigen Kissen und legen seine Schnauze in eine Narkose Bugnase mit der gleichen Konzentration von Sauerstoff und Isofluran. sorgfältig überwachen, die Atemfrequenz und die Konzentration von Isofluran nach Bedarf anpassen.
    2. eines injizierten lang wirkendes Anästhetikum Cocktail, betäuben die Maus in einer Anästhesiekammer zu verwenden, wie oben beschrieben, und dann das Anästhetikum Cocktail injizieren. Entfernen Sie die Maus aus der Narkose Kammer und beobachten ihr Verhalten.
      HINWEIS: Die Maus kurz von der Anästhesie entstehen kann, aber innerhalb von mehreren Minuten vollständig sollte wieder unter der Wirkung des injizierten Anästhetikums anästhesiert werden. Übertragen Sie die Maus in eine warme Wasserkreislaufdecke mit einem saugfähigen Kissen bedeckt.
      HINWEIS: Für eine Anästhetikum Cocktail empfehlen wir eine Mischung, die Ketamin 10 mg / ml und Xylazin 1 mg / ml in normaler Kochsalzlösung, intraperitoneal geliefert. Die Standarddosis dieser Mischung ist300 & mgr; l für eine 30 g-Maus, die 100 mg / kg und Xylazin 10 mg / kg Ketamin entspricht. Siehe die Diskussion Abschnitt für weitere Details in Bezug auf die injizierbare Betäubungsmittel.
    3. Verwenden Sie einen Zeh Prise Manöver, um die Tiefe der Anästhesie bestimmen. Eine ausreichend narkotisiert Maus wird seine Pfote nicht zurückziehen, wenn sie leicht durch den Chirurgen eingeklemmt wird.
    4. Gelten Augensalbe Austrocknung der Hornhaut zu verhindern.
    5. Verwalten 1 mg / kg Buprenorphin SR subkutan.
      HINWEIS: Analgesie vor der Operation, führt zu besseren Schmerzlinderung.
    6. Während des gesamten Verfahrens, zur Überwachung der Atemfrequenz der Maus.
      HINWEIS: - 100 Atemzüge / min Eine Maus richtig unter Isofluran betäubt sollte eine Atemfrequenz von 50 haben. Eine erhöhte Atemfrequenz zeigt an, dass der Anästhesie zu hell ist, während eine verminderte Atemfrequenz kann darauf hindeuten, dass der Anästhesie zu tief ist.
  2. Bereiten Sie die Haut des dorsalen des Schädels mit Povidon-IODine Lösung von 70% Ethanol dreimal gefolgt. Drape mit sterilen Tüchern, ausgesetzt, um die Operationsstelle zu verlassen.
    HINWEIS: Tragen Sie sterile OP-Handschuhe und halten sterile Technik während des Verfahrens. Berühren Sie nur sterile Flächen und Gegenstände wie die sterile Abdeckung und die autoklaviert Instrumente. Haben ein Assistent Beleuchtung, offene Naht Pakete anpassen, usw.
  3. Mit einem 15-Blatt-Skalpell, machen Sie eine sagittale Mittelschnitt, die die Mehrheit der dorsalen Schädel erstreckt. Mit einem feinen Zahnzange ziehen sich die Haut auf der rechten Seite des Einschnitts den rechten Scheitelbein zu belichten.
  4. Mit einem Bohrer mit einem autoklaviert 4 mm diamantbeschichtete Trepanfräse Bit, bohren, um einen Defekt durch den Scheitelbein. Sie nicht, den Defekt Vergangenheit Knochen in die Dura mater Schicht erstrecken. (Figur 4)
  5. Legen Sie ein Gerüst in den Defekt, und schließen Sie dann die Hautschnitt mit fließendem Nylonfaden.
  6. Überwachen Sie die Maus und bieten Standard postoperativen Versorgung einL aut institutionellen Richtlinien.
    1. Halten Sie die Maus auf einem sauberen Papiertuch in einem sauberen Käfig, während er sich erholt. Die eine Hälfte des Käfigs sollte über einen Warmwasserumlauf Decke angebracht werden und die Maus sollte ursprünglich in dieser Halbzeit platziert werden.
    2. Seien Sie nicht eine Maus unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein wiedererlangt zu ambulate hat. Verwenden Sie keine Maus zurück, die Operation zu einem Käfig mit anderen Mäusen unterzogen wurde, bis es vollständig zurückgewonnen wird.
  7. Wiederholen der obigen Schritte mit einem neuen Maus für jedes Gerüst, das getestet werden soll. Sterilisieren von chirurgischen Instrumenten in zwischen Operationen eine heiße Perle Sterilisator oder andere geeignete Verfahren.
  8. Kurz nach dem Verfahren, und anschließend bei 2, 4, 6 und 8 Wochen, verwenden micro CT Scanning die Rate der Calvaria Defektverschluss zu analysieren.
    HINWEIS: Siehe den Artikel von Levi et al. 6 für eine Beschreibung der Mikro - CT - Scan von Kalvariamodell Defekte.
  9. Wenn das Experiment ist complete, euthanize die Mäuse durch sie in eine saubere Euthanasie Kammer platziert und bei einer Rate von 2 L / min ein Strom von Kohlendioxidgas in die Kammer beginnt. Nach Respiration vollständig aufgehört haben (nach ca. 10 min) durchführen Euthanasie Zervikaldislokation zu bestätigen.
  10. Gegebenenfalls kann nach der Versuch abgeschlossen ist, verwenden Sektionierung und histologische Färbung innerhalb des Defekts Knochenbildung zu bewerten.
    HINWEIS: Siehe den Artikel von McArdle et al. 12 Einzelheiten der Knochen Vorbereitung Proben für die Histologie. Für einen Überblick über Techniken histologischen und Färbung finden Sie eine histologische Handbuch wie dem Handbuch für Klinische Pathologie 15.

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Representative Results

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Micro-CT am Tag der Operation durchgeführt wird den Schädeldefekt deutlich zeigen. Zu diesem Zeitpunkt gibt es keine Einwachsen in die 4 mm Defekt sein. Nachfolgende Abtastungen werden über die Zeit erhalten, die Größe des Fehlers im Laufe der Zeit zu quantifizieren verglichen mit der Basislinie. Defekte beimpft mit BMPR-IB + Zellen sollten schnellere Schließung des Defektes zeigen , wenn sie mit BMPR-IB- und unsortiert Zellen (Abbildung 5) verglichen. Zusätzlich kann der Teil des Schädels den Defekt enthält , entkalkt und für die Histologie Verwendung von Standardverfahren 12 verarbeitet werden. Gefärbte Schnitte mit Movat des Penta Fleck wird zeigen , größere Knochenregeneration in der behandelten Defekt mit BMPR-IB - Zellen im Vergleich mit den anderen Zellpopulationen (Abbildung 6).

Abbildung 1
Abbildung 1: Lipoaspirate nach PBS waschen. Ein Kanister lipoaspirate nach PBS strong> wird zugegeben, und die Mischung absetzen gelassen. Die obere Gewebeschicht ist das Fettgewebe die ASCs beherbergt, während die untere Schicht die wässrige Schicht ist, hauptsächlich aus Kochsalzlösung und Blut. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Platzierung der Zellsuspension auf Polysucrose Lösung. (a) Die Zellsuspension muß sehr vorsichtig auf die Seite des Röhrchens pipettiert werden, so dass sie auf der Oberseite der Polysaccharose Lösung zu Schicht. (b) Dies ist die korrekte Aussehen einer Zellsuspensionsschicht auf der Oberseite des Polysaccharose vor der Zentrifugation."> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Säen der Zellen auf das Schafott. (a) Auf der sterilen Oberfläche eine Vertiefung einer 24-Well - Zellkulturplatte, laden ein trockenes Gerüst mit etwa 50 & mgr; l der Zellsuspension. (b) Inkubieren des Gerüsts in einem Zellkulturbrutschrank für 30 min Zelladhäsion zu ermöglichen. Hinweis: In der Figur ist ein 10-cm-Platte zu Demonstrationszwecken verwendet wird. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Schaffung des Schädeldachdefekten. Der Schädeldefekt (Pfeile) sichtbar ist innerhalb desoffene Hautschnitt. Beachten Sie die intakte dural Blutgefäße (Pfeile), was darauf hinweist, dass die Bohrungen die Dura nicht verletzt hat. Maßstabsbalken, 5 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Heilung von Critical-Größe Schädeldach Defekte mit unterschiedlichen ASC Subpopulationen. (A) Dreidimensionale Mikro CT Rekonstruktionen wurden für Kalvariamodell Defekte durchgeführt RE- mit unsortiertem gepaart, BMPR-IB (+) oder BMPR-IB (-) ASCS. (B) Quantifizierung der Heilung nach 8 Wochen zeigten eine signifikant höhere Knochenregeneration mit BMPR-IB (+) ASCS (92%) im Vergleich mit dem unsortierten und BMPR-IB (-) ASCS (58% bzw. 46% bzw. ** p < 0,01). Signifikante Unterschiede bei der Heilung wurden auch bei zwei wir gesehenEKS (** p <0,01), 4 Wochen (*** p <0,001) und 6 Wochen (*** p <0,001). Micro-CT, Mikro-Computertomographie. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von McArdle et al. 12. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6: Die histologische Anfärbung von Knochenregenerat. (A) Movat des Pentafärbung von Knochen Defekte regenerieren repariert mit unsortiertem, BMPR-IB (+) oder BMPR-IB (-) ASCS bei 5fache Vergrößerung mit Hellfeldmikroskopie. Hinweis robuster Knochenbildung in BMPR-IB (+) Gruppe, verglichen mit BMPR-IB (-) Gruppe. Die gepunktete Linie stellt die Ausdehnung des Defektbereichs. Der Bereich innerhalb des schwarzen Rechteck auf höhere magnific gezeigtation mit (B) 10X und (C) 40X Hellfeldmikroskopie von Defektbereich. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von McArdle et al. 12. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls

Während der Ernte der ASCs, ist der kritische Schritt ausreichende Verdauung von Fett mit Kollagenase. Eine unzureichende Verdauung wird in einer geringen Ausbeute an ASCS führen. Während der FACS-Sortierung von BMPR-IB + Zellen ist es wichtig, das Tor für Positivität sorgfältig zu definieren. Tore zu lose Definition in sortierten Populationen resultieren, die nicht rein sind. Bei der Erstellung des Kalvariamodell Defekt, ist es entscheidend, den Mangel durch den Knochen des Schädels zu bohren, aber in die Dura mater, um nicht weiter. Dies führt dazu, starke Blutungen und Exposition des Gehirns, die Euthanasie des Tieres erforderlich machen.

Technische Änderungen und Fehlerbehebung

für die Calvaria Defekt Operation bezüglich Anästhesie, bevorzugt unserem Labor inhalativen Isofluran zu verwenden, aber eine andere Möglichkeit ist, eine Mischung intraperitoneal injizieren eine Endkonzentration von Ketamin 10 mg / mL und Xylazin 1 mg / ml in normaler sa enthaltendLinie. Die Standarddosis dieser Mischung beträgt 300 & mgr; l für eine 30 g-Maus. Dies stellt ungefähr 30 min zuverlässiger Anästhesie, die in der Isofluran Bugnase während der Operation zu sein, nicht die Maus benötigen. Nachteilig an Anästhetikum injiziert ist, dass es nicht möglich ist, die Dosis zu verringern, nachdem die Injektion gegeben worden ist. Im Gegensatz dazu kann inhaliert Isofluran leicht in Echtzeit titriert nach oben oder unten.

Wenn Zellsuspension auf dem Gerüst Zugabe kann Forscher feststellen, dass das Fluidvolumen zu klein ist, und wird teilweise in den 30 min der Inkubation verdampfen. Das Verdampfen kann zum Zelltod führen, die eine besonders schädliche confounder in Knochenheilungsversuche ist. Um dies zu bekämpfen, laden Sie das Gerüst in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte. Füllen Sie die unmittelbar umgebenden Brunnen mit klarem Medium. Dies wird eine befeuchtete Mikroumgebung schaffen, die ein Austrocknen der geladenen Gerüst hilft halten.

Die histologische Färbung der Knochen vordicated über den Stand der korrekte und vollständige Entkalkung der Schädelkalotte zur Einbettung und Schneiden. Es wird angenommen, dass Schädel unterschiedlichen Alters erfordern unterschiedliche Dauer der Entkalkung, die traditionell in einer EDTA-Lösung getan

Einschränkungen der Technik

Dieses Protokoll verwendet eine 4 mm Calvaria Defekt die Fähigkeit einer Population von Zellen zu beurteilen Verschluß des Defekts zu erhöhen. Dieses Modell kann nicht die Heilung zu simulieren, die in einer komplexeren Umgebung, beispielsweise eine lange Knochenfraktur oder eine Tumorresektion auftritt. Aus diesem Grund können andere Tiermodelle müssen verwendet werden, um den Beitrag der ASCs zu Knochenheilung in diesen Einstellungen zu verstehen.

Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / Alternativmethoden

Mit Hilfe der Durchflusszytometrie spezifischen ASC Populationen zu isolieren, ist eine vielversprechende Technik zur Heilung und Regeneration im Zusammenhang mit mehreren Gewebe zu verbessern und inJury-Modelle, wie Angiogenese, Adipogenese und Osteogenese. Der Nutzen der pro-osteogenen Zellen wird in dieser Studie untersucht, einen profunden Effekt mit Zellen positiv selektiert für BMPR-IB bei der Heilung eines Kalvariamodell Defekt zeigt.

Stand der Protokolle für die Isolierung von ASC beinhalten die Zellen mehrere Tage Kultivierung auf die Zellkulturplatten mit 16. Allerdings erleben können Zellen signifikante phänotypische Drift, während in der Kultur. Aus diesem Grund verwenden wir ein ASC Isolation Protokoll, das für die schnelle Isolierung dieser Zellen, gefolgt von einer weiteren Subpopulation Reinigung unter Verwendung von FACS ermöglicht. Das gesamte Verfahren wird in weniger als einem Tag durchgeführt, um die Auswirkungen von Zelloberflächenmarker oder phänotypische Drift zu minimieren.

Zukünftige Anwendungen und Anfahrt

Wir haben gezeigt, dass ASCS sehr BMPR-IB zeigen eine größere Fähigkeit Heilung regenerative Knochendefekt im Vergleich zu anderen ASCS zu verbessern auszudrücken. Die Mechanismen Basiswertes verwendetdieses Phänomen ing sind nicht bekannt. Zum Beispiel ist es nicht klar, ob die Zellen direkt selbst in den Knochen bildenden Zellen zu unterscheiden, oder ob sie Faktoren produzieren, die andere Zellen zu fördern, dies zu tun. Zukünftige Studien müssen durchgeführt werden, um diese Fragen zu beantworten.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 micron cell strainer Falcon 352360
15 blade scalpel Miltex 4-515
24 well plate Corning 3524
40 micron cell strainer Falcon 352340
50 mL conical centrifuge tubes Falcon 352098
6-0 Ethilon nylon suture, 18", P-3 needle,  Ethicon 1698G
Anti-BMPR-IB primary antibody R&D systems FAB5051A
BioGel PI surgical gloves Mölnlycke Health Care ALA42675Z
Buprenorphine SR ZooPharm
Castro-Viejo needle driver Fine Science Tools 12565-14
CD1 nude mouse Charles River 086
Collagenase Type II powder Gibco 17101-015
DMEM medium Gibco 10564-011
Drill: Circular knife 4.0 mm Xemax Surgical CK40
Drill: Z500 Brushless Micromotor NSK NSKZ500
FBS Gicbo 10437-077
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24" Fisher Scientific 14-206-62
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4" Fisher Scientific 22-415-469
Heating pad Kent Scientific DCT-20
Hyclone 199/EBSS medium GE  Life Sciences SH30253.01
Isothesia isoflurane Henry Schein  050033
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Paraffin film (Parafilm) Bemis PM996
PBS Gibco 10010-023
Pen-Strep Gibco 15140-122
PLGA scaffolds Proprietary Formulation
Poloxamer 188, 10% Sigma P5556-100ML
Polylined Sterile Field, 18" x 24" Busse Hospital Disposables 696 Cut a rectangular hole of the appropriate size
Polysucrose Solution: Histopaque 1119 Sigma 11191
Povidone Iodine Prep Solution Medline MDS093944H
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube Dechra Veterinary Products
RBC lysis buffer Sigma 11814389001
Webcol alcohol prep swabs Covidien 6818

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Schnelle Isolierung von BMPR-IB + Fettgewebe gewonnene Stromazellen für die Verwendung in einem Schädeldachdefektheilung Modell
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Marshall, C. D., Zielins, E. R., Brett, E. A., Blackshear, C. P., Hu, M. S., Leavitt, T., Barnes, L. A., Lorenz, H. P., Longaker, M. T., Wan, D. C. Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model. J. Vis. Exp. (120), e55120, doi:10.3791/55120 (2017).More

Marshall, C. D., Zielins, E. R., Brett, E. A., Blackshear, C. P., Hu, M. S., Leavitt, T., Barnes, L. A., Lorenz, H. P., Longaker, M. T., Wan, D. C. Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model. J. Vis. Exp. (120), e55120, doi:10.3791/55120 (2017).

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