Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

בידוד מהיר של BMPR-IB + השומן שמקורם בתאי סטרומה לשימוש במודל ריפוי פגם calvarial

doi: 10.3791/55120 Published: February 24, 2017

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פגמי עצם סרן כתוצאה מפגיעה, זיהום, או סרטן פולשני להיות השפעה משמעותית על ההתאוששות ואיכות החיים של מטופל. טכניקות קיימות למלא פגמים אלה עם עצם בריא ממקום אחר בגוף החולה עצמו, אך העברה זו נושאת תחלואה סיכון משלה לסיבוכי 1, 2, 3. יתר על כן, פגמים מסוימים הם כל כך גדולים או מורכבים כי עצם מתורם מספיק גדול אינו זמין כדי למלא את הפגם. פרוטזות הן אפשרות פוטנציאל למילוי פגמים גרמיים אבל אלה קשורים עם מספר חסרונות כולל זיהומים, כשל חומרה, ותגובת גוף זר 4.

מסיבות אלה יש עניין רב באפשרות של הנדסת תחליפי עצם ביולוגי באמצעות תאים של החולה עצמו 5. שומן שמקורם בתאי סטרומה (ASCs)יש פוטנציאל יישום זה כי הם בשפע זמינים ברקמת השומן של החולה עצמו והם הדגימו את היכולת לרפא פגמי עצם על ידי יצירת רקמת עצם חדשה 6, 7. ASCs הוא אוכלוסייה מגוונת של תאים וכמה מחקרים הראתה כי בחירה עבור סמנים פני תא מסוימים יכולה לייצר אוכלוסיות תאים עם פעילות osteogenic משופרת 8, 9. בחירת ASCs עם פוטנציאל osteogenic הגבוה ביותר תגדיל את הסבירות כי פיגום זורע עם תאים אלה יכול להתחדש פגם עצם גדול.

חלבון עצם המוךפו"גנטי שהולך (BMP) איתות היא קריטית להסדרת עצם בידול היווצרות 10 ואת סוג קולטן BMP IB (BMPR-IB) ידוע להיות חשוב עבור osteogenesis ב ASCs 11. לאחרונה, הראינו ביטוי של BMPR-IB יכול בדואר המשמש כדי לבחור עבור ASCs עם פעילות osteogenic משופרת 12. כאן אנו מדגימים פרוטוקול לבידוד של BMPR-IB להביע ASCs משומן אדם ואחריו assay פעילות osteogenic שלהם באמצעות מודל פגם in vivo calvarial.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הערה: דוגמאות התקבלו ממטופלים אשר נתנו הסכמה מדעת. כל הפרוטוקולים היו נבדקו ואושרו על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי המתאים אונ' סטנפורד. בעוד טיפול רקמות ותאי אדם, תמיד לדבוק 2 רמת בטיחות ביולוגית (BSL2) אמצעי זהירות, כפי שצוין על ידי המוסד שלך.

1. הכנת ריאגנטים

  1. הכן חיץ FACS: הוסף 10 FBS מ"ל, 5 מ"ל Poloxamer 188 ו -5 מ"ל עט סטרפטוקוקוס 500 פוספט שנאגרו סטרילי מ"ל סליין (PBS).
  2. הכן לעכל תערובת: הוסף 0.375 גרם סוג collagenase ג hemolyticum אבקת II ו -5 מ"ל Poloxamer 188 500 מ"ל סטרילי בינוני 199 / EBSS.
  3. הכן בינוני רגיל: הוסף 50 FBS מ"ל ו 5 מ"ל עט סטרפטוקוקוס 500 בינוני הנשר שונה של מ"ל Dulbecco.

קציר 2. ובידוד של ASCs

הערה: ודא כי אישורים מוסדיים נאותים נמצאים במקום לשימוש רקמה אנושית ואת לבידוד hתאי גזע אנושיים. השג בטן אנושית, אגף, או על ירך שומן תת עורי מתורם בריא עובר שאיבת שומן אלקטיבי. שמור את השומן מיכל יניקה פלסטיק.

  1. הוסף PBS סטרילי ביחס של 1: 1 עד השומן במכל פלסטיק המקורי. (אם יש 500 שומן מ"ל, להוסיף 500 מ"ל PBS). מערבבים על ידי תסיסה עדינה למשך 30 שניות. אפשר את השכבה המימית כדי ליישב לתחתית (איור 1) ולאחר מכן לשאוב ולזרוק את השכבה המימית עם טפטפת פלסטיק 10 מ"ל מצורף יניקה.
  2. למזוג את החלב לתוך מיכל פלסטיק גדול ומוסיף לעכל תערובת ביחס של 1: 1. סגור את המיכל ולנקות מבחוץ עם 70% אתנול. חותם את הכובע עם סרט פרפין.
  3. להתסיס מיכל זה ב שייקר מסלולית ב 180 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  4. לנטרל את מערכת העיכול על ידי הוספת בינוני רגיל ביחס של 1: 1. (אם יש 1,000 תערובת שומן מ"ל, להוסיף 1,000 מ"ל בינוני סטנדרטי).
  5. פזר את התערובת באופן שווה לתוך מספר זוגי של 250 מ"ל פלסטיק צינורות צנטריפוגה חרוטי ו צנטריפוגות את התערובת על XG 300 במשך 20 דקות ב 4 ° C.
  6. לשאוב את supernatant להיות זהיר כדי להשאיר את הכדור פגע. כדורי Resuspend ב 5 בינוני תקן מ"ל לכל צינור חרוטי.
  7. סנן את ההשעיה דרך מסנן 100 מיקרון לתוך צינור צנטריפוגות חרוטי אחד 50 מ"ל. ואז, צנטריפוגה XG ב 300 במשך 15 דקות ב 4 ° C.
  8. לשאוב supernatant ו resuspend גלולה במאגר תמוגה טמפרטורה 5 מ"ל חדר RBC. אפשר לתערובת לשבת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ואז צנטריפוגות ב XG 300 במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  9. לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 15 בינוני תקן מ"ל. שוב לסנן דרך פילטר 100 מיקרון לתוך צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר חרוטים.
  10. בתוך חרוטי 50 מיליליטר חדש, להוסיף 15 מיליליטר פתרון polysucrose מיועד הפרדה מבוססת צפיפות (ראה רשימה של ריאגנטים). ואז, מחזיקה את הצינור בזווית של 45 °, בזהירות פיפטה את התאים על הצד שלהצינורית כך השעית התא בעדינות שכבות על גבי פתרון polysucrose (איור 2).
    הערה: חשוב תאי פיפטה על פני השטח של הפתרון. אל תוסיף פתרון polysucrose כדי השעיה של תאים כמו זו תיצור תערובת בלתי הפיכה. באופן דומה, לא פיפטה את התאים לתוך במרכז הפתרון polysucrose.
  11. צנטריפוגה את התערובת על XG 300 במשך 10 דקות ב RT. השתמש בהאצה נמוכה (2 - 3 מתוך 10) וקבע את פונקצית הבלם של צנטריפוגות לאפס עבור שלב זה.
    הערה: שלוש שכבות תהיינה גלויות: ברור על התחתונה, מעונן באמצע, וסלמון בצבע על החלק העליון. השכבה האמצעית מכילה את התאים של עניין.
  12. בעזרת פיפטה 10 מ"ל להסיר בזהירות את השכבה האמצעית ולהעביר צינור חרוטי חדש 50 מ"ל.
    הערה: עדיפה לחלוטין להעביר את השכבה האמצעית ובתהליך לקחת כמה שכבות העליונות ותחתונות מאשר לשכוח מכמה השכבה האמצעית.
  13. <li> ספירת התאים באמצעות hemocytometer ולקבוע מספר תא חי כולל.
    הערה: אנו משתמשים בדרך כלל כחול trypan הוסיף לתערובת תא לריכוז סופי של 0.8% כדי לסייע בספירת התאים. תאי חיים בת קיימא לא תופסים את הצבע הכחול ויופיעו לבן.

3. FACS מיון עבור תאים חיוביים BMPR-IB והכנה של פיגומים ניידים המכיל

  1. צנטריפוגה ההשעיה התא XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. Resuspend תאי חיץ FACS בריכוז של 1 מיליון תאים לכל 100 μL (מבוססים על ספירת התאים נעשתה בשלב 2.13).
  2. העבר לפחות 10 מיליון תאים לצינור צנטריפוגות פלסטיק שכותרתו "BMPR-IB." בנפרד, להעביר ממיליון תאים 100 μL חיץ FACS לצינור צנטריפוגות פלסטיק נפרד שכותרתו "מחולל." הוסף 1 מ"ל FACS חיץ אל הצינור "בלא כתם". שמור את שארית התאים חיץ FACS על הקרח בעוד FACS מיון החלק של experiment נעשה. תווית תאים אלה "לא ממוינים." השתמש בו שולט מאוחר יותר בניסוי.
  3. הוספת כמות מתאימה של נוגדן אנטי אנושי BMPR-IB פלורסנט אל הצינור "BMPR-IB" על פי הוראות היצרן. פיפטה את התערובת מעלה מטה בעדינות כדי לפזר את הנוגדן.
    הערה: אנו משתמשים נוגדן APC מצומדות אדם BMPR-IB / ALK-6 ב דילול 1:10 (ראה רשימה של ריאגנטים לפרטים נוספים). עם זאת, נוגדנים מיצרנים שונים יהיו ריכוזים שונים מומלצים.
  4. מכסים את דלי קרח באופן שמונע את האור. אפשר תערובת תא / הנוגדן לשבת במשך 30 דקות (או על פי הוראות יצרן הנוגדנים).
    הערה: אם הנוגדן אנטי BMPR-IB בא בתור נוגדן unconjugated עיקרי הדורש נוגדנים משני, לבצע צעד מכתים נפרד על קרח עם נוגדנים משני על פי הוראות היצרן.
  5. צנטריפוגה שני צינורות בXG 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C. לשאוב supernatant, נזהר שלא לשאוב את הכדור. Resuspend התאים pelleted ב חיץ 1 מ"ל FACS. שוב בצנטריפוגה צינורות ב XG 300 במשך 5 דקות. בזהירות לשאוב supernatant ו resuspend התאים במאגר FACS לריכוז של 1 מיליון תאים לכל 1 מ"ל.
  6. סנן את תאי "BMPR-IB," "בלא כתם," ו "לא ממוינים" דרך 40 מיקרון מסננות תא לתוך צינורות FACS הזכוכית חדשים שכותרתו. יש לשטוף את המסננים עם 500 חיץ μL FACS על מנת להבטיח כי התאים אינם נשאר מאחור במסנן. גם להוסיף 2 מ"ל בינוני תקן לשני צינורות פלסטיק צנטריפוגות נפרד שכותרתו "BMPR-IB-חיובי" ו "BMPR-IB-שלילי." השתמש בשני אלה כדי לאסוף את התאים המסודרים במכונת FACS.
  7. על מכונת FACS, להשתמש בתאים בלא הכתם להגדיר שער שלילי על סמן פלואורסצנטי.
  8. באמצעות זרבובית 100 מיקרון, מעין BMPR-IB תאים חיוביים ושליליים לתוך צינורות בהתאמה containing בינוני סטנדרטי. שמור צינורות אלה מקוררים על 4 מעלות צלזיוס במהלך מעין אם מכשיר FACS יש את היכולת הזו.
    הערה: אנא עיין במאמר יופיטר 13 על ידי שרון et al. עבור פרוטוקול מצוין מיון FACS.
  9. באמצעות hemocytometer, לספור את התאים בצינור אחד. בצנטריפוגה צינורות "BMPR-IB-חיובי", "BMPR-IB-שלילית," ו "לא ממוינים" ב XG 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C ו לשאוב supernatant, נזהר שלא להפריע תא גלול. ואז resuspend התאים במדיום תקן לריכוז של 1 מיליון תאים לכל 250 μL.
  10. השג 4 מראש לחתוך מ"מ PLGA (פולי [לקטית-שיתוף גליקולית וחומצה]) פיגומים מצופה hydroxyapatite. מניחים כל פיגום לתוך באר של צלחת 24 באר. מכסה כל פיגום עם 50 μL של השעית תא מאחד משלוש הקבוצות (כלומר על, 200,000 תאים.): לא ממוין, BMPR-IB-חיובי, BMPR-IB-שלילי (איור 3).
    הערה: אנאעיין במאמר יופיטר 14 על ידי Lo et al. לפרטים על בניית פיגומים PLGA.
  11. חלקית למלא את הבארות ריקות סביב עם מדיום סטנדרטי (כדי למנוע התייבשות של הפיגומים), מכסות את הצלחת עם המכסה שלה, דגירת חממת תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

4. יצירת פגמי calvarial ויישום של פיגום ACS המכיל

הערה: ודא כי אישורים מוסדיים נאותים נמצאים במקום ליצירת פגמי calvarial בעכברים חיים. פרוטוקול זה אושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת סטנפורד ועדת שימוש.

  1. להרדים עכבר בעירום CD-1 או באמצעות גז isoflurane בשאיפה או קוקטייל הרדמה ארוך טווח מוזרק.
    1. כדי להשתמש בגז לבד, במקום את העכבר לתוך תא הרדמה ולהתחיל את זרימת החמצן ב 2 - 3 ליטר / דקה בריכוז 2% של isoflurane. לאחר העכבר הוא fully מחוסר הכרה, למקם אותו נוטה על שמיכה הסירקולציה המחודשת מים חמים עם כרית absorbant ומניחים חוטמו לתוך חרטומו הרדמה עם ריכוז זהה של חמצן isoflurane. בזהירות לפקח על קצב הנשימה ולהתאים את ריכוז isoflurane לפי הצורך.
    2. כדי להשתמש קוקטייל ההרדמה ארוך טווח מוזרק, להרדים את העכבר בתא הרדמה כמתואר לעיל ולאחר מכן להזריק קוקטייל ההרדמה. הסר את העכבר מאולם ההרדמה להתבונן בהתנהגות שלה.
      הערה: העכבר עשוי לצוץ בקצרה מהרדמה אבל בתוך כמה דקות צריכה להיות שוב בהרדמה מלאה תחת השפעת ההרדמה המוזרקת. מעבירים את העכבר על שמיכה הסירקולציה המחודשת מים חמים מכוסה עם כרית absorbant.
      הערה: עבור קוקטייל ההרדמה, אנו ממליצים על תערובת המכילה קטמין 10 מ"ג / מ"ל ​​ו xylazine 1 מ"ג / מ"ל ​​ב מלח רגיל, נמסר intraperitoneally. המינון הסטנדרטי של תערובת זו הוא300 μL עבור עכבר 30 גרם, אשר משווה ל קטמין 100 מ"ג / ק"ג ו xylazine 10 מ"ג / ק"ג. עיין בסעיף הדיון לפרטים נוספים לגבי ההרדמה בזריקות.
    3. השתמש תמרון קמצוץ הבוהן כדי לקבוע את עומק ההרדמה. עכבר הרדים כראוי לא חוזר בי הכפה שלו כאשר הוא צבט קלות על ידי המנתח.
    4. החל העין משחה כדי למנוע התייבשות של הקרנית.
    5. נהל 1 מ"ג / תת עורי עצירות SR ק"ג.
      הערה: מתן שיכוך כאבים לפני תוצאות הניתוח קל בכאב מעולה.
    6. במהלך ההליך כולו, לפקח על קצב הנשימה של העכבר.
      הערה: עכבר הרדים כראוי תחת isoflurane צריכה קצב נשימה של 50 - 100 נשימות / דקה. שיעור נשימה מוגבר עולה כי ההרדמה בהירה מדי, בעוד קצב נשימת ירד עשוי להצביע על כך ההרדמה עמוקה מדי.
  2. הכן את העור של בהיבט הגבי של הגולגולת עם-iod povidoneine פתרון ואחריו 70% אתנול שלוש פעמים. וילון בסדינים מעוקרים, עוזב את האתר כירורגית החשוף.
    הערה: יש להשתמש בכפפות ניתוח סטרילי ולתחזק טכניקה סטרילית במהלך ההליך. רק לגעת משטחים וחפצים סטרילי כמו וילון סטרילית המכשירים autoclaved. יש לך עוזר להתאים תאורה, מנות תפר פתוחות, וכו '
  3. באמצעות אזמל 15-להב, לעשות חתך קו אמצע sagittal המשתרע על רוב הגולגולת הגבה. בעזרת מלקחיים בסדר שיניים, לחזור בו העור בצד ימין של החתך לחשוף את העצם הקודקודית הימנית.
  4. בעזרת מקדח עם מקדח מקדחת autoclaved 4 מ"מ מצופה יהלומים, לקדוח פגם דרך עצם הקודקוד. אל תפתח את הפגם בעבר העצם לתוך שכבת דורה מאטר. (איור 4)
  5. מניח פיגום לתוך הפגם, ולאחר מכן לסגור את החתך בעור עם ריצת תפר ניילון.
  6. צג את העכבר ולספק טיפול לאחר ניתוח סטנדרטיccording הנחיות מוסדיות.
    1. שמור את העכבר על מגבת נייר נקייה בתוך כלוב נקי בזמן שהוא מתאושש. מחצית אחת של הכלוב צריך להיות ממוקמת מעל שמיכת הסירקולציה המחודשת מים חמה והעכבר בתחילה צריך להיות ממוקם המחצית.
    2. אל תשאירו עכבר ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי ambulate. אל תחזור עכבר שעבר ניתוח כלוב עם עכברים אחרים עד שהוא התאושש לחלוטין.
  7. חזור על השלבים לעיל עם עכבר חדש עבור כל פיגום כי הוא להיבדק. לעקר מכשירי ניתוח בין ניתוחים באמצעות מעקר חרוז חם או שיטה מתאימה אחרת.
  8. זמן קצר לאחר ההליך, ולאחר מכן ב 2, 4, 6, ו -8 שבועות, להשתמש סריקת CT מיקרו לנתח את קצב סגירת פגם calvarial.
    הערה: ראה מאמרו של לוי ואח '. 6 לתיאור בדיקת CT מיקרו פגמים calvarial.
  9. כאשר הניסוי הוא משליםטה, להרדים את העכברים ידי הצבת לתוך תא המתת חסד נקי החל זרם של גז פחמן דו חמצני לתוך התא בקצב של 2 ליטר / דקה. אחרי הנשימות חדלו לחלוטין (אחרי בערך 10 דקות) לבצע פריקה צוואר הרחם כדי לאשר המתת חסד.
  10. לחלופין, לאחר הניסוי הושלם, חתך שימוש והכתים היסטולוגית להעריך היווצרות עצם בתוך הפגם.
    הערה: ראה מאמרו של מקארדל et al. 12 לפרטים הכנת עצם דגימות לצורך היסטולוגיה. לקבלת סקירה של שיטות היסטולוגית ו מכתים, ראה מדריך היסטולוגית כגון ידני לפתולוגיה כירורגי 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

CT מיקרו סריקה נעשה ביום הניתוח יציג את פגם הגולגולת בבירור. בשלב זה לא יהיה ingrowth לתוך פגם 4 מ"מ. סריקות אחריו מתקבלות לאורך הזמן לכמת את גודל הפגם לאורך זמן בהשוואה לקו הבסיס. פגמים זורעים עם BMPR-IB + תאים צריכים להפגין סגר מהיר יותר של הפגם בהשוואת BMPR-IB- ותאי לא ממוין (איור 5). בנוסף, החלק של הגולגולת המכילה את הפגם ניתן decalcified ומעובד היסטולוגיה באמצעות שיטות סטנדרטיות 12. סעיפים מוכתם בכתם pentachrome של Movat יגלה התחדשות העצם גדולה יותר הפגם שטופלו בתאים BMPR-IB לעומת אוכלוסיות תאים אחרים (איור 6).

איור 1
איור 1: Lipoaspirate לאחר PBS לשטוף. strong> מיכל של lipoaspirate לאחר PBS הוא הוסיף את התערובת מותר להתיישב. שכבת הרקמה העליונה היא רקמת השומן אשר מארחת ASCs, ואילו השכבה התחתונה היא השכבה המימית, בעיקר מורכב מלוח ודם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: מיקום השעית תא על פתרון Polysucrose. (א) השעית התא חייב להיות pipetted בעדינות מאוד על הצד של הצינור, שמאפשר לו שכבה על גבי פתרון polysucrose. (ב) זהו המראה הנכון של שכבת השעית תא על גבי polysucrose לפני צנטריפוגה."> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: זריעה של תאים על הפיגום. (א) על פני השטח הסטרילי של אחד טובה של צלחת תרבית תאי 24 גם, לטעון פיגום יבש עם כ 50 μL של השעית תא. (ב) דגירת הפיגום בתוך חממת תרבית תאים עבור 30 דקות, כדי לאפשר הידבקות תא. הערה: באיור, צלחת של 10 סנטימטרים משמשת למטרות הדגמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: בריאת פגם calvarial. פגם calvarial (החיצים) גלוי בתוךחתך בעור פתוח. הערת כלי הדם ללא פגע dural (ראשי החץ), המציין כי הקידוח לא הפר את הדורה. סרגל קנה מידה, 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: ריפוי של פגמים calvarial קריטיים בגודל עם תת-אוכלוסיות ASC שונים. (א) תלת ממדי שחזורים CT מיקרו בוצעו עבור פגמים calvarial מחדש זיווג עם ממוינת, BMPR-IB (+), או BMPR-IB (-) ASCs. (ב) כימות של ריפוי אחרי 8 שבועות הפגינו משמעותי התחדשות העצם גדול עם BMPR-IB (+) ASCs (92%) לעומת ממוינים BMPR-IB (-) ASCs (58% ו -46%, בהתאמה, ** p < 0.01). הבדלים משמעותיים בריפוי נראו גם ב -2 אנחנוEKS (** p <0.01), 4 שבועות (*** p <0.001), ו -6 שבועות (*** p <0.001). מיקרו-CT, טומוגרפיה-מחושב מיקרו. הודפס מחדש באישור מקארדל et al. 12. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: מכתים היסטולוגית של העצם להתחדש. (א) pentachrome מכתים של Movat של העצם להתחדש ב ליקויים לתקן עם ממוינת, BMPR-IB (+), או BMPR-IB (-) ASCs בהגדלה 5X באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. הערת היווצרות עצם חזקה יותר BMPR-IB (+) קבוצה לעומת BMPR-IB (-) קבוצה. הקו המקווקו מייצג את היקף השטח פגם. האזור בתוך מלבן שחור מוצג על magnific גבוהation (B) 10X ו- (ג) 40X מיקרוסקופ שדה בהיר של אזור פגם משתמש. הודפס מחדש באישור מקארדל et al. 12. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול

בזמן הקציר של ASCs, השלב הקריטי הוא אכול נאות של שומן עם collagenase. עיכול לקוי יגרום בתשואה נמוכה של ASCs. במהלך FACS מיון של תאי BMPR-IB +, חשוב להגדיר את השער בזהירות חיובית. הגדרת שערים מדי רופפת עלולה לגרום אוכלוסיות מיון שאינם טהורים. במהלך היצירה של פגם calvarial, זה קריטי כדי לתחקר את הפגם דרך העצם של הגולגולת אלא לא להתקדם לתוך דורה מאטר. זה יגרום לדימום וחשיפה פזרני של המוח, אשר יחייב המתת חסד של החיה.

שינויים ופתרון בעיות

לגבי הרדמה לניתוח פגם calvarial, במעבדה שלנו מעדיף להשתמש isoflurane בשאיפה, אך אפשרות נוספת היא intraperitoneally להזריק תערובת המכילה ריכוז סופי של קטמין 10 מ"ג / מ"ל ​​ו מ"ג xylazine 1 / מ"ל ​​ב sa נורמליקַו. המינון הסטנדרטי של תערובת זו הוא 300 μL עבור עכבר 30 גרם. זה מספק כ -30 דקות של הרדמה אמינה שאינו דורש בעכבר כדי להיות חרטומו isoflurane במהלך ניתוח. חסרון של שימוש הרדמה מוזרקת הוא שזה לא ניתן להקטין את המינון לאחר ההזרקה ניתנה. לעומת זאת, isoflurane בשאיפה יכול בקלות להיות טיטרציה כלפי מעלה או מטה בזמן אמת.

בעת הוספת תא השעיה אל הגרדום, חוקרים עשויים לגלות כי נפח הנוזל הוא קטן מדי יתאדו חלקית ב -30 דקות של דגירה. אידוי יכול לגרום מוות של תאים, אשר הוא מתערב מזיקה במיוחד בניסויי ריפוי עצם. כדי להילחם בכך, טען את הפיגום בתוך באר של צלחת 24 היטב. מלא את הבארות הסמוכות עם מדיום רגיל. פעולה זו תיצור מיקרו-סביבה humidified אשר מסייע לשמור על פיגום טעון מהתייבשות.

מכתים היסטולוגית של העצם הוא מראשdicated על decalcification נכונה ויסודית של calvarium לפני הטבעה ו חתך. מקובל כי גולגולות בגילים שונים דורשות משכים שונים של decalcification, נעשה באופן מסורתי פתרון EDTA

מגבלות של הטכניקה

פרוטוקול זה מנצל פגם 4 מ"מ calvarial כדי להעריך את היכולת של אוכלוסייה של תאים כדי לשפר סגירת הפגם. דגם זה עשוי שלא לדמות את הריפוי המתרחשת בסביבה מורכבת יותר, כגון שברים בעצמות ארוכות או כריתה של הגידול. מסיבה זו, במודלים של בעלי חיים חלופי ייתכן שיהיה צורך להשתמש כדי להבין את התרומה של ASCs לריפוי עצם ההגדרות האלה.

משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות

באמצעות זרימת cytometry לבודד אוכלוסיות ASC ספציפיות היא טכניקה מבטיחה לשפר את הריפוי והתחדשות בהקשר של רקמות מרובות במודלים מושבעים, כגון אנגיוגנזה, adipogenesis, ו osteogenesis. השירות של תאי פרו-osteogenic הוא חקר במחקר זה, מראה השפעה עמוקה עם התאים שנבחרו באופן חיובי עבור BMPR-IB בריפוי פגם calvarial.

פרוטוקולים מראש ל הבידוד של ASC לערב culturing התאים במשך כמה ימים על צלחות תרבית תאים 16. עם זאת, תאים עשויים לחוות להיסחף פנוטיפי מהותית תוך בתרבות. מסיבה זו, אנו משתמשים בפרוטוקול בידוד ASC המאפשר בידוד מהיר של תאים אלה, ואחריו טיהור תת-אוכלוסייה נוספת באמצעות FACS. התהליך כולו מתבצע פחות מיממה, למזער את ההשפעות של סמן פני התא או להיסחף פנוטיפי.

יישומים וכיוונים לעתיד

הראינו כי ASCs מאוד להביע BMPR-IB להפגין יכולת גדולה יותר כדי לשפר ריפוי פגם עצם רגנרטיבית לעומת ASCs אחרים. מנגנוני underlying תופעה זו אינם ידועים. לדוגמה, אין זה ברור אם התאים עצמם להבדיל ישירות לתאים יוצרי עצם, או אם הם מייצרים גורמים המעודדים תאים אחרים לעשות זאת. מחקרים עתידיים יצטרכו להתבצע כדי לענות על שאלות אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 micron cell strainer Falcon 352360
15 blade scalpel Miltex 4-515
24 well plate Corning 3524
40 micron cell strainer Falcon 352340
50 mL conical centrifuge tubes Falcon 352098
6-0 Ethilon nylon suture, 18", P-3 needle,  Ethicon 1698G
Anti-BMPR-IB primary antibody R&D systems FAB5051A
BioGel PI surgical gloves Mölnlycke Health Care ALA42675Z
Buprenorphine SR ZooPharm
Castro-Viejo needle driver Fine Science Tools 12565-14
CD1 nude mouse Charles River 086
Collagenase Type II powder Gibco 17101-015
DMEM medium Gibco 10564-011
Drill: Circular knife 4.0 mm Xemax Surgical CK40
Drill: Z500 Brushless Micromotor NSK NSKZ500
FBS Gicbo 10437-077
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24" Fisher Scientific 14-206-62
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4" Fisher Scientific 22-415-469
Heating pad Kent Scientific DCT-20
Hyclone 199/EBSS medium GE  Life Sciences SH30253.01
Isothesia isoflurane Henry Schein  050033
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Paraffin film (Parafilm) Bemis PM996
PBS Gibco 10010-023
Pen-Strep Gibco 15140-122
PLGA scaffolds Proprietary Formulation
Poloxamer 188, 10% Sigma P5556-100ML
Polylined Sterile Field, 18" x 24" Busse Hospital Disposables 696 Cut a rectangular hole of the appropriate size
Polysucrose Solution: Histopaque 1119 Sigma 11191
Povidone Iodine Prep Solution Medline MDS093944H
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube Dechra Veterinary Products
RBC lysis buffer Sigma 11814389001
Webcol alcohol prep swabs Covidien 6818

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28, (2), 134-139 (2003).
  2. Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: an update. Injury. 36, S20-S27 (2005).
  3. Laurencin, C., Khan, Y., El-Amin, S. F. Bone graft substitutes. Expert Rev Med Devices. 3, (1), 49-57 (2006).
  4. Walmsley, G. G., et al. Nanotechnology in bone tissue engineering. Nanomedicine. 11, (5), 1253-1263 (2015).
  5. Chapekar, M. S. Tissue engineering: challenges and opportunities. J Biomed Mater Res. 53, (6), 617-620 (2000).
  6. Levi, B., et al. Human adipose derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defects. PLoS One. 5, (6), e11177 (2010).
  7. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100, (9), 1249-1260 (2007).
  8. Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. J Biol Chem. 286, (45), 39497-39509 (2011).
  9. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1)-positive selection enhances osteogenic capacity of human adipose-derived stromal cells. Tissue Eng Part A. 19, (7-8), 989-997 (2013).
  10. Wozney, J. M., et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science. 242, (4885), 1528-1534 (1988).
  11. Wan, D. C., et al. Osteogenic differentiation of mouse adipose-derived adult stromal cells requires retinoic acid and bone morphogenetic protein receptor type IB signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (33), 12335-12340 (2006).
  12. McArdle, A., et al. Positive selection for bone morphogenetic protein receptor type-IB promotes differentiation and specification of human adipose-derived stromal cells toward an osteogenic lineage. Tissue Eng Part A. 20, (21-22), 3031-3040 (2014).
  13. Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (71), e4425 (2013).
  14. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. J Vis Exp. (68), (2012).
  15. Lester, S. C. Manual of surgical pathology. Saunders/Elsevier. (2010).
  16. Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45, (2), 115-120 (2008).
בידוד מהיר של BMPR-IB + השומן שמקורם בתאי סטרומה לשימוש במודל ריפוי פגם calvarial
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marshall, C. D., Zielins, E. R., Brett, E. A., Blackshear, C. P., Hu, M. S., Leavitt, T., Barnes, L. A., Lorenz, H. P., Longaker, M. T., Wan, D. C. Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model. J. Vis. Exp. (120), e55120, doi:10.3791/55120 (2017).More

Marshall, C. D., Zielins, E. R., Brett, E. A., Blackshear, C. P., Hu, M. S., Leavitt, T., Barnes, L. A., Lorenz, H. P., Longaker, M. T., Wan, D. C. Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model. J. Vis. Exp. (120), e55120, doi:10.3791/55120 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter