Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Snabb Isolering av BMPR-IB + Fett-stromala celler för användning i en calvarial defekt Healing Modell

doi: 10.3791/55120 Published: February 24, 2017

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Stora bendefekter till följd av skada, infektion eller invasiv cancer har en betydande inverkan på patientens tillfrisknande och livskvalitet. Tekniker finns för att fylla dessa brister med friskt ben från andra ställen i patientens egen kropp, men denna överföring bär sin egen sjuklighet och risk för komplikationer 1, 2, 3. Dessutom kan vissa defekter är så stora eller komplicerade att tillräcklig donatorben inte är tillgänglig för att fylla defekten. Protesanordningar är en potentiell alternativ för att fylla bendefekter, men dessa är förknippade med flera nackdelar inklusive infektionsrisk, hårdvarufel, och främmande kropp reaktion 4.

Av dessa skäl finns det ett stort intresse för möjligheten att konstruera biologiska bensubstitut med hjälp av en patients egna celler 5. Adipos-härledda stromal celler (ASCs)har potential för denna applikation eftersom de finns i riklig mängd i patientens egen fettvävnad och de har visat förmåga att läka bendefekter genom att generera ny benvävnad 6, 7. ASC: er är en skiftande population av celler och flera studier har visat att selektera för specifika cellytmarkörer kan producera cellpopulationer med förbättrad osteogen aktivitet 8, 9. Välja ASC: er med den högsta osteogena potentialen skulle öka sannolikheten för att en byggnadsställning ympades med dessa celler kan regenerera en stor bendefekt.

Benmorfogenetiskt protein (BMP) signalering är kritisk för reglering bendifferentiering och bildning 10 och BMP-receptor typ IB (BMPR-IB) är känt för att vara viktigt för osteogenes i ASC: er 11. Nyligen har vi visat att uttryck av BMPR-IB kan be används för att välja för DSKer med förbättrad osteogen aktivitet 12. Här visar vi ett protokoll för isolering av BMPR-IB-uttryck DSKer från mänskligt fett, följt av en analys av deras osteogen aktivitet med hjälp av ett in vivo calvarial fel modell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

OBS: Prover erhölls från patienter som gav informerat samtycke. Alla protokoll granskades och godkändes av lämplig Stanford University Institutional Review Board. Vid hantering mänskliga vävnader och celler, alltid hålla sig till biosäkerhetsnivå 2 (BSL2) försiktighetsåtgärder, enligt uppgifterna från institutionen.

1. Beredning av reagenser

  1. Förbereda FACS-buffert: tillsätt 10 ml FBS, 5 ml Poloxamer 188 och 5 ml Pen-Strep till 500 ml steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
  2. Förbered smälta blandning: Lägg 0,375 g C. hemolyticum kollagenas typ II pulver och 5 ml Poloxamer 188 till 500 ml steril 199 / EBSS medel.
  3. Förbered standardmedium: Tillsätt 50 ml FBS och 5 ml Pen-Strep till 500 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium.

2. Skörd och isolering av ASC: er

OBS: Se till att det finns tillräckliga institutionella godkännanden finns på plats för att använda mänskliga vävnader och för att isolera hUman stamceller. Skaffa mänsklig buken, flanken eller lår underhudsfett från en frisk donator genomgår elektiv fettsugning. Hålla fettet i en plast sug kapsel.

  1. Tillsätt steril PBS i en 1: 1-förhållande till fettet i den ursprungliga plastdunk. (Om det finns 500 ml fett, tillsätt 500 ml PBS). Blanda genom försiktig omrörning under 30 sekunder. Tillåt det vattenhaltiga skiktet för att sedimentera till botten (fig 1) och sedan aspirera och kassera vattenskiktet med en 10 ml plastpipett fäst vid sugning.
  2. Dekan fettet i en stor plastbehållare och tillsätt smälta blandningen i en 1: 1-förhållande. Stäng behållaren och rengöra utsidan med 70% etanol. Täta locket med paraffin film.
  3. Agitera denna behållare i en orbital skakanordning vid 180 rpm vid 37 ° C under 30 min.
  4. Neutralisera digestion genom tillsats av standard-medium i en 1: 1-förhållande. (Om det finns 1000 ml fettblandning, tillsätt 1000 mL standardmedium).
  5. Fördela blandningen lika i ett jämnt antal 250 mL plast koniska centrifugrör och centrifugera blandningen vid 300 xg under 20 minuter vid 4 ° C.
  6. Aspirera supernatanten och vara noga med att lämna pellets intakt. Resuspendera pellets i 5 ml standardmedium för varje koniska rör.
  7. Filtrera suspensionen genom ett 100 ^ m filter in i ett 50 ml koniskt centrifugrör. Då, centrifugera vid 300 xg under 15 min vid 4 ° C.
  8. Aspirera supernatanten och suspendera pelleten i 5 ml rumstemperatur RBC lyseringsbuffert. Låt blandningen stå under 5 min vid rumstemperatur sedan centrifugera vid 300 xg under 15 min vid rumstemperatur (RT).
  9. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 15 ml standardmedium. Återigen filtrera genom ett 100 mikron filter in i en 50 ml koniskt centrifugrör.
  10. I en ny 50 ml koniska, tillsätt 15 ml polysackaros lösning utformad för densitetsbaserad separation (se lista av reagens). Sedan, som håller röret vid en 45 ° vinkel, noggrant pipettera cellerna på sidan avröret så att cellsuspensionen försiktigt skikt på toppen av polysackaros lösning (Figur 2).
    OBS: Det är viktigt för att pipettera celler på ytan av lösningen. Inte lägga polysackaros lösning till en suspension av celler, eftersom detta kommer att skapa en oåterkallelig blandning. På samma sätt, inte pipett cellerna i mitten av polysackaros lösning.
  11. Centrifugera denna blandning vid 300 xg under 10 min vid RT. Använd låg acceleration (2-3 av 10) och ställ in bromsfunktion centrifugen till noll för det här steget.
    OBS: Tre lager kommer att synas: klar på botten, molnigt på mitten, och lax-färgat på toppen. Det mellersta skiktet innehåller cellerna av intresse.
  12. Med hjälp av en 10 ml pipett försiktigt bort mellanskiktet och förflyttas till en ny 50 ml koniska rör.
    OBS: Det är bättre att helt överföra mellanskiktet och i processen tar några av de övre och undre skikt än att lämna bakom några av mellanskiktet.
  13. <li> Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och bestämma total levande cell nummer.
    OBS: Vi använder typiskt trypanblått sattes till cellblandningen till en slutlig koncentration av 0,8% för att hjälpa till att räkna celler. Livskraftiga levande celler kommer inte att ta upp den blå färgen och visas vit.

3. FACS sortering för BMPR-IB positiva celler och framställning av cellinnehållande Ställningar

  1. Centrifugera cellsuspensionen vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Resuspendera cellerna i FACS-buffert vid en koncentration av 1 miljon celler per 100 | il (baserat på antalet celler som göras i steg 2,13).
  2. Överför minst 10 miljoner celler till en plast centrifugrör märkt "BMPR-IB." Separat, överföra en miljon celler i 100 mikroliter FACS buffert till en separat centrifugrör av plast märkt "Obehandlat." Tillsätt 1 ml FACS-buffert till "Obehandlat" rör. Hålla resten av cellerna i FACS-buffert på is medan FACS sortering parti av experiment görs. Märk dessa celler "Osorterade." Använda dessa som kontroller senare i experimentet.
  3. Tillsätta en lämplig mängd av en fluorescerande anti-human BMPR-IB antikropp till "BMPR-IB" rör enligt tillverkarens instruktioner. Pipettera blandningen upp och ned försiktigt för att distribuera antikroppen.
    OBS: Vi använder en mänsklig BMPR-IB / ALK-6 APC-antikropp vid en 1:10 utspädning (se lista av reagens för mer information). Dock kommer antikroppar från olika tillverkare har olika rekommenderade koncentrationer.
  4. Täck ishink på ett sätt som håller ut ljus. Låt blandningen cell / antikropp för att sitta i 30 minuter (eller i enlighet med instruktionerna av antikroppen tillverkaren).
    OBS: Om anti-BMPR-IB antikropp kommer som en primär okonjugerad antikropp som kräver en sekundär antikropp, utföra en separat färgning steg på is med den sekundära antikroppen enligt tillverkarens anvisningar.
  5. Centrifugera båda rören vid300 xg under 5 min vid 4 ° C. Aspirera supernatanten, försiktigt så att inte aspirera pelleten. Resuspendera pelleterade cellerna i 1 ml FACS-buffert. Centrifugera igen rören vid 300 xg under 5 min. Noggrant aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i FACS-buffert till en koncentration av 1 miljon celler per 1 ml.
  6. Filtrera "BMPR-IB", "Obehandlat" och "Osorterade" celler genom 40 mikron cell silar till nya märkta glas FACS rör. Skölj filtren med 500 mikroliter FACS buffert för att säkerställa att cellerna inte kvar i filtret. Också lägga till 2 ml standardmedium till två separata plast centrifugrör märkta "BMPR-IB-positiv" och "BMPR-IB-negativa." Använd dessa två för att samla in de sorterade cellerna i FACS-maskinen.
  7. På FACS maskinen använder ofärgade celler för att definiera en negativ grind för den fluorescerande markören.
  8. Med hjälp av en 100 mikron munstycke, sortera BMPR-IB positiva och negativa celler i respektive rör conlande standardmedium. Håll dessa rör kylda vid 4 ° C under sorteringen om FACS maskinen har denna förmåga.
    OBS: Se till JUPITER artikeln 13 av Sharon et al. för en utmärkt protokoll för FACS-sortering.
  9. Med användning av en hemocytometer, räkna cellerna i varje rör. Centrifugera "BMPR-IB-positiv", "BMPR-IB-negativa" och "Osorterade" rören vid 300 xg under 5 minuter vid 4 ° C och aspirera supernatanten, försiktigt så att inte störa cellpelleten. resuspendera sedan cellerna i standardmedium till en koncentration av 1 miljon celler per 250 | il.
  10. Erhålla förskurna 4 mm PLGA (poly [mjölksyra-sam-glykolsyra]) byggnadsställningar belagda med hydroxiapatit. Placera varje byggnadsställning i en brunn på en 24-brunnar. Täck varje byggnadsställning med 50 mikroliter av cellsuspensionen från en av de tre grupperna (i .e, 200.000 celler.): Osorterat, BMPR-IB-positiva, och BMPR-IB-negativa (Figur 3).
    OBS: Vänligenhänvisar till JUPITER artikeln 14 av Lo et al. för mer information om byggandet av PLGA ställningar.
  11. Delvis fylla de omgivande tomma brunnar med standardmedium (för att förhindra uttorkning av de ställningar), täcker plattan med locket, och inkubera i en cellkultur inkubator vid 37 ° C under 30 min.

4. Skapande av calvarial Defekter och tillämpning av ACS-innehållande Scaffold

OBS: Se till att det finns tillräckliga institutionella godkännanden finns på plats för att skapa calvarial defekter i levande möss. Detta protokoll har godkänts av Stanford University Institutional Animal Care och användning kommittén.

  1. Söva en CD-1 nakna möss med antingen inhalerat isofluran gas eller en injicerad långverkande bedövningsmedel cocktail.
    1. Med enbart använda gas, placera musen i en anestesi kammare och starta flödet av syre vid 2-3 L / min med en koncentration på 2% av isofluran. När musen är fUlly medvetslös, placera den benägen på ett varmt vatten cirkulerande filt med en absorberande dyna och placera sin nos i en anestesi noskon med samma koncentration av syre och isofluran. Noggrant övervaka andningsfrekvens och justera koncentrationen av isofluran som behövs.
    2. Att använda en injicerad långverkande anestetikum cocktail, söva musen i en anestesikammare såsom beskrivits ovan och sedan injicera bedövningsmedel cocktail. Ta bort musen från anestesi kammaren och observera dess beteende.
      OBS: Musen kan kort dyka upp från anestesi men inom flera minuter bör återigen helt bedövad under inverkan av den injicerade bedövningsmedel. Överför musen till en varm vatten cirkulerande filt täckt med ett absorberande dyna.
      OBS: För ett bedövningsmedel cocktail, rekommenderar vi en blandning innehållande ketamin 10 mg / ml och xylazin 1 mg / ml i normal saltlösning, levereras intraperitonealt. Standarddosen i denna sammansättning är300 mikroliter för en 30 g mus, vilket är lika med ketamin 100 mg / kg och xylazin 10 mg / kg. Se diskussionsavsnittet för mer information om den injicerbara bedövningsmedel.
    3. Använd en tå nypa manöver för att bestämma djupet av anestesi. En tillräckligt sövda musen dras inte in sin tass när det är lätt kläms av kirurgen.
    4. Applicera ögonsalva för att förhindra uttorkning av hornhinnan.
    5. Administrera 1 mg / kg buprenorfin SR subkutant.
      OBS: tillhandahållande av smärtlindring före det kirurgiska ingreppet resulterar i överlägsen smärtlindring.
    6. Under hela proceduren, övervaka andningsfrekvens av musen.
      OBS: En mus ordentligt sövda enligt isofluran bör ha en andningsfrekvens på 50 - 100 andetag / min. En ökad andningsfrekvens indikerar att anestesi är för ljus, medan en minskad andningsfrekvens kan tyda på att anestesi är för djupt.
  2. Prep huden på den dorsala aspekten av skallen med povidon-IODine-lösning följt av 70% etanol tre gånger. Drapera med sterila dukar, lämnar operationsområdet exponeras.
    OBS: Använd sterila operationshandskar och bibehålla steril teknik under förfarandet. Endast beröra sterila ytor och föremål såsom steril duk och autoklave instrument. Har en assistent justera belysning, öppna sutur paket, etc.
  3. Med användning av en 15-bladig skalpell görs en sagittal mittlinje snitt som sträcker sig över större delen av den dorsala skallen. Med användning av en fintandad pincett, dra tillbaka huden på den högra sidan av snittet för att exponera den högra parietala benet.
  4. Med hjälp av en borr med en autoklav 4 mm diamantbelagd trephine borr, borra ett fel genom hjässben. Förläng inte felet förbi benet i dura mater skiktet. (Figur 4)
  5. Placera en byggnadsställning i defekten, och stäng sedan snittet huden med rinnande nylon sutur.
  6. Övervaka musen och ger standardpostoperativ vård ennligt institutionens riktlinjer.
    1. Håll muspekaren över en ren pappershandduk i en ren bur medan den återhämtar sig. En halv av buren bör placeras över ett varmt vatten recirkulerande filt och musen bör inledningsvis placeras i detta halv.
    2. Lämna inte en mus utan uppsikt tills den har återfått tillräckligt medvetande pendla. Skicka inte tillbaka en mus som har opererats för en bur med andra möss tills den är helt återställd.
  7. Upprepa ovanstående steg med en ny mus för varje byggnadsställning som ska testas. Sterilisera kirurgiska instrument mellan operationer med användning av en varm pärla autoklav eller annan lämplig metod.
  8. Strax efter ingreppet, och sedan vid 2, 4, 6 och 8 veckor, använder mikro datortomografi för att analysera graden av calvarial defekt stängning.
    OBS: Se artikeln av Levi et al. 6 för en beskrivning av mikro CT-svep av calvarial defekter.
  9. När experimentet är komplette, euthanize möss genom att placera dem i en ren eutanasi kammare och starta ett flöde av koldioxidgas in i kammaren med en hastighet av 2 I / min. Efter andetag har upphört helt och hållet (efter ungefär 10 minuter) utföra halsdislokation att bekräfta dödshjälp.
  10. Eventuellt efter experimentet är klar, använda snitt och histologiska färgning att utvärdera benbildning inom defekten.
    OBS: Se artikeln av McArdle et al. 12 för information om att förbereda ben prover för histologi. För en översikt av histologiska och färgningsteknik, se en histologisk manual såsom Manual of Surgical Pathology 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Micro datortomografi gjordes på operationsdagen visar tydligt skallen defekten. Vid denna tid blir det ingen inväxt i 4 mm defekten. Efterföljande avsökningar erhålles över tid för att kvantifiera storleken av defekten med tiden jämfört med baslinjen. Defekter ympade med BMPR-IB + celler bör visa snabbare stängning av defekten jämfört med BMPR-Ib- och Osorterade celler (Figur 5). Dessutom kan den del av skallen som innehåller defekten avkalkas och bearbetas för histologi med användning av standardmetoder 12. Sektioner färgade med Movat s pentachrome fläck kommer att avslöja större benuppbyggnad i defekten behandlad med BMPR-IB-celler jämfört med andra cellpopulationer (figur 6).

Figur 1
Figur 1: Lipoaspirate efter PBS tvätt. strong> En kanister av lipoaspirate efter PBS tillsätts och blandningen får sedimentera. Det översta tissueskiktet är den fettvävnad som är värd DSKer, medan det undre skiktet är det vattenhaltiga skiktet, består i huvudsak av saltlösning och blod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Placering av Cell Suspension på polysackaros Solution. (a) Cellsuspensionen skall pipetteras mycket försiktigt på sidan av röret, så att den till lager på toppen av polysackaros lösning. (b) Detta är den korrekta uppträdandet av en cellsuspension skikt ovanpå polysackaros före centrifugering."> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Ympning av celler på Scaffold. (a) På den sterila ytan av en brunn på en 24 brunnar cellodling platta, ladda en torr byggnadsställning med ca 50 mikroliter av cellsuspensionen. (b) Inkubera byggnadsställning i en cellkultur inkubator under 30 minuter för att tillåta cellvidhäftning. Obs: I figuren är en 10-cm platta som används i demonstrationssyfte. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Skapande av calvarial defekt. Den calvarial defekt (pilar) är synlig iöppen hud snitt. Notera de intakta durala blodkärl (pilspetsar), vilket indikerar att borrningen inte har brutit mot dura. Skala bar, 5 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: Läkning av kritiska stora calvarial Defekter med olika ASC Subpopulationer. (A) Tredimensionella mikro- CT rekonstruktioner utfördes för calvarial defekter repar med osorterade, BMPR-IB (+) eller BMPR-IB (-) DSK: er. (B) Kvantifiering av healing på 8 veckor visade signifikant större benuppbyggnad med BMPR-IB (+) DSKer (92%) jämfört med osorterade BMPR-IB (-) DSKer (58% och 46%, respektive, ** p < 0,01). Signifikanta skillnader i healing sågs också vid två vieks (** p <0,01), 4 veckor (*** p <0,001), och 6 veckor (*** p <0,001). Micro-CT, mikro-datortomografi. Återgivet med tillstånd från McArdle et al. 12. Felstaplar representerar standardavvikelsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6: Histologisk färgning av Bone återhämta sig. (A) Movat s pentachrome färgning av ben regenerera i defekter reparerade med osorterade, BMPR-IB (+) eller BMPR-IB (-) DSKer på 5X förstoring med ljusfältsmikroskopi. Obs mer robust benbildning i BMPR-IB (+) gruppen jämfört med BMPR-IB (-) grupp. Den streckade linjen representerar utsträckningen av den defekta området. Området inom den svarta rektangeln visas på högre magnification med användning av (B) 10X och (C) 40X ljusfältsmikroskopi av defekta området. Återgivet med tillstånd från McArdle et al. 12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kritiska steg i protokollet

Under skörden av DSK: er, är det kritiska steget tillräcklig nedbrytning av fett med kollagenas. Otillräcklig matsmältning kommer att resultera i ett lågt utbyte av ASC: er. Under FACS sortering av BMPR-IB + -celler, är det viktigt att noggrant definiera grinden för positivitet. Definiera portar för löst kan resultera i sorterade populationer som inte är rena. Under skapandet av calvarial defekten, är det viktigt att borra felet genom benet i skallen men att inte avancera in i dura mater. Detta kommer att orsaka rikliga blödningar och exponering av hjärnan, vilket kommer att nödvändig dödshjälp av djuret.

Ändringar och felsökning

Beträffande anestesi för calvarial defekt kirurgi, föredrar vårt labb för att använda inhalerad isofluran, men ett annat alternativ är att intraperitonealt injicera en blandning som innehåller en slutlig koncentration av ketamin 10 mg / ml och xylazin 1 mg / ml i normal salinje. Standarddosen i denna sammansättning är 300 mikroliter för en 30 g mus. Detta ger ungefär 30 minuter av tillförlitliga anestesi som inte kräver musen för att vara i isofluran noskonen under operation. En nackdel med att använda injicerade anestetiska är att det inte är möjligt att minska dosen efter injektionen har givits. I motsats härtill kan inhaleras isofluran lätt titreras upp eller ner i realtid.

När du lägger till cellsuspensionen till schavotten, kan forskarna tycker att vätskevolymen är för liten och kommer delvis avdunsta i 30 min inkubation. Avdunstning kan orsaka celldöd, som är en särskilt skadlig confounder i benläkning experiment. För att bekämpa detta, ladda scaffold inuti en brunn på en 24-brunnsplatta. Fyll omedelbart omgivande brunnarna med vanligt medium. Detta kommer att skapa en fuktig mikromiljö som hjälper till att hålla den laddade ställningen från att torka ut.

Histologisk färgning av ben är predicated på korrekt och noggrann urkalkning av calvarium före inbäddning och snittning. Det är accepterat att skallar av olika åldrar behöver olika löptider för urkalkning traditionellt gjort i en EDTA-lösning

Begränsningar av tekniken

Detta protokoll använder en 4 mm calvarial defekten för att bedöma förmågan hos en population av celler för att förbättra tillslutning av defekten. Denna modell kan inte simulera helande som sker i en mer komplex miljö, såsom en lång benfraktur eller en tumör resektion. Av detta skäl, får alternativa djurmodeller måste användas för att förstå bidraget av ASC: er till benläkning i dessa inställningar.

Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder

Använda flödescytometri att isolera specifika ASC populationer är en lovande teknik för att förbättra läkning och förnyelse i samband med multipel vävnad och ijury modeller, såsom angiogenes, adipogenes, och osteogenes. Nyttan av pro-osteogena celler undersöks i denna studie, som visar en djupgående effekt med celler positivt valda för BMPR-IB i healing en calvarial defekt.

Tidigare protokoll för isolering av ASC involverar odling av cellerna under flera dagar på cellodlingsplattor 16. Däremot kan celler uppleva betydande fenotypisk drift medan kultur. Av denna anledning använder vi en ASC isolering protokoll som möjliggör snabb isolering av dessa celler, följt av ytterligare underpopulation rening med hjälp av FACS. Hela proceduren sker i mindre än en dag, minimera effekterna av cellytan markör eller fenotypisk drift.

Framtida tillämpningar och vägbeskrivning

Vi har visat att DSKer starkt uttrycker BMPR-IB demonstrerar en större förmåga att förbättra regenerativ bendefekt läkning jämfört med andra ASC: er. Mekanismerna underliggande fastighetsing detta fenomen är inte kända. Till exempel är det inte klart om cellerna själva direkt differentiera till benbildande celler, eller om de producerar faktorer som uppmuntrar andra celler för att göra det. Framtida studier kommer att behöva göras för att besvara dessa frågor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 micron cell strainer Falcon 352360
15 blade scalpel Miltex 4-515
24 well plate Corning 3524
40 micron cell strainer Falcon 352340
50 mL conical centrifuge tubes Falcon 352098
6-0 Ethilon nylon suture, 18", P-3 needle,  Ethicon 1698G
Anti-BMPR-IB primary antibody R&D systems FAB5051A
BioGel PI surgical gloves Mölnlycke Health Care ALA42675Z
Buprenorphine SR ZooPharm
Castro-Viejo needle driver Fine Science Tools 12565-14
CD1 nude mouse Charles River 086
Collagenase Type II powder Gibco 17101-015
DMEM medium Gibco 10564-011
Drill: Circular knife 4.0 mm Xemax Surgical CK40
Drill: Z500 Brushless Micromotor NSK NSKZ500
FBS Gicbo 10437-077
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24" Fisher Scientific 14-206-62
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4" Fisher Scientific 22-415-469
Heating pad Kent Scientific DCT-20
Hyclone 199/EBSS medium GE  Life Sciences SH30253.01
Isothesia isoflurane Henry Schein  050033
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Paraffin film (Parafilm) Bemis PM996
PBS Gibco 10010-023
Pen-Strep Gibco 15140-122
PLGA scaffolds Proprietary Formulation
Poloxamer 188, 10% Sigma P5556-100ML
Polylined Sterile Field, 18" x 24" Busse Hospital Disposables 696 Cut a rectangular hole of the appropriate size
Polysucrose Solution: Histopaque 1119 Sigma 11191
Povidone Iodine Prep Solution Medline MDS093944H
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube Dechra Veterinary Products
RBC lysis buffer Sigma 11814389001
Webcol alcohol prep swabs Covidien 6818

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28, (2), 134-139 (2003).
  2. Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: an update. Injury. 36, S20-S27 (2005).
  3. Laurencin, C., Khan, Y., El-Amin, S. F. Bone graft substitutes. Expert Rev Med Devices. 3, (1), 49-57 (2006).
  4. Walmsley, G. G., et al. Nanotechnology in bone tissue engineering. Nanomedicine. 11, (5), 1253-1263 (2015).
  5. Chapekar, M. S. Tissue engineering: challenges and opportunities. J Biomed Mater Res. 53, (6), 617-620 (2000).
  6. Levi, B., et al. Human adipose derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defects. PLoS One. 5, (6), e11177 (2010).
  7. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100, (9), 1249-1260 (2007).
  8. Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. J Biol Chem. 286, (45), 39497-39509 (2011).
  9. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1)-positive selection enhances osteogenic capacity of human adipose-derived stromal cells. Tissue Eng Part A. 19, (7-8), 989-997 (2013).
  10. Wozney, J. M., et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science. 242, (4885), 1528-1534 (1988).
  11. Wan, D. C., et al. Osteogenic differentiation of mouse adipose-derived adult stromal cells requires retinoic acid and bone morphogenetic protein receptor type IB signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (33), 12335-12340 (2006).
  12. McArdle, A., et al. Positive selection for bone morphogenetic protein receptor type-IB promotes differentiation and specification of human adipose-derived stromal cells toward an osteogenic lineage. Tissue Eng Part A. 20, (21-22), 3031-3040 (2014).
  13. Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (71), e4425 (2013).
  14. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. J Vis Exp. (68), (2012).
  15. Lester, S. C. Manual of surgical pathology. Saunders/Elsevier. (2010).
  16. Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45, (2), 115-120 (2008).
Snabb Isolering av BMPR-IB + Fett-stromala celler för användning i en calvarial defekt Healing Modell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marshall, C. D., Zielins, E. R., Brett, E. A., Blackshear, C. P., Hu, M. S., Leavitt, T., Barnes, L. A., Lorenz, H. P., Longaker, M. T., Wan, D. C. Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model. J. Vis. Exp. (120), e55120, doi:10.3791/55120 (2017).More

Marshall, C. D., Zielins, E. R., Brett, E. A., Blackshear, C. P., Hu, M. S., Leavitt, T., Barnes, L. A., Lorenz, H. P., Longaker, M. T., Wan, D. C. Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model. J. Vis. Exp. (120), e55120, doi:10.3791/55120 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter