Production et administration de la thérapeutique mésenchymateuses souches / cellules stromales (MSC) Spheroids apprêté dans les cultures 3-D dans des conditions d'Xeno-libres

Abstract

cellules stromales souches / mésenchymateuses (CSM) sont très prometteurs en bioingénierie et la médecine régénérative. MSCs peuvent être isolés à partir de tissus adultes multiples par leur forte adhérence à la culture tissulaire en plastique, puis encore développés in vitro, le plus souvent à l' aide de sérum bovin fœtal (FBS). Depuis FBS peut provoquer des MSCs pour devenir immunogène, sa présence dans les cultures MSC limite les applications cliniques et expérimentales des cellules. (XF) médias libres xéno-Par conséquent, les études employant chimiquement définis pour les cultures MSC sont extrêmement précieux. De nombreux effets bénéfiques des cellules souches mésenchymateuses ont été attribuées à leur capacité à réguler l'inflammation et l'immunité, principalement par la sécrétion de facteurs immunomodulateurs tels que le facteur stimulée par le gène de nécrose tumorale 6 (TSG6) et de la prostaglandine E2 (PGE2). Cependant, MSCs nécessitent une activation pour produire ces facteurs et puisque l'effet des cellules souches mésenchymateuses est souvent transitoire, un grand intérêt a émergé pour découvrir des moyens de pré-activation des cellules prior pour leur utilisation, ce qui élimine le temps de retard pour l' activation in vivo. Nous présentons ici des protocoles pour activer efficacement ou MSCs premiers en trois dimensions (3D) cultures dans des conditions XF définies chimiquement et d'administrer ces MSCs pré-activé in vivo. Plus précisément, nous décrivons d'abord les méthodes pour générer MSC sphérique micro-tissus ou «sphéroïdes» en gouttes suspendues à l'aide de moyen XF et démontrer comment les sphères et milieu conditionné (CM) peuvent être récoltées pour diverses applications. Deuxièmement, nous décrivons les écrans d'expression des gènes et in vitro des tests fonctionnels pour évaluer rapidement le niveau d'activation MSC en sphéroïdes, mettant l' accent sur le potentiel anti-inflammatoire et anti-cancer des cellules. En troisième lieu , on décrit une nouvelle méthode pour injecter des sphéroïdes intacts MSC dans le péritoine de souris pour tester in vivo l' efficacité. Dans l'ensemble, les protocoles ici à surmonter des défis majeurs de l'obtention de cellules souches mésenchymateuses pré-activé sous XF con défini chimiquementconditions et fournir un système flexible pour administrer sphéroïdes MSC pour les thérapies.

Introduction

Mésenchymateuses souches / cellules stromales (CSM) ont montré un grand potentiel pour diverses approches de la médecine régénératrice. MSC ont été initialement isolé en tant que composant de stroma de moelle osseuse , mais elles ont été obtenues à partir de nombreux autres tissus adultes, y compris le tissu adipeux ^{1, 2, 3.} Fait intéressant, la méthode d'isolement principale englobe la propriété remarquable de cellules souches mésenchymateuses à adhérer étroitement sur une culture de tissu en plastique en présence de sérum de fœtus bovin (FBS). Bien que cette technique d'isolement classique permet une extension aisée et rapide des cellules souches mésenchymateuses en deux dimensions (2D) la culture, il est également très artificielle et ne tient pas compte l' importance de l'environnement naturel en trois dimensions (3D) conduisant à une perte potentielle d'importantes caractéristiques cellulaires ^{4, 5 , 6.} Par conséquent, l'étude des cellules souches mésenchymateuses dans des cultures 3D, quisont plus physiologique que les cultures 2D traditionnels, a vu le jour à la recherche des caractéristiques de MSC "perdus / diminués». En outre, un grand intérêt a augmenté pour identifier les conditions (XF) gratuit xéno-chimiquement défini pour la culture et l'activation MSC, et donc rendre les cellules plus favorable pour les applications cliniques.

De nombreuses études ont été publiées démontrant la culture 3D de MSCs tant en biomatériaux et que des agrégats ou sphéroïdes sphériques. MSCs en biomatériaux ont été initialement conçus pour les approches d'ingénierie tissulaire pour remplacer des tissus endommagés par des échafaudages de cellules ensemencées, alors que les cultures sphéroïde de MSCs ont été considérés comme un moyen de comprendre le comportement de MSC in vivo après l' administration des cellules pour des thérapies dans les essais pré-cliniques ou cliniques ^{4, 5, 7.} Fait intéressant, la forme MSCs sphéroïdes spontanément lorsque l'adhésion à la culture de tissus en plastique ne sont pas autorisés^{8, 9, 10.} Traditionnellement, l'agrégation cellulaire a été facilitée par des procédés de ballon spinner ou des techniques d'incrustation liquides, les méthodes utilisées initialement dans la biologie du cancer dans les efforts visant à essayer d'imiter le microenvironnement tumoral. Plus récemment, d' autres méthodes sont apparues qui démontrent l' agrégation des cellules dans des boîtes de culture pré-enduit avec des produits chimiques spécifiques pour empêcher la cellule-plastique adhérence ^{4, 5, 6.} L'un des plus simples et les plus économiques méthodes pour générer des sphéroïdes MSC est à la culture les en gouttes suspendues, une technique qui a été souvent utilisé pour produire des corps embryoïdes à partir de cellules souches embryonnaires. La pendaison technique de culture de goutte, l'adhérence des cellules à la matière plastique de culture de tissu est empêchée en mettant en suspension les cellules dans une goutte de milieu sur le côté inférieur d'un couvercle de boîte de culture tissulaire et en laissant la gravité pour faciliter AGGREG cellulairetion dans le sommet de la goutte. La taille des sphéroïdes peut être facilement manipulée en changeant la concentration des cellules ou du volume de la goutte, ce qui rend les cultures suspendues goutte particulièrement facile à contrôler.

Les premières études sur la culture 3D de MSCs ont démontré des différences radicales dans les caractéristiques des cellules en 3D par rapport à leurs homologues 2D ^{6, 8, 9.} Dans le même temps, des rapports ont démontré que les effets bénéfiques des cellules souches mésenchymateuses in vivo comptaient sur leur capacité à devenir activés par des signaux micro-environnementales et, en réponse, pour produire des anti-inflammatoires et immunomodulateurs ¹¹ facteurs. Fait intéressant, la plupart de ces facteurs, tels que la Prostaglandine E2 (PGE2), d'une tumeur gène du facteur stimulée nécrose 6 (TSG6) et le facteur de croissance des hépatocytes (HGF) ont été produits en quantités beaucoup plus importantes de sphéroïdes MSC que MSCs 2D traditionnels ouvrant la voie à la idée deen utilisant des cultures 3D pour activer les cellules ^{8, 12, 13.} De plus, l' activation de gènes dans des cultures 3D est apparu récapituler les mécanismes, au moins en partie, de l' activation des cellules après injection à des souris ^12. En activant MSCs avant leur utilisation dans des expériences, les effets des cellules peuvent être longs et plus important que l'effet de MSC traditionnelle in vivo est souvent retardé et transitoire, et peut être décrit comme "hit and run". Au cours des dernières années, des études fonctionnelles importantes en utilisant sphéroïdes MSC ont démontré qu'ils peuvent supprimer les réponses inflammatoires et de moduler l' immunité in vivo en influençant les cellules effectrices telles que les macrophages, les cellules dendritiques, les neutrophiles et les cellules T faisant sphéroïdes une forme attrayante de MSCs apprêtées ^{2 , 3.} En outre, la production de molécules anticancéreuses, telles que interleukin-24 (IL-24) et la nécrose de la tumeur lié au facteur de ligand induisant l' apoptose (TRAIL) sont augmentés dans des cultures 3D de cellules souches mésenchymateuses par rapport à la monocouche MSCs, un phénomène qui pourrait être exploité pour la thérapie ciblée des cancers ^{8, 10, 14.}

Comme la culture de MSC traditionnelle exigeait non seulement l'utilisation de la culture de tissus en plastique, mais aussi FBS, un autre obstacle pour rendre sphéroïdes MSC plus favorable pour une utilisation clinique avait à surmonter. Pour faire face à cet obstacle, nous avons récemment montré la formation de sphéroïdes MSC dans des conditions de XF spécifiques définis chimiquement et établi que les sphéroïdes MSC résultants ont été activés pour produire les mêmes molécules anti-inflammatoires et anti-cancéreuses que les sphéroïdes générés dans des conditions avec du FBS ^14. Ici, ces résultats sont présentés dans plusieurs protocoles détaillés qui démontrent la génération de cellules souches mésenchymateuses pré-activé dans les cultures 3D en utilisant XFmédias. En outre, les protocoles sont présentés qui décrivent des moyens efficaces pour évaluer les niveaux des MSCs d'activation en ce qui concerne leurs effets anti-inflammatoires, immunomodulatrices et anti-cancéreuses, ainsi qu'un procédé pratique pour livrer les sphéroïdes intacts dans des souris.

Protocol

1. MSC Isolement et expansion

1. Obtenir MSCs de passage au début du Centre pour la préparation et la distribution des cellules souches adultes ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html~~number=plural ) ¹⁵ flacons comme congelés. Alternativement, isoler MSCs de aspirats de moelle osseuse en suivant un protocole de routine ¹⁴ et stocker des flacons comme congelés.
2. Préparer un milieu de culture complet (CCM), ce qui est un minimum de milieu essentiel alpha (aMEM) additionné de 15 à 20% de prime sélectionner de FBS, 2 mM de L-glutamine et 1 x pénicilline-streptomycine. Stériliser le milieu par filtration.
3. Placer 30 ml de CCM dans une boîte de culture cellulaire de 150 mm et incuber le plat pendant 30 min à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO _2.
4. Incuber le flacon congelé contenant environ 10 ⁶ cellules souches mésenchymateuses pendant 2 minutes dans un bain - marie à 37 °.
5. Transférer le contenu du flacon à la boîte de culture en utilisant un 5 ml pipettes sérologiques et laver le flacon plusieurs fois avec 1-2 ml CCM de l'antenne pour capturer les cellules résiduelles. Placer le plat du jour au lendemain dans un incubateur approprié.
6. Laver soigneusement la culture deux fois avec du phosphate de la température ambiante une solution saline tamponnée (PBS) et détacher les MSCs avec 3 ml d'acide / éthylènediaminetétraacétique (EDTA) solution préchauffée 0,25% de trypsine. Détachement prend habituellement environ 3-4 min dans l'incubateur.
7. Neutraliser la trypsine dans le plat avec 6 ml CCM pré-chauffé à 37 ° C et transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 ml. Combiner avec des lavages de PBS pour maximiser le rendement des cellules.
8. Centrifuger les cellules (450 xg) pendant 10 minutes à la température ambiante et aspirer le surnageant.
9. Re-suspendre les cellules dans un petit volume de CCM et de compter les cellules viables en utilisant un hémocytomètre et bleu trypan.
10. Seed un nombre approprié de 150 plats mm à 100 cellules / cm ²
11. Récolter les cellules comme ci-dessus avec de la trypsine / EDTA et de combiner toutes les cellules dans un tube conique unique avec le milieu approprié. Centrifuger à nouveau et remettre en suspension les cellules dans un petit volume d'un même support pour les numérations cellulaires. Utiliser CCM standard (contenant du FBS) ou différents disponibles dans le commerce formulations de milieux XF, ici dénommé XF moyen 1 (XFM-1) et XF moyen 2 (XFM-2), à la fois avec et sans sérum-albumine humaine (SAH, 13 mg / ml) supplémentation.

2. Préparation de Activé MSC Spheroids en 3-D Hanging Cultures goutte sous Conditions XF

1. Pour générer des sphéroïdes d'environ 25 000 cellules, on dilue les cellules souches mésenchymateuses récoltées en CCM, XFM-1, XFM-1 + ASH (13 mg / ml), XFM-2 ou XFM-2 + ASH (13 mg / ml) à 714 cellules / ul.
2. Pipette 35 ul / gouttes des cellules surla face inférieure d'une culture de 150 mm inversé plat couvercle. plusieurs gouttes peuvent être facilement introduits à la pipette à l'aide d'une pipette multicanaux.
   NOTE: Si sphéroïdes plus ou moins sont souhaitées, modifier la concentration cellulaire ou le volume de la goutte (25-45 pi) de manière appropriée.
3. Transférer 20 ml de la température ambiante PBS dans la base du plat et dans un mouvement continu et régulier retourner le couvercle, contenant les gouttes, de sorte que les sommets de baisse face à la baisse. Placez soigneusement le couvercle sur la base de la boîte de culture.
4. Transférer le plat dans l'incubateur pendant 3 jours sans perturber pour permettre l'assemblage de la sphère appropriée.
5. Au bout de 72 heures, la récolte commence sphéroïde en retirant le couvercle avec précaution et l'inversant de façon que les gouttes, une fois encore, orientées vers le haut.
6. Angle du couvercle à environ 10 à 20 ° et pousser les gouttes contenant les sphéroïdes, au bord de la plaque à l'aide d'un dispositif de levage de pile.
7. Transférer les sphères et le milieu dans un tube conique de 15 ml avec un tube 1000 piTTE. Utiliser la température ambiante du PBS et la pipette avec la même astuce pour laver la plaque et assurer une récupération maximale de sphéroïdes.
8. Pour les essais de PCR en temps réel (protocole 3), centrifuger la suspension de la sphère à 450 xg pendant 5 min à température ambiante et aspirer le surnageant. Laver les sphéroïdes avec du PBS et répéter les deux centrifugation et aspiration étapes. Pour la livraison des animaux (protocole 8), permettent sphères de régler dans le fond du tube (~ 3-4 min) sans centrifugation.

3. PCR en temps réel des marqueurs anti-inflammatoires et anti-cancer

1. Utilisez le kit d'extraction d'ARN avec des colonnes homogénéisateur et RNase-Free DNase Set pour isoler l'ARN sans ADN total provenant de cellules souches mésenchymateuses monocouche (Protocole 1) et sphéroïdes MSC (protocole n ° 2) qui ont été lavés avec du PBS et centrifugés.
2. Lyser au moins 100.000 cellules souches mésenchymateuses monocouches et 20 sphéroïdes de chaque état séparé dans 15 ml tubes coniques avec du tampon RLT contenant β-mercaptoéthanol (1: 100).
3. Transfert les lysats soigneusement mélangés dans 1,5 ml tubes RNase-libres et le placer dans un congélateur (-80 ° C) pendant au moins 3 heures à l'aide dans la lyse sphéroïde.
4. Décongeler les lysats de cellules sur la glace, vortex brièvement, et suivez les instructions du fabricant pour l'isolement d'ARN en utilisant un kit disponible dans le commerce des mammifères d'isolement de l'ARN total.
5. Quantifier et évaluer la qualité de l'ARN isolé à l'aide d'un spectrophotomètre.
6. Utilisez le kit d'ADNc transcription inverse ou équivalent selon haute capacité aux instructions du fabricant pour générer l'ADNc pour la PCR en temps réel.
7. Placer les échantillons d'ADNc, des amorces de PCR en temps réel conçu dans le commerce / sondes (dosages Gene Expression) et PCR Master Mix sur la glace. Utiliser des amorces / sondes pour GAPDH (témoin), PTGS2 (COX-2, anti-inflammatoire), TNFAIP6 (TSG6, anti-inflammatoire), TRAIL (anticancéreuse), et l'IL-24 (anti-cancer).
8. Préparer les réactions de PCR en temps réel selon les instructions du fabricant pour Gene Expression Assays et rapide Universelle Master Mix.
9. Suivez les directives pour l'instrument PCR en temps réel pour générer les documents d'expérimentation et d'effectuer la course.
10. Analyser les données en utilisant la méthode ΔΔC _T en calculant la variation relative (quantité relative, RQ) dans l' expression du gène en utilisant la GAPDH comme les cellules souches mésenchymateuses de contrôle et de monocouches endogènes comme une base de référence ^{8, 14.}

4. Collection de CM pour les dosages de immunomodulateurs et anti-cancer potentiel

1. Récolter les sphéroïdes et CM comme décrit ci-dessus mais dans un tube conique de 15 ml, en utilisant un dispositif de levage de cellule et d'une pipette, ne pas laver les couvercles de plat avec du PBS, car cela va diluer le CM.
2. Centrifuger à 450 g pendant 5 min à température ambiante, recueillir soigneusement le surnageant exempt de cellules avec une pipette, et transférer le surnageant dans 1,5 ml tubes.
3. Centrifugeuse à 10.000 xg pendant 5-10 min à température ambiante, recueillir soigneusement la clCM arified avec une pipette, et transférer le CM dans de nouveaux tubes de 1,5 ml pour le stockage dans un congélateur (-80 ° C). Préparer des aliquotes du CM avant congélation lors de son utilisation pour de multiples essais.
   NOTE: Avant d'effectuer des essais en aval, la concentration de PGE2, un bon indicateur du potentiel anti-inflammatoire de la CM, peut être déterminée en utilisant un kit ELISA commercial conformément aux instructions du fabricant. La concentration TSG6 peut être déterminée à l' aide d' un protocole publié ^14.

5. Macrophage Assay pour évaluer le potentiel anti-inflammatoire du CSM-CM

1. Préparer le milieu macrophage, qui se compose de milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant de la L-alanyl-L-glutamine et supplémenté avec 10% de FBS et sélectionner prime 1x pénicilline-streptomycine. Filtre-stériliser le milieu.
2. Obtenir un flacon congelé de macrophages de souris d' environ 10 ⁶ J774 et laisser incuber le flacon pendant 2 minutes dans un bain - marie à 37 °.
3. Aspirer le surnageant, suspendre les macrophages dans 1 ml de milieu macrophage, et transférer les macrophages dans une boîte de Pétri de 150 mm contenant 30 ml de milieu macrophage.
4. Changer le milieu tous les 2 jours et on incube les cellules dans l'incubateur jusqu'à ce qu'environ 70-80% de confluence.
   NOTE: Les macrophages n'adhèrent pas étroitement à la boîte de Pétri, donc il faut prendre soin de ne pas perdre des cellules avec changement de milieu.
5. Récolter les macrophages en pulvérisant le milieu sur les cellules macrophages avec une pipette. Transférer les cellules dans un tube conique de 50 ml et on centrifuge pendant 5 minutes à 200-300 x g et à température ambiante.
6. Aspirer le surnageant et les cellules en suspension dans un petit volume de milieu macrophage pour le nombre de cellules avec un hémocytomètre. Ajuster la concentration de 200.000 cellules / ml avec macrophage medium.
7. Pour commencer la mise en place pour le dosage de macrophage, ajouter 480 ul de milieu macrophage dans des puits d'une plaque de 12 puits.
8. Ajouter 20 pi de milieu macrophage dans des puits non stimulées contrôle et 20 pi de non-conditionné ou moyen MSC-conditionné, préparé ci-dessus, dans les puits expérimentaux. Mélanger le milieu dans les puits en tapant sur la plaque.
9. Transférer 500 pi de la suspension cellulaire de macrophages dans les puits témoins non stimulés par des macrophages.
10. Stimule les macrophages restants avec addition de 1: 500-1: 1000 de 0,1 mg / ml de lipopolysaccharide (LPS) et incuber 5-10 min à température ambiante.
11. Transférer 500 ul des macrophages stimulés dans les puits avec un milieu non conditionné ou MSC-conditionné. Mélanger les puits en basculant régulièrement la plaque à plusieurs reprises.
12. Transférer la plaque dans un incubateur pour 16-18 h.
13. Récolter le moyen et centrifuger macrophage conditionné à 500 xg pendant 5 min à température ambiante.
14. Transfertle surnageant dans des tubes neufs et de dosage pour facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et (IL-10), le contenu de l'interleukine-10 par des kits commerciaux ELISA suivant les instructions du fabricant.

6. splénocytes Assay pour évaluer le potentiel immunomodulateur de Spheroid-CM

1. Préparer le milieu de splénocytes complet, qui se compose de Rosewell Memorial Institute Park (RPMI) -1640 du milieu supplémenté avec 10% de FBS inactivé à la chaleur, 1 x pénicilline-streptomycine, et 2-mercaptoéthanol. Filtre-stériliser le milieu.
2. Rates de récolte provenant de souris BALB / c euthanasiés-mâle par l' intermédiaire d' une incision préparée sur le côté gauche de l'abdomen sur la rate, environ à mi-chemin entre l'avant et les pattes arrière ^14. Transférer la rate pour une cellule crépine 70 um pour isoler les splénocytes ^14.
3. Isoler les splénocytes / lymphocytes en poussant la rate à travers le tamis de 70 um dans une boîte de Pétri stérile using du caoutchouc mou fin / plastique d'un piston d'une seringue 2-3 ml ^14. Utilisez un mouvement circulaire de broyage de dissocier les rates.
4. Laver le tamis cellulaire à plusieurs reprises avec du PBS froid et le transfert des cellules à partir de la boîte de Pétri dans un tube conique de 50 ml. Remplir le tube avec du PBS froid et centrifugation (500 x g) à 4 ° C pendant 10 min.
5. Aspirer le surnageant et effacer les cellules des globules rouges par incubation avec 5 à 10 ml de solution de lyse des globules rouges (par rate) pendant 5 à 10 min.
6. Arrêtez la lyse en ajoutant du PBS froid dans le tube et centrifuger pendant 5-10 min à 500 g et à 4 ° C.
7. Suspendre les cellules isolées en milieu de splénocytes complète, filtrer à travers un tamis de 40 um, et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Ajouter du milieu de splénocytes à la suspension cellulaire pour obtenir une concentration cellulaire finale de 10 ⁶ cellules / ml
   NOTE: Cette technique donne généralement environ 3 x 10 ⁷ splénocytes par rate de souris.
NOTE: La quantité de splénocytes nécessaire dépend du nombre de conditions expérimentales telles que déterminées par l'enquêteur (voir étape 6.9). Pour chaque échantillon expérimental / puits, 10 ⁶ splénocytes sont nécessaires.
8. Transférer 10 ⁶ splénocytes (stimulées ou non stimulées) dans les puits d'une plaque à 12 puits et on ajoute non conditionné (contrôle) ou MSC-CM dans les puits à une dilution finale de 1: 10-1: 20.
9. Récolter les splénocytes CM après 24 h et centrifuger à 500 g pendant 5 min à température ambiante.
10. Transférer le surnageant dans de nouveaux tubes et dosage pour l'interféron gamma (IFN-γ) contenu par kit commercial ELISA suivant les instructions du fabricant.

7. cancer de la prostate Assay pour évaluer le potentiel anti-cancer du Spheroid-CM

1. Préparer un milieu de croissance RPMI complet qui est un milieu RPMI-1640 complété avec 10% FBS, 1x pénicilline-streptomycine.
2. Obtenir un flacon congelé des cellules cancéreuses de la prostate LNCaP et incuber le flacon pendant 2 min dans un bain d'eau à 37 ° C.
3. Transférer le contenu du flacon dans une boîte de culture contenant 30 ml de milieu de croissance RPMI complet à l'aide d'une pipette motorisée et un 5 ml pipettes sérologiques. Laver le flacon plusieurs fois avec le milieu de la boîte et placez le plat dans l'incubateur.
4. Juste avant que les cellules atteignent la confluence, laver la culture deux fois avec la température ambiante du PBS et détacher les cellules LNCaP avec 3 ml de solution préchauffée 0,25% de trypsine / EDTA.
5. Neutraliser la trypsine dans le récipient avec le milieu de croissance complet RPMI et transférer les cellules avec des lavages dans un tube conique de 50 ml.
6. Centrifuger les cellules à 450 xg pendant 10 min à température ambiante et à aspirer le surnageant.
7. Remettre en suspension les cellules dans un petit volume du milieu de croissance complet RPMI et compter les cellules cancéreuses à l'aide d'un hémocytomètre.
8. Pour effectuer un test de croissance cellulaire en utilisant un kit de dosage de la prolifération cellulaire, Aspirer le milieu des puits, et transférer la plaque dans un congélateur (-80 ° C) pendant au moins 3 h.
   1. Décongeler la plaque et lyser les cellules dans chaque puits en ajoutant 100 ul de réactif de lyse cellulaire contenant 180 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA et 0,2 mg / ml de RNase A.
   2. Pour obtenir une courbe d'étalonnage, des quantités connues de lyser les cellules LNCaP comme décrit ci-dessus.
   3. Au bout de 1 h, ajouter 100 ul de 1 x tampon de lyse cellulaire contenant dilution 1: 100 de la prolifération cellulaire réactif d'essai et mesurer la fluorescence dans chaque puits pour déterminer la quantité de cellules.

8. Livraison intrapéritonéale de Spheroids Intact

1. Préparer MSCs sphéroïde comme décrit ci-dessus (protocole 2) et resuspendre til en microbilles dans une solution saline équilibrée de Hank stérile (HBSS) additionnée de 0,2 au 0,5% de HSA pour maintenir des conditions XF. HSA dans la solution contribue à empêcher l'adhésion sphère en plastique lors de l'injection.
2. Transférer 40-120 sphéroïdes dans 15 ml tubes coniques et laver les cellules par addition de 6 ml de HBSS / HSA aux tubes. Autoriser 3-4 min pour les sphères de descendre. Préparer un tube conique de sphéroïdes indépendants pour chaque animal. En outre, de préparer des tubes supplémentaires de sphéroïdes pour les essais de détermination de la rétention d'sphéroïde (voir 8.18 ci-dessous) et la production de facteurs thérapeutiques après le transfert (voir 8.19 ci-dessous) si vous le souhaitez.
3. Aspirer le surnageant, superposer les sphéroïdes avec 100-200 pi de HBSS stérile additionné de 0,2-0,5% HSA, et placer les tubes sur la glace.
4. En bref anesthésier les animaux avec 2% d'isoflurane dans 100% d'oxygène jusqu'à la disparition du réflexe de pincement orteil pendant environ 2 min dans la chambre d'induction.
5. Placez l'animal à l'intérieur du BSL-2 cabinet, dorsale aspect vers le bas (face ventrale vers le haut), avec le flux continu d'un mélange isoflurane / oxygène de 1,5% au moyen d'un cône de nez.
6. Nettoyez l'abdomen de la souris inférieure avec un antiseptique tel que 70% d'alcool.
7. Retirer le bouchon du 20 G intraveineuse (iv) cathéter et effectuer l'injection intrapéritonéale avec l'ensemble cathéter-aiguille. Utilisez une main pour tenir la peau de la souris et un autre pour effectuer l'injection. Localisez le point d'injection à peu près au milieu d'une ligne artificielle reliant une zone commune et génitale genou fléchi à la pointe de l'aiguille pointant vers la ligne médiane.
   NOTE: L'ensemble cathéter-aiguille a une résistance supérieure à celle d'une aiguille ordinaire, le soin doit donc être considéré comme ne pas injecter l'aiguille trop profondément dans l'abdomen, ce qui pourrait entraîner des blessures aux organes internes. La pénétration de la peau, puis les muscles / membrane péritonéale peuvent être ressentis lors de la pose du cathéter.
8. Retirez délicatement le stylet métallique / aiguille de l'ensemble cathéter-aiguille. Check le stylet pour le sang, l'urine et les matières fécales et le jeter. Du sang sur l'aiguille indique la ponction d'organe (s) interne.
9. Maintenir le cathéter en matière plastique dans une position verticale lors de l'injection pour permettre l'écoulement du fluide.
10. Confirmer le placement correct du cathéter en plastique par injection d'environ 100 pi de HBSS stérile / HSA par le cathéter à l'aide d'une pipette avec une pointe 100-200 pi. Placer l'extrémité de la pointe de la pipette à l'intérieur de l'adaptateur de seringue pour un cathéter formant un joint étanche. Injecter lentement le liquide dans la cavité péritonéale.
    REMARQUE: le fluide dans un cathéter est correctement positionné va circuler librement à l'intérieur de la cavité peritoneale avec seulement des ajustements mineurs du cathéter. Mauvais placement du cathéter (sous-cutanée ou intra-intestinale, ou si la pointe de l'aiguille blessés organes tels que les reins péritonéale) va augmenter la résistance et réduire le débit. le placement sous-cutanée se traduira par une formation d'une «bulle» évidente sous la peau.
11. Collecter til MSC sphéroïdes, préparés dans 100-200 ul de HBSS / HSA (étape 8.3), en utilisant une pointe de pipette 200 pi, et de transférer la totalité du volume de sphères (40-120 sphères) dans la cavité péritonéale à travers le cathéter comme décrit ci-dessus.
12. Laver le tube contenant des sphères avec 100 pi de HBSS / HSA en utilisant la même astuce que ci-dessus pour recueillir des sphéroïdes résiduelles et les injecter dans la cavité péritonéale.
13. (Facultatif) Injecter un 100 pi supplémentaires de HBSS / HSA dans la cavité péritonéale pour laver le cathéter.
14. Placez le tampon de gaze trempé dans un antiseptique sur le cathéter et retirer lentement le cathéter dans la cavité péritonéale et le jeter.
15. Massez doucement la cavité péritonéale avec les doigts pour assurer une distribution uniforme des sphéroïdes.
16. Laissez l'animal récupérer sous la surveillance étroite et de regarder pour des saignements du site d'injection.
17. Inspecter le cathéter et le tube de 15 ml pour toutes les sphéroïdes restantes. Il est normal d'observer quelques sphères de lacathéter / tube.
    NOTE: La technique décrite pour la livraison sphéroïde MSC peut être adopté pour une utilisation chez les animaux normaux ou dans une variété de modèles de lésion. Cette technique a été utilisée avec succès pour injecter des sphéroïdes lésion de la cornée de la souris et des modèles de endotoxémie, ainsi que dans un modèle de péritonite induite par le zymosan ^8.
18. Pour quantifier le nombre de sphéroïdes retenues (en option), utiliser une base d'ADN nombre de cellules quantification kit / réactif. Maintenir le cathéter utilisé dans le tube de 15 ml et distribuer vigoureusement HBSS / HSA à travers le cathéter pour forcer toutes les billes restantes dans le tube de 15 ml.
    1. Centrifuger le tube de 15 ml à 500 g pendant 5 min à température ambiante et à aspirer le surnageant. Transférer le tube contenant le culot sphéroïde dans un congélateur (-80 ° C) pendant au moins 3 h.
    2. Décongeler le tube et lyser les sphères en ajoutant 500 ul de réactif de lyse cellulaire contenant 180 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA et 0,2 mg / ml de RNase A.
    3. Pour un contrôle, freeze et lysent une quantité connue de sphéroïdes (de préférence égal au nombre de sphéroïdes préparés pour une seule injection), comme décrit ci-dessus.
    4. Au bout de 1 h, transférer 100 pl du lysat cellulaire, en double exemplaire, dans une microplaque à 96 puits et on ajoute à chaque puits 100 ul de 1 x tampon de lyse cellulaire contenant une dilution au 1:50 de la prolifération cellulaire réactif de dosage dans le kit. Au bout de 10 min, de mesurer la fluorescence dans chaque puits pour déterminer le nombre de domaines qui ne sont pas injectés en comparant l'échantillon expérimental (s) avec l'échantillon témoin.
19. Évaluer le niveau de sphéroïdes préparés pour injection (en option) en mesurant la concentration de PGE2 et TSG6 produite par des sphères transférés activation. Transfert 40-120 sphères à travers le cathéter, comme décrit ci-dessus, dans une plaque de 12 puits ou de 6 puits contenant 1 ou 2 ml d'aMEM additionné de 2% de FBS et 1 x pénicilline / streptomycine. Placer les plaques dans l'incubateur pendant 6 heures.
    1. Transférez le moyen deles puits après 6 h en 1,5 ou 15 ml tubes et centrifuger les tubes à 450 g pendant 5 min à température ambiante.
    2. Transférer le surnageant exempt de cellules dans 1,5 ml de nouveaux tubes à l'aide d'une pipette et centrifuger à 10 000 xg pendant 5 à 10 min à température ambiante.
    3. Transférer le CM clarifié (surnageant de) dans de nouveaux tubes de 1,5 ml et analyse pour la concentration de PGE2 (bon indicateur du potentiel anti-inflammatoire de la CM) en utilisant un kit ELISA commercial conformément aux instructions du fabricant. La concentration TSG6 peut être déterminée à l' aide d' un protocole publié ^14.

Representative Results

Dans les travaux en cours, suspendus cultures de chute ont été utilisées pour générer des micro-tissus sphériques compacts ou «sphéroïdes» de MSCs activées dans des conditions XF. La feuille de route d' investigation sur la figure 1 montre que les CSM sont encouragés à auto-assembler en sphéroïdes lorsqu'il est suspendu dans la pendaison gouttes pendant 72 heures, après quoi les sphéroïdes, ou le CM chargés de facteurs thérapeutiques sphère dérivés, peuvent être collectés et potentiellement utilisés dans les deux la recherche et les applications cliniques. Le grand nombre de cellules nécessaires à la production de la sphère peut être acquis en une semaine en ensemençant les cellules souches mésenchymateuses à faible densité, typiquement 100-200 cellules par cm ^2, puis l' expansion des cellules pendant 6-7 jours jusqu'à environ 80% de confluence (Figure 2 ). La cinétique de la croissance cellulaire, déterminée par comptage des cellules viables par jour, a indiqué qu'une phase de forte expansion (jour 3-7) suit une brève phase de latence de 1-2 jours (figure 2C </ Strong>). MSCs dans le passage 2 ou 3 donnent généralement 50-100 millions de cellules à partir d'un seul flacon de 1 million de cellules cryoconservés lorsque cultivées en CCM.

Après l'expansion et la récolte, les cellules souches mésenchymateuses sont suspendues à une concentration cellulaire élevée pour générer des sphéroïdes, typiquement 500-1000 cellules par ul. Hanging cultures de chute sont préparées en transférant 25-40 gouttes ul de milieu contenant les cellules souches mésenchymateuses sur la face inférieure d'un plat couvercle tissu de culture, qui est ensuite retourné et convenablement positionné sur la base du plat (Figure 3). En suspension dans 35 gouttes ul de CCM à 714 cellules par ul (ie 25.000 cellules par goutte), MSCs assembler d' abord dans de petits agrégats qui a finalement fusionnent pour générer une sphère compacte unique à 72 h dans l'apex de la goutte (figure 3C). Spheroids forment aussi plus de 72 heures dans plusieurs types de médias disponibles dans le commerce XF optimisés pour l'expansion MSC, Ici dénommé XFM-1 et XFM-2. Cependant, la formation de sphères compactes simples dans XFM-1 nécessite une supplémentation en 13 mg / ml de sérum albumine humaine (HSA), une concentration qui reflète la teneur en protéines totale estimée CCM (Figure 3D). Sphères compactes simples ne forment pas facilement dans XFM base-1 sans HSA ou aMEM exempt de protéines (Figure 3D). Lors de l' assemblage de la sphère, les changements de phénotype MSC radicalement (figure 4), et lorsque dans le milieu XF défini chimiquement approprié (c. -à- XFM-1 + ASH), l' expression de nombreux facteurs anti-inflammatoires sont régulés à la hausse , y compris PGE2 et TSG6 (figure 4C). Cependant, la production de TSG6 et PGE2 n'a pas sensiblement augmenté dans CSM cultivées comme des sphères dans XFM-2 ou XFM-1 sans HSA (figure 4C). Notamment ces facteurs anti-inflammatoires, ainsi que les facteurs anti-cancéreux TRAIL et l'IL-24, ont été fortement surexprimés dans les cellules souches mésenchymateuses par rapport à la sphéroïde monocouche MSCs, lorsque til les sphères ont été cultivées dans XFM-1 complété avec soit HSA recombinant (rHSA) ou de grade clinique HSA (AHC) préparé à partir de sang humain (Figure 4D).

Afin d' évaluer le potentiel thérapeutique des sphères MSC préparées dans différentes formulations de milieux, plusieurs essais pratiques sont effectuées (figure 5). Les propriétés immunomodulateurs de sphéroïdes sont tout d' abord déterminée in vitro en mesurant les effets de la sphère CM sur les concentrations de cytokines produites par les macrophages stimulés par le LPS et des splénocytes stimulés par CD3 / lymphocytes (figure 5). CM du CSM cultivées dans des sphères CCM et XFM-1 / ASH production nettement supprimée de macrophage TNFa et IFNy de splénocytes, tandis que dans le même temps des niveaux accrus de la cytokine anti-inflammatoire IL-10 (figure 5A et 5B). Les propriétés anticancéreuses des sphères sont évaluées en mesurant les effets de la sphère CM on croissance et la morphologie des cellules cancéreuses de la prostate LNCaP. Le milieu XF XFM-1 / HSA réduit efficacement la prolifération LNCaP similaire à FBS contenant CCM (Figure 5C et 5D).

Fait important, les sphères de MSC intactes peuvent être administrées dans la cavité péritonéale de souris pour tester l'activité anti-inflammatoire des cellules in vivo (figure 6). Pour ces expériences, les sphères sont préparées pour l'injection dans HBSS contenant une faible concentration de la SAH, ce qui réduit leur adhérence sur les tubes en matière plastique tout en conservant un état XF. Par la suite, les sphères peuvent être facilement injectées après le transfert du tube de prélèvement (figure 6A), à l' aide d' une pipette (figure 6B), à travers un ensemble aiguille / cathéter (Figure 6C et 6D) positionné de manière appropriée pour une injection intrapéritonéale standard. En utilisant cette approche, sphéroïdes MSC peuvent être régulièrementtransféré à une efficacité supérieure à 90% (Figure 6E et 6F) sans perturber leur intégrité (Figure 6G et 6H). Un mauvais positionnement de la pointe du cathéter dans la cavité péritonéale conduit à la livraison de la sphère pauvre et une rétention élevée (Figure 6F). Fait important, le niveau de maintien de la sphère à l'intérieur de la pipette / cathéter peut être déterminée qualitativement par une inspection visuelle, ou quantitativement en recueillant / lyser les sphères retenues et en mesurant le nombre de cellules avec une disponible dans le commerce réactif de quantification de cellules à base d' ADN / kit (figure 6F). Post-injection analyse de rétention de la sphère permet de créer des critères d'inclusion / exclusion lors de l'expérimentation. Notamment, la possibilité pour la CCM et XFM-1 / HSA sphéroïdes à sécréter des niveaux élevés de PGE2 et TSG6 sont maintenus au moins 6 heures après le transfert des sphères de pendaison des cultures de goutte (figure 6I). Semblable à leur in vitro effets, des sphères XFM-1 / HSA injectés dans la cavité péritonéale de souris, immédiatement après l' induction de l' inflammation systémique par administration intraveineuse de LPS, renforcée PGE2 et d' IL-10 niveaux dans le péritoine , tout en diminuant la pro-inflammatoire TNFa (figure 6J).

Figure 1: Représentation schématique de la plate - forme développée pour exploiter le sécrétome des MSCs apprêtées comme des micro-tissus sphériques dans des conditions XF. Après l'expansion de cultures en monocouche (1), les cellules souches mésenchymateuses sont suspendues dans la pendaison gouttes du couvercle d'une boîte de culture (2) à une concentration cellulaire élevée pour activer / amorcer les cellules. Au bout de 72 h, à la fois le (3) un milieu conditionné (CM) et (4) des sphéroïdes intacts peuvent être récoltées à partir des gouttelettes et utilisées dans diverses applications en aval. Le CM est riche en facteurs immunitaires de modulation, ainsi que d'autres compon thérapeutiqueents. Les sphéroïdes compactes qui se forment dans des gouttes suspendues peuvent être facilement transférés à l' aide d' une pipette (5) et efficacement administrés in vivo à travers un cathéter (6). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: caractéristiques des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse dans des cultures monocouches croissance. MSCs dans le passage 2 ont été ensemencées à faible densité (100 cellules par cm ²⁾ dans 15 cm plats (15.000 cellules par boîte) et cultivées pendant 7 jours en CCM. Le milieu a été changé le jour 3, puis de nouveau le jour 5 ou 6 (24-48 h avant la récolte). Représentant des micrographies en contraste de phase MSCs 3 jours (A) et 7 jours (B) après étalement des cellules. Barre d'échelle = 200 um. (C) cinétique de MSCs de croissanceobtenu à partir de 3 donneurs ont été déterminés en comptant le nombre de cellules adhérentes viables par jour du jour 2 au jour 7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Préparation de la pendaison cultures de chute pour l' amorçage sphéroïdes MSC en milieu XF. (A) Photographie montrant la technique suspendu à la couche rapidement des gouttes sur la face inférieure d'un couvercle de boîte de culture tissulaire. (B) La photo illustrant la pendaison baisse après l' inversion et le positionnement du couvercle sur la base de plat. (C) les changements dépendant du temps dans l'agrégation de 25.000 cellules souches mésenchymateuses dans une goutte suspendue comme visualisé par microscopie à contraste de phase. L'objectif était centrée sur le sommet de la goutte. Barre d'échelle = 500 um. (D) Imagements de sphères MSC formés après 3 jours dans la pendaison cultures de chute en utilisant diverses formulations de milieux , y compris aMEM avec et sans FBS (c. -à- CCM), XFM-1 avec et sans HSA, et XFM-2 avec et sans HSA. Barre d'échelle = 200 um. Les données du panel D ont été obtenus à partir de l'article original avec l' autorisation de l'éditeur ^14. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4: Evaluation de l' activation MSC en 3-D cultures XF. (A) Sphères / CM sont récoltées après 72 heures par inversion / inclinaison du couvercle plat et en forçant les gouttelettes sur le bord à l' aide d' un poussoir de cellule. Sphères assemblés à partir de 25.000 cellules peuvent être facilement visualisées lors de la collecte. (B) Photographie de approxiron 500 billes recueillies à partir de plusieurs couvercles des plaques de culture tissulaire. Sphères descend rapidement vers le fond du tube sans centrifugation. (C) Niveau de PGE2 sécrétée par les sphères MSC après 72 heures a été mesurée par ELISA. En temps réel RT-PCR a été utilisée pour mesurer les niveaux TSG6. Deux TSG6 et PGE2 sont des marqueurs utiles pour le criblage de l'activation du MSC en sphéroïdes. Le milieu XF XFM-1 + HSA a montré un niveau élevé de PGE2 et de la production de TSG6 (boîtes rouges). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart type et ont été analysées par le test t de Student (*** p <0,001, par rapport à l'échantillon aMEM). (D) PGE2 ELISA et en temps réel RT-PCR des essais sur des sphères produites dans CCM et XFM-1 complété spécifiquement avec 13 mg / ml de HSA recombinant (rHSA) ou grade clinique HSA (AHC) , préparé à partir de sang veineux humain. Plier les modifications ont été déterminées à partir des cellules souches mésenchymateuses adhérentes en monocouche (QR = 1). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart type et ont été analysées par le test t de Student (** p <0,01, *** p <0,001, par rapport àmonocouche CSM). Certaines données dans les panneaux C et D ont été obtenus à partir de l'article original avec l' autorisation de l'éditeur ^14. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5: Les essais in vitro fonctionnels pour l' évaluation des propriétés anti-inflammatoires et anti-cancer du CSM-CM collectées à partir des cultures de pendaison goutte. (A) Des résultats représentatifs de tests ELISA montrant les effets de la sphère CM (CCM et XFM-1 / ASH) sur la production de TNFa et d' IL-10 par des macrophages de souris stimulées par le LPS (MQ). (B) Des résultats représentatifs de l' ELISA montrant les effets de la sphère CM (CCM et XFM-1 / ASH) sur la production d'IFN - y par les splénocytes de souris (Spl) stimulées par un anticorps anti-CD3. Les micrographies (C) de contraste de phase de cellules de cancer de la prostate LNCaP traitées par CCM base et XFM-1 / ASH ou un milieu conditionné (CM) provenant des sphères MSC préparées CCM et XFM-1 / ASH. Des cellules LNCaP ont été cultivées dans un milieu RPMI (témoin). La barre d'échelle est de 200 um. (D) des changements quantitatifs dans la croissance des cellules cancéreuses de la prostate LNCaP a été déterminée avec un réactif à base d' ADN de quantification de cellules / kit disponible dans le commerce. La ligne pointillée indique la densité de semis de 5000 cellules par puits. Les données de tous les panneaux sont présentés sous forme de moyenne ± écart-type, et ont été analysées par le test t de Student (*** p <0,001). Certaines données de tous les panneaux ont été obtenus à partir des articles originaux avec l' autorisation de l'éditeur ^14. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 6: transfert efficace des MSCs intacts sphéroïdes, préparés dans des conditions XF, en utilisant un système aiguille 20G iv / cathéter. (A) photographie représentant d'un tube de 15 ml conique avec XFM-1 / sphères HSA MSC préparées pour injection dans HBSS contenant 0,2% HSA. (B) photographie représentant des sphères de MSC après aspiration dans une pointe de pipette de 200 pi. (C) l' image de l'ensemble 20 aiguille G / cathéter utilisé pour administrer sphéroïdes MSC intactes dans des souris. (D) l' image montrant le positionnement correct de la pointe de pipette dans l'adaptateur du cathéter en polyuréthane. (E) l' image des sphères MSC immédiatement après passage à travers le cathéter dans une boîte de culture. Environ 95 sphères sur 100 ont été transférées. (F) l' efficacité de la livraison de la sphère dans la cavité péritonéale de souris a été déterminée en recueillant des sphères / lysant retenues dans lePipette / cathéter et le nombre de cellules de mesure, par l'intermédiaire d'un essai de quantification de cellules à base d'ADN du commerce, par rapport au nombre de cellules obtenues à partir d'un ensemble complet de sphères lysées. ligne rouge Dotted indique une efficacité de transfert de 90%. la livraison de la sphère des pauvres (71%) a été observée avec une seule injection (flèche). (G) micrographies en contraste de phase de sphères dans le panneau E (grossie vue). Barre d'échelle = 200 um. (H) à contraste de phase micrographie d'un XFM-1 / HSA sphère 16 heures après le transfert sur une boîte de culture de tissu. Le fibroblastique, la morphologie en forme de fuseau des cellules souches mésenchymateuses est maintenue dans les cellules qui ont migré hors de la sphère. Barre d'échelle = 200 um. Essais (I) dans ELISA pour les facteurs anti-inflammatoires et TSG6 PGE2 ont été effectués sur CM recueilli 6 heures après le transfert des sphères dans des plaques 6 puits contenant 2 ml d' aMEM / 2% de FBS. Sphères préparés dans le milieu XF XFM-1 / HSA a montré plus haut niveau de TSG6 et PGE2 sécrétion (boîtes rouges). Données, exprimée en moyenneSD ±, ont été analysées par le test t de Student (*** p <0,001, par rapport à l'échantillon aMEM). Certaines données ont été obtenues à partir de l'article original avec l' autorisation de l'éditeur ^14. (J) des graphes représentatifs illustrant la capacité des sphéroïdes, injectées dans la cavité peritoneale, pour augmenter la PGE2 peritoneale et l' IL-10 , tout en diminuant le niveau de TNFa chez des souris attaquées par injection intraveineuse d'endotoxines (LPS). Les échantillons ont été obtenus par péritonéale lavage 6 h après l'induction de l'inflammation et de la livraison de 80 sphéroïdes. Données, exprimées sous forme de moyenne ± écart-type, ont été analysées par le test t de Student (* p <0,05, ** p <0,01 par rapport au témoin). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Le MSC optimal pour une utilisation dans des applications cliniques et de recherche devrait être très active pour maximiser leur profit, et préférentiellement préparé dans des conditions XF chimiquement définis pour réduire au minimum la fourniture d'antigènes potentiels de moyenne composants xénogéniques tels que FBS. Dans les protocoles décrits ici, nous avons montré des méthodes pour 1) activer MSCs en culture en 3D par la formation de sphéroïdes, 2) réaliser l'activation 3D des cellules souches mésenchymateuses dans des conditions XF, 3) évaluer les niveaux de MSCs sphéroïdes d'activation en ce qui concerne leur anti- inflammatoires, immunomodulateurs et le potentiel anti-cancer, et 4) remettre MSCs activés sous forme de sphéroïdes intacts dans des souris.

Cellules souches mésenchymateuses sont des cellules souches pluripotentes qui peuvent être isolées par adhérence plastique de nombreux tissus adultes, y compris la moelle osseuse et le tissu adipeux. MSCs sont facilement propagées sur la culture de tissus en plastique sous relativement élevée (10-20%) des concentrations de FBS, expriment un ensemble distinct de marqueurs de surface, etpeuvent être différenciés au moins en adipocytaire, ostéogénique, et lignées chondrogéniques ^{1, 16, 17, 18.} MSCs ont été démontrées pour exercer des effets bénéfiques dans différents modèles animaux de maladies humaines, même si elles semblent persister transitoirement après leur administration in vivo. L'effet de MSCs a donc été appelé "hit and run" et est souvent médiée par les facteurs paracrines anti-inflammatoires et immunomodulatrices, tels que PGE2, TSG-6, et indoleamine 2,3-dioxygénase (IDO), sécrétées par MSCs ^{2 , 3, 11, 19, 20, 21.} Toutefois, afin de produire ces facteurs, MSCs nécessitent une activation, que ce soit grâce à des signaux provenant d'un tissu endommagé ou à partir de c immunaunes du destinataire. Par la suite, il y a eu un intérêt croissant pour développer des protocoles MSC pré-activation ou d' amorçage avant la livraison des cellules dans des animaux ou des patients ^22. En outre, la présence de composants antigéniques FBS dans les préparations de MSC standards a soulevé des inquiétudes. Par conséquent, des études ont été menées pour déterminer les conditions optimales de XF chimiquement définis pour les cultures de MSC. Dans nos travaux récents, nous avons montré que les MSC peuvent être activés en 3D par la formation de sphéroïdes, puis a découvert que l' activation des cellules peut également être réalisée dans des conditions spécifiques XF ^{8, 12, 13, 14.}

techniques de culture cellulaire 3D ont été utilisés pendant des décennies dans le but de fournir de véritables conditions physiologiques dans la recherche à base de cellules. Cultures en 2D ne tiennent pas compte de la nature 3D des tissus et donc ne sont pas toujours récapitulent pasla cellule à cellule, et les interactions cellule-matrice important dans la signalisation cellulaire. De nombreuses techniques de culture 3D utilisent des navires rotatifs, des flacons rotatifs, ou diverses surfaces non-adhérentes, cependant, le plus grand inconvénient dans beaucoup de ces méthodes est l'hétérogénéité de la taille sphéroïde générée et / ou de l'exigence d'un matériel coûteux spécifique. Des recherches ont également été effectuées en utilisant des cultures de gouttes pendantes qui favorisent essentiellement MSCs spontanément à regrouper en un seul sphéroïde ^{4, 5, 6, 7, 8, 9, 23.} Notamment, suspendus cultures d'abandon soutiennent l'assemblage de micro-tissus / agrégats relativement uniformes, avec l'avantage supplémentaire d'être en mesure de manipuler facilement la taille de l'agrégat de cellules en ajustant la concentration de cellules et / ou volume de la goutte. Par ailleurs, la maîtrise de la pendaison drop technique de culture ne nécessite pas une formation approfondie. Des gouttes de 25-40 ul peuvent être facilement préparées avec MSCs à des concentrations cellulaires élevées, typiquement 500-1000 cellules par ul. Gouttes de moins de 20 pi ont tendance à s'évaporer rapidement, et les plus de 45 pi enduisent souvent à travers le couvercle pendant l'inversion. Toutefois, lorsque le retournement d'un couvercle contenant des gouttelettes de toute taille, la vitesse et la directionnalité sont des paramètres critiques à prendre en compte pour maintenir la tension de surface et la forme appropriée de la chute / sphéroïde. culture ininterrompue et une ventilation adéquate dans l'incubateur sont également importants pour assurer l'ensemble des MSC dans une seule sphère dans chaque goutte.

Un inconvénient de cette technique est que des plaques contenant des gouttes suspendues ne doivent pas être empilés dans l'incubateur ou déplacés lors de l'assemblage de la sphère, ce qui rend l'intensification des traitements difficiles de patients. Par ailleurs, l'évolution moyenne pendaison cultures de chute est extrêmement difficile, donc des cultures à long terme devraient être avoided. En outre, le faible ratio médias à cellule en gouttes suspendues peut provoquer l'épuisement des nutriments et de l'accumulation des déchets pour aboutir finalement à la perte des fonctions cellulaires importantes et / ou la mort cellulaire.

Cependant, avec la technique appropriée de goutte suspendue, nous avons démontré que les cellules souches mésenchymateuses dans les sphéroïdes deviennent très actifs ou amorcés, en ce que les cellules deviennent des usines des molécules anti-inflammatoire puissant PGE2 et TSG6, ainsi que les molécules anti-cancéreuses de l'IL-24 et PISTE. Nous avons montré que les sphéroïdes MSC sont en effet anti-inflammatoire et immunomodulatrice et ont des propriétés anticancéreuses supérieures à celles de leurs homologues monocouches 2D dans de nombreux tests fonctionnels à l' aide des macrophages en culture, les splénocytes et les cellules de cancer de la prostate , ^{8, 12, 13, 14.} En outre, nous avons montré que les sphéroïdes MSC peuvent exercer des effets anti-inflammatoires puissants lorsqu'ils sont administrésdans la cavité péritonéale de souris avec péritonite ^8. Plus précisément, nous avons montré que les grandes sphéroïdes d'environ 400 à 500 um de diamètre (25.000-30.000 MSCs chacun) peuvent être efficacement délivrés dans un petit volume de HBSS en utilisant une aiguille de 20G / Ensemble de cathéter et d'une pipette standard. Avec cette technique, le placement de cathéter incorrecte, qui se traduit par une résistance élevée à l'écoulement de fluide, peut être facilement déterminé avant le transfert sphéroïde en injectant d'abord un petit volume de HBSS / HSA comme décrit dans les protocoles. Les sphéroïdes dans un cathéter positionné correctement circule librement, sous réserve que la HBSS est complétée par la HSA pour réduire au minimum l'adhérence sphère au tube en plastique, et peuvent être facilement visualisés. De plus, cette technique évite la contrainte de cisaillement sur les cellules qui peuvent se produire à l'aide d'une aiguille / seringue standard pour l'injection, et évite la nécessité d'une incision chirurgicale qui comporte un risque plus élevé d'infection et il est plus difficile techniquement. Un inconvénient majeur est tChapeau grand nombre de sphéroïdes ne peuvent être injectés dans les cavités du corps spacieux, tels que le péritoine, car la résistance contre le transfert de matière à travers le cathéter est élevée dans les zones rétrécies.

Nous avons également démontré récemment que le même niveau d'activation du MSC en sphéroïdes peut être réalisée en utilisant un support spécifique disponible dans le commerce XF, appelé ici XFM-1, tant qu'elle a été complétée par la SAH obtenue à partir de sang humain ou préparé par des techniques de recombinaison ^14. Il est important de noter ici que sphéroïdes MSC ne produisent pas des niveaux élevés de PGE2 et TSG6 dans tous les types de médias XF ^14, probablement parce que la plupart des médias XF pour MSCs ont d' abord été formulée pour l' expansion optimale des cellules en 2D. Il est également important de noter que les différents types de SAH varient quant à leur activité ^14. En outre, le niveau absolu de PGE2 détecté dans CM de sphéroïdes activées peuvent varier légèremently comme ELISA utilisé pour PGE2 est en effet un test de compétition. Ainsi, il est essentiel d'inclure des contrôles appropriés dans tous les PGE2 ELISA et d'éviter directement la comparaison des données entre les échantillons analysés à différents moments ou dans différentes plaques. En outre, les CSM doit être lavé à fond dans le milieu XF avant de préparer la pendaison des gouttes pour éliminer CCM résiduelle et, par conséquent, de limiter le report des composants FBS. Les protocoles décrits ici peuvent être facilement adoptées pour évaluer d'autres formulations de milieux sur la formation de la sphère et l'expression du gène thérapeutique.

Il est clair que de nombreux événements de signalisation cellulaire qui ne se produisent normalement en 2D MSCs sont mises en mouvement lors de MSCs sont mises en culture en 3D. De cellule à cellule des interactions cellule-matrice et médiée par les cadhérines et les intégrines guide de formation de sphéroïde et de compactage ^{24, 25, 26} et sont susceptibles critique pour la thérapie sphéroïde. Comme les cellules d'agrégats et de compact en sphéroïdes, divers signaux de stress, y compris l' apoptose mineure, l' aide dans le processus d'activation MSC qui se traduit par la production de nombreux facteurs potentiellement thérapeutiques ^{4, 5.} Nous avons montré précédemment le rôle critique de autocrine IL-1 de signalisation dans l' activation MSC et la production de PGE2 et TSG6 ^12. Bien que beaucoup reste inconnue sur les différentes voies de signalisation que l'aide à l'activation MSC, la pendaison plate-forme de culture de goutte offre un moyen pratique pour étudier ce phénomène et d'améliorer les thérapies à base MSC. Dans l'ensemble, nous avons décrit, dans les protocoles ici, les moyens d'activation ou de l'amorçage dans des cultures 3D MSCs, dans des conditions chimiquement définies XF, pour produire anti-inflammatoires, immunomodulateurs et les facteurs anti-cancéreux. Nous avons également décrit comment ces sphéroïdes MSC intactes peuvent être livrées in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM-α (minimal essential medium alpha)	ThermoFisher/Gibco	12561049; 12561056; 12561072	minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium select	Atlanta Biologicals	S11595; S11510; S11550; S11595-24	component of complete culture media for all types of cells
L-glutamine	ThermoFisher/Gibco	25030081; 25030149; 25030164	component of complete culture media for all types of cells
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher/Gibco	15070063	component of complete culture media for all types of cells
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane	MilliporeSigma	SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE	media sterilization
150 mm cell culture dish	Nunc	D8554 SIGMA	cell culture
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator	Thermo Fisher	Model 3110	incubation of cultured cells
Early passage MCSs	Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White	NA	preparation of 2D and 3D cultures of MSCs
water bath	VWR	89501-468	warming media to 37 °C
Pipettes	Eppendorf	492000904	manual liquid handling
Pipete-Aid	Drummond Scientific Company	4-000-300	handling sereological pipetes
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml)	Corning	4487; 4101; 4251; 4490	liquid handling
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4	ThermoFisher/Gibco	10010023; 10010072; 10010031; 10010049	cell culture processing
0.25% trypsin/EDTA solution	ThermoFisher/Gibco	25200056; 25200072; 25200114	lifting adherent cells and dispersing cell aggregates
15 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352097	cell centrifugation
50 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352098	cell centrifugation
Eppendor refrigerated centrifuge	Eppendorf/Fisher Scientific	Model 5810R	cell centrifugation
hemocytometer	Fisher Scientific	26716	cell counting
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154 SIGMA	dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)	ThermoFisher/Gibco	A1067501	Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2)	Stem Cell Technologies	5420	Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells
HSA (Human serum albumin)	Gemini	800-120	Component of xeno-free MSC media
rHSA (recombinant Human serum albumin)	Sigma-Aldrich	A9731 SIGMA	Component of xeno-free MSC media
Total RNA isolation Mini Kit	Qiagen	74104	Total RNA extraction
Qiashredder	Qiagen	79654	Sample homogenization prior to total RNA extraction
RNAse-free DNase Set	Qiagen	79254	On-column DNA elimination during total RNA extraction
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250 ALDRICH	inhibition of RNAses in RLT buffer
Vortex	VWR	97043-562	mixing sample
Spectrophotometer	Biorad	NA	RNA concentration and quality
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher/Applied Biosystems	4368814	transcription of total RNA into cDNA
Gene Expression Assays	ThermoFisher/Applied Biosystems	varies	primer/probe combination for real-time PCR
Fast Universal PCR Master Mix	ThermoFisher/Applied Biosystems	4352042; 4364103; 4366073; 4367846	master mix for real-time PCR reaction
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)	ABI Prizm	NA	real-time PCR
1.5 ml centrifuge tube	Eppendorf	22364111	cell centrifugation, sample collection and storage
(-80 °C) freezer	Thermo Fisher	Model Thermo Forma 8695	sample storage
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit	R&D Systems	KGE004B	estimation of cytokine concentration in the sample
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)	ThermoFisher/Gibco	10566-016; 10566-024;10566-032	macrophage culture media
J774 mouse macrophages	ATCC	TIB-67	mouse macrophage cell line
12-well plate	Corning	3513	in vitro macrophage stimulation
LPS (lipopolysaccharide)	Sigma-aldrich	L4130	in vitro macrophage stimulation
Mouse TNF-a ELISA kit	R&D Systems	MTA00B	estimation of cytokine concentration in the sample
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit	R&D Systems	M1000B	estimation of cytokine concentration in the sample
RPMI-1640 medium	ThermoFisher/Gibco	11875-085	splenocyte culture media
BALB/c mice	The Jackson Laboratory	651	in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified	eBioscience	145-2C11	in vitro splenocyte stimulation
70 μm strainer	Corning	352350	Splenocyte preparation
Red blood cell lysis solution (1x)	Affymetrix eBioscience	00-4333	removal of red blood cells during splenocyte isolation
Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kit	R&D Systems	MIF 00	estimation of cytokine concentration in the sample
LNCaP prostate cancer cells	ATCC	CRL-1740	study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro
DNA-based cell proliferation assay kit	ThermoFisher	C7026	cell number measurement based on DNA content
NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	component of lysis reagent
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	ThermoFisher	FERR1021	calcium chelator, component of lysis reagent
Rnase A	Qiagen	19101	RNA degradation for measurement of DNA
Filter-based multi-mode microplate reader	BMG Technology	NA	Microplate assays (ELISA, cell quantification, etc.)
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher/Gibco	14175079	resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections
Isoflurane	MWI Vet Supply	502017	Anesthesia for in vivo injections
Oxygen, compressed gas	Praxair	NA	For use with isoflurane
Thermo Forma BSL-2 cabinet	Thermo Fisher	Model 1385	Sterile cell culture
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch	Terumo	SR*FNP2025	Delivery of shperoids into peritoneal cavity
Sterile micropipette tips	Eppendorf	varies	liquid/cells handling