Herstellung und Verabreichung von therapeutischen mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen (MSC) Sphäroiden Primed in 3-D-Kulturen unter Xeno freien Bedingungen

Abstract

Mesenchymale Stammzellen / Stromazellen (MSCs) vielversprechend in der Biotechnik und der regenerativen Medizin. MSCs können aus mehreren adulten Geweben durch ihre starke Adhärenz an Gewebekulturkunststoff und dann expandiert weiter in vitro isoliert werden, am häufigsten fötalem Rinderserum (FBS) verwendet wird . Da FBS können MSCs verursachen immunogen zu werden, begrenzt seine Präsenz in MSC-Kulturen sowohl klinische und experimentelle Anwendungen der Zellen. Daher unter Verwendung von Studien chemisch definierte Xeno-freie (XF) Medien für die MSC-Kulturen sind äußerst wertvoll. Viele vorteilhafte Wirkungen von MSCs wurden auf ihre Fähigkeit zurückzuführen Entzündung und Immunität zu regeln, vor allem durch die Sekretion von immunmodulatorische Faktoren wie Tumor-Nekrose-Faktor-stimulierte Gen 6 (TSG6) und Prostaglandin E2 (PGE2). Jedoch erfordern MSCs Aktivierung dieser Faktoren zu erzeugen, und da die Wirkung von MSCs oft vergänglich ist, hat großes Interesse hervor Wege der Pre-Aktivierung der Zellen Prio zu entdeckenr ihre Verwendung, wodurch die Beseitigung der Verzögerungszeit für die Aktivierung in vivo. Hier präsentieren wir Protokolle effizient aktivieren oder prime MSCs in dreidimensionalen (3D) Kulturen unter chemisch XF Bedingungen definiert und diese voraktivierten MSCs in vivo zu verabreichen. Insbesondere wir zuerst beschreiben Verfahren zur sphärischen MSC Mikrogeweben oder "Sphäroide" in hängenden Tropfen unter Verwendung XF Medium erzeugen und zu zeigen, wie die Kugeln und konditioniertes Medium (CM) können für verschiedene Anwendungen geerntet werden. Zweitens beschreiben wir die Genexpression Bildschirme und in vitro funktionelle Assays , um schnell das Niveau der MSC Aktivierung in Sphäroide bewerten, die entzündungshemmende und Anti-Krebs - Potential der Zellen zu betonen. Drittens beschreiben wir ein neues Verfahren intakte MSC Sphäroide in die Maus - Peritonealhöhle für in vivo Wirksamkeitstests zu injizieren. Insgesamt überwinden die Protokolle hier großen Herausforderungen unter chemisch definierten XF con voraktivierten MSCs zu erhaltenBedingungen und bieten ein flexibles System MSC Sphäroiden für Therapien zu verabreichen.

Introduction

Mesenchymale Stammzellen / Stromazellen (MSCs) sind für verschiedene regenerative Medizin Ansätze großes Potenzial gezeigt. MSCs wurden zunächst als stromal Komponente von Knochenmark isoliert wurden , da aber von zahlreichen anderen adulten Geweben erhalten worden sind , einschließlich Fettgewebe ^{1, 2, 3.} Interessanterweise umfasst der Hauptisolationsverfahren die bemerkenswerte Eigenschaft von MSCs fest auf Gewebekulturkunststoff in Gegenwart von fötalem Rinderserum (FBS) zu haften. Während dieses traditionelle Isolationstechnik eine einfache und schnelle Expansion von MSCs ermöglicht in zweidimensionalen (2D) Kultur, ist es auch sehr künstlich und mißachtet Bedeutung der nativen dreidimensionalen (3D) Umgebung zu möglichen Verlust von wichtigen zellulären Eigenschaften führende ^{4, 5 , 6.} Daher ist die Untersuchung von MSCs in 3D-Kulturen, diesind physiologische als herkömmliche 2D-Kulturen, hat für "verloren / verminderte" MSC Merkmale auf der Suche entstanden. Xeno-frei (XF) chemisch definierte Bedingungen für die MSC Kultur und Aktivierung, zu identifizieren und somit machen die Zellen besser geeignet für klinische Anwendungen Zudem hat großes Interesse gestiegen.

Viele Studien sind veröffentlicht worden, die 3D-Kultur von MSCs zeigen sowohl in Biomaterialien und als sphärische Aggregate oder Sphäroide. MSCs in Biomaterialien wurden zunächst für das Tissue Engineering Ansätze entwickelt , beschädigte Gewebe mit Zell ausgesät Gerüste zu ersetzen, während Sphäroid - Kulturen von MSCs als eine Möglichkeit gesehen wurden MSC Verhalten in vivo nach der Verabreichung der Zellen für Therapien in präklinischen oder klinischen Studien zu verstehen , ^{4, 5, 7.} Interessanterweise spontan Sphäroiden MSCs bilden sich, wenn die Einhaltung der Gewebekultur-Plastik ist nicht zulässig^{8, 9, 10.} Traditionell wurde die Zellaggregation durch Rührflasche Methoden oder flüssigen Overlay-Techniken erleichtert, Methoden zunächst in der Krebsbiologie bei den Bemühungen um zu versuchen, den Tumor-Mikroumgebung zu imitieren. In jüngerer Zeit wurden weitere Methoden taucht , die Zellaggregation in Kulturschalen vorbeschichtet mit spezifischen Chemikalien zeigen zu verhindern Zelle zu Kunststoffhaft ^{4, 5, 6.} Eine der einfachsten und wirtschaftlichsten Verfahren MSC Sphäroide zu erzeugen, ist zur Kultur sie in hängenden Tropfen, eine Technik, die häufig verwendet wurde embryoid bodies aus embryonalen Stammzellen zu erzeugen. Mit hängenden Tropfen Kulturtechnik, die Zellhaftung an den Gewebekulturkunststoff wird durch Suspendieren der Zellen in einem Tropfen des Mediums auf der Unterseite einer Gewebekulturschale Deckel verhindert und damit die Schwerkraft zu erleichtern Zelle AGGREGation in der Spitze des Tropfens. Das Sphäroid Größe kann leicht durch Ändern der Zellkonzentration oder das Tropfenvolumen manipuliert werden, Tropfen Kulturen machen hanging besonders einfach zu steuern.

Frühe Untersuchungen über die 3D - Kultur von MSCs gezeigt radikalen Unterschiede in den Eigenschaften der Zellen in 3D im Vergleich zu ihren Pendants 2D ^{6, 8, 9.} Zur gleichen Zeit zeigten Berichte , dass die vorteilhaften Wirkungen von MSCs in vivo auf ihre Fähigkeit , durch Mikroumweltreize aktiviert zu werden , verlassen und in Reaktion darauf zu erzeugen , entzündungshemmende und immunmodulierende ¹¹ Faktoren. Interessanterweise viele dieser Faktoren wie Prostaglandin E2 (PGE2), Tumor-Nekrose-Faktor-stimulierte Gen 6 (TSG6) und Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) wurde in viel größeren Mengen von MSC Sphäroide als herkömmliche 2D MSCs ebnet den Weg für das produzierte Idee vonVerwendung von 3D - Kulturen , die Zellen ^{8, 12, 13} zu aktivieren. Außerdem Genaktivierung in 3D Kulturen erschienen Mechanismen zu rekapitulieren, zumindest teilweise der Zellaktivierung nach Injektion in ¹² Mäusen. Durch die in den Experimenten MSCs vor ihrer Verwendung zu aktivieren, Auswirkungen der Zellen verlängert werden könnte , und mehr im Vordergrund als die traditionelle MSC Wirkung in vivo oft verzögert und vorübergehend, und kann als "Hit and Run" beschrieben werden. In den letzten Jahren wichtige funktionelle Studien MSC Sphäroide verwenden , haben gezeigt , dass sie Entzündungsreaktionen zu unterdrücken und zu modulieren Immunität in vivo durch Effektorzellen , wie beispielsweise Makrophagen, dendritischen Zellen zu beeinflussen, Neutrophile und T - Zellen Sphäroide eine attraktive Form grundierte MSCs ² Herstellung ^{, 3.} Zusätzlich Herstellung von Anti-Krebs-Moleküle, wie interleukin-24 (IL-24) und Tumor - Nekrose - Faktor-verwandten Apoptose-induzierenden Liganden (TRAIL), werden in 3D - Kulturen von MSCs relativ erhöht MSCs zu Monoschicht ein Phänomen , das für die gezielte Krebstherapien ^{8, 10, 14} ausgenutzt werden könnte.

Da die traditionelle MSC Kultur nicht nur die Verwendung von Gewebekulturkunststoff erforderlich, sondern auch FBS, auf eine weitere Hürde zugänglich MSC Sphäroiden mehr machen für die klinische Anwendung zu überwinden hatte. Um diese Hürde bewältigen, wir die Bildung von Sphäroiden MSC unter bestimmten Bedingungen chemisch definierten XF kürzlich gezeigt und festgestellt , dass die resultierenden MSC Sphäroide wurden die gleichen entzündungshemmenden und anti-Krebs - Moleküle , wie die Sphäroide in Bedingungen mit ¹⁴ FBS erzeugt herzustellen aktiviert. Hier werden diese Erkenntnisse in mehreren ausführlichen Protokolle vorgestellt, die die Erzeugung von voraktivierten MSCs in 3D-Kulturen unter Verwendung von XF zeigenMedien. Außerdem werden Protokolle vorgestellt, die effektivsten Möglichkeiten, beschreiben die Aktivierungsstufen der MSCs in Bezug auf ihre entzündungshemmende, immunmodulierende und Anti-Krebs-Wirkung, zusammen mit einem praktischen Verfahren zur Beurteilung der intakten Sphäroiden in Mäuse zu liefern.

Protocol

1. MSC Isolierung und Expansion

1. Erhalten frühen Passage MSCs von Zentrum für die Vorbereitung und Verteilung von adulten Stammzellen ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html ) ¹⁵ als gefrorene Fläschchen. Alternativ isolieren MSCs aus Aspiraten Knochenmark eine Routine - Protokoll nach dem ^14. und speichern , wie gefrorene Fläschchen.
2. Bereiten komplettem Kulturmedium (CCM), die minimal essential medium alpha (& agr; MEM), ergänzt mit 15-20% Aufschlag wählen FBS, 2 mM L-Glutamin und 1x Penicillin-Streptomycin. Sterilisieren des Mediums durch Filtration.
3. Platzieren 30 ml CCM in eine 150 mm Zellkulturschale und inkubiere die Schale für 30 min bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO _2.
4. Inkubiere die gefrorene Ampulle etwa 10 ⁶ MSCs für 2 min in einem 37 ° C Wasserbad enthält.
5. Übertragen Sie den Inhalt des Fläschchens in die Kulturschale eine 5 ml serologische Pipette und waschen Sie die Fläschchen mehrmals mit 1-2 ml CCM aus der Schale Restzellen zu erfassen. Die Schale über Nacht in einem geeigneten Inkubator.
6. werden gründlich Kultur zweimal mit Raumtemperatur phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und die MSCs mit 3 ml Trypsin / (EDTA) -Lösung vorgewärmten 0,25% abnehmen. Detachment dauert in der Regel ca. 3-4 min im Inkubator.
7. Neutralisieren Sie die Trypsin in der Schale mit 6 ml CCM vorgewärmt auf 37 ° C und übertragen Sie die Zellsuspension in einem 50 ml konischen Röhrchen. Kombinieren Sie mit Waschungen mit PBS Zellausbeute zu maximieren.
8. Zentrifugation der Zellen (450 · g) für 10 min bei Raumtemperatur und den Überstand aspirieren.
9. Wieder die Zellen in einem kleinen Volumen von CCM und zählen Sie die lebenden Zellen ein Hämozytometer und unter Verwendung von Trypanblau.
10. Seed eine entsprechende Anzahl von 150 - mm - Schalen bei 100 Zellen / cm ²
11. Ernten Sie die Zellen wie oben beschrieben mit Trypsin / EDTA und vereinen alle Zellen in einem einzigen konischen Röhrchen mit dem entsprechenden Medium. Zentrifuge wieder und die Zellen in einem kleinen Volumen des gleichen Mediums für Zellzählungen resuspendieren. Verwenden Sie Standard-CCM (mit FBS) oder verschiedenen im Handel erhältlichen XF Medienformulierungen, die hier als XF Medium-1 (XFM-1) und XF Medium-2 (XFM-2), sowohl mit als auch ohne menschliches Serumalbumin (HSA, 13 mg / ml) Supplementierung.

2. Herstellung von aktivierten MSC Sphäroide in 3-D Hängetropfen Cultures unter Bedingungen XF

1. Zu erzeugen Sphäroide von etwa 25.000 Zellen, verdünne die geernteten MSCs in CCM, XFM-1, XFM-1 + HSA (13 mg / ml), XFM-2 oder XFM-2 + HSA (13 mg / ml) in 714-Zellen / & mgr; l.
2. Pipette 35 ul / Tropfen der Zellen aufdie Unterseite einer 150 mm Kulturschale invertiertes Deckel. Mehrere Tropfen unter Verwendung einer Mehrkanalpipette leicht pipettiert werden können.
   HINWEIS: Wenn größere oder kleinere Sphäroiden gewünscht werden, ändern Sie die Zellkonzentration oder das Tropfenvolumen (25-45 ul) entsprechend.
3. Übertragen Sie 20 ml Raumtemperatur PBS in den Boden der Schale und in einem kontinuierlichen und gleichmäßigen Bewegung des Deckels drehen, um die Tropfen enthält, so dass die Tropfen Scheiteln nach unten zeigen. Setzen Sie den Deckel vorsichtig auf den Boden der Kulturschale.
4. Übertragen Sie die Schale in den Inkubator für 3 Tage ohne sie zu stören entsprechende Kugel Montage zu ermöglichen.
5. Nach 72 h beginnen, die Sphäroid Ernte durch den Deckel vorsichtig zu entfernen und es so, dass die Tropfen wieder invertiert, nach oben zeigen.
6. Winkel der Deckel auf etwa 10-20 ° und die Tropfen schieben, die Sphäroiden enthält, an die Plattenkante eine Zelle Lifter.
7. Übertragen Sie die Kugeln und Medium in einem 15 ml konischen Röhrchen mit einem 1000 ul Rohrtte. Verwenden Raumtemperatur PBS und die Pipette mit der gleichen Spitze der Platte zu waschen und die maximale Rückgewinnung von Sphäroiden gewährleisten.
8. Zentrifuge für Echtzeit-PCR-Assays (Protokoll 3), die Kugel-Suspension bei 450 xg für 5 min bei Raumtemperatur und den Überstand aspirieren. Waschen Sie die Sphäroiden mit PBS und wiederholen Sie die beiden Zentrifugation und Aspirationsschritte. Für die Lieferung in Tiere (Protokoll 8), erlauben Kugeln in den Boden des Rohres (~ 3-4 min) ohne Zentrifugation zu begleichen.

3. Real-time PCR von entzündungshemmenden und Anti-Krebs-Marker

1. Verwenden, um die RNA-Extraktions-Kits mit Homogenisator Säulen und RNase-Free-DNase Set DNA-freie Gesamt-RNA aus einschichtigen MSCs (Protokoll 1) und MSC Sphäroide (Protokoll 2), die mit PBS gewaschen und zentrifugiert, zu isolieren.
2. Lyse mindestens 100.000 einschichtigen MSCs und 20 Sphäroide aus jedem Zustand in getrennte 15 ml konischen Röhrchen mit RLT-Puffer, enthaltend β-Mercaptoethanol (1: 100).
3. Transfer die gründlich gemischt Lysate in 1,5 ml RNase-freie Röhrchen und in einen Gefrierschrank (-80 ° C) für mindestens 3 Stunden in Sphäroid Lyse zu unterstützen.
4. Tauen die Zelllysate auf Eis, Wirbel kurz, und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für die RNA-Isolierung eines im Handel erhältlichen Säugetier-Gesamt-RNA Isolation Kit.
5. Quantifizieren und die Qualität der isolierten RNA beurteilen mit einem Spektralphotometer.
6. Verwenden Sie die High Capacity cDNA Reverse Transkription-Kit oder gleichwertig gemäß den Anweisungen des Herstellers cDNA für die PCR in Echtzeit zu erzeugen.
7. Legen Sie cDNA-Proben, die im Handel entwickelt Echtzeit-PCR-Primer / Sonden (Gene Expression Assays) und PCR Master Mix auf Eis. Verwenden Primer / Sonden für GAPDH (Kontrolle), PTGS2 (COX-2, anti-inflammatorische), TNFAIP6 (TSG6, entzündungshemmend), TRAIL (anti-Krebs) und IL-24 (anti-Krebs).
8. Bereiten Sie die Echtzeit-PCR-Reaktionen gemäß den Anweisungen des Herstellers für Gene Expression Assays und Fast Universal Master Mix.
9. Folgen Sie den Richtlinien für die Echtzeit-PCR-Instrument für das Experiment Dokumente zu erzeugen und den Lauf durchführen.
10. Analysieren Sie die Daten , die die ΔΔC _T - Methode durch Berechnung der relativen Veränderungen (relative Menge, RQ) in der Genexpression unter Verwendung von GAPDH als endogene Kontrolle und einschichtige MSCs als Basislinie mit ^{8, 14.}

4. Sammlung von CM für Assays von immunmodulatorischen und Anti-Krebs-Potenzial

1. Ernten Sie die Sphäroiden und CM, wie oben in einem 15 ml konischen Röhrchen beschrieben, eine Zelle Heber und mit einer Pipette, jedoch nicht die Schale Deckel mit PBS waschen, da dies die CM verdünnen.
2. Zentrifuge bei 450 xg für 5 min bei Raumtemperatur, sorgfältig sammeln, um die zellfreie Überstand mit einer Pipette, und den Überstand in 1,5-ml-Röhrchen.
3. Zentrifuge bei 10.000 g für 5-10 Minuten bei Raumtemperatur, sorgfältig sammeln clarified CM mit einer Pipette, und übertragen Sie die CM in neue 1,5-ml-Röhrchen für die Lagerung in einem Gefrierschrank (-80 ° C). Bereiten Aliquote des CM vor dem Gefrieren, wenn sie für mehrere Assays verwendet.
   Hinweis: Vor dem Downstream-Assays durchgeführt wird, PGE2 Konzentration, ein guter Indikator für entzündungshemmende Potential von CM, kann entsprechend den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung eines kommerziellen ELISA-Kits bestimmt werden. TSG6 Konzentration kann ¹⁴ mit einem veröffentlichten Protokoll bestimmt werden.

5. Makrophagen-Assay zur Beurteilung des Entzündungshemmende Potential von MSC-CM

1. Bereiten Sie Makrophagen-Medium, das die von Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das L-Alanyl-L-Glutamin und ergänzt mit 10% Prämie auswählen FBS und 1x Penicillin-Streptomycin besteht. Filter-sterilisieren das Medium.
2. Besorgen Sie sich eine gefrorene Fläschchen von etwa 10 ⁶ J774 Makrophagen der Maus und Inkubation der Flasche für 2 Minuten in einem 37 ° C Wasserbad.
3. Den Überstand aspirieren, zu suspendieren, die Makrophagen in 1 ml-Makrophagen-Medium, und übertragen Sie die Makrophagen in eine 150 mm Petrischale 30 ml Makrophagen-Medium enthält.
4. Ändern Sie das Medium alle 2 Tage und Inkubation der Zellen in den Inkubator, bis etwa 70-80% konfluent.
   HINWEIS: Die Makrophagen nicht haften fest an der Petrischale, so dass nicht genommen werden sollten Pflege Zellen mit Mediumwechsel zu verlieren.
5. Ernte der Makrophagen durch die Makrophagen-Medium auf die Zellen mit einer Pipette Aufsprühen. Übertragen Sie die Zellen in einer 50 ml konischen Röhrchen und zentrifugiere für 5 Minuten bei 200-300 xg und Raumtemperatur.
6. die Zellen in einem kleinen Volumen von Makrophagen Medium für Zellzählungen mit einem Hämozytometer den Überstand aspirieren und suspendieren. Stellen Sie die Konzentration auf 200.000 Zellen / ml mit Makrophagen mirdium.
7. die Einrichtung für den Makrophagen-Assay, fügen 480 ul Makrophagen Medium in die Vertiefungen einer 12-Well-Platte zu starten.
8. Geben Sie 20 & mgr; l Makrophagen Medium in nicht-stimulierten Kontrollvertiefungen und 20 & mgr; l nicht-konditionierten oder MSC-konditioniertem Medium, wie oben hergestellt, in experimentellen Vertiefungen. Mischen Sie das Medium in den Vertiefungen durch Klopfen der Schale.
9. Transfer 500 ul der Makrophagenzellsuspension auf die nicht-stimulierten Makrophagen Kontrollvertiefungen.
10. Stimulieren Sie die restlichen Makrophagen unter Zusatz von 1: 500 bis 1: 1000 von 0,1 mg / ml Lipopolysaccharid (LPS) und 5-10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
11. Übertragen Sie 500 ul der stimulierten Makrophagen in die Vertiefungen mit nicht-konditionierten oder MSC-konditioniertes Medium. Mischen Sie die Vertiefungen durch stetig die Platte mehrmals zu schaukeln.
12. Übertragen Sie die Platte in einen Inkubator für 16-18 Std.
13. Ernten Sie die Makrophagen-konditionierten Medium und Zentrifuge bei 500 xg für 5 min bei Raumtemperatur.
14. Übertragungder Überstand in neue Röhrchen und Assay für Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-α) und Interleukin-10 (IL-10) -Gehalt von kommerziellen ELISA-Kits den Anweisungen des Herstellers folgenden.

6. Splenozyten- Assay die immunmodulatorische Potential von Sphäroid-CM zu beurteilen

1. Bereiten vollständige Splenozyten Medium, das von Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) -1640-Medium, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem FBS, 1x Penicillin-Streptomycin und 2-Mercaptoethanol besteht. Filter-sterilisieren das Medium.
2. Ernte Milzen von euthanasiert-männlich BALB / c - Mäuse durch einen Einschnitt auf der linken Seite des Abdomens über der Milz hergestellt, etwa auf halbem Weg zwischen den Vorder- und Hinterbeine ^14. Übertragen Sie die Milz zu einer 70 & mgr; m Zellsieb die Splenozyten ¹⁴ zu isolieren.
3. Isolieren der Splenozyten / Lymphozyten durch die Milzen durch das 70 um Sieb in eine sterile Petrischale usin drängeng der weiche Gummi / Kunststoff Ende eines Kolbens von einer 2-3 ml ¹⁴ Spritze. Verwenden Sie eine Schleifkreisbewegung die Milzen zu distanzieren.
4. Waschen Sie die Zellsieb mehrmals mit kaltem PBS und Transfer-Zellen aus der Petrischale in einem 50 ml konischen Röhrchen. Füllen Sie den Schlauch mit kaltem PBS und Zentrifuge (500 × g) bei 4 ° C für 10 min.
5. Den Überstand aspirieren und deaktivieren Sie die Zellen aus Erythrozyten durch Inkubation mit 5-10 ml roter Blutkörperchen Lyse-Lösung (pro Milz) für 5-10 min.
6. Beenden Sie die Lyse durch Zugabe von kaltem PBS in das Röhrchen und zentrifugieren für 5-10 min bei 500 xg und bei 4 ° C.
7. Suspend die isolierten Zellen in komplettem Splenozyten- Medium, filtriert durch ein 40 & mgr; m Sieb, und die Zellen zählen eine Zählkammer. Hinzufügen Splenozyten Medium zu der Zellsuspension eine endgültige Zellkonzentration von 10 ⁶ Zellen / ml zu erreichen ,
   HINWEIS: Diese Technik wird typischerweise etwa 3 x 10 ⁷ Splenozyten pro Maus Milz ergibt.
HINWEIS: Die Menge von Splenozyten erforderlich ist, hängt von der Anzahl der Versuchsbedingungen, wie vom Prüfer bestimmt (siehe Schritt 6.9). Für jede experimentelle Probe / Vertiefung, 10 ⁶ Splenozyten sind erforderlich.
8. Transfer 10 ⁶ Splenozyten (stimuliert oder nicht stimuliert) in die Vertiefungen einer 12-Well - Platte und fügen nicht-konditionierten (Kontrollen) oder MSC-CM in Vertiefungen an Endverdünnung von 1: 10-1: 20.
9. Ernten Sie die Splenozyten-CM nach 24 Stunden und Zentrifuge bei 500 xg für 5 min bei Raumtemperatur.
10. Den Überstand in neue Röhrchen und Assay auf Interferon-gamma (IFN-γ) -Gehalt durch kommerzielle ELISA-Kit nach den Anweisungen des Herstellers.

7. Prostatakrebs-Assay die Anti-Krebs-Potenzial der Sphäroid-CM zu beurteilen

1. Bereiten vollständigen RPMI-Wachstumsmedium, das RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% FBS, 1x Penicillin-Streptomycin.
2. Besorgen Sie sich eine gefrorene Fläschchen von Prostatakrebszellen LNCaP und Inkubation der Flasche für 2 Minuten in einem 37 ° C Wasserbad.
3. Transferieren des Inhalts des Fläschchens in eine Kulturschale mit 30 ml vollständigem RPMI-Wachstumsmedium ein motorisiertes Pipettiergerät und ein 5 ml serologische Pipette. Waschen Sie die Fläschchen mehrmals mit dem Medium aus der Schale und die Schale in den Inkubator.
4. Kurz bevor die Zellen Konfluenz erreichen, waschen Sie die Kultur zweimal mit Raumtemperatur PBS und die LNCaP-Zellen mit 3 ml Trypsin / EDTA-Lösung vorgewärmten 0,25% abnehmen.
5. Neutralisieren des Trypsins in der Schale mit dem vollständigen RPMI-Wachstumsmedium übertragen und die Zellen zusammen mit Waschungen in einen 50 ml konischen Röhrchen.
6. Zentrifugieren der Zellen bei 450 xg für 10 min bei Raumtemperatur und den Überstand aspirieren.
7. Resuspendieren der Zellen in ein kleines Volumen des kompletten RPMI Wachstumsmedium und zählen die Krebszellen eine Zählkammer.
8. eine Zellwachstumstest ein Zellproliferations-Assay-Kit, anzusaugen, das Medium aus den Vertiefungen und übertragen die Platte in einen Gefrierschrank (-80 ° C) für mindestens 3 Stunden durchzuführen, verwendet wird.
   1. Aufzutauen, die Platte und lysieren in jeder Vertiefung, die Zellen durch Zugabe von 100 & mgr; l Reagens Zelllyse enthält 180 mM NaCl, 1 mM EDTA und 0,2 mg / ml RNase A.
   2. Für eine Standardkurve, lysieren die bekannte Mengen von LNCaP-Zellen, wie oben beschrieben.
   3. Nach 1 Stunde werden 100 ul Zelllyse-Puffer 1x 1, enthaltend: 100-Verdünnung von Zellproliferationsassay-Reagens und die Fluoreszenz in jeder Vertiefung messen die Zellmenge zu bestimmen.

8. intraperitoneale Lieferung von Intact Sphäroiden

1. Bereiten Sie Sphäroid MSCs wie oben (Protokoll 2) und resuspendieren t beschriebener Kugeln in steriler Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) mit 0,2-0,5% HSA ergänzt XF Bedingungen aufrechtzuerhalten. HSA in der Lösung hilft beim Spritz sphere Adhäsion an Kunststoff zu verhindern.
2. Übertragen 40-120 Sphäroiden in 15 ml konische Röhrchen und die Zellen werden durch Zugabe von 6 ml HBSS / HSA zu den Rohren. Lassen Sie 3-4 min für Kugeln abzusteigen. Bereiten Sie eine unabhängige konische Röhre von Sphäroiden für jedes Tier. Auch bereiten zusätzliche Rohre von Sphäroiden für Assays Bestimmung Sphäroid Retention (siehe 8.18 unten) und Herstellung von therapeutischen Faktoren nach der Übertragung (siehe 8.19 unten), falls gewünscht.
3. Den Überstand aspirieren, überlagern die Sphäroiden mit 100-200 ul sterilem HBSS mit 0,2 bis 0,5% HSA ergänzt, und legen Sie die Röhrchen auf Eis.
4. Kurz betäuben für ca. 2 min in der Induktionskammer, die Tiere mit 2% Isofluran in 100% Sauerstoff bis zum Verschwinden von Pinch-Zehenreflex.
5. Legen Sie das Tier innerhalb des BSL-2 Schrank, dorsalen Aspect unten (Bauchseite nach oben), mit dem kontinuierlichen Fluss von 1,5% Isofluran / Sauerstoff-Gemisch über einen Nasenkegel.
6. Reinigen Sie die untere Maus Bauch mit einem Antiseptikum wie 70% Alkohol.
7. Entfernen Sie die Kappe des 20 G intravenös (iv) Katheter und führen Sie die intraperitoneale Injektion mit dem Katheter-Stilett Montage. Mit einer Hand die Maus Haut zu halten und eine andere die Injektion durchzuführen. Suchen Sie den Injektionspunkt etwa in der Mitte eines künstlichen Linie ein gebeugtem Kniegelenk und im Genitalbereich mit der Nadelspitze in Richtung des Mittellinie zu verbinden.
   HINWEIS: Die Katheter-Stilett Anordnung weist einen höheren Widerstand als eine normale Nadel, muss daher darauf geachtet werden, wie die Nadel nicht zu tief in den Bauch zu injizieren, die zu Verletzungen der inneren Organe führen kann. Penetration der Haut und dann Muskeln / Peritonealmembranfunktion kann während der Platzierung des Katheters zu spüren sein.
8. Die Baugruppe vorsichtig Metall-Stiletto / Nadel aus dem Katheter-Stilett zu entfernen. Check die Stilett für Blut, Urin und Kot und entsorgen. Blut auf der Nadel zeigt Einstich von inneren Organen (n).
9. Halten der Kunststoffkatheter in einer aufrechten Position während des Injektionsfluidströmung zu ermöglichen.
10. Bestätigen Sie die richtige Platzierung des Kunststoff-Katheter von etwa 100 ul sterilem HBSS / HSA durch den Katheter Injizieren einer Pipette mit einer 100-200 ul Spitze verwenden. Das Ende der Pipettenspitze im Inneren des Katheters Spritzenadapter eine dichte Abdichtung bildet. injizieren Sie langsam die Flüssigkeit in der Bauchhöhle.
    ANMERKUNG: Die Flüssigkeit in einem richtig positionierten Katheter mit nur geringfügigen Anpassung des Katheters im Inneren der Bauchhöhle frei fließen. Eine falsche Platzierung des Katheters (subkutan oder intra Darm-, oder wenn die Spitze der Nadel Peritonealdialyse Organe verletzt wie Nieren) wird Widerstand zu erhöhen und den Fluss zu reduzieren. Subkutan Platzierung wird in einer Formation von einer offensichtlichen "Blase" unter der Haut führen.
11. Collect ter MSC Sphäroiden, hergestellt in 100-200 ul HBSS / HSA (Schritt 8.3), eine 200 & mgr; l-Pipettenspitze verwendet, und übertragen das gesamte Volumen der Kugeln (40-120 Kugeln) in die Bauchhöhle durch den Katheter, wie oben beschrieben.
12. Waschen Sie die Röhrchen Kugeln mit 100 ul HBSS / HSA unter Verwendung der gleichen Spitze wie oben zu sammeln alle restlichen Sphäroiden und injizieren sie in die Bauchhöhle enthält.
13. (Optional) Injizieren weitere 100 & mgr; l HBSS / HSA in die Bauchhöhle des Katheters zu waschen.
14. Legen Sie die Gazeauflage getränkt in antiseptisch über den Katheter und langsam den Katheter aus der Bauchhöhle zu entfernen und entsorgen.
15. Massieren Sie die Bauchhöhle mit den Fingern eine gleichmäßige Verteilung der Sphäroide zu gewährleisten.
16. Lassen Sie das Tier unter Aufsicht erholen und achten Sie auf von der Injektionsstelle Blutungen.
17. Untersuchen Sie den Katheter und 15-ml-Röhrchen für die restlichen Sphäroiden. Es ist normal, ein paar Kugeln in die zu beobachtenKatheter / Schlauch.
    HINWEIS: Die Technik zur MSC Sphäroid Lieferung beschrieben können für die Verwendung in normalen Tieren oder in einer Vielzahl von Verletzungen Modelle übernommen werden. Diese Technik wurde erfolgreich einzuspritzen Sphäroide in Maushornhautverletzung und Endotoxämie Modelle sowie in einer Zymosan-induzierte Peritonitis - Modell ⁸ verwendet.
18. Um die Anzahl der zurückbehaltenen Sphäroiden (optional) zu quantifizieren, verwenden, um eine DNA-basierte Zellzahl Quantifizierung kit / Reagenz. Halten Sie die verwendeten Katheter über den 15-ml-Röhrchen und kräftig HBSS / HSA durch den Katheter verzichtet werden zurück in die 15-ml-Röhrchen alle verbleibenden Kugeln zu erzwingen.
    1. Zentrifugieren Sie die 15-ml-Röhrchen bei 500 g für 5 Minuten bei Raumtemperatur und den Überstand aspirieren. Übertragen, um das Rohr das Sphäroid Pellet in einen Gefrierschrank (-80 ° C) für mindestens 3 Stunden enthält.
    2. Auftauen das Rohr und lysieren die Kugeln durch Zugabe von 500 & mgr; l Reagens Zelllyse enthält 180 mM NaCl, 1 mM EDTA und 0,2 mg / ml RNase A.
    3. Für eine Steuer, freeze und lysieren eine bekannte Menge von Sphäroiden (vorzugsweise gleich der Anzahl von Sphäroiden für eine einzelne Injektion hergestellt) wie oben beschrieben.
    4. Nach 1 Stunde, dann 100 & mgr; l des Zelllysats in zweifacher Ausfertigung in einer 96-Well-Mikroplatte und fügen Sie eine Verdünnung von 1:50 der Zellproliferation Testreagens aus dem Satz zu jeder Vertiefung 100 ul 1x Zelllysepuffer enthält. Nach 10 min Messung der Fluoreszenz in jeder Vertiefung, die Anzahl der Kugeln zu bestimmen, die durch einen Vergleich der experimentellen Probe (n) mit der Kontrollprobe nicht injiziert.
19. Bewerten Sie die Aktivierungsniveau von Sphäroiden zur Injektion (optional) durch die Konzentration von PGE2 Messen und TSG6 durch übertragen Kugeln hergestellt. Transfer 40-120 Kugeln durch den Katheter, wie oben beschrieben, in eine 12-Well-oder 6-Well-Platte mit 1 oder 2 ml & agr; MEM, supplementiert mit 2% FBS und 1 x Penicillin / Streptomycin. Legen Sie die Platten in den Inkubator für 6 Stunden.
    1. Übertragen Sie das Medium ausdie Vertiefungen nach 6 h in 1,5 oder 15 ml-Röhrchen und die Röhrchen für 5 min bei Raumtemperatur bei 450 xg zentrifugiert.
    2. Übertragen Sie die zellfreie Überstand in frische 1,5-ml-Röhrchen mit einer Pipette und Zentrifuge bei 10.000 × g für 5-10 Minuten bei Raumtemperatur verwenden.
    3. Übertragen Sie die geklärte CM (Überstand) in neue 1,5-ml-Röhrchen und Assay für PGE2-Konzentration (guter Indikator für entzündungshemmende Potential von CM) mit einem im Handel erhältlichen ELISA-Kits nach den Anweisungen des Herstellers. TSG6 Konzentration kann ¹⁴ mit einem veröffentlichten Protokoll bestimmt werden.

Representative Results

In der aktuellen Arbeit wurden hängenden Tropfen Kulturen unter XF Bedingungen kompakten sphärischen Mikrogeweben oder "Sphäroiden" von aktivierten MSCs zu erzeugen. Die Prüfpräparate Roadmap in 1 veranschaulicht , dass MSCs zur Selbstorganisation gefördert werden in Sphäroide wenn in hängenden Tropfen für 72 Stunden ausgesetzt, wonach die Sphäroide oder das CM mit Kugel abgeleiteten therapeutischen Faktoren geladen wird , kann sowohl gesammelt und möglicherweise genutzt werden , Forschung und klinische Anwendungen. Die große Anzahl von Zellen für die Sphäre der Produktion benötigt werden , können durch Impfen der MSCs bei niedriger Dichte, in der Regel 100 bis 200 Zellen pro cm ^2, und dann die Zellen für 6-7 Tage , bis etwa 80% konfluent (Abbildung 2 expandiert innerhalb einer Woche erworben werden ). Das Zellwachstum Kinetik, bestimmt durch Zählen täglich lebenden Zellen zeigten , dass eine robuste Expansionsphase (Tag 3-7) folgt eine kurze Verzögerungsphase von 1-2 Tagen (2C </ Strong>). MSCs in Durchgang 2 oder 3 ergeben typischerweise 50-100000000 Zellen, die aus einem einzigen Fläschchen von 1 Million kryokonservierten Zellen, wenn sie in CCM.

Nach Ausbau und die Ernte werden die MSCs bei hohen Zellkonzentration ausgesetzt Sphäroiden zu erzeugen, in der Regel 500-1000 Zellen pro ul. Hängenden Tropfen Kulturen werden durch Transferieren 25-40 ul Tröpfchen Medium hergestellt , die die MSCs an der Unterseite einer Gewebekulturschale mit Deckel enthält, die anschließend umgedreht wird und in geeigneter Weise positioniert , auf der Basis der Schale (3). Wenn in 35 & mgr; l Tropfen CCM bei 714 Zellen pro & mgr; l (dh 25.000 Zellen pro Tropfen) suspendiert, montieren MSCs zuerst in kleine Aggregate , die schließlich eine einzige kompakte Kugel bei 72 h in der Spitze des Tropfens (3C) zu erzeugen koaleszieren. Sphäroiden auch in verschiedene Arten von im Handel erhältlichen XF Medien optimiert für MSC Expansion über 72 Stunden bilden, Hier bezeichnet als XFM-1 und XFM-2. Jedoch ist die Bildung von kompakten Kugeln in XFM-1 erfordert eine Supplementierung mit 13 mg / ml Humanserumalbumin (HSA), eine Konzentration, die die geschätzte Gesamtproteingehalt in CCM (Abbildung 3D) widerspiegelt. Kompakten Kugeln nicht leicht in basischen XFM-1 ohne HSA oder in proteinfreien & agr; MEM (3D) bilden. Während Kugelanordnung Phänotyp MSC Änderungen radikal (Abbildung 4), und wenn in dem entsprechenden chemisch definierten XF Medium (dh XFM-1 + HSA), Expression zahlreicher entzündungshemmende Faktoren werden aufreguliert einschließlich PGE2 und TSG6 (4C). Jedoch ist die Herstellung von TSG6 und PGE2 wird nicht merklich in MSCs gezüchtete als Kugeln in XFM-2 ergänzt oder XFM-1 ohne HSA (4C). Bemerkenswert ist dieser entzündungshemmenden Faktoren, sowie die Anti-Krebs-Faktoren TRAIL und IL-24 wurden in Sphäroid MSCs relativ zu Monoschicht MSCs stark hochreguliert, wenn ter Kugeln wurden in XFM-1 ergänzt mit entweder rekombinantem HSA (rHSA) oder klinischer Güte HSA (cHSA) , hergestellt aus menschlichem Blut (4D).

Um das therapeutische Potential von MSC Kugeln , hergestellt in verschiedenen Medienformulierungen, mehrere praktische Tests durchgeführt (Figur 5) zu bewerten. Die immunmodulatorischen Eigenschaften von Sphäroiden werden zuerst durch Messung der Auswirkungen der Kugel CM auf den Ebenen von Zytokinen , hergestellt durch LPS-stimulierte Makrophagen und CD3-stimulierten Splenozyten / Lymphozyten (Figur 5) in vitro bestimmt. CM von MSC Kugeln gezüchtet in CCM und XFM-1 / HSA deutlich unterdrückt die Produktion von Makrophagen - TNF & alpha; und IFN & ggr; Splenozyten, während gleichzeitig erhöhte Mengen des anti-inflammatorischen Zytokins IL-10 (5A und 5B). Die Anti-Krebs-Eigenschaften von Kügelchen werden durch die Messung der Auswirkungen von sphere CM o evaluiertn Wachstum und Morphologie von LNCaP-Prostatakrebszellen. Der XF Medium XFM-1 / HSA effektiv LNCaP Proliferation ähnlich wie FBS enthaltenden CCM (5C und 5D) reduziert.

Wichtig ist , dass intakte MSC Kugeln in die Bauchhöhle von Mäusen verabreicht werden , um die entzündungshemmende Aktivität der Zellen in vivo (Abbildung 6) zu testen. Für diese Experimente werden Kugeln für die Injektion in HBSS hergestellt, der eine niedrige Konzentration von HSA enthält, die ihre Haftung auf Kunststoffschlauch minimiert, während ein XF-Zustand zu erhalten. Anschließend kann Kugeln leicht nach aus dem Sammelrohr (6A) Transfer injiziert werden, eine Pipette (6B) unter Verwendung von durch eine Nadel / Katheter - Anordnung (6C und 6D) in geeigneter Weise für eine Standard - intraperitoneale Injektion positioniert. Mit diesem Ansatz kann MSC Sphäroiden werden regelmäßigbei einem Wirkungsgrad von mehr als 90% (6E und 6F) übertragen , ohne ihre Integrität (6G und 6H) zu stören. Falsche Positionierung der Katheterspitze innerhalb der Bauchhöhle führt zu einer schlechten sphere Lieferung und hohe Retention (6F). Wichtig ist, dass Niveau der Kugelbindung innerhalb der Pipette / Katheter qualitativ durch visuelle Inspektion bestimmt werden oder quantitativ durch das Sammeln / die zurückgehaltenen Kugeln Lysieren und die Zellzahl mit einem im Handel erhältlichen DNA-basierte Zell Quantifizierung Reagenz / kit (6F) zu messen. Nacheinspritzung Kugel Retentionsanalyse hilft während des Experimentierens Ein- / Ausschlusskriterien erstellen. Die Möglichkeit für CCM und XFM-1 / HSA Sphäroide Insbesondere hohe TSG6 und PGE2 abzusondern mindestens 6 Stunden nach der Überführung der Kugeln aus hängenden Tropfens Kulturen (Figur 6I) gehalten. Ähnlich wie ihre in vitro efXFM-1 / HSA Kugeln in die Bauchhöhle von Mäusen injiziert, unmittelbar im Anschluss an die Induktion der systemischen Entzündung durch iv Verabreichung von LPS, erhöhte PGE2 und IL-10 - Spiegel im Peritoneum fekte, während abnehm proinflammatorischen TNFa (Figur 6J).

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Plattform für die Nutzung der Sekretom von MSCs grundiert als sphärische Mikrogewebe unter XF Bedingungen entwickelt. Nach Expansion als Monolayer-Kulturen (1) werden die MSCs in hängenden Tropfen aus dem Deckel einer Kulturschale (2) mit hoher Zellkonzentration suspendiert die Zellen zu aktivieren / Prime. Nach 72 h sowohl die (3) konditioniertes Medium (CM) und (4) intakt Sphäroide können aus den Tröpfchen und verwendet in verschiedenen Downstream-Anwendungen geerntet werden. Das CM ist reich an immunmodulierende Faktoren sowie andere therapeutische components. Die kompakten Sphäroide , die in hängenden Tropfen bilden kann leicht mit einer Pipette (5) übertragen werden , unter Verwendung von und wirksam in vivo durch einen Katheter verabreicht wird (6). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Wachstumscharakteristika von Knochenmark abgeleiteten MSCs in Monolayerkulturen. MSCs in Durchgang 2 wurden in 15 cm - Schalen mit geringer Dichte (pro cm ² 100 Zellen) ausgesät (15000 Zellen pro Schale) und kultiviert für 7 Tage in CCM. Das Medium wurde am Tag 3 geändert und dann erneut am Tag 5 oder 6 (24-48 h vor der Ernte). Repräsentative Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen von MSCs 3 Tage (A) und 7 Tage (B) nach dem Ausplattieren der Zellen. Maßstabsbalken = 200 & mgr; m. (C) Wachstumskinetik MSCserhalten von 3 Spendern wurden durch Zählen der Zahl der lebenden adhärenten Zellen täglich von Tag 2 bis Tag bestimmt 7. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Darstellung von Tropfen Kulturen hängen zum Grundieren MSC Sphäroide in XF Medium. (A) Fotografisches Bild der Technik darstellend schnell zu Schicht Tropfen auf der Unterseite einer Gewebekulturschale Deckel hängt. (B) hängen Photo zeigt , fällt nach der Inversion und Positionierung des Deckels auf die Schale Basis. (C) zeitabhängige Änderungen in der Aggregation von 25.000 MSCs in einem hängenden Tropfen , wie durch Phasenkontrastmikroskopie visualisiert. Das Ziel wurde auf die Spitze des Tropfens fokussiert. Maßstabsbalken = 500 & mgr; m. (D) Images von MSC Kugeln in hängenden Tropfen Kulturen mit verschiedenen Medienformulierungen einschließlich & agr; MEM mit und ohne FBS (dh CCM), XFM-1 mit und ohne HSA und XFM-2 mit und ohne HSA nach 3 Tagen gebildet. Maßstabsbalken = 200 & mgr; m. Daten in das Panel D wurden aus dem Original - Artikel mit freundlicher Genehmigung des Verlags ¹⁴ erhalten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: Bewertung der MSC Aktivierung in 3-D XF Kulturen. (A) Spheres / CM werden nach 72 Stunden geerntet durch Umkehren / Neigen des Schalendeckel und zwingt die Tröpfchen an den Rand einer Zelle Lifter. Kugeln aus 25.000 Zellen zusammengesetzt leicht während der Sammlung sichtbar gemacht werden. (B) Fotografie von ungefähr 500 Kugeln aus Deckeln von zahlreichen Gewebekulturplatten gesammelt. Spheres abstammen schnell auf den Boden des Röhrchens ohne Zentrifugation. (C) Stufe von PGE2 von MSC Sphären abgesondert nach 72 h mittels ELISA gemessen. Echtzeit-RT-PCR wurde verwendet, TSG6 Ebenen zu messen. Sowohl TSG6 und PGE2 sind wertvolle Marker für das Screening von MSC Aktivierung in Sphäroiden. Der XF Medium XFM-1 + HSA zeigte hohe PGE2 und TSG6 Produktion (rote Kästen). Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt und wurden durch den Student-t-Test (*** p <0,001 im Vergleich zu & agr; MEM Probe) analysiert. (D) PGE2 - ELISA und real-time RT-PCR - Assays auf Kugeln in CCM hergestellt und XFM-1 spezifisch mit 13 mg / ml rekombinantem HSA (rHSA) ergänzt oder klinischer Güte HSA (cHSA) aus menschlichem venösem Blut hergestellt. Falten Sie Änderungen wurden von adhärenten einschichtigen MSCs (RQ = 1) bestimmt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt und wurden durch den Student-t-Test analysiert (** p <0,01 *** p <0,001 im Vergleich zueinschichtige MSCs). Einige Daten in den Feldern C und D wurden aus dem ursprünglichen Artikel mit freundlicher Genehmigung des Verlags ¹⁴ erhalten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5: In vitro funktionelle Assays zur Bewertung der entzündungshemmende und Anti-Krebs - Eigenschaften von MSC-CM von hängenden Tropfen Kulturen gesammelt. (A) Repräsentative Ergebnisse der ELISAs die Auswirkungen der Kugel CM (CCM und XFM-1 / HSA) auf die Produktion von TNF & agr; und IL-10 durch LPS-stimulierten Maus - Makrophagen (MQ) zeigt. (B) Repräsentative Ergebnisse von ELISA zeigt die Auswirkungen der Kugel CM (CCM und XFM-1 / HSA) auf die Produktion von IFNy durch Maus - Splenozyten (SPL) stimuliert mit einem anti-CD3 - Antikörper. (C) Phasenkontrast - Aufnahmen von LNCaP Prostatakrebs mit basischen CCM behandelten Zellen und XFM-1 / HSA oder konditionierte Medium (CM) von MSC Kugeln , hergestellt in CCM und XFM-1 / HSA. LNCaP-Zellen wurden in RPMI-Medium (Kontrolle). Maßstabsbalken ist 200 & mgr; m. (D) quantitative Veränderungen in Wachstum der LNCaP - Prostatakrebszellen wurden mit einem handelsüblichen DNA-basierte Zellquantifizierung Reagenz / kit bestimmt. Die gestrichelte Linie zeigt Aussaatdichte von 5.000 Zellen pro Vertiefung. Daten in allen Panels sind als Mittelwert ± SD gezeigt und wurden durch den Student-t-Test analysiert (*** p <0,001). Einige Daten in allen Platten wurden aus den ursprünglichen Artikel mit freundlicher Genehmigung des Verlags ¹⁴ erhalten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Last / 55126 / 55126fig6.jpg "/>
Abbildung 6: Effiziente Übertragung von intakten MSCs Sphäroiden, hergestellt unter XF Bedingungen eine 20G iv Nadel / Katheter - System. (A) Repräsentative Fotografie eines 15 ml konischen Röhrchen mit XFM-1 / HSA MSC Kugeln zur Injektion in HBSS mit 0,2% HSA. (B) Repräsentative Fotografie der MSC Kugeln nach dem Absaugen in eine 200 ul Pipettenspitze. (C) Bild der 20 G - Nadel / Katheter - Anordnung verwendet intakt MSC Sphäroiden in Mäuse zu verabreichen. (D) Bild zeigt die richtige Positionierung der Pipettenspitze in den Adapter des Polyurethan - Katheters. (E) Bild der MSC Kugeln unmittelbar nachdem sie durch den Katheter in eine Kulturschale verläuft. Ca. 95 Kugeln aus 100 übertragen wurden. (F) Efficiency of sphere Abgabe in die Bauchhöhle von Mäusen wurde durch Sammeln / Lysieren Kugeln in die beibehaltene bestimmtPipette / Katheter und Messzellzahlen über eine kommerzielle DNA-basierte Zellquantifizierungsassay, bezogen auf die Anzahl der von einem vollständigen Komplement lysiert Kugeln erhaltenen Zellen. Gepunktete rote Linie zeigt eine Übertragungseffizienz von 90%. Schlechte sphere Lieferung (71%) wurde mit einer Injektion (Pfeil) beobachtet. (G) Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen von Kugeln in das Panel - E (vergrößerte Ansicht). Maßstabsbalken = 200 & mgr; m. (H) Phasenkontrastmikroskopische Aufnahme eines XFM-1 / HSA Kugel 16 Stunden nach der Übertragung auf eine Gewebekulturschale. Die fibroblastischen, spindelförmige Morphologie von MSCs in Zellen aufrechterhalten, die aus dem Bereich migriert. Maßstabsbalken = 200 & mgr; m. (I) ELISA - Assays für die entzündungshemmende Faktoren TSG6 und PGE2 auf CM durchgeführt wurden gesammelt 6 h nach der Überführung der Kugeln in Platten mit 6 Vertiefungen , die 2 ml & agr; MEM / 2% FBS. Kugeln im Medium XFM-1 XF vorbereitet / HSA zeigte höchste TSG6 und PGE2-Sekretion (rote Kästen). Daten, ausgedrückt als Mittelwert± SD, durch den Student-t-Test (*** p <0,001, im Vergleich zu & agr; MEM-Probe) wurden analysiert. Einige Daten wurden aus dem ursprünglichen Artikel mit freundlicher Genehmigung des Verlags ¹⁴ erhalten. (J) Repräsentative graphische Darstellungen , die Fähigkeit für Sphäroide, in die Bauchhöhle injiziert, peritoneal PGE2 und IL-10 zu erhöhen , während bei Mäusen durch intravenöse Injektion von Endotoxin (LPS) in Frage Niveau TNFa abnimmt. Proben wurden durch peritoneale Lavage 6 h nach Induktion der Entzündung und die Lieferung von 80 Sphäroide erhalten. Daten, ausgedrückt als Mittelwert ± SD, analysiert wurden durch den Student-t-Test (* p <0,05, ** p <0,01 im Vergleich zur Kontrolle). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Die optimale MSC für die Verwendung in einigen Forschung und klinische Anwendungen sollten hoch aktivierten ihren Nutzen zu maximieren, und vorzugsweise unter chemisch definierten XF Bedingungen hergestellt, die Lieferung von potentiellen Antigenen aus xenogenen Mediumkomponenten wie FBS zu minimieren. In den Protokollen hier beschrieben, haben wir Methoden 1 gezeigt) aktivieren MSCs in 3D Kultur durch Bildung von Sphäroiden, 2) erreichen, um die 3D-Aktivierung von MSCs unter Bedingungen XF, 3) Auswertung der Aktivierungsstufen Sphäroid MSCs in Bezug auf ihre anti- entzündungshemmende, immunmodulatorische und Anti-Krebs-Potential und 4) aktiviert MSCs als intakte Sphäroide in Mäuse liefern.

MSCs sind multipotente Stammzellen, die über Kunststoffadhärenz aus zahlreichen adulten Geweben einschließlich Knochenmark und Fettgewebe isoliert werden kann. MSCs werden auf Gewebekulturkunststoff unter relativ hoch (10-20%) FBS Konzentrationen leicht propagiert, eine bestimmte Gruppe von Oberflächenmarkern zum Ausdruck bringen, undzumindest in adipogenen, osteogenen, chondrogenen und Abstammungslinien ^{1, 17 16,} differenziert ^{werden, 18.} MSCs wurden gezeigt , vorteilhafte Wirkungen bei verschiedenen Tiermodellen von menschlichen Krankheiten ausüben, auch wenn sie nur vorübergehend nach ihrer Verabreichung in vivo zu bestehen scheinen. Die Wirkung von MSCs hat deshalb "Hit and Run" genannt worden und oft durch die entzündungshemmende und immunmodulatorische parakrine Faktoren, wie PGE2, TSG-6, und indoleamine 2,3-Dioxygenase (IDO), abgesondert von MSCs vermittelt wird ^{2 , 3, 11, 19, 20, 21.} Um jedoch diese Faktoren zu erzeugen, MSCs erfordern eine Aktivierung entweder durch Signale von beschädigtem Gewebe oder von Immun cells des Empfängers. Anschließend gab es MSC Voraktivierung oder Priming - Protokolle ein aufstrebendes Interesse zu entwickeln vor der Auslieferung der Zellen in Tiere oder Patienten ^22. Auch hat die Anwesenheit von Antigen-FBS Komponenten in Standard-MSC Vorbereitungen Bedenken. Daher wurden Studien durchgeführt, optimal chemisch für MSC-Kulturen definiert XF Bedingungen zu bestimmen. In unserem jüngsten Arbeiten haben wir gezeigt , dass MSCs ersten kann durch die Bildung von Sphäroiden in 3D aktiviert werden, und dann entdeckt , daß Zellaktivierung kann auch unter bestimmten Bedingungen XF ^{8, 12, 13, 14} erreicht werden.

3D-Zellkulturtechniken sind seit Jahrzehnten mit dem Ziel der Bereitstellung von echten physiologischen Bedingungen in der zellbasierten Forschung eingesetzt. Kulturen in 2D die 3D-Natur von Gewebe außer Acht lassen und daher nicht immer rekapitulierendie Zell-Zell- und Zell-Matrix-Wechselwirkungen wichtig in Zellsignalisierung. Viele 3D-Kulturtechniken verwenden rotierenden Behälter, Spinnerflaschen oder verschiedene nicht-adhärenten Oberflächen jedoch der größte Nachteil bei vielen dieser Verfahren ist die Heterogenität der erzeugten Sphäroid Größe und / oder die Anforderung der spezifischen teure Ausrüstung. Die Forschung hat auch Kulturen unter Verwendung von hängenden Tropfen durchgeführt wurde, die im Wesentlichen MSCs fördern spontan Aggregat in einem einzigen Sphäroid ^{4, 5, 6, 7, 8, 9, 23.} Bemerkenswerterweise unterstützt hängenden Tropfens Kulturen Montage von relativ gleichförmigen Mikrogeweben / Aggregate, mit dem zusätzlichen Vorteil, leicht in der Lage, Größe der Zellaggregat manipulieren durch Zellkonzentration eingestellt und / oder Tropfenvolumen. Außerdem Beherrschung der hängenden drop Kulturtechnik erfordert keine umfassende Ausbildung. Tropfen von 25-40 ul kann leicht mit MSCs bei hohen Zellkonzentrationen, typischerweise 500-1000 Zellen pro ul hergestellt werden. Tropfen kleiner als 20 & mgr; l neigen schnell zu verdampfen, und die größer als 45 & mgr; l Abstrich oft über den Deckel während Inversion. Wenn jedoch ein Deckel enthält Tröpfchen jeder Größe, Geschwindigkeit und Direktionalität sind kritische Parameter für die Aufrechterhaltung der Oberflächenspannung und eine geeignete Form des Tropfens / Sphäroid zu betrachten Spiegeln. Ununterbrochene Kultur und einen ausreichenden Luftstrom im Inkubator sind auch wichtig für die in jedem Tropfen der MSCs Aggregat in einer einzigen Kugel zu gewährleisten.

Ein Nachteil dieser Technik ist, dass Platten hängenden Tropfen enthalten, sollten nicht in den Inkubator bewegt oder während des Kugelanordnung gestapelt werden, so dass Scale-up für die Patiententherapie schwierig. Außerdem Mediumwechsel Drop Kulturen hängen extrem schwierig ist, so sollten langfristige Kulturen avoided. Zusätzlich kann die niedrige Medien-Zell-Verhältnis in hängenden Tropfen verursachen Nährstoffmangel und Abfallaufkommen schließlich zum Verlust von wichtigen Zellfunktionen führen und / oder Zelltod.

Doch mit Technik richtigen hängenden Tropfen haben wir gezeigt, dass MSCs in Sphäroiden sehr aktiv werden oder grundiert, dass die Zellen Fabriken der starke entzündungshemmende Moleküle PGE2 und TSG6 werden, sowie die Anti-Krebs-Moleküle IL-24 und WEG. Wir haben gezeigt , dass MSC Sphäroide Tat sind entzündungshemmende und immunmodulierende und haben Anti-Krebs - Eigenschaften überlegen ihre 2D einschichtigen Pendants in zahlreichen funktionellen Assays unter Verwendung von kultivierten Makrophagen, Splenozyten und Prostatakrebszellen ^{8, 12, 13, 14.} Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass MSC Sphäroiden starke entzündungshemmende Wirkungen ausüben können, wenn sie verabreichtin die Bauchhöhle von Mäusen , die mit Peritonitis ^8. Verwendung einer 20G Nadel / Katheter-Anordnung und einer Standardpipette Insbesondere haben wir gezeigt, dass große Sphäroide von etwa 400-500 & mgr; m im Durchmesser (25.000-30.000 jeweils MSCs) effizient in einem kleinen Volumen HBSS geliefert werden. Mit dieser Technik, falsche Katheterplatzierung, die für den Fluidstrom in hohem Widerstand führt, kann leicht bestimmt werden, vor Übertragung auf spheroid indem zuerst ein kleines Volumen an HBSS / HSA Injektion, wie in den Protokollen beschrieben. Die Sphäroide in einem richtig positionierten Katheter fließt frei, sofern die HBSS mit HSA ergänzt sphere Haftung an dem Kunststoffrohr zu minimieren und leicht sichtbar gemacht werden kann. Außerdem verhindert diese Technik auf Zellen Scherspannung, die für die Injektion unter Verwendung einer Standard-Nadel / Spritze auftreten können, und vermeidet die Notwendigkeit für einen chirurgischen Einschnitt, die ein höheres Infektionsrisiko trägt und technisch anspruchsvoll ist. Ein großer Nachteil ist that eine große Anzahl von Sphäroiden kann nur in großen Körperhöhlen, wie beispielsweise die Bauchhöhle injiziert werden, da der Widerstand gegen sphere Übertragung durch den Katheter in hohen engten Bereichen.

Wir kürzlich gezeigt, dass das gleiche Niveau der MSC Aktivierung in Sphäroide unter Verwendung eines spezifischen handelsüblichen XF Medium erreicht werden kann, bezeichnet hier als XFM-1, solange es mit HSA ergänzt wurde aus menschlichem Blut gewonnen oder hergestellt durch rekombinante Techniken ^14. Es ist wichtig , dass MSC Sphäroide hohe PGE2 und TSG6 in allen Arten von Medien ¹⁴ XF, wahrscheinlich weil die meisten XF Medien für MSCs wurden zunächst formuliert für eine optimale Expansion der Zellen in 2D produzieren nicht zu beachten. Es ist auch wichtig zu beachten , dass verschiedene Arten von HSA unterscheiden sich in ihrer Wirkungsstärke ^14. Darüber hinaus erfasst die absolute Höhe der PGE2 in CM von aktivierten Sphäroiden können leichte variierenly als ELISA für PGE2 eingesetzt wird, ist in der Tat ein Konkurrenztest. Daher ist es entscheidend, geeignete Kontrollen in jedem PGE2-ELISA aufzunehmen und direkt zu vermeiden, Daten zwischen den Proben getestet zu unterschiedlichen Zeiten oder in verschiedenen Platten zu vergleichen. Außerdem muss MSCs gründlich in XF-Medium gewaschen werden, bevor hängenden Vorbereitung fällt, um Rest CCM und zu entfernen, daher Begrenzung Verschleppung von FBS-Komponenten. Die Protokolle hier kann leicht angenommen werden beschrieben, um die Expression anderer Medienformulierungen auf Kugelbildung und therapeutisches Gen bewerten.

Offensichtlich sind zahlreiche Zellsignalereignisse, die normalerweise nicht in 2D MSCs auftreten, werden in Bewegung gesetzt, wenn MSCs gezüchtet werden, in 3D. Zell-Zell- und Zell-Matrix - Interaktionen, vermittelt durch Cadherine und Integrine Führungs Sphäroidbildung und Verdichtung ^{24, 25, 26} und sind wahrscheinlich kritisch für Sphäroid Therapie. Da die Zellen aggregieren und comit Folgen in Sphäroiden, verschiedene Stresssignale, einschließlich kleinerer Apoptose, Hilfe im Prozess der MSC - Aktivierung , die ⁴ in der Produktion zahlreicher potentiell therapeutischen Faktoren ^{ergibt, 5.} Wir zeigten zuvor die kritische Rolle der autokrinen IL-1 - Signalisierung in MSC - Aktivierung und die Produktion von PGE2 und TSG6 ^12. Während viel über die verschiedenen Signalwege, die Hilfe bei MSC Aktivierung unbekannt bleibt, bietet der hängende Tropfen Kulturplattform einen praktischen Weg, um dieses Phänomen zu untersuchen und MSC-basierte Therapien zu verbessern. Insgesamt haben wir beschrieben, in den Protokollen hier die Mittel zu aktivieren oder zu MSCs in 3D-Kulturen unter chemisch definierten XF Bedingungen zu produzieren entzündungshemmende, immunmodulatorische und Antikrebs Faktoren Priming. Wir haben auch diese intakt MSC Sphäroiden beschrieben , wie in vivo abgegeben werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM-α (minimal essential medium alpha)	ThermoFisher/Gibco	12561049; 12561056; 12561072	minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium select	Atlanta Biologicals	S11595; S11510; S11550; S11595-24	component of complete culture media for all types of cells
L-glutamine	ThermoFisher/Gibco	25030081; 25030149; 25030164	component of complete culture media for all types of cells
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher/Gibco	15070063	component of complete culture media for all types of cells
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane	MilliporeSigma	SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE	media sterilization
150 mm cell culture dish	Nunc	D8554 SIGMA	cell culture
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator	Thermo Fisher	Model 3110	incubation of cultured cells
Early passage MCSs	Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White	NA	preparation of 2D and 3D cultures of MSCs
water bath	VWR	89501-468	warming media to 37 °C
Pipettes	Eppendorf	492000904	manual liquid handling
Pipete-Aid	Drummond Scientific Company	4-000-300	handling sereological pipetes
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml)	Corning	4487; 4101; 4251; 4490	liquid handling
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4	ThermoFisher/Gibco	10010023; 10010072; 10010031; 10010049	cell culture processing
0.25% trypsin/EDTA solution	ThermoFisher/Gibco	25200056; 25200072; 25200114	lifting adherent cells and dispersing cell aggregates
15 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352097	cell centrifugation
50 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352098	cell centrifugation
Eppendor refrigerated centrifuge	Eppendorf/Fisher Scientific	Model 5810R	cell centrifugation
hemocytometer	Fisher Scientific	26716	cell counting
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154 SIGMA	dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)	ThermoFisher/Gibco	A1067501	Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2)	Stem Cell Technologies	5420	Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells
HSA (Human serum albumin)	Gemini	800-120	Component of xeno-free MSC media
rHSA (recombinant Human serum albumin)	Sigma-Aldrich	A9731 SIGMA	Component of xeno-free MSC media
Total RNA isolation Mini Kit	Qiagen	74104	Total RNA extraction
Qiashredder	Qiagen	79654	Sample homogenization prior to total RNA extraction
RNAse-free DNase Set	Qiagen	79254	On-column DNA elimination during total RNA extraction
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250 ALDRICH	inhibition of RNAses in RLT buffer
Vortex	VWR	97043-562	mixing sample
Spectrophotometer	Biorad	NA	RNA concentration and quality
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher/Applied Biosystems	4368814	transcription of total RNA into cDNA
Gene Expression Assays	ThermoFisher/Applied Biosystems	varies	primer/probe combination for real-time PCR
Fast Universal PCR Master Mix	ThermoFisher/Applied Biosystems	4352042; 4364103; 4366073; 4367846	master mix for real-time PCR reaction
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)	ABI Prizm	NA	real-time PCR
1.5 ml centrifuge tube	Eppendorf	22364111	cell centrifugation, sample collection and storage
(-80 °C) freezer	Thermo Fisher	Model Thermo Forma 8695	sample storage
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit	R&D Systems	KGE004B	estimation of cytokine concentration in the sample
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)	ThermoFisher/Gibco	10566-016; 10566-024;10566-032	macrophage culture media
J774 mouse macrophages	ATCC	TIB-67	mouse macrophage cell line
12-well plate	Corning	3513	in vitro macrophage stimulation
LPS (lipopolysaccharide)	Sigma-aldrich	L4130	in vitro macrophage stimulation
Mouse TNF-a ELISA kit	R&D Systems	MTA00B	estimation of cytokine concentration in the sample
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit	R&D Systems	M1000B	estimation of cytokine concentration in the sample
RPMI-1640 medium	ThermoFisher/Gibco	11875-085	splenocyte culture media
BALB/c mice	The Jackson Laboratory	651	in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified	eBioscience	145-2C11	in vitro splenocyte stimulation
70 μm strainer	Corning	352350	Splenocyte preparation
Red blood cell lysis solution (1x)	Affymetrix eBioscience	00-4333	removal of red blood cells during splenocyte isolation
Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kit	R&D Systems	MIF 00	estimation of cytokine concentration in the sample
LNCaP prostate cancer cells	ATCC	CRL-1740	study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro
DNA-based cell proliferation assay kit	ThermoFisher	C7026	cell number measurement based on DNA content
NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	component of lysis reagent
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	ThermoFisher	FERR1021	calcium chelator, component of lysis reagent
Rnase A	Qiagen	19101	RNA degradation for measurement of DNA
Filter-based multi-mode microplate reader	BMG Technology	NA	Microplate assays (ELISA, cell quantification, etc.)
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher/Gibco	14175079	resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections
Isoflurane	MWI Vet Supply	502017	Anesthesia for in vivo injections
Oxygen, compressed gas	Praxair	NA	For use with isoflurane
Thermo Forma BSL-2 cabinet	Thermo Fisher	Model 1385	Sterile cell culture
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch	Terumo	SR*FNP2025	Delivery of shperoids into peritoneal cavity
Sterile micropipette tips	Eppendorf	varies	liquid/cells handling