Produktion och administrering av terapeutiska mesenkymala stam / Stromacells- (MSC) sfäroiderna Primed i 3-D kulturer Under Xeno fria förhållanden

Abstract

Mesenkymala stamceller / stromaceller (MSC) är mycket lovande i bioteknik och regenerativ medicin. MSCs kan isoleras från flera vuxna vävnader via deras goda vidhäftning till vävnadsodlingsplast och sedan vidare expanderas in vitro, oftast med användning av fetalt bovint serum (FBS). Eftersom FBS kan orsaka MSCs att bli immunogena, dess närvaro i MSC kulturer begränsar både kliniska och experimentella tillämpningar av cellerna. Därför studier arbetskraft i kemiskt definierade xeno-fria (XF) media för MSC kulturer är mycket värdefulla. Många positiva effekter av MSC har tillskrivits deras förmåga att reglera inflammation och immunitet, främst genom utsöndring av immunmodulerande faktorer såsom tumörnekrosfaktor-stimulerad gen 6 (TSG6) och prostaglandin E2 (PGE2). Men MSC kräver aktivering för att producera dessa faktorer och eftersom effekten av MSC är ofta övergående, har stort intresse framkommit att upptäcka sätt att i förväg aktivera celler prior för att deras användning, vilket eliminerar fördröjningstiden för aktivering in vivo. Här presenterar vi protokoll för att på ett effektivt sätt aktivera eller prime MSCs i tredimensionella (3D) kulturer under kemiskt definierade XF förhållanden och att administrera dessa föraktiverade MSC in vivo. Specifikt vi först beskriva metoder för att generera sfäriska MSC mikro vävnader eller "sfäroider" i hängande droppar med hjälp av XF medium och visa hur sfärerna och konditionerat medium (CM) kan skördas för olika applikationer. För det andra, beskriver vi genuttryck skärmar och in vitro funktionella analyser för att snabbt bedöma graden av MSC aktivering i sfäroider, betonar den antiinflammatoriska och anticancer potential hos cellerna. För det tredje beskriver vi en ny metod för att injicera intakta MSC sfäroider i musen peritonealhålan för in vivo effektivitetstestning. Sammantaget protokollen häri övervinna stora utmaningar att få föraktiverade MSCs under kemiskt definierade XF conförhållanden och ger ett flexibelt system för att administrera MSC sfäroider för terapier.

Introduction

Mesenkymala stamceller / stromaceller (MSC) har visat stor potential för olika regenerativ medicin metoder. MSC ursprungligen isolerades som en stromal komponent i benmärgen, men har sedan dess erhållits från många andra vuxna vävnader, inklusive fettvävnad ^{en, två, tre.} Intressant nog omfattar huvudisoleringsmetoden den anmärkningsvärda egenskapen hos MSCs att vidhäfta stadigt på vävnadsodlingsplast i närvaro av fetalt bovint serum (FBS). Även om detta traditionella isoleringsteknik medger enkel och snabb expansion av MSC i tvådimensionell (2D) kultur, är det också mycket artificiell och bortser betydelsen av nativa tredimensionella (3D) miljö som leder till potentiell förlust av viktiga cellegenskaper ^{4, 5 , 6.} Därför studiet av MSCs i 3D-kulturer, somär mer fysiologiska än traditionella 2D kulturer, har dykt upp i sökandet efter "förlorade / minskade" MSC egenskaper. Dessutom har ett stort intresse ökat för att identifiera Xeno Fritt (XF) kemiskt definierade villkor för MSC kultur och aktivering, och därmed göra cellerna mer mottagliga för kliniska tillämpningar.

Många studier har publicerats som visar 3D-kulturen i MSC både i biomaterial och som sfäriska aggregat eller sfäroider. MSC i biomaterial ursprungligen avsedd för vävnadstekniska metoder för att ersätta skadade vävnader med cell seedade ställningar, medan sfäroida kulturer av MSC sågs som ett sätt att förstå MSC beteende in vivo efter administrering av cellerna för behandlingar i prekliniska och kliniska prövningar ^{4, 5, 7.} Intressant MSC bildar sfäroider spontant när vidhäftning till vävnadsodlingsplast är inte tillåtet^{8, 9, 10.} Traditionellt har cell aggregering underlättas genom spinnerflaska metoder eller flytande tekniker overlay, metoder som används initialt i cancerbiologi i arbetet med att försöka efterlikna tumörmikromiljö. På senare tid har ytterligare metoder dykt upp som visar cell aggregering i odlingsskålar i förväg belagd med specifika kemikalier för att förhindra cell-till-plast vidhäftning ^{4, 5, 6.} Ett av de enklaste och mest ekonomiska metoder för att generera MSC sfäroider är att odla dem i hängande droppar, en teknik som ofta användes för att producera embryoidkroppar från embryonala stamceller. Med hängande droppe odlingstekniken, är cellvidhäftning till vävnadsodlingsplast förhindras genom att suspendera cellerna i en droppe medium på undersidan av en vävnadsodlingsskål lock och låta tyngdkraften för att underlätta cell aggregation i apex av droppen. Sfäroiddiametern storlek kan lätt manipuleras genom att ändra cellkoncentrationen eller den droppvolymen, vilket gör hängande droppe kulturer speciellt lätt att kontrollera.

Tidiga studier på 3D kultur MSC visade radikala skillnader i egenskaper hos cellerna i 3D jämfört med sina 2D motsvarigheter ^{6, 8, 9.} Samtidigt, rapporter visat att de gynnsamma effekterna av MSC: er in vivo förlitat sig på deras förmåga att bli aktiverad av mikromiljö signaler och som svar, för att producera anti-inflammatoriska och immunmodulerande faktorer ^11. Intressant nog många av dessa faktorer såsom prostaglandin E2 (PGE2), tumörnekrosfaktor-stimulerad gen 6 (TSG6), och hepatocyte growth factor (HGF) producerades i mycket större mängder av MSC spheroids än traditionella 2D MSC banar väg för idé ommed hjälp av 3D-kulturer för att aktivera cellerna ^{8, 12, 13.} Dessutom genaktivering i 3D-kulturer tycktes rekapitulera mekanismer, åtminstone delvis, av cellaktivering efter injektion i möss ^12. Genom att aktivera MSCs innan deras användning i experiment, kan effekterna av cellerna förlängas och mer framträdande som den traditionella MSC effekt in vivo är ofta försenade och övergående, och kan beskrivas som "hit and run". Under de senaste åren har viktiga funktionella studier med användning av MSC sfäroider visat att de kan undertrycka inflammatoriska reaktioner och modulera immunitet in vivo genom att påverka effektorceller såsom makrofager, dendritiska celler, neutrofiler och T-celler gör sfäroider en attraktiv form av primade MSC ^{2 , 3.} Dessutom produktion av anti-cancermolekyler, såsom interleukin-24 (IL-24) och tumömekrosfaktor-relaterad apoptosinducerande ligand (TRAIL), ökar i 3D-kulturer av MSCs i förhållande till monoskiktet MSC: er, ett fenomen som skulle kunna utnyttjas för riktade cancerterapier ^{8, 10, 14.}

Som den traditionella MSC kultur krävs inte bara användningen av vävnadsodling plast men också FBS till en annan hinder gör MSC sfäroider mer mottaglig för klinisk användning hade övervinnas. Att ta itu med detta hinder, vi nyligen visade bildandet av MSC sfäroider under specifika kemiskt definierade XF förhållanden och konstaterat att de resulterande MSC sfäroiderna aktiverades för att producera samma anti-inflammatoriska och anti-cancermolekyler som sfäroiderna genereras under förhållanden med FBS ^14. Här är dessa resultat presenteras i flera detaljerade protokoll som visar genereringen av föraktiverade MSCs i 3D kulturer använder XFmedia. Dessutom är protokoll presenteras som beskriver effektiva sätt att bedöma aktiverings nivåer av MSCs i avseende på deras anti-inflammatoriska, immunmodulerande och anti-cancer effekter, tillsammans med en praktisk metod för att leverera intakta sfäroiderna i möss.

Protocol

1. MSC Isolering och Expansion

1. Skaffa tidig passage MSCs från center för framställning och distribution av vuxna stamceller ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html~~number=plural ) ¹⁵ som frysta flaskor. Alternativt, isolera MSC från benmärgsaspirat efter en rutin protokoll ¹⁴ och lagra frysta flaskor.
2. Förbereda komplett odlingsmedium (CCM), som är minimalt essentiellt medium alfa (aMEM) kompletterat med 15 till 20% premie välja FBS, 2 mM L-glutamin, och 1 x penicillin-streptomycin. Sterilisera mediet genom filtrering.
3. Häll 30 ml CCM in i en 150 mm cellodlingsskål och inkubera skålen under 30 min vid 37 ° C i en fuktad inkubator innehållande 5% _CO2.
4. Inkubera den frusna flaska innehållande ca 10 ⁶ MSCs för två minuter i ett 37 ° C vattenbad.
5. Överför innehållet i flaskan till odlingsskål med en 5 ml serologisk pipett och tvätta flaskan flera gånger med 1-2 ml CCM från skålen för att fånga kvarvarande celler. Placera skålen över natten i en lämplig inkubator.
6. Tvätta omsorgsfullt kultur två gånger med rumstemperatur fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och lossa MSCs med 3 ml förvärmd 0,25% trypsin / etylendiamintetraättiksyra (EDTA) lösning. Detachment tar vanligtvis ungefär 3-4 min i inkubatorn.
7. Neutralisera trypsin i skålen med 6 ml CCM förvärmas till 37 ° C och överför cellsuspensionen i en 50 ml koniska rör. Kombinera med tvättar av PBS för att maximera cellutbyte.
8. Centrifugera cellerna (450 xg) i 10 minuter vid rumstemperatur och aspirera supernatanten.
9. Återsuspendera cellerna i en liten volym av CCM och räkna livskraftiga celler med användning av en hemocytometer och trypanblått.
10. Seed ett lämpligt antal 150 mm skålar vid 100 celler / cm ²
11. Skörda cellerna såsom ovan med trypsin / EDTA och kombinera alla celler till en enda koniskt rör med lämpligt medium. Centrifugera igen och återsuspendera cellerna i en liten volym av samma medium för cellräkning. Använda standard CCM (innehållande FBS) eller olika kommersiellt tillgängliga XF medieformuleringar, här kallade XF-medium-1 (XFM-1) och XF-medium-2 (XFM-2), både med och utan humant serumalbumin (HSA, 13 mg / ml) tillskott.

2. Framställning av aktiverad MSC sfäroiderna i 3-D droppe kulturer enligt XF Villkor

1. För att generera sfäroider av ungefär 25000 celler, späd de skördade MSCs till CCM, XFM-1, XFM-1 + HSA (13 mg / ml), XFM-2, eller XFM-2 + HSA (13 mg / ml) vid 714-celler / | il.
2. Pipettera 35 | il / droppar av de celler påundersidan av en 150 mm inverterad odlingsskål lock. Flera droppar kan lätt pipetteras med hjälp av en flerkanalspipett.
   OBS: Om större eller mindre sfäroider önskas, ändra cellkoncentrationen eller droppvolym (25-45 l) på lämpligt sätt.
3. Överför 20 ml rumstemperatur PBS i botten av skålen och i en kontinuerlig och jämn rörelse flip locket, innehållande dropparna, så att fall spetsarna möter nedåt. Placera locket noggrant på basen av odlingsskålen.
4. Överför skålen i inkubatorn i 3 dagar utan att störa den att möjliggöra en lämplig sfär montering.
5. Efter 72 timmar, börja sfäroid skörd genom att ta bort locket försiktigt och vända det så att dropparna, återigen, riktade uppåt.
6. Vinkla locket till cirka 10-20 ° och skjut dropparna, som innehåller sfäroider, till plåtkanten med hjälp av en cell lyftaren.
7. Överför sfärer och medium i en 15 ml koniska rör med en 1000 l rörtte. Använd rumstemperatur PBS och pipetten med samma spets att tvätta plattan och säkerställa maximal återhämtning av sfäroider.
8. För realtids-PCR-analyser (protokoll 3), centrifugera sfären suspensionen vid 450 xg under 5 min vid rumstemperatur och aspirera supernatanten. Tvätta sfäroiderna med PBS och upprepa både centrifugering och aspirationsstegen. För leverans i djur (protokoll 8), tillåta sfärer att bosätta sig i botten av röret (~ 3-4 min) utan centrifugering.

3. Realtids-PCR av anti-inflammatoriska och anti-cancermarkörer

1. Använd RNA-extraktion kit med homogenisator kolumner och RNas-fritt DNas Set för att isolera DNA-fri total RNA från monolager MSC (protokoll 1) och MSC sfäroider (protokoll 2) som tvättades med PBS och centrifugeras.
2. Lyse minst 100.000 monoskikt MSCs och 20 sfäroider från varje tillstånd i separata 15 ml koniska rör med RLT buffert innehållande β-merkaptoetanol (1: 100).
3. TransFer noggrant blandade lysat i 1,5 ml RNas-fria rör och placera i en frys (-80 ° C) under minst tre timmar för att underlätta sfäroid lys.
4. Tina cellysaten på is, virvel kort och följ tillverkarens instruktioner för RNA-isolering genom att använda en kommersiellt tillgänglig däggdjur total RNA isolering kit.
5. Kvantifiera och bedöma kvaliteten på det isolerade RNA med användning av en spektrofotometer.
6. Använd High Capacity cDNA omvänd transkription Kit eller motsvarande i enlighet med tillverkarens instruktioner för att generera cDNA för realtids-PCR.
7. Placera cDNA prover, kommersiellt utformad realtids-PCR primers / prober (genuttryck analyser), och PCR Master Mix på is. Använda grundfärger / prober för GAPDH (kontroll), PTGS2 (COX-2, anti-inflammatorisk), TNFAIP6 (TSG6, antiinflammatorisk), TRAIL (anti-cancer), och IL-24 (anti-cancer).
8. Förbered realtids-PCR reaktioner enligt tillverkarens anvisningar för genuttryck analyser och snabb UniveRsal Master Mix.
9. Följ riktlinjerna för realtids-PCR instrument för att generera experiment dokument och utföra körningen.
10. Analysera data med hjälp av ΔΔC _T-metoden genom att beräkna relativa förändringar (relativ kvantitet, RQ) i genuttryck använder GAPDH som endogena kontroll och monoskikt MSC som en baslinje ^{8, 14.}

4. Insamling av CM för Analyser av immunomodulerande och anti-cancer Potential

1. Skörda sfäroiderna och CM som beskrivits ovan i en 15 ml koniska rör med hjälp av en cell lyftaren och en pipett, men inte tvätta skålen locken med PBS som detta kommer att späda CM.
2. Centrifugera vid 450 xg under 5 minuter vid rumstemperatur, noggrant samla den cellfria supernatanten med en pipett, och överför supernatanten till 1,5 ml rör.
3. Centrifugera vid 10.000 xg under 5-10 min vid rumstemperatur, noggrant samla clarified CM med en pipett, och för över CM in i nya 1,5 ml rör för lagring i en frys (-80 ° C). Förbered alikvoter av CM före frysning när du använder den för flera analyser.
   OBS: Före utföra analyser nedströms, PGE2 koncentration, en god indikator på antiinflammatoriska potentialen hos CM, kan bestämmas med användning av ett kommersiellt ELISA-kit enligt tillverkarens instruktioner. TSG6 koncentration kan bestämmas med användning av ett publicerat protokoll ^14.

5. Macrophage analys för att bedöma antiinflammatoriska potential av MSC-CM

1. Förbereda makrofag-medium, som består av Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) innehållande L-alanyl-L-glutamin och kompletterat med 10% premie välja FBS och 1x penicillin-streptomycin. Filtrera-sterilisera mediet.
2. Skaffa en frusen ampull av ungefär 10 ⁶ J774 mus makrofager och inkubera flaskan under 2 minuter i en 37 ° C vattenbad.
3. Aspirera supernatanten, avbryta makrofager i en ml av makrofager medium och överföra makrofager i en 150 mm petriskål innehållande 30 ml av makrofager medium.
4. Ändra medium var 2 dagar och inkubera cellerna i inkubator fram till ungefär 70 till 80% konfluenta.
   OBS! Makrofagerna inte följer tätt till petriskålen, alltså försiktighet bör tas inte förlora celler med medium förändring.
5. Skörda makrofager genom sprutning av makrofag mediet på cellerna med en pipett. Överföra celler i ett 50 ml koniskt rör och centrifugera under 5 min vid 200 till 300 xg och rumstemperatur.
6. Aspirera supernatanten och suspendera cellerna i en liten volym av makrofag medium för cellräkningar med en hemocytometer. Justera koncentrationen till 200.000 celler / ml med makrofager migDIUM.
7. För att starta upp för makrofagen analysen, tillsätt 480 pl makrofag medium i brunnar i en 12-brunnar.
8. Tillsätt 20 | il av makrofag medium i icke-stimulerade kontrollbrunnar och 20 pl av icke-konditionerat eller MSC-konditionerat medium, som framställts ovan, i experimentella brunnar. Blanda mediet i brunnarna genom att knacka på plattan.
9. Överför 500 pl av makrofager cellsuspensionen till de icke-stimulerade makrofager kontrollbrunnar.
10. Stimulera de återstående makrofager med tillsats av 1: 500 till 1: 1000 av 0,1 mg / ml lipopolysackarid (LPS) och inkubera 5-10 min vid rumstemperatur.
11. Överför 500 | il av de stimulerade makrofager i brunnarna med icke-rade eller MSC-konditionerat medium. Blanda brunnarna genom stadigt gunga plattan flera gånger.
12. Överför plattan till en inkubator för 16-18 timmar.
13. Skörda makrofag-konditionerat medium och centrifugera vid 500 xg under 5 min vid rumstemperatur.
14. Överförasupernatanten till nya rör och analys för tumörnekrosfaktor-alfa (TNF-α) och interleukin-10 (IL-10) innehåll genom kommersiella ELISA kit efter tillverkarens instruktioner.

6. splenocyt analys för att bedöma immunomodulerande potential av Sfär-CM

1. Förbereda komplett splenocyt-medium, som består av Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) -1640-medium kompletterat med 10% värmeinaktiverat FBS, 1x penicillin-streptomycin och 2-merkaptoetanol. Filtrera-sterilisera mediet.
2. Harvest mjälte från euthanized-manliga BALB / c-möss genom ett snitt framställd på den vänstra sidan av buken över mjälten, ungefär halvvägs mellan de främre och bakbenen ^14. Överföra mjälten till en 70 | im cellfilter för att isolera splenocyter ^14.
3. Isolera splenocyter / lymfocyterna genom att trycka mjältarna genom 70 ^ m sil i en steril petriskål using i mjukt gummi / plast änden av en kolv från en 2-3 ml spruta ^14. Använd en slipcirkelrörelse för att dissociera mjälten.
4. Tvätta cellfilter flera gånger med kall PBS och överföra celler från petriskålen till ett 50 ml koniskt rör. Fyll röret med kall PBS och centrifugera (500 xg) vid 4 ° C under 10 min.
5. Aspirera supernatanten och rensa cellerna från erytrocyter genom inkubation med 5-10 ml röda blodkroppar lyslösning (per mjälte) under 5-10 min.
6. Stoppa lys genom tillsats av kall PBS till röret och centrifugera i 5-10 min vid 500 x g och vid 4 ° C.
7. Suspendera isolerade celler i komplett splenocyter medium, filtrera genom ett 40 um sil och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer. Lägg splenocyt-medium till cellsuspensionen för att åstadkomma en slutlig cellkoncentration av 10 ⁶ celler / ml
   OBS: Denna teknik ger vanligtvis ungefär 3 x 10 ⁷ splenocyter per mus mjälte.
OBS: Den mängd av splenocyter som krävs beror på antalet experimentella förhållanden enligt vad som bestäms av forskaren (se steg 6.9). För varje experimentellt prov / brunn, är 10 ⁶ splenocyter krävs.
8. Överför 10 ⁶ splenocyter (stimulerad eller icke-stimulerad) i brunnar på en 12-brunnar och tillsätt icke konditionerade (kontroller) eller MSC-CM i brunnar vid slutspädning av 1: 10-1: 20.
9. Skörda splenocyt CM efter 24 h och centrifugera vid 500 xg under 5 min vid rumstemperatur.
10. Överför supernatanten till nya rör och analys med avseende på interferon-gamma (IFN-γ) innehåll genom kommersiella ELISA-kit enligt tillverkarens instruktioner.

7. Prostate Cancer analys för att bedöma anti-cancer potential av Sfär-CM

1. Förbereda fullständigt RPMI tillväxtmedium som är RPMI-1640-medium kompletterat med 10% FBS, 1x penicillin-streptomycin.
2. Skaffa en frusen ampull av LNCaP prostatacancerceller och inkubera flaskan under 2 minuter i en 37 ° C vattenbad.
3. Överför innehållet i flaskan i en odlingsskål innehållande 30 ml komplett RPMI tillväxtmedium med hjälp av en motordriven pipett och en 5 ml serologisk pipett. Tvätta flaskan flera gånger med mediet från skålen och placera skålen i inkubatorn.
4. Strax innan cellerna når sammanflytning, tvätta kultur två gånger med rumstemperatur PBS och lossa LNCaP-celler med 3 ml förvärmd 0,25% trypsin / EDTA-lösning.
5. Neutralisera trypsin i skålen med det kompletta RPMI tillväxtmedium och överföra celler tillsammans med tvättningar i ett 50 ml koniskt rör.
6. Centrifugera cellerna vid 450 xg under 10 min vid rumstemperatur och aspirera supernatanten.
7. Återsuspendera celler i liten volym av fullständigt RPMI tillväxtmedium och räkna de cancerceller med användning av en hemocytometer.
8. För att utföra en celltillväxtanalys med användning av en cellproliferationsanalys-kit, aspirera mediet från brunnarna och för över plattan i en frys (-80 ° C) under minst 3 timmar.
   1. Tina plattan och lysera cellerna i varje brunn genom tillsats av 100 pl av cell-lys reagens innehållande 180 mM NaCl, 1 mM EDTA och 0,2 mg / ml RNas A.
   2. För en standardkurva, lyserar kända mängder av LNCaP-celler såsom beskrivits ovan.
   3. Efter 1 h, tillsätt 100 | il av 1 x cell lysbuffert innehållande 1: 100 spädning av cellproliferationsanalys-reagens och mäta fluorescensen i varje brunn för att bestämma cellbeloppet.

8. Intraperitoneal leverans av intakta sfäroider

1. Förbereda sfäroida MSCs såsom beskrivs ovan (protokoll 2) och återsuspendera than sfärer i steril Hanks balanserade saltlösning (HBSS) med tillsats av 0,2 till 0,5% HSA för att bibehålla XF betingelser. HSA i lösningen hjälper till att förhindra sfär vidhäftning till plast under injektion.
2. Överföra 40-120 sfäroider i 15 ml koniska rör och tvätta cellerna genom att tillsätta 6 ml HBSS / HSA till rören. Låt 3-4 minuter för områden att sjunka. Förbered en oberoende koniska rör av sfäroider för varje djur. Också förbereda ytterligare rör av sfäroider för analyser som bestämmer sfäroid retention (se 8.18 nedan) och produktion av terapeutiska faktorer efter överföring (se 8.19 nedan) om så önskas.
3. Aspirera supernatanten, överlagra sfäroiderna med 100-200 il steril HBSS kompletterad med 0,2-0,5% HSA, och placera rören på is.
4. Kortfattat söva djuren med 2% isofluran i 100% syre tills försvinnandet av nypa tå reflex för cirka två minuter i induktionskammaren.
5. Placera djuret inuti BSL-2 skåp, dorsal aspect nedåt (ventrala sidan uppåt), med det kontinuerliga flödet av 1,5% isofluran / syreblandning via en noskon.
6. Rengöra den nedre mus buken med ett antiseptikum, såsom 70% alkohol.
7. Ta bort locket på 20 G intravenös (iv) kateter och utför intraperitoneal injektion med kateter stilett enheten. Använd en hand för att hålla musen huden och en annan för att utföra injektionen. Lokalisera injektionspunkten approximativt i mitten av en konstgjord linje som förbinder en böjd knäled och underliv med nålspetsen pekar mot mittlinjen.
   OBS! Kateter stilett enheten har en högre motståndskraft än en vanlig nål, därför försiktighet måste vidtas för att inte injicera nålen alltför djupt i buken, vilket kan leda till skador på inre organ. Penetration av huden och sedan musklerna / bukhinnan kan kännas vid kateterplacering.
8. Försiktigt bort metall stilett / nål från kateter stilett enheten. Check stilett för blod, urin och avföring och kasta det. Blod på nålen indikerar punktering av inre organ (s).
9. Håll plastkateter i ett upprätt läge under injektionerna för att medge fluidflöde.
10. Bekräfta korrekt placering av plastkateter genom att injicera ca 100 | il steril HBSS / HSA genom katetern med hjälp av en pipett med en 100 till 200 | j, l spets. Placera änden av pipettspetsen inuti katetersprutadapter som bildar en tät försegling. Långsamt injicera vätskan i bukhålan.
    OBS: Vätskan i en korrekt placerad kateter kommer att fritt strömma in i peritonealhålan med endast mindre anpassning av katetem. Felaktig placering av katetern (subkutan eller intra-intestinal, eller om nålspetsen skadad peritoneal organ såsom njurar) kommer att öka motståndet och minska flödet. Subkutan placering kommer att resultera i en bildning av en uppenbar "bubbla" under huden.
11. samla than MSC sfäroider, som framställts i 100-200 ul HBSS / HSA (steg 8,3), med hjälp av en 200 mikroliter pipettspets, och överföra hela volymen av sfärer (40-120 sfärer) i bukhålan genom katetern som beskrivits ovan.
12. Tvätta röret innehållande sfärer med 100 pl av HBSS / HSA med användning av samma spets som ovan för att samla eventuella rest sfäroider och spruta in dem i den peritoneala håligheten.
13. (Valfritt) Injicera ytterligare 100 pl av HBSS / HSA i peritonealhålan för att tvätta katetern.
14. Placera kompress indränkt i antiseptisk över katetern och sakta ut katetern från bukhålan och kassera den.
15. massera försiktigt bukhålan med fingrarna för att säkerställa en jämn fördelning av sfäroider.
16. Låt djuret återhämta sig under noggrann övervakning och titta på blödning från injektionsstället.
17. Inspektera katetern och 15 ml rör för eventuella återstående sfäroider. Det är normalt att observera några sfärer ikateter / rör.
    OBS: Den teknik som beskrivs för MSC sfäroid leverans kan antas för användning i normala djur eller i en mängd olika skademodeller. Denna teknik har med framgång använts för att injicera spheroids i mus hornhinneskada och endotoxemi modeller, liksom i en zymosan-inducerad peritonit modell ^8.
18. För att kvantifiera antalet bibehållna sfäroider (tillval), använd en DNA-baserad mobilnummer kvantifiering kit / reagens. Håll den använda katetern över 15 ml rör och kraftfullt dosera HBSS / HSA genom katetern att tvinga eventuella kvarvarande sfärer tillbaka in i 15 ml rör.
    1. Centrifugera 15 ml rör vid 500 xg under 5 min vid rumstemperatur och aspirera supernatanten. Överföra röret innehållande sfäroid pelleten i en frys (-80 ° C) under minst 3 timmar.
    2. Tina röret och lysera sfärerna genom att tillsätta 500 | il cellysisreagens innehållande 180 mM NaCl, 1 mM EDTA och 0,2 mg / ml RNas A.
    3. För en kontroll, freeze och lyserar en känd mängd av sfäroider (företrädesvis ekvivalent med antalet sfäroider som framställts för en enda injektion), såsom beskrivits ovan.
    4. Efter 1 h, överföra 100 ul av cellysatet, i två exemplar, i en 96-brunnars mikroplatta och lägga till varje brunn 100 | il av 1 x cellysbuffert innehållande en 1:50 utspädning av cellproliferationsanalys-reagens ur satsen. Efter 10 min, mäta fluorescensen i varje brunn för att bestämma antalet sfärer som inte injicerades genom att jämföra den experimentella provet (proven) med kontrollprovet.
19. Utvärdera aktiveringsnivån sfäroider förberedda för injektion (tillval) genom att mäta koncentrationen av PGE2 och TSG6 produceras av överförda sfärer. Överföring 40-120 sfärer genom katetern, såsom beskrivits ovan, till en 12-brunnars eller 6-brunnars platta innehållande 1 eller 2 ml aMEM kompletterat med 2% FBS och 1 x penicillin / streptomycin. Placera plattorna i inkubatorn under 6 timmar.
    1. Överföra mediet frånbrunnarna efter 6 h i 1,5 eller 15 ml rör och centrifugera rören vid 450 xg under 5 min vid rumstemperatur.
    2. Överföra den cellfria supernatanten i färska 1,5 ml rör med hjälp av en pipett och centrifugera vid 10.000 xg under 5-10 min vid rumstemperatur.
    3. Överföra den klarnade CM (supernatant) i nya 1,5 ml rör och analys med avseende på PGE2 koncentration (god indikator på antiinflammatoriska potentialen hos CM) med användning av ett kommersiellt ELISA-kit enligt tillverkarens instruktioner. TSG6 koncentration kan bestämmas med användning av ett publicerat protokoll ^14.

Representative Results

I det pågående arbetet, hängande droppe kulturer används för att generera kompakta sfäriska mikro vävnader eller "sfäroider" av aktiverade MSCs enligt XF förhållanden. Prövnings färdplan i Figur 1 visar att MSC uppmuntras att själv montera in spheroids när de suspenderas i hängande droppar under 72 timmar, varefter sfäroiderna eller CM laddad med sfär framställda terapeutiska faktorer kan samlas in och potentiellt utnyttjas i både forskning och kliniska tillämpningar. Det stora antalet celler som behövs för sfär produktion kan förvärvas inom en vecka efter sådd MSCs vid låg densitet, typiskt 100-200 celler per cm ^2, och sedan expandera cellerna under 6-7 dagar tills cirka 80% sammanflytande (Figur 2 ). Celltillväxt kinetik, bestäms genom att räkna levande celler dagligen, indikerade att en kraftig expansionsfas (dag 3-7) följer en kort fördröjning fas av 1-2 dagar (Figur 2C </ Strong>). MSC i passagen 2 eller 3 ger typiskt 50-100 miljoner celler från en injektionsflaska på 1 miljon kryokonserverade celler när odlade i CCM.

Efter expansion och skörd, är MSCs suspenderades vid hög cellkoncentration för att generera sfärer, typiskt 500-1000 celler per ul. Hängande droppe kulturer framställes genom överföring av 25-40 | il droppar av medium innehållande MSCs på undersidan av en maträtt lock vävnadskultur, som därefter vänds och på lämpligt sätt placerad på basen av skålen (Figur 3). När de suspenderas i 35 | il droppar av CCM vid 714 celler per | il (dvs 25.000 celler per droppe), MSC: er först montera in små aggregat som så småningom smälter samman för att generera en enda kompakt sfär vid 72 h i toppen av droppen (figur 3C). Sfäroider bildar också över 72 timmar i flera typer av kommersiellt tillgängliga XF media optimerade för MSC utbyggnad, Här kallade XFM-1 och XFM-2. Men enmans kompakta sfärer i XFM-1 kräver tillskott med 13 mg / ml humant serumalbumin (HSA), en koncentration som återspeglar den uppskattade totala proteinhalten i CCM (Figur 3D). Enda kompakt sfärer inte lätt bildas i grund XFM-1 utan HSA eller proteinfritt aMEM (Figur 3D). Under sphere montering, MSC fenotyp förändringar radikalt (Figur 4), och när i den lämpliga kemiskt definierade XF medium (dvs. XFM-1 + HSA), uttryck av ett stort antal antiinflammatoriska faktorer uppregleras inklusive PGE2 och TSG6 (Figur 4C). Men produktionen av TSG6 och PGE2 inte märkbart förstärks i MSC odlade som sfärer i XFM-2 eller XFM-1 utan HSA (Figur 4C). Särskilt dessa antiinflammatoriska faktorer, såväl som anti-cancerfaktorer TRAIL och IL-24, var starkt uppreglerat i sfäroida MSCs relativt monoskikt MSC, när than sfärer odlades i XFM-1 kompletterat med antingen rekombinant HSA (rHSA) eller klinisk kvalitet HSA (cHSA) framställs från humant blod (Figur 4D).

För att utvärdera den terapeutiska potentialen hos MSC sfärer framställda i olika medie formuleringar är flera praktiska tester (Figur 5). De immunmodulerande egenskaper sfäroider först bestäms in vitro genom att mäta effekterna av sfär CM på nivåer av cytokiner som produceras av LPS-stimulerade makrofager och CD3-stimulerade splenocyter / lymfocyter (Figur 5). CM från MSC spheres odlades i CCM och XFM-1 / HSA markant undertryckt produktion av makrofag TNFa och splenocyt IFNy, medan på samma gång ökade nivåer av det antiinflammatoriska cytokinet IL-10 (figur 5a och 5b). De anticanceregenskaper av sfärer utvärderas genom att mäta effekterna av sfär CM on tillväxt och morfologi av LNCaP prostatacancerceller. XF-medium XFM-1 / HSA minskas effektivt LNCaP proliferation liknar FBS-innehållande CCM (Figur 5C och 5D).

Viktigt kan intakta MSC sfärer administreras in i bukhålan hos möss för att testa den antiinflammatoriska aktiviteten av cellerna in vivo (Figur 6). För dessa experiment är sfärer förberedd för injektion i HBSS innehållande en låg koncentration av HSA, som minimerar deras vidhäftning till plastslang samtidigt en XF tillstånd. Därefter kan sfärerna lätt injiceras efter överföring från provröret (Figur 6A), med hjälp av en pipett (Figur 6B), genom en nål / kateterenhet (Figur 6C och 6D) lämpligt positionerad för en standard intraperitoneal injektion. Med hjälp av denna metod, kan MSC sfäroider regelbundetöverförs vid en verkningsgrad på mer än 90% (figur 6E och 6F) utan att störa deras integritet (Figur 6G och 6H). Felaktig placering av kateterspetsen i den peritoneala kaviteten leder till dålig sfär leverans och hög retention (Figur 6F). Viktigt kan nivå sfär kvarhållas i pipetten / katetern kvalitativt bestämmas genom visuell inspektion, eller kvantitativt genom att samla / lysering av balanserade sfärerna och mäta antalet celler med en kommersiellt tillgänglig DNA-baserad cell kvantifiering reagens / kit (Figur 6F). Efter injektionen sfär behålla analys bidrar till att skapa integration / kriterier för uteslutning under experiment. Noterbart är möjligheten för CCM och XFM-1 / HSA sfäroider att utsöndra höga nivåer av TSG6 och PGE2 bibehålls åtminstone sex timmar efter överföring av sfärerna från droppe kulturer (figur 6i). I likhet med deras in vitro effekter, XFM-1 / HSA sfärer injicerades i den peritoneala håligheten hos möss, omedelbart efter induktion av systemisk inflammation genom intravenös administrering av LPS, förstärkt PGE2 och IL-10 nivåer i peritoneum samtidigt som man minskar proinflammatorisk TNFa (Figur 6J).

Figur 1: Schematisk representation av plattformen utvecklats för att utnyttja secretome av MSC-celler primade som sfäriska mikro vävnader under XF betingelser. Efter expansionen som monoskiktkulturer (1), är MSCs suspenderas i hängande droppar från locket av en odlingsskål (2) vid hög cellkoncentration för att aktivera / prime cellerna. Efter 72 timmar, både (3) konditionerat medium (CM) och (4) intakta sfäroider kan skördas från dropparna och utnyttjas i olika tillämpningar nedströms. CM är rik på immunmodulerande faktorer, såväl som andra terapeutiska COMPONent. De kompakta sfäroider som bildas i hängande droppar kan enkelt överföras med hjälp av en pipett (5) och administreras effektivt in vivo genom en kateter (6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Tillväxt egenskaper benmärgshärledda MSC i monolagerkulturer. MSC: er i passagen 2 såddes vid låg densitet (100 celler per cm ²⁾ på 15 cm skålar (15.000 celler per skål) och odlades under 7 dagar i CCM. Mediet byttes på dag 3 och sedan igen på dag 5 eller 6 (24 till 48 h före skörd). Representativa faskontrast mikrofotografier av MSC 3 dagar (A) och 7 dagar (B) efter plätering cellerna. Skalstreck = 200 | j, m. (C) Tillväxt kinetik för MSCserhållits från 3 donatorer bestämdes genom att räkna antalet livskraftiga vidhäftande celler dagligen från dag 2 till dag 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Beredning av droppe kulturer för priming MSC spheroids i XF medium. (A) Foto som visar teknik för att snabbt lager hängande droppar på undersidan av en vävnadsodlingsskål lock. (B) Foto visar hängande droppar efter invertering och placering av locket på skålen basen. (C) Tidsberoende förändringar i aggregering av 25.000 MSCs i en hängande droppe som visualiseras genom faskontrastmikroskopi. Målet var inriktad på toppen av droppen. Skalstreck = 500 | j, m. (D) ImaGES av MSC sfärer bildade efter 3 dagar i hängande droppe odlingar med användning av olika medie formuleringar inkluderande aMEM med och utan FBS (dvs. CCM), XFM-1 med och utan HSA, och XFM-2 med och utan HSA. Skalstreck = 200 | j, m. Data i panel D erhölls från den ursprungliga artikeln med tillstånd från förlaget ^14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Utvärdering av MSC aktivering i 3-D XF kulturer. (A) Spheres / CM skördas efter 72 timmar genom att vända / luta skålen locket och tvingar dropparna till kanten med en cell lyftare. Sfärer sammansatta av 25.000 celler kan lätt visualiseras under insamling. (B) Ett fotografi av approxifär 500 sfärer som samlats in från lock av många vävnadsodlingsplattor. Sfärer sjunka snabbt till botten av röret utan centrifugering. (C) Nivå PGE2 utsöndras från MSC sfärer efter 72 timmar mättes genom ELISA. Realtids-RT-PCR användes för att mäta TSG6 nivåer. Både TSG6 och PGE2 är värdefulla markörer för screening MSC aktivering i sfäroiderna. XF-medium XFM-1 + HSA uppvisade hög nivå av PGE2 och TSG6 produktion (röda lådor). Data visas som medelvärde ± SD och analyserades med Students t-test (*** p <0,001, jämfört med aMEM prov). (D) PGE2 ELISA och realtids-RT-PCR-analyser på sfärer som produceras i CCM och XFM-1 kompletterat specifikt med 13 mg / ml rekombinant HSA (rHSA), eller klinisk kvalitet HSA (cHSA) framställd från venöst blod. Vika förändringar bestämdes från vidhäftande monoskikts MSCs (RQ = 1). Data visas som medelvärde ± SD och analyserades med Students t-test (** p <0,01, *** p <0,001, jämfört medmono MSC). Vissa uppgifter i panelerna C och D erhölls från den ursprungliga artikeln med tillstånd från förlaget ^14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: In vitro-funktionella analyser för att utvärdera den anti-inflammatoriska och anticanceregenskaper av MSC-CM uppsamlade från hängande droppe kulturer. (A) Representativa resultat från ELISA visar effekterna av sfär CM (CCM och XFM-1 / HSA) på produktion av TNF-a och IL-10 genom LPS-stimulerade mus makrofager (MQ). (B) Representativa resultat från ELISA visar effekterna av sfär CM (CCM och XFM-1 / HSA) på produktion av IFNy genom mussplenocyter (SPL) stimulerade med en anti-CD3-antikropp. (C) Fas kontrastmikrofotografier av LNCaP prostataceller cancerpatienter behandlade med grundläggande CCM och XFM-1 / HSA eller konditionerat medium (CM) från MSC sfärer framställda i CCM och XFM-1 / HSA. LNCaP-celler odlades i RPMI-medium (kontroll). Skala bar är 200 pm. (D) Kvantitativa förändringar i tillväxten av LNCaP-prostatacancerceller bestämdes med en kommersiellt tillgänglig DNA-baserad cell kvantifiering reagens / kit. Streckade linjen anger såddtäthet av 5.000 celler per brunn. Data i alla paneler visas som medelvärde ± SD, och analyserades med Students t-test (*** p <0,001). Vissa uppgifter i alla paneler erhölls från de ursprungliga artiklarna med tillstånd från förlaget ^14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

belastning / 55126 / 55126fig6.jpg "/>
Figur 6: Effektiv överföring av intakta MSC sfäroider, beredda enligt XF förhållanden, med hjälp av en 20G IV nål / katetersystem. (A) representant fotograferar av en 15 ml koniska rör med XFM-1 / HSA MSC sfärer framställda för injektion i HBSS innehållande 0,2% HSA. (B) Representativa fotografi av MSC sfärerna efter aspiration in i en 200 mikroliter pipettspets. (C) Bild av 20 G nål / kateterenhet som används för att administrera intakta MSC sfäroider i möss. (D) Bild som visar korrekt positionering av pipettspetsen i adaptern av polyuretankateter. (E) Bild av MSC sfärer omedelbart efter att ha passerat dem genom katetern i en odlingsskål. Cirka 95 sfärer av 100 överfördes. (F) Effektivitet av sfär leverans in i peritonealhålan hos möss bestämdes genom att samla in / lyserande sfärer kvarhållna ipipett / kateter och mätcell nummer, via en kommersiell DNA-baserad cell kvantifiering analys, i förhållande till antalet celler som erhållits från en full uppsättning av lyserade sfärer. Prickade röda linjen indikerar en överföringseffektivitet på 90%. Dålig sfär leverans (71%) observerades med en injektion (pil). (G) faskontrast mikrofotografier av sfärer i panel E (förstorad bild). Skalstreck = 200 | j, m. (H) faskontrast mikroskop av en XFM-1 / HSA sfären 16 timmar efter överföring till en vävnadsodlingsskål. Den fibroblastiska, spolformad morfologi MSC bibehålls i celler som migrerade ut ur sfären. Skalstreck = 200 | j, m. (I) ELISA-analyser för de antiinflammatoriska faktorer TSG6 och PGE2 utfördes på CM uppsamlas 6 timmar efter överföring av sfärerna in i 6-brunnars plattor innehållande 2 ml aMEM / 2% FBS. Sfärer framställda i XF-medium XFM-1 / HSA visade högsta TSG6 och PGE2 utsöndring (röda lådor). Data uttryckt som medelvärde± SD, analyserades med Students t-test (*** p <0,001, jämfört med aMEM prov). Vissa uppgifter erhölls från den ursprungliga artikeln med tillstånd från förlaget ^14. (J) Representativa grafer som illustrerar förmågan för sfäroider, injiceras in i peritonealhålan, för att öka peritoneal PGE2 och IL-10 samtidigt minska nivån av TNFa hos möss utmanas genom intravenös injektion av endotoxin (LPS). Prover erhölls genom peritoneal sköljning sex timmar efter induktion av inflammation och leverans av 80 sfäroider. Data uttryckt som medelvärde ± SD, analyserades med Students t-test (* p <0,05, ** p <0,01, jämfört med kontrollgruppen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Den optimala MSC för användning i vissa forskning och kliniska tillämpningar bör vara mycket aktivt för att maximera sin fördel, och företrädesvis framställts under kemiskt definierade XF villkor för att minimera leverans av potentiella antigener från xenogena mediumkomponenter såsom FBS. I protokollen som beskrivs här, har vi visat metoder för att 1) ​​aktivera MSC i 3D-kulturen genom bildning av sfäroider, 2) uppnå 3D aktiveringen av MSCs i XF förhållanden, 3) utvärdera aktiveringsnivåer sfäroida MSCs när det gäller deras anti- inflammatoriska, immunmodulerande och anti-cancer potential, och 4) leverera aktiverade MSCs som intakta sfäroider i möss.

MSC: er finns multipotenta stamceller som kan isoleras via plast vidhäftning från många vuxna vävnader inklusive benmärg och fettvävnad. MSC är lätt förökas på vävnadsodlingsplast under relativt hög (10-20%) FBS koncentrationer uttrycka en distinkt uppsättning av ytmarkörer, ochkan differentieras åtminstone in i adipogena, osteogena och kondrogena härstamningar ^{1, 16, 17, 18.} MSC har visats utöva gynnsamma effekter i olika djurmodeller för mänskliga sjukdomar, även om de verkar bestå endast övergående efter deras administrering in vivo. Effekten av MSC har därför kallats "hit and run" och ofta förmedlas av de antiinflammatoriska och immunmodulerande parakrina faktorer, såsom PGE2, TSG-6, och indoleamine 2,3-dioxygenas (IDO), som utsöndras av MSC ^{2 , 3, 11, 19, 20, 21.} Men för att producera dessa faktorer, MSC: er kräver en aktivering, antingen genom signaler från en skadad vävnad eller från immun calnar hos mottagaren. Därefter har det funnits en växande intresse för att utveckla MSC före aktivering eller priming protokoll innan leverans av cellerna i djur eller patienter ^22. Dessutom har förekomsten av antigena FBS komponenter i standard MSC preparat väckt oro. Därför har studier utförts för att bestämma optimala kemiskt definierade XF villkor för MSC kulturer. I vår senaste arbete, först visade vi att MSC kan aktiveras i 3D genom bildande av sfäroider, och sedan upptäckte att cellaktivering också kan åstadkommas under särskilda XF villkor ^{8, 12, 13, 14.}

3D cellodlingstekniker har använts i årtionden med målet att ge verkliga fysiologiska förhållanden i cellbaserad forskning. Kulturer i 2D bortse 3D karaktär vävnader och därför inte alltid rekapituleraden cell-till-cell och cell-till-matris-interaktioner är viktiga vid cellsignalering. Många 3D odlingstekniker använder roterande kärl, spinnerflaskor, eller olika icke-vidhäftande ytor, dock är den största nackdelen i många av dessa metoder heterogenitet den genererade sfäroid storlek och / eller krav på särskild dyr utrustning. Forskning har också utförts med användning av hängande droppe kulturer som huvudsakligen stimulerar MSCs att spontant aggregerade till en enda sfäroid ^{4, 5, 6, 7, 8, 9, 23.} Noterbart är droppe kulturer stödja montering av relativt likformiga mikro vävnader / aggregat, med den extra fördelen av att lätt kunna manipulera cellens storlek aggregat genom att justera cellkoncentrationen och / eller droppvolym. Dessutom behärskning av hängande drop kultur teknik inte kräver omfattande utbildning. Droppar av 25-40 pl lätt kan framställas med MSC vid höga cellkoncentrationer, typiskt 500-1000 celler per ul. Droppar mindre än 20 pl tenderar att avdunsta snabbt och de större än 45 ^ smeta ofta över locket under inversion. Men när vända ett lock innehållande droppar av valfri storlek, hastighet och riktning är kritiska parametrar att ta hänsyn till för att upprätthålla ytspänningen och lämplig form av droppen / sfäroid. Oavbruten kultur och korrekt luftflöde i inkubatorn är också viktigt för att säkerställa MSC aggregat i en enda sfär inom varje droppe.

En nackdel med denna teknik är att plattor innehållande hängande droppar inte kan staplas i inkubatorn eller flyttas under sfär montering, vilket gör uppskalning för patientbehandlingar svårt. Dessutom, ändra medium i droppe kulturer är extremt utmanande, vilket långsiktiga kulturer bör vara AVoided. Dessutom kan den låga media till cellförhållandet i hängande droppar orsaka näringsämnen utarmning och ackumulering av avfall så småningom leder till förlust av viktiga cellulära funktioner och / eller celldöd.

Men med rätt droppe teknik, har vi visat att MSC i sfäroider blivit mycket aktiva eller primas genom att cellerna blir fabriker kraftfulla antiinflammatoriska molekyler PGE2 och TSG6, liksom anti-cancermolekyler IL-24 och SPÅR. Vi har visat att MSC sfäroider verkligen är anti-inflammatoriska och immunmodulerande, och har anticanceregenskaper som är överlägsna sina 2D monoskikts motsvarigheter i många funktionella analyser med användning av odlade makrofager, splenocyter och prostatacancerceller ^{8, 12, 13, 14.} Dessutom har vi visat att MSC sfäroider kan utöva potent anti-inflammatoriska effekter när de administrerasi bukhålan av möss med peritonit ^8. Specifikt, vi visade att stora sfäroider av ungefär 400 till 500 ^ m i diameter (25000-30000 MSCs vardera) effektivt kan levereras i en liten volym HBSS med användning av en 20G nål / kateteraggregatet och en vanlig pipett. Med denna teknik, felaktig kateterplacering, vilket resulterar i högt motstånd mot vätskeflöde, kan lätt bestämmas före sfäroid överföring genom att först injicera en liten volym HBSS / HSA såsom beskrivits i protokollen. Sfäroiderna i en rätt placerad kateter kommer att flöda fritt, förutsatt att den HBSS kompletterad med HSA att minimera sfär vidhäftning till plaströret, och kan lätt visualiseras. Dessutom förhindrar denna teknik skjuvspänning på celler som kan förekomma med en vanlig nål / spruta för injektion, och undviker behovet av ett kirurgiskt snitt, som uppbär en högre risk för infektion och är mer tekniskt utmanande. En stor nackdel är thatt stort antal sfäroider kan endast injiceras i rymliga kroppshåligheter, såsom bukhålan, eftersom motståndet mot sfären överföring genom katetern är hög i trånga utrymmen.

Vi har nyligen visade också att samma nivå av MSC aktivering i sfäroiderna kan uppnås genom att använda en specifik kommersiellt tillgängligt XF medium, som här kallas XFM-1, så länge som det kompletterades med HSA som erhållits från humant blod eller framställas genom rekombinanta tekniker ^14. Det är viktigt att notera här att MSC sfäroider inte producerar höga nivåer av PGE2 och TSG6 i alla typer av XF media ^14, förmodligen eftersom de flesta XF media för MSC: er ursprungligen formuleras för optimal expansion av cellerna i 2D. Det är också viktigt att notera att olika typer av HSA varierar i deras potens ^14. Dessutom den absoluta nivån på PGE2 detekterades i CM av aktiverade sfäroider kan variera lättly som ELISA används för PGE2 är verkligen en konkurrensanalys. Således är det viktigt att inkludera lämpliga kontroller i varje PGE2 ELISA och för att undvika direkt jämföra data mellan proverna analyserades vid olika tidpunkter eller i olika plattor. Vidare måste MSCs noggrant tvättas i XF medium före framställning av hängande droppar i syfte att avlägsna rester CCM och därför, begränsa överföring av FBS komponenter. De protokoll som beskrivs här kan lätt antas att utvärdera andra medier formuleringar på sfär bildning och terapeutisk genuttryck.

Uppenbarligen är många cellsignalering händelser som normalt inte förekommer i 2D MSC satt i rörelse när MSC odlas i 3D. Cell-till-cell och cell-till-matris-interaktioner, medierad av cadheriner och integriner styr sfäroid bildning och kompaktering ^{24, 25, 26} och kommer sannolikt kritisk för sfäroid terapi. Eftersom cellerna aggregat och coav konsekvens i sfäroider, olika stresssignaler, inklusive mindre apoptos, stöd i processen MSC aktivering som resulterar i produktion av ett stort antal potentiellt terapeutiska faktorer ^{4, 5.} Vi visade tidigare avgörande roll för autokrin IL-1-signalering i MSC aktivering och produktionen av PGE2 och TSG6 ^12. Även om mycket är fortfarande okänt om de olika signalvägar som stöd i MSC aktivering ger droppe kultur plattform ett praktiskt sätt att studera detta fenomen och förbättra MSC baserade terapier. Sammantaget har vi beskrivit, i protokollen här, medel för att aktivera eller priming MSCs i 3D kulturer under kemiskt definierade XF förhållanden för att producera anti-inflammatoriska, immunmodulerande och anti-cancer faktorer. Vi har också beskrivit hur dessa intakta MSC sfäroider kan levereras in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM-α (minimal essential medium alpha)	ThermoFisher/Gibco	12561049; 12561056; 12561072	minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium select	Atlanta Biologicals	S11595; S11510; S11550; S11595-24	component of complete culture media for all types of cells
L-glutamine	ThermoFisher/Gibco	25030081; 25030149; 25030164	component of complete culture media for all types of cells
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher/Gibco	15070063	component of complete culture media for all types of cells
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane	MilliporeSigma	SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE	media sterilization
150 mm cell culture dish	Nunc	D8554 SIGMA	cell culture
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator	Thermo Fisher	Model 3110	incubation of cultured cells
Early passage MCSs	Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White	NA	preparation of 2D and 3D cultures of MSCs
water bath	VWR	89501-468	warming media to 37 °C
Pipettes	Eppendorf	492000904	manual liquid handling
Pipete-Aid	Drummond Scientific Company	4-000-300	handling sereological pipetes
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml)	Corning	4487; 4101; 4251; 4490	liquid handling
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4	ThermoFisher/Gibco	10010023; 10010072; 10010031; 10010049	cell culture processing
0.25% trypsin/EDTA solution	ThermoFisher/Gibco	25200056; 25200072; 25200114	lifting adherent cells and dispersing cell aggregates
15 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352097	cell centrifugation
50 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352098	cell centrifugation
Eppendor refrigerated centrifuge	Eppendorf/Fisher Scientific	Model 5810R	cell centrifugation
hemocytometer	Fisher Scientific	26716	cell counting
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154 SIGMA	dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)	ThermoFisher/Gibco	A1067501	Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2)	Stem Cell Technologies	5420	Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells
HSA (Human serum albumin)	Gemini	800-120	Component of xeno-free MSC media
rHSA (recombinant Human serum albumin)	Sigma-Aldrich	A9731 SIGMA	Component of xeno-free MSC media
Total RNA isolation Mini Kit	Qiagen	74104	Total RNA extraction
Qiashredder	Qiagen	79654	Sample homogenization prior to total RNA extraction
RNAse-free DNase Set	Qiagen	79254	On-column DNA elimination during total RNA extraction
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250 ALDRICH	inhibition of RNAses in RLT buffer
Vortex	VWR	97043-562	mixing sample
Spectrophotometer	Biorad	NA	RNA concentration and quality
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher/Applied Biosystems	4368814	transcription of total RNA into cDNA
Gene Expression Assays	ThermoFisher/Applied Biosystems	varies	primer/probe combination for real-time PCR
Fast Universal PCR Master Mix	ThermoFisher/Applied Biosystems	4352042; 4364103; 4366073; 4367846	master mix for real-time PCR reaction
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)	ABI Prizm	NA	real-time PCR
1.5 ml centrifuge tube	Eppendorf	22364111	cell centrifugation, sample collection and storage
(-80 °C) freezer	Thermo Fisher	Model Thermo Forma 8695	sample storage
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit	R&D Systems	KGE004B	estimation of cytokine concentration in the sample
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)	ThermoFisher/Gibco	10566-016; 10566-024;10566-032	macrophage culture media
J774 mouse macrophages	ATCC	TIB-67	mouse macrophage cell line
12-well plate	Corning	3513	in vitro macrophage stimulation
LPS (lipopolysaccharide)	Sigma-aldrich	L4130	in vitro macrophage stimulation
Mouse TNF-a ELISA kit	R&D Systems	MTA00B	estimation of cytokine concentration in the sample
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit	R&D Systems	M1000B	estimation of cytokine concentration in the sample
RPMI-1640 medium	ThermoFisher/Gibco	11875-085	splenocyte culture media
BALB/c mice	The Jackson Laboratory	651	in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified	eBioscience	145-2C11	in vitro splenocyte stimulation
70 μm strainer	Corning	352350	Splenocyte preparation
Red blood cell lysis solution (1x)	Affymetrix eBioscience	00-4333	removal of red blood cells during splenocyte isolation
Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kit	R&D Systems	MIF 00	estimation of cytokine concentration in the sample
LNCaP prostate cancer cells	ATCC	CRL-1740	study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro
DNA-based cell proliferation assay kit	ThermoFisher	C7026	cell number measurement based on DNA content
NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	component of lysis reagent
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	ThermoFisher	FERR1021	calcium chelator, component of lysis reagent
Rnase A	Qiagen	19101	RNA degradation for measurement of DNA
Filter-based multi-mode microplate reader	BMG Technology	NA	Microplate assays (ELISA, cell quantification, etc.)
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher/Gibco	14175079	resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections
Isoflurane	MWI Vet Supply	502017	Anesthesia for in vivo injections
Oxygen, compressed gas	Praxair	NA	For use with isoflurane
Thermo Forma BSL-2 cabinet	Thermo Fisher	Model 1385	Sterile cell culture
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch	Terumo	SR*FNP2025	Delivery of shperoids into peritoneal cavity
Sterile micropipette tips	Eppendorf	varies	liquid/cells handling