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Developmental Biology

उत्पादन और चिकित्सीय mesenchymal स्टेम के प्रशासन / stromal सेल (एमएससी) Spheroids Primed 3-डी संस्कृतियों में अंडर Xeno मुक्त परिस्थितियों

Published: March 18, 2017 doi: 10.3791/55126
Automatic Translation
1, 2, 3, 4
1Department of Biology, University of Mary Hardin-Baylor, 2Department of Pediatrics, University of Texas Medical Branch, 3Multi-Organ Support Technology Task Area, U.S. Army Institute of Surgical Research, 4Internal Medicine, Texas A&M University Health Science Center

Abstract

Mesenchymal स्टेम / stromal कोशिकाओं (MSCs) जैव प्रौद्योगिकी और पुनर्योजी चिकित्सा में महान वादा पकड़। MSCs टिशू कल्चर प्लास्टिक करने के लिए अपने मजबूत पालन के माध्यम से कई वयस्क ऊतकों से अलग किया जा सकता है और फिर आगे इन विट्रो में विस्तार किया है, सबसे अधिक भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) का उपयोग। चूंकि FBS MSCs immunogenic बनने के लिए पैदा कर सकता है, एमएससी संस्कृतियों में अपनी उपस्थिति कोशिकाओं के दोनों नैदानिक ​​और प्रायोगिक अनुप्रयोगों को सीमित करता है। इसलिए, पढ़ाई रोजगार रासायनिक परिभाषित Xeno मुक्त (XF) एमएससी संस्कृतियों के लिए मीडिया अत्यंत मूल्यवान हैं। MSCS की कई लाभकारी प्रभाव इस तरह के ट्यूमर परिगलन कारक उत्तेजित जीन 6 (TSG6) और प्रोस्टाग्लैंडीन E2 (PGE2) के रूप में मुख्य रूप से इम्यूनोमॉड्यूलेटरी कारकों के स्राव के माध्यम से, सूजन और प्रतिरोधक क्षमता को विनियमित करने के लिए उनकी क्षमता के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है। हालांकि, MSCs सक्रियण की आवश्यकता होती है इन कारकों का उत्पादन करने के लिए और बाद MSCs के प्रभाव अक्सर क्षणिक है, बहुत रुचि के पूर्व सक्रिय कोशिकाओं prio के तरीके खोजने के लिए उभरा हैउनके उपयोग के लिए अनुसंधान, इस प्रकार इन विवो में क्रियान्वयन के लिए समय अंतराल को नष्ट करने। यहाँ हम तीन आयामी (3 डी) संस्कृतियों में या प्रोटोकॉल कुशलता से सक्रिय करने के लिए प्रधानमंत्री MSCs पेश रासायनिक परिभाषित एक्सएफ शर्तों के तहत और vivo में इन पूर्व सक्रिय MSCs प्रशासन के लिए। विशेष रूप से, हम पहली बार विधियों का वर्णन गोलाकार एमएससी माइक्रो ऊतकों या फांसी बूंदों में 'spheroids' एक्सएफ माध्यम का उपयोग कर पैदा करते हैं और प्रदर्शन कैसे क्षेत्रों और वातानुकूलित मध्यम (मुख्यमंत्री) विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए काटा जा सकता है। दूसरा, हम जीन अभिव्यक्ति स्क्रीन का वर्णन है और इन विट्रो में कार्यात्मक assays तेजी से spheroids में एमएससी सक्रियण के स्तर का आकलन करने के लिए कोशिकाओं के विरोधी भड़काऊ और विरोधी कैंसर संभावित बल। तीसरा, हम इन विवो प्रभावकारिता परीक्षण के लिए माउस पेरिटोनियल गुहा में बरकरार एमएससी spheroids इंजेक्षन करने के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन है। कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल के साथ साथ रासायनिक परिभाषित एक्सएफ चुनाव के तहत पूर्व सक्रिय MSCs प्राप्त करने का प्रमुख चुनौतियों पर काबू पानेditions और उपचार के लिए एमएससी spheroids प्रशासन के लिए एक लचीली व्यवस्था प्रदान करते हैं।

Introduction

Mesenchymal स्टेम / stromal कोशिकाओं (MSCs) विभिन्न पुनर्योजी चिकित्सा दृष्टिकोण के लिए महान क्षमता दिखाई है। MSCs शुरू में अस्थि मज्जा का एक stromal घटक के रूप में अलग थे लेकिन जब से वसा ऊतकों 1, 2, 3 सहित कई अन्य वयस्क ऊतकों से प्राप्त किया गया है। दिलचस्प है, मुख्य अलगाव विधि MSCs की उल्लेखनीय संपत्ति भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) की उपस्थिति में टिशू कल्चर प्लास्टिक पर कसकर पालन करने के लिए गले लगाती है। नदीम इस पारंपरिक अलगाव तकनीक दो आयामी (2 डी) संस्कृति में MSCs के आसान और तेजी से विस्तार के परमिट, यह भी बहुत कृत्रिम है और महत्वपूर्ण सेलुलर विशेषताओं 4 के संभावित नुकसान के लिए अग्रणी मूल निवासी तीन आयामी (3 डी) पर्यावरण के महत्व की उपेक्षा, 5 , 6। इसलिए, 3 डी संस्कृतियों में MSCs का अध्ययन है, जोपारंपरिक 2 डी संस्कृतियों की तुलना में अधिक शारीरिक हैं, "खो / कम" एमएससी विशेषताओं के लिए खोज में उभरा है। इसके अलावा, बहुत रुचि एमएससी संस्कृति और क्रियान्वयन के लिए Xeno मुक्त (XF) रासायनिक परिभाषित की स्थिति की पहचान है, और इस तरह नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए कोशिकाओं को और अधिक उत्तरदायी बनाने के लिए बढ़ गया है।

कई अध्ययनों से दोनों biomaterials में और गोलाकार समुच्चय या spheroids के रूप में MSCS की 3 डी संस्कृति का प्रदर्शन प्रकाशित किया गया है। Biomaterials में MSCs शुरू में, सेल वरीयता प्राप्त scaffolds के साथ क्षतिग्रस्त ऊतकों को बदलने के लिए ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण के लिए डिजाइन किए गए थे, जबकि MSCS की अंडाकार आकृति संस्कृतियों पूर्व नैदानिक या नैदानिक परीक्षणों में उपचार के लिए कोशिकाओं के प्रशासन के बाद विवो में एमएससी व्यवहार को समझने के लिए एक रास्ता के रूप में देखा गया था 4, 5, 7। दिलचस्प बात यह है MSCs प्रपत्र spheroids अनायास जब टिशू कल्चर प्लास्टिक के पालन की अनुमति नहीं है8, 9, 10। परंपरागत रूप से, सेल एकत्रीकरण स्पिनर कुप्पी तरीकों या तरल ओवरले तकनीक, प्रयासों में कैंसर जीव विज्ञान में शुरू में इस्तेमाल किया ट्यूमर microenvironment की नकल करने की कोशिश करने के तरीकों से मदद की थी। हाल ही में, अतिरिक्त तरीकों सामने आए हैं दिखाना है कि संस्कृति बर्तन में सेल एकत्रीकरण विशिष्ट रसायनों के साथ पूर्व लेपित सेल करने वाली प्लास्टिक आसंजन 4, 5, 6 को रोकने के लिए। सरल और सबसे किफायती तरीकों एमएससी spheroids उत्पन्न करने के लिए एक, एक तकनीक है कि अक्सर भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से embryoid निकायों के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया था फांसी बूंदों में उन्हें संस्कृति है। बूंद संस्कृति तकनीक फांसी के साथ, टिशू कल्चर प्लास्टिक के लिए सेल पालन सेल aggreg की सुविधा के लिए एक टिशू कल्चर डिश ढक्कन के नीचे पर मध्यम की एक बूंद में कोशिकाओं को निलंबित और गुरुत्वाकर्षण की इजाजत देने से रोका हैबूंद के शीर्ष में समझना। अंडाकार आकृति आकार में आसानी से, सेल एकाग्रता या ड्रॉप मात्रा बदलते फांसी ड्रॉप संस्कृतियों को नियंत्रित करने के लिए विशेष रूप से आसान बनाने के द्वारा चालाकी से किया जा सकता है।

MSCs के 3 डी संस्कृति पर प्रारंभिक अध्ययन के लिए अपने 2 डी समकक्षों 6, 8, 9 की तुलना में 3 डी में कोशिकाओं की विशेषताओं में कट्टरपंथी मतभेद का प्रदर्शन किया। एक ही समय में, रिपोर्ट में प्रदर्शन किया है कि इन विवो में MSCs के लाभदायक प्रभाव उनके जवाब में सूक्ष्म पर्यावरण cues से सक्रिय और बन विरोधी भड़काऊ और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी कारकों 11 का उत्पादन करने की क्षमता पर भरोसा किया। दिलचस्प है, इस तरह के प्रोस्टाग्लैंडीन E2 (PGE2), ट्यूमर परिगलन कारक उत्तेजित जीन 6 (TSG6), और hepatocyte वृद्धि कारक (HGF) के रूप में इन कारकों में से कई के लिए रास्ता साफ हो पारंपरिक 2 डी MSCs से एमएससी spheroids से ज्यादा बड़ी मात्रा में उत्पादन किया गया था का विचार3 डी संस्कृतियों का उपयोग कोशिकाओं 8, 12, 13 को सक्रिय करें। इसके अलावा, 3 डी संस्कृतियों में जीन सक्रियण चूहों 12 में इंजेक्शन के बाद तंत्र पुनरावृत्ति करने के लिए, कम से कम हिस्से में, सेल सक्रियण के लिए दिखाई दिया। प्रयोगों में उनके उपयोग के लिए पहले MSCs सक्रिय करके, कोशिकाओं के प्रभाव लंबे समय तक किया जा सकता है और अधिक प्रमुख के रूप में विवो में पारंपरिक एमएससी प्रभाव अक्सर देरी और क्षणिक है, और 'के रूप में हिट और रन "में वर्णित किया जा सकता है। पिछले कई वर्षों के दौरान, महत्वपूर्ण कार्यात्मक एमएससी spheroids का उपयोग अध्ययन दिखा दिया है कि वे भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को दबाने और इस तरह के मैक्रोफेज, वृक्ष के समान कोशिकाओं, न्यूट्रोफिल, और टी कोशिकाओं spheroids primed MSCs 2 के एक आकर्षक रूप बनाने के रूप में प्रेरक कोशिकाओं को प्रभावित करने से विवो में प्रतिरोधक क्षमता मिलाना कर सकते हैं 3। इसके अलावा, इस तरह के int के रूप में कैंसर रोधी अणुओं का उत्पादनerleukin -24 (आईएल -24) और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर से संबंधित apoptosis उत्प्रेरण ligand (निशान), MSCs monolayer को MSCs रिश्तेदार के 3 डी संस्कृतियों में बढ़ रहे हैं एक घटना है कि लक्षित कैंसर उपचार 8, 10, 14 के लिए शोषण किया जा सकता है।

परंपरागत एमएससी संस्कृति की आवश्यकता न केवल टिशू कल्चर प्लास्टिक लेकिन यह भी FBS के उपयोग के रूप में, एक और बाधा एमएससी spheroids अधिक उत्तरदायी बनाने के लिए नैदानिक ​​इस्तेमाल को दूर करने की थी। इस बाधा से निपटने के लिए हमने हाल ही में विशिष्ट रासायनिक परिभाषित एक्सएफ की शर्तों के तहत एमएससी spheroids के गठन से पता चला है और स्थापना की है कि जिसके परिणामस्वरूप एमएससी spheroids FBS के साथ 14 की स्थिति में उत्पन्न spheroids के रूप में ही विरोधी भड़काऊ और विरोधी कैंसर के अणुओं का उत्पादन करने में सक्रिय थे। इधर, इन निष्कर्षों कई विस्तृत प्रोटोकॉल है कि एक्सएफ का उपयोग कर 3 डी संस्कृतियों में पूर्व सक्रिय MSCs की पीढ़ी को प्रदर्शित में प्रस्तुत कर रहेमीडिया। इसके अलावा, प्रोटोकॉल प्रस्तुत कर रहे हैं कि एक साथ चूहों में बरकरार spheroids वितरित करने के लिए एक व्यावहारिक विधि के साथ, उनके विरोधी भड़काऊ, इम्यूनोमॉड्यूलेटरी और विरोधी कैंसर प्रभाव के संबंध में MSCs की सक्रियता के स्तर का आकलन करने के लिए प्रभावी तरीके से वर्णन है।

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Protocol

1. एमएससी अलगाव और विस्तार

  1. तैयारी के लिए केंद्र से जल्दी पारित होने MSCs और वयस्क स्टेम सेल (का वितरण प्राप्त http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html ) 15 के रूप में जमे हुए शीशियों। वैकल्पिक रूप से, एक नियमित प्रोटोकॉल 14 निम्नलिखित अस्थि मज्जा रेस्पायरेट्रस से MSCs अलग और रूप में जमे हुए शीशियों की दुकान।
  2. पूरी संस्कृति के माध्यम से (सीसीएम) है, जो कम से कम आवश्यक माध्यम अल्फा (αMEM) 15-20% प्रीमियम के साथ पूरक FBS, 2 मिमी एल glutamine का चयन करें, और 1x पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन है तैयार करें। निस्पंदन द्वारा मध्यम जीवाणुरहित।
  3. एक 150 मिमी सेल संस्कृति डिश में सीसीएम की 30 मिलीलीटर की जगह और युक्त 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पकवान सेते हैं।
  4. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 2 मिनट के लिए लगभग 10 6 MSCs युक्त जमे हुए शीशी सेते हैं।
  5. एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक pipet का उपयोग संस्कृति डिश के लिए शीशी की सामग्री स्थानांतरण और अवशिष्ट कोशिकाओं पर कब्जा करने के लिए पकवान से 1-2 मिलीलीटर सीसीएम के साथ शीशी कई बार धोने। एक उपयुक्त इनक्यूबेटर में पकवान रात भर रखें।
  6. ध्यान से कमरे के तापमान फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ दो बार धोने और संस्कृति पूर्व गर्म 0.25% trypsin / ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) समाधान के 3 मिलीलीटर के साथ MSCs अलग। टुकड़ी आमतौर पर इनक्यूबेटर में लगभग 3-4 मिनट लगते हैं।
  7. 6 मिलीलीटर सीसीएम पूर्व गरम करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के साथ पकवान में trypsin बेअसर और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन हस्तांतरण। पीबीएस के washes के साथ गठबंधन सेल उपज को अधिकतम करने के लिए।
  8. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं (450 XG) अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  9. सीसीएम की एक छोटी मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित और एक hemocytometer और trypan नीले रंग का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं की गिनती।
  10. 100 कोशिकाओं / 2 सेमी से कम 150 मिमी व्यंजन का एक उचित संख्या बीज
  11. trypsin / EDTA के साथ ऊपर के रूप में कोशिकाओं फसल और उचित माध्यम के साथ एक एकल शंक्वाकार ट्यूब में सभी कोशिकाओं गठबंधन। फिर से और अपकेंद्रित्र कोशिकाओं की गिनती के लिए एक ही माध्यम की एक छोटी मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित। मानक सीसीएम (FBS युक्त) या विभिन्न व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एक्सएफ मीडिया योगों का प्रयोग करें, यहाँ के रूप में एक्सएफ मध्यम-1 (XFM -1) और एक्सएफ मध्यम 2 (XFM -2), दोनों के साथ और मानव सीरम albumin बिना निर्दिष्ट (एचएसए, 13 मिलीग्राम / एमएल) पूरकता।

3-डी में सक्रिय एमएससी spheroids के 2. तैयारी एक्सएफ शर्तों के तहत ड्रॉप संस्कृतियों फांसी

  1. लगभग 25,000 कोशिकाओं के spheroids उत्पन्न करने के लिए, सीसीएम में काटा MSCs, XFM -1, XFM-1 + एचएसए (13 मिलीग्राम / एमएल), XFM -2, या XFM -2 + एचएसए 714 कोशिकाओं में (13 मिलीग्राम / एमएल) पतला / μl।
  2. पिपेट 35 μl / पर कोशिकाओं की बूंदेंएक 150 मिमी उल्टे संस्कृति डिश ढक्कन के नीचे। एकाधिक बूंदों को आसानी से एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके pipetted जा सकता है।
    नोट: बड़ा या छोटा spheroids वांछित हैं, सेल एकाग्रता या ड्रॉप मात्रा (25-45 μl) उचित रूप से बदल जाते हैं।
  3. पकवान के आधार में कमरे के तापमान पीबीएस के 20 मिलीलीटर स्थानांतरण और एक सतत और स्थिर गति में ढक्कन फ्लिप, बूंदों से युक्त है, ताकि बूंद apices नीचे का सामना। संस्कृति डिश के आधार पर सावधानी से ढक्कन रखें।
  4. यह परेशान उचित क्षेत्र विधानसभा की अनुमति के बिना 3 दिन के लिए इनक्यूबेटर में पकवान स्थानांतरण।
  5. 72 घंटे के बाद, ढक्कन ध्यान हटाने और यह inverting इतना है कि बूँदें, एक बार फिर से ऊपर की ओर का सामना करके अंडाकार आकृति फसल शुरू करते हैं।
  6. कोण लगभग 10-20 डिग्री तक ढक्कन और बूंदों धक्का, spheroids युक्त, एक सेल चोर का उपयोग कर प्लेट किनारे करने के लिए।
  7. एक 1000 μl पाइप के साथ एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में क्षेत्रों और मध्यम स्थानांतरणटीटीई। उपयोग कमरे के तापमान पीबीएस और उसी टिप प्लेट धोने और spheroids के अधिक से अधिक वसूली सुनिश्चित करने के साथ पिपेट।
  8. वास्तविक समय पीसीआर assays (प्रोटोकॉल 3) के लिए, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 450 XG पर क्षेत्र के निलंबन अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला aspirate। पीबीएस के साथ spheroids धो और दोनों centrifugation और आकांक्षा चरणों को दोहराएँ। जानवरों में प्रसव (प्रोटोकॉल 8), क्षेत्रों centrifugation बिना ट्यूब (~ 3-4 मिनट) के तल में व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं।

विरोधी भड़काऊ और विरोधी कैंसर मार्कर के 3. वास्तविक समय पीसीआर

  1. अलग-थलग करने monolayer MSCs से डीएनए मुक्त कुल शाही सेना (1 प्रोटोकॉल) और एमएससी spheroids (प्रोटोकॉल 2) है कि पीबीएस के साथ धोया और centrifuged थे homogenizer कॉलम और RNase मुक्त DNase सेट के साथ शाही सेना निकासी किट का प्रयोग करें।
  2. Lyse कम से कम 100,000 monolayer MSCs और अलग 15 मिलीलीटर में हर हालत से 20 spheroids RLT बफर युक्त β-mercaptoethanol (1: 100) के साथ शंक्वाकार ट्यूब।
  3. ट्रांस1.5 मिलीलीटर RNase मुक्त ट्यूबों में अच्छी तरह से मिश्रित lysates fer और अंडाकार आकृति सेल में सहायता करने के लिए एक फ्रीजर (-80 डिग्री सेल्सियस) के लिए कम से कम 3 घंटा में जगह है।
  4. बर्फ, भंवर पर सेल lysates गला लें संक्षेप में, और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्तनधारी कुल शाही सेना अलगाव किट का उपयोग कर शाही सेना के अलगाव के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
  5. यों और पृथक शाही सेना एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग की गुणवत्ता का आकलन।
  6. निर्माता के निर्देशों के उच्च क्षमता सीडीएनए रिवर्स प्रतिलेखन किट या समकक्ष अनुसार उपयोग करने के लिए वास्तविक समय पीसीआर सीडीएनए उत्पन्न करते हैं।
  7. सीडीएनए नमूने, व्यावसायिक रूप से डिजाइन किया गया वास्तविक समय पीसीआर प्राइमरों / जांच (जीन एक्सप्रेशन Assays), और पीसीआर मास्टर मिक्स बर्फ पर रखें। GAPDH (नियंत्रण), पीटीजीएस 2 (कॉक्स -2, विरोधी भड़काऊ) के लिए उपयोग प्राइमरों / जांच, TNFAIP6 (TSG6, विरोधी भड़काऊ), निशान (एंटी-कैंसर), और आईएल -24 (एंटी-कैंसर)।
  8. जीन एक्सप्रेशन Assays और फास्ट Unive के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार वास्तविक समय पीसीआर प्रतिक्रियाओं को तैयारrsal मास्टर मिक्स।
  9. प्रयोग दस्तावेजों पैदा करने और चलाने के प्रदर्शन के लिए वास्तविक समय पीसीआर साधन के लिए दिशा-निर्देशों का पालन करें।
  10. GAPDH एक आधारभूत 8, 14 के रूप में अंतर्जात नियंत्रण और monolayer MSCs के रूप में प्रयोग जीन अभिव्यक्ति में रिश्तेदार परिवर्तन (सापेक्ष मात्रा, RQ) की गणना के द्वारा ΔΔC टी पद्धति का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण।

इम्यूनोमॉड्यूलेटरी की assays और एंटी-कैंसर की क्षमता के लिए मुख्यमंत्री की 4. संग्रह

  1. के रूप में एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में ऊपर वर्णित है, एक सेल चोर और एक पिपेट का उपयोग, हालांकि spheroids और मुख्यमंत्री फसल, पीबीएस के साथ पकवान पलकों साफ नहीं है के रूप में इस सीएम कमजोर होगी।
  2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 450 XG पर अपकेंद्रित्र, ध्यान से एक विंदुक के साथ सेल मुक्त सतह पर तैरनेवाला जमा है, और 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण।
  3. कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र, ध्यान से सीएल इकट्ठाएक विंदुक के साथ arified सेमी, और एक फ्रीजर में भंडारण के लिए नए 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में मुख्यमंत्री हस्तांतरण (-80 डिग्री सेल्सियस)। जब यह कई assays के लिए उपयोग कर ठंड से पहले मुख्यमंत्री की aliquots तैयार करें।
    नोट: नीचे की ओर assays के प्रदर्शन के लिए पहले, PGE2 एकाग्रता, मुख्यमंत्री के विरोधी भड़काऊ क्षमता का एक अच्छा संकेत है, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक एलिसा किट का उपयोग निर्धारित किया जा सकता है। TSG6 एकाग्रता एक प्रकाशित प्रोटोकॉल 14 का उपयोग निर्धारित किया जा सकता है।

5. Macrophage परख एमएससी-मुख्यमंत्री के विरोधी भड़काऊ क्षमता का आकलन करने के लिए

  1. Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) एल alanyl-एल glutamine युक्त और 10% प्रीमियम के साथ पूरक FBS और 1x पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन चयन के होते हैं जो बृहतभक्षककोशिका मध्यम, तैयार करें। फिल्टर बाँझ माध्यम।
  2. लगभग 10 6 J774 माउस मैक्रोफेज के एक जमे हुए शीशी प्राप्त करें और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 2 मिनट के लिए शीशी सेते हैं।
  3. सतह पर तैरनेवाला Aspirate, मैक्रोफेज के माध्यम से 1 मिलीलीटर में मैक्रोफेज निलंबित, और एक 150 मिमी पेट्री बृहतभक्षककोशिका माध्यम के 30 मिलीलीटर युक्त डिश में मैक्रोफेज हस्तांतरण।
  4. मध्यम बदलें हर 2 दिन और लगभग 70-80% मिला हुआ है जब तक इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं।
    नोट: मैक्रोफेज पेट्री डिश के लिए कसकर पालन नहीं करते हैं, इस प्रकार देखभाल मध्यम परिवर्तन के साथ कोशिकाओं को कम करने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए।
  5. एक विंदुक के साथ कोशिकाओं पर बृहतभक्षककोशिका मध्यम छिड़काव द्वारा मैक्रोफेज हार्वेस्ट। 200-300 XG और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं स्थानांतरण।
  6. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और एक hemocytometer साथ सेल की गिनती के लिए बृहतभक्षककोशिका माध्यम की एक छोटी मात्रा में कोशिकाओं को निलंबित। बृहतभक्षककोशिका मेरे साथ 200,000 कोशिकाओं / एमएल एकाग्रता समायोजितdium।
  7. बृहतभक्षककोशिका परख के लिए सेट शुरू करने के लिए, एक 12 अच्छी तरह से थाली के कुओं में बृहतभक्षककोशिका माध्यम के 480 μl जोड़ें।
  8. गैर उत्तेजित नियंत्रण कुओं में बृहतभक्षककोशिका माध्यम के 20 μl जोड़ें और 20 μl गैर वातानुकूलित या एमएससी वातानुकूलित मध्यम, प्रयोगात्मक कुओं में ऊपर तैयार। प्लेट दोहन से कुओं में मध्यम मिक्स।
  9. गैर उत्तेजित मैक्रोफेज नियंत्रण कुओं को बृहतभक्षककोशिका सेल निलंबन के 500 μl स्थानांतरण।
  10. 500-1: 1 के अलावा के साथ शेष मैक्रोफेज उत्तेजित 0.1 के 1,000 मिलीग्राम / एमएल (LPS) lipopolysaccharide और सेते कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट।
  11. गैर-वातानुकूलित या एमएससी वातानुकूलित माध्यम के साथ कुओं में उत्तेजित मैक्रोफेज के 500 μl स्थानांतरण। तेजी से प्लेट में कई बार कमाल से कुओं मिक्स।
  12. 16-18 घंटे के लिए एक मशीन के लिए थाली स्थानांतरण।
  13. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर बृहतभक्षककोशिका वातानुकूलित मध्यम और सेंट्रीफ्यूज हार्वेस्ट।
  14. हस्तांतरणनई ट्यूब और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा (TNF-α) और निर्माता के निर्देशों का पालन वाणिज्यिक एलिसा किट द्वारा इंटरल्यूकिन 10 (आईएल -10) सामग्री के लिए परख में सतह पर तैरनेवाला।

6. Splenocyte परख उपगोल-मुख्यमंत्री की इम्यूनोमॉड्यूलेटरी क्षमता का आकलन करने के लिए

  1. पूरा splenocyte मध्यम, Rosewell पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) -1640 मध्यम 10% गर्मी निष्क्रिय FBS, 1x पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक है, और 2-mercaptoethanol के होते हैं जो तैयार करें। फिल्टर बाँझ माध्यम।
  2. तिल्ली के ऊपर पेट के बाईं ओर पर तैयार एक चीरा के माध्यम से euthanized-पुरुष BALB / ग चूहों से फसल spleens, सामने के बीच लगभग मध्य मार्ग और पैर 14 हिंद। एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के लिए तिल्ली स्थानांतरण splenocytes 14 को अलग-थलग करने के लिए।
  3. एक बाँझ पेट्री डिश usin में 70 माइक्रोन झरनी के माध्यम से spleens धक्का द्वारा splenocytes / लिम्फोसाइट अलगजी एक 2-3 से एक सवार की नरम रबर / प्लास्टिक अंत 14 सिरिंज मिलीलीटर। spleens अलग कर देना एक पीस को परिपत्र गति का प्रयोग करें।
  4. सेल झरनी ठंड पीबीएस के साथ कई बार धोएं और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पेट्री डिश से कोशिकाओं को हस्तांतरण। 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंड पीबीएस और सेंट्रीफ्यूज (500 XG) के साथ ट्यूब भरें।
  5. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 5-10 मिनट के लिए 5-10 मिलीलीटर लाल रक्त सेल समाधान (तिल्ली प्रति) के साथ ऊष्मायन द्वारा एरिथ्रोसाइट्स से कोशिकाओं को साफ़ करें।
  6. 500 XG पर 5-10 मिनट के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज को ठंड पीबीएस जोड़कर सेल बंद करो।
  7. , पूरा splenocyte माध्यम में अलग कक्षों को निलंबित एक 40 माइक्रोन झरनी के माध्यम से फिल्टर, और एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती। सेल निलंबन के लिए splenocyte मध्यम जोड़ें 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम सेल एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए
    नोट: इस तकनीक को आम तौर पर माउस तिल्ली के अनुसार लगभग 3 एक्स 10 7 splenocytes अर्जित करता है।
    8. नोट: splenocytes की मात्रा की आवश्यकता प्रयोगात्मक शर्तों के रूप में अन्वेषक द्वारा निर्धारित की संख्या पर निर्भर करता है (6.9 कदम देखें)। हर प्रयोगात्मक नमूना के लिए / अच्छी तरह से, 10 6 splenocytes आवश्यक हैं।
  8. स्थानांतरण 10 6 splenocytes (उत्तेजित या गैर उत्तेजित) एक 12 अच्छी तरह से थाली के कुओं में और गैर वातानुकूलित (नियंत्रण) जोड़ने या एमएससी-सेमी 1 के अंतिम कमजोर पड़ने पर कुओं में: 10-1: 20।
  9. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर 24 घंटा और सेंट्रीफ्यूज के बाद splenocyte मुख्यमंत्री हार्वेस्ट।
  10. वाणिज्यिक एलिसा किट निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए नई ट्यूब और इंटरफेरॉन गामा (IFN-γ) सामग्री के लिए परख में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण।

7. प्रोस्टेट कैंसर परख उपगोल-मुख्यमंत्री के विरोधी कैंसर क्षमता का आकलन

  1. पूरा RPMI मध्यम विकास है कि RPMI 1640 मध्यम 10 के साथ पूरक तैयार% FBS, 1x पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन।
  2. LNCaP प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं का एक जमे हुए शीशी प्राप्त करें और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 2 मिनट के लिए शीशी सेते हैं।
  3. पूरा RPMI विकास एक मोटर चालित pipettor का उपयोग माध्यम के 30 मिलीलीटर और एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक pipet युक्त एक संस्कृति डिश में शीशी की सामग्री स्थानांतरण। पकवान से मध्यम के साथ शीशी कई बार धोएं और इनक्यूबेटर में पकवान जगह है।
  4. बस से पहले कोशिकाओं confluency तक पहुँचते हैं, कमरे के तापमान पीबीएस के साथ दो बार धोने और संस्कृति पूर्व गर्म 0.25% trypsin / EDTA समाधान के 3 मिलीलीटर के साथ LNCaP कोशिकाओं को अलग।
  5. पूरा RPMI मध्यम विकास के साथ डिश में trypsin बेअसर और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में washes के साथ एक साथ कोशिकाओं को हस्तांतरण।
  6. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 450 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  7. पूरा RPMI मध्यम विकास की छोटी मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित और एक hemocytometer का उपयोग कैंसर कोशिकाओं की गिनती।
  8. एक सेल प्रसार परख किट का उपयोग कर एक सेल के विकास परख करने के लिए, कुओं से मध्यम aspirate और एक फ्रीजर (-80 डिग्री सेल्सियस) के लिए कम से कम 3 घंटा में थाली हस्तांतरण।
    1. प्लेट गला लें और अच्छी तरह से सेल युक्त 180 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, और 0.2 मिलीग्राम / एमएल RNase ए अभिकर्मक के 100 μl जोड़कर प्रत्येक में कोशिकाओं lyse
    2. एक मानक वक्र के लिए, LNCaP कोशिकाओं के lyse जाना जाता मात्रा में ऊपर वर्णित है।
    3. 1 घंटे के बाद, 1x सेल युक्त 1 बफर के 100 μl जोड़ें: सेल प्रसार परख अभिकर्मक के 100 कमजोर पड़ने और सेल राशि का निर्धारण करने के लिए प्रत्येक कुएं में प्रतिदीप्ति उपाय।

8. बरकरार spheroids के इंट्रापेरिटोनियल प्रसव

  1. जैसा कि ऊपर (प्रोटोकॉल 2) और resuspend टी वर्णित अंडाकार आकृति MSCs तैयारवह बाँझ हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HbSS) 0.2-0.5% एचएसए के साथ पूरक एक्सएफ की स्थिति बनाए रखने के लिए क्षेत्रों। समाधान में एचएसए इंजेक्शन के दौरान प्लास्टिक के लिए क्षेत्र के आसंजन को रोकने में मदद करता है।
  2. 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 40-120 spheroids स्थानांतरण और ट्यूबों के लिए 6 मिलीलीटर HBSS / एचएसए जोड़कर कोशिकाओं को धो लें। क्षेत्रों उतरना करने के लिए 3-4 मिनट की अनुमति है। प्रत्येक जानवर के लिए spheroids के एक स्वतंत्र शंक्वाकार ट्यूब तैयार करें। इसके अलावा, अंडाकार आकृति प्रतिधारण (नीचे 8.18 देखें) और हस्तांतरण के बाद चिकित्सीय कारकों के उत्पादन (नीचे 8.19 देखें) अगर वांछित निर्धारण करने assays के लिए spheroids के अतिरिक्त ट्यूबों तैयार।
  3. सतह पर तैरनेवाला Aspirate, बाँझ HBSS के 100-200 μl 0.2-0.5% एचएसए के साथ पूरक के साथ spheroids ओवरले, और बर्फ पर ट्यूबों की जगह।
  4. संक्षेप में प्रेरण कक्ष में लगभग 2 मिनट के लिए चुटकी पैर की अंगुली पलटा के लापता होने तक 100% ऑक्सीजन में 2% isoflurane के साथ जानवरों anesthetize।
  5. पशु बीएसएल -2 कैबिनेट, पृष्ठीय Aspe के अंदर की जगहनीचे सीटी (उदर पक्ष का सामना करना पड़), एक नाक शंकु के माध्यम से 1.5% isoflurane / ऑक्सीजन के मिश्रण के निरंतर प्रवाह के साथ।
  6. एक एंटीसेप्टिक के रूप में इस तरह के 70% शराब के साथ कम माउस पेट साफ करें।
  7. 20 जी नसों (iv) कैथेटर की टोपी निकालें और कैथेटर-कटार विधानसभा के साथ intraperitoneal इंजेक्शन प्रदर्शन करते हैं। माउस त्वचा धारण करने के लिए एक हाथ का उपयोग करें और एक और इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए। लगभग सुई की नोक midline की ओर इशारा करते हुए के साथ एक flexed संयुक्त घुटने और जननांग क्षेत्र को जोड़ने के लिए एक कृत्रिम लाइन के बीच में इंजेक्शन के बिंदु का पता लगा।
    नोट: कैथेटर-कटार विधानसभा एक नियमित सुई से एक उच्च प्रतिरोध किया है, इसलिए सावधानी के रूप में पेट, जो आंतरिक अंगों को चोट में परिणाम सकता है में भी गहरी सुई इंजेक्षन करने के लिए नहीं लिया जाना है। त्वचा की पैठ और उसके बाद मांसपेशियों / पेरिटोनियल झिल्ली कैथेटर प्लेसमेंट के दौरान महसूस किया जा सकता है।
  8. धीरे-कैथेटर कटार विधानसभा से धातु कटार / सुई को हटा दें। checरक्त, मूत्र और मल के लिए कटार कश्मीर और यह त्यागें। सुई पर रक्त आंतरिक अंग (एस) के पंचर इंगित करता है।
  9. इंजेक्शन के दौरान एक ईमानदार स्थिति में प्लास्टिक कैथेटर पकड़ो द्रव का प्रवाह की अनुमति के लिए।
  10. एक 100-200 μl टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग कैथेटर के माध्यम से बाँझ HBSS / एचएसए के लगभग 100 μl इंजेक्शन द्वारा प्लास्टिक कैथेटर के उचित स्थान की पुष्टि करें। कैथेटर सिरिंज एडाप्टर के एक तंग सील के गठन के अंदर विंदुक टिप के अंत में रखें। धीरे-धीरे पेरिटोनियल गुहा के अंदर तरल पदार्थ इंजेक्षन।
    नोट: एक ठीक से तैनात कैथेटर में तरल पदार्थ को स्वतंत्र रूप से कैथेटर की केवल मामूली समायोजन के साथ पेरिटोनियल गुहा के अंदर प्रवाह होगा। कैथेटर के अनुचित स्थान (चमड़े के नीचे या इंट्रा-आंतों, या अगर इस तरह के गुर्दे के रूप में सुई घायल पेरिटोनियल अंगों की नोक) प्रतिरोध को बढ़ाने और प्रवाह कम हो जाएगा। चमड़े के नीचे प्लेसमेंट के त्वचा के नीचे एक स्पष्ट "बुलबुले" के गठन में परिणाम होगा।
  11. टी लीजिएवह spheroids, HBSS / एचएसए (कदम 8.3) के 100-200 μl में तैयार एक 200 μl विंदुक टिप का उपयोग एमएससी, और जैसा कि ऊपर वर्णित कैथेटर के माध्यम से पूरे पेरिटोनियल गुहा में क्षेत्रों की मात्रा (40-120 क्षेत्रों) हस्तांतरण।
  12. ऊपर के रूप में एक ही टिप का उपयोग कर किसी भी अवशिष्ट spheroids इकट्ठा करने और उन्हें पेरिटोनियल गुहा में इंजेक्षन करने के लिए HBSS / एचएसए के 100 μl के साथ क्षेत्रों युक्त ट्यूब धो लें।
  13. (वैकल्पिक) कैथेटर धोने के लिए पेरिटोनियल गुहा में HBSS / एचएसए के एक अतिरिक्त 100 μl इंजेक्षन।
  14. धुंध पैड कैथेटर से अधिक एंटीसेप्टिक में भिगो प्लेस और धीरे धीरे पेरिटोनियल गुहा से कैथेटर हटा दें और इसे त्यागने।
  15. धीरे उंगलियों के साथ पेरिटोनियल गुहा की मालिश spheroids का भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए।
  16. पशु निकट पर्यवेक्षण के तहत वसूली और इंजेक्शन साइट से खून बह रहा है के लिए देखते हैं।
  17. किसी भी शेष spheroids के लिए कैथेटर और 15 मिलीलीटर ट्यूब का निरीक्षण किया। इसमें कुछ क्षेत्रों का निरीक्षण करने के लिए सामान्य हैकैथेटर / ट्यूब।
    नोट: तकनीक एमएससी अंडाकार आकृति वितरण के लिए वर्णित सामान्य जानवरों में या चोट मॉडल की एक किस्म में उपयोग के लिए अपनाया जा सकता है। इस तकनीक को सफलतापूर्वक माउस कार्निया की चोट और अन्तर्जीवविष मॉडल में spheroids इंजेक्षन करने के लिए, साथ ही एक zymosan प्रेरित पेरिटोनिटिस मॉडल 8 में इस्तेमाल किया गया है।
  18. बरकरार रखा spheroids (वैकल्पिक) की संख्या यों, एक डीएनए आधारित सेल नंबर मात्रा का ठहराव किट / अभिकर्मक का उपयोग करें। 15 मिलीलीटर ट्यूब से अधिक इस्तेमाल कैथेटर पकड़ो और सख्ती किसी भी शेष क्षेत्रों के 15 मिलीलीटर ट्यूब में वापस मजबूर करने के लिए कैथेटर के माध्यम से HBSS / एचएसए बांटना।
    1. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर 15 मिलीलीटर ट्यूब अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला aspirate। एक फ्रीजर (-80 डिग्री सेल्सियस) के लिए कम से कम 3 घंटा में अंडाकार आकृति गोली युक्त ट्यूब स्थानांतरण।
    2. ट्यूब गला लें और सेल युक्त 180 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, और 0.2 मिलीग्राम / एमएल RNase ए अभिकर्मक के 500 μl जोड़कर क्षेत्रों lyse
    3. एक नियंत्रण, fre के लिएEZE और lyse spheroids के एक ज्ञात राशि के रूप में ऊपर वर्णित (अधिमानतः एक इंजेक्शन के लिए तैयार spheroids की संख्या के बराबर)।
    4. 1 घंटे के बाद, सेल lysate के 100 μl, दो प्रतियों में, 1x सेल किट से सेल प्रसार परख अभिकर्मक के एक 1:50 कमजोर पड़ने से युक्त बफर के 100 μl हस्तांतरण एक 96 अच्छी तरह से microplate में और एक अच्छी तरह से जोड़ें। 10 मिनट के बाद, क्षेत्रों की संख्या है कि नियंत्रण नमूने के साथ प्रयोगात्मक नमूना (एस) की तुलना द्वारा इंजेक्शन नहीं थे निर्धारित करने के लिए प्रत्येक कुएं में प्रतिदीप्ति उपाय।
  19. PGE2 की एकाग्रता और TSG6 का तबादला क्षेत्रों द्वारा उत्पादन को मापने के द्वारा इंजेक्शन (वैकल्पिक) के लिए तैयार spheroids की सक्रियता के स्तर का मूल्यांकन। स्थानांतरण 40-120 कैथेटर के माध्यम से क्षेत्रों, के रूप में एक 12 अच्छी तरह से या 6 अच्छी तरह से थाली में 1 या 2 मिलीलीटर αMEM 2% FBS और 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक युक्त में ऊपर वर्णित है। इनक्यूबेटर में प्लेटें 6 घंटे के लिए रखें।
    1. मध्यम से स्थानांतरणकुओं 1.5 या 15 मिलीलीटर ट्यूबों में 6 घंटे के बाद और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 450 XG पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र।
    2. कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए 10,000 XG पर एक पिपेट और सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर नए सिरे से 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में सेल मुक्त सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण।
    3. नई 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और PGE2 एकाग्रता (मुख्यमंत्री के विरोधी भड़काऊ क्षमता का अच्छा सूचक) निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक एलिसा किट का उपयोग करने के लिए परख में स्पष्ट किया मुख्यमंत्री (सतह पर तैरनेवाला) हस्तांतरण। TSG6 एकाग्रता एक प्रकाशित प्रोटोकॉल 14 का उपयोग निर्धारित किया जा सकता है।

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Representative Results

वर्तमान काम में, फांसी ड्रॉप संस्कृतियों कॉम्पैक्ट गोलाकार सूक्ष्म ऊतकों या एक्सएफ की शर्तों के तहत सक्रिय MSCS की 'spheroids' उत्पन्न करने के लिए कार्यरत थे। चित्रा 1 में अनुसंधानात्मक रोडमैप को दर्शाया गया है कि MSCs स्वयं को इकट्ठा करने के लिए प्रोत्साहित किया जब 72 घंटा, जिसके बाद spheroids, या मुख्यमंत्री क्षेत्र व्युत्पन्न चिकित्सीय कारकों के साथ लोड के लिए बूँदें फांसी में निलंबित कर दिया spheroids में एकत्र किया जा सकता है और संभवतः दोनों में उपयोग किया जाता है अनुसंधान और नैदानिक ​​अनुप्रयोगों। क्षेत्र के उत्पादन के लिए आवश्यक कोशिकाओं की बड़ी संख्या 2 सेमी प्रति 100-200 कोशिकाओं कम घनत्व पर MSCs बोने, आम तौर पर, और उसके बाद लगभग 80% मिला हुआ (चित्रा 2 तक 6-7 दिनों के लिए कोशिकाओं के विस्तार के द्वारा एक सप्ताह के भीतर प्राप्त किया जा सकता )। सेल विकास कैनेटीक्स, दैनिक व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना के द्वारा चुना गया, संकेत दिया है कि एक मजबूत विस्तार के चरण (दिन 3-7) 1-2 दिनों का एक संक्षिप्त अंतराल चरण (चित्रा -2 सी <इस प्रकार है/ Strong>)। पारित होने के 2 या 3 में MSCs आम तौर पर 1 लाख cryopreserved कोशिकाओं जब सीसीएम में सुसंस्कृत की एक एकल शीशी से 50-100 मिलियन कोशिकाओं निकलेगा।

विस्तार और फसल के बाद, MSCs उच्च सेल एकाग्रता में निलंबित कर रहे हैं spheroids, आम तौर पर μl प्रति 500-1,000 कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए। फांसी ड्रॉप संस्कृतियों एक ऊतक संस्कृति डिश ढक्कन, जो बाद में फ़्लिप किया और उचित रूप से पकवान के आधार पर तैनात है (चित्रा 3) के नीचे पर MSCs युक्त मध्यम के 25-40 μl बूंदों में परिवर्तित करने के लिए तैयार हैं। जब μl प्रति 714 कोशिकाओं पर सीसीएम के 35 μl बूंदों में निलंबित कर दिया है (यानी बूंद प्रति 25,000 कोशिकाओं), MSCs पहले छोटे समुच्चय है कि अंत में ड्रॉप (चित्रा 3 सी) के शीर्ष में 72 घंटा में एक कॉम्पैक्ट क्षेत्र उत्पन्न करने के लिए संगठित होना में इकट्ठा। Spheroids भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एक्सएफ एमएससी विस्तार के लिए अनुकूलित मीडिया के कई प्रकार में 72 घंटा से अधिक फार्म, यहाँ XFM -1 और XFM -2 के रूप में भेजा। हालांकि, XFM -1 में एक कॉम्पैक्ट क्षेत्रों के गठन के 13 मिलीग्राम / एमएल मानव सीरम albumin (एचएसए), एक एकाग्रता है कि सीसीएम में अनुमानित कुल प्रोटीन सामग्री (चित्रा 3 डी) को दर्शाता साथ पूरकता की आवश्यकता है। एक कॉम्पैक्ट क्षेत्रों में आसानी से एचएसए के बिना या प्रोटीन से मुक्त αMEM (चित्रा 3 डी) में बुनियादी XFM -1 में फार्म नहीं है। क्षेत्र के विधानसभा, एमएससी phenotype परिवर्तन मौलिक (चित्रा 4), और जब उचित रासायनिक परिभाषित एक्सएफ मध्यम (यानी XFM-1 + एचएसए) में, PGE2 और TSG6 (चित्रा 4C) सहित upregulated रहे हैं कई विरोधी भड़काऊ कारकों की अभिव्यक्ति के दौरान। हालांकि, TSG6 और PGE2 के उत्पादन स्पष्ट रूप से एचएसए (चित्रा 4C) के बिना XFM -2 या XFM -1 में क्षेत्रों के रूप में सुसंस्कृत MSCs में संवर्धित नहीं है। उल्लेखनीय है कि इन विरोधी भड़काऊ कारकों, साथ ही कैंसर रोधी कारकों ट्रेल और आईएल -24, अत्यधिक अंडाकार आकृति MSCs में रिश्तेदार, MSCs monolayer को जब टी upregulated थेवह XFM -1 या तो पुनः संयोजक एचएसए (RHSA) या नैदानिक ग्रेड एचएसए (cHSA) मानव रक्त (चित्रा 4D) से तैयार के साथ पूरक में सुसंस्कृत थे क्षेत्रों।

विभिन्न मीडिया योगों में तैयार एमएससी क्षेत्रों के चिकित्सीय क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, कई व्यावहारिक परीक्षण (चित्रा 5) प्रदर्शन कर रहे हैं। Spheroids के प्रतिरक्षा modulatory गुण पहली LPS उत्तेजित मैक्रोफेज और CD3 उत्तेजित splenocytes / लिम्फोसाइटों (चित्रा 5) द्वारा उत्पादित साइटोकिन्स के स्तर पर क्षेत्र में मुख्यमंत्री के प्रभाव को मापने के द्वारा इन विट्रो में निर्धारित कर रहे हैं। एमएससी से मुख्यमंत्री, सीसीएम और XFM-1 / एचएसए स्पष्ट रूप से दबा दिया बृहतभक्षककोशिका TNFα और splenocyte IFNγ के उत्पादन में सुसंस्कृत क्षेत्रों है, जबकि एक ही समय में विरोधी भड़काऊ साइटोकाइन का बढ़ाया स्तरों आईएल -10 (चित्रा 5 ए और 5 ब)। क्षेत्रों के विरोधी कैंसर गुण क्षेत्र मुख्यमंत्री ओ के प्रभाव को मापने के द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैंn विकास और LNCaP प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं की आकृति विज्ञान। एक्सएफ मध्यम XFM-1 / एचएसए प्रभावी ढंग से LNCaP प्रसार सीसीएम FBS युक्त (चित्रा 5C और 5 डी) के समान कम हो।

महत्वपूर्ण बात है, बरकरार एमएससी क्षेत्रों विवो में कोशिकाओं की विरोधी भड़काऊ गतिविधि (चित्रा 6) का परीक्षण करने के लिए चूहों के पेरिटोनियल गुहा में प्रशासित किया जा सकता है। इन प्रयोगों के लिए, क्षेत्रों एचएसए के एक कम एकाग्रता, जबकि एक एक्सएफ राज्य संरक्षण जो प्लास्टिक टयूबिंग के लिए उनकी आसंजन को कम करता युक्त HBSS में इंजेक्शन के लिए तैयार हैं। इसके बाद, क्षेत्रों को आसानी से संग्रह ट्यूब (चित्रा 6A) से स्थानांतरण के बाद, एक सुई / कैथेटर विधानसभा (चित्रा 6C और 6D) उचित रूप से एक मानक intraperitoneal इंजेक्शन के लिए तैनात इंजेक्शन के माध्यम से किया जा सकता है पिपेट (चित्रा 6B) का उपयोग। इस दृष्टिकोण का प्रयोग, एमएससी spheroids नियमित रूप से हो सकता हैउनकी ईमानदारी (चित्रा 6G और 6H) बाधा पहुँचा के बिना एक दक्षता 90% से अधिक (चित्रा 6E और 6F) में स्थानांतरित कर दिया। पेरिटोनियल गुहा के भीतर कैथेटर टिप की अनुचित स्थिति गरीब क्षेत्र के वितरण और उच्च प्रतिधारण (चित्रा 6F) की ओर जाता है। महत्वपूर्ण बात है, पिपेट / कैथेटर के भीतर क्षेत्र के प्रतिधारण के स्तर में गुणात्मक दृश्य निरीक्षण द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, या मात्रात्मक संग्रह / बनाए रखा क्षेत्रों lysing और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए आधारित सेल मात्रा का ठहराव अभिकर्मक / किट (चित्रा 6F) के साथ सेल नंबर को मापने के द्वारा। बाद इंजेक्शन क्षेत्र प्रतिधारण विश्लेषण प्रयोग के दौरान शामिल किए जाने / बहिष्कार मापदंड बनाने में मदद करता है। विशेष रूप से, TSG6 और PGE2 के उच्च स्तर को छिपाना सीसीएम और XFM-1 / एचएसए spheroids के लिए क्षमता बूंद संस्कृतियों (चित्रा 6I) फांसी से क्षेत्रों के हस्तांतरण के बाद कम से कम 6 घंटा रखा जाता है। उनकी इन विट्रो एफई के लिए इसी प्रकारfects, XFM-1 / एचएसए क्षेत्रों चूहों के पेरिटोनियल गुहा में इंजेक्शन, तुरंत पेरिटोनियम में एलपीएस के चतुर्थ प्रशासन, बढ़ाया PGE2 और आईएल 10 के स्तर से प्रणालीगत सूजन की प्रेरण निम्नलिखित समर्थक भड़काऊ TNFα (चित्रा 6J) कम हो रही है।

आकृति 1
चित्रा 1: एक्सएफ की शर्तों के तहत गोलाकार सूक्ष्म ऊतकों के रूप में primed MSCS की secretome दोहन के लिए विकसित मंच की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। monolayer संस्कृतियों (1) के रूप में विस्तार के बाद, MSCs उच्च सेल एकाग्रता में एक संस्कृति डिश (2) के ढक्कन से बूँदें फांसी कोशिकाओं को सक्रिय / प्रधानमंत्री के लिए निलंबित कर दिया है। 72 घंटे के बाद, दोनों (3) वातानुकूलित मध्यम (मुख्यमंत्री) और (4) बरकरार spheroids बूंदों से काटा और विभिन्न बहाव के अनुप्रयोगों में उपयोग किया जा सकता है। मुख्यमंत्री प्रतिरक्षा का नियमन करने वाले कारकों, साथ ही अन्य चिकित्सीय compon में समृद्ध हैदस्तावेजों। कॉम्पैक्ट spheroids कि फांसी की बूंदों में फार्म आसानी से एक (6) कैथेटर के माध्यम से एक पिपेट (5) और प्रभावी ढंग से विवो में प्रशासित का उपयोग करते हुए स्थानांतरित किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: monolayer संस्कृतियों में अस्थि मज्जा व्युत्पन्न MSCs के विकास विशेषताओं। पारित होने के 2 में MSCs 15 सेमी व्यंजन (पकवान प्रति 15,000 कोशिकाओं) और सीसीएम में 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत में (2 सेमी प्रति 100 कोशिकाओं) कम घनत्व पर वरीयता प्राप्त थे। मीडियम दिन 5 या 6 (24-48 घंटा फसल से पूर्व) पर 3 दिन में बदल गया था और उसके बाद फिर से। कोशिकाओं चढ़ाना के बाद MSCs 3 दिन (ए) और 7 दिन (बी) के प्रतिनिधि चरण विपरीत micrographs। स्केल बार = 200 माइक्रोन। (सी) MSCs के विकास कैनेटीक्स3 दानदाताओं से प्राप्त व्यवहार्य पक्षपाती कोशिकाओं की संख्या में दैनिक 2 दिन से 7 दिन तक की गणना के द्वारा निर्धारित किया गया है कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: एक्सएफ माध्यम में एमएससी spheroids भड़काना के लिए ड्रॉप संस्कृतियों फांसी की तैयारी। (ए) फोटोग्राफ तकनीक का चित्रण तेजी से एक टिशू कल्चर डिश ढक्कन के नीचे पर बूँदें फांसी परत करने के लिए। (बी) के फोटो फांसी को दर्शाता हुआ उलटा और ढक्कन की स्थिति के आधार पर पकवान के बाद चला जाता है। (सी) एक बूंद के रूप में फांसी चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना में 25,000 MSCs के एकत्रीकरण में समय पर निर्भर परिवर्तन। उद्देश्य बूंद के शीर्ष पर ध्यान केंद्रित किया गया था। स्केल बार = 500 माइक्रोन। (डी) भारतीय सैन्य अकादमीएमएससी क्षेत्रों के GES साथ और FBS (यानी सीसीएम) के बिना αMEM, XFM-1 के साथ और एचएसए के बिना, और XFM-2 के साथ और एचएसए के बिना सहित विभिन्न मीडिया योगों का उपयोग कर ड्रॉप संस्कृतियों फांसी में 3 दिनों के बाद का गठन किया। स्केल बार = 200 माइक्रोन। पैनल डी में डेटा प्रकाशक 14 से अनुमति के साथ मूल लेख से प्राप्त किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: 3-डी एक्सएफ संस्कृतियों में एमएससी सक्रियण का मूल्यांकन। (ए) क्षेत्रों / मुख्यमंत्री inverting / डिश ढक्कन झुकने और एक सेल चोर का उपयोग कर किनारे करने के लिए बूंदों मजबूर द्वारा 72 घंटे के बाद काटा जाता है। 25,000 कोशिकाओं से इकट्ठे क्षेत्रों आसानी से संग्रह के दौरान देखे जा सकते हैं। (बी) के अनुमानित की तस्वीर500 क्षेत्रों कई टिशू कल्चर प्लेटों की पलकों से एकत्र mately। क्षेत्रों में तेजी से centrifugation बिना ट्यूब के नीचे उतर। (सी) PGE2 का स्तर एमएससी क्षेत्रों से स्रावित होने के बाद 72 घंटा एलिसा द्वारा मापा गया था। वास्तविक समय आरटी पीसीआर TSG6 के स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था। दोनों TSG6 और PGE2 spheroids में एमएससी सक्रियण स्क्रीनिंग के लिए बहुमूल्य मार्करों हैं। एक्सएफ मध्यम XFM-1 + एचएसए PGE2 और TSG6 उत्पादन (लाल बक्से) के उच्च स्तर से पता चला है। डेटा के रूप में मतलब ± एसडी दिखाया जाता है और (*** पी <0.001, αMEM नमूना की तुलना में) छात्र की टी परीक्षण द्वारा विश्लेषण किया गया। (डी) सीसीएम और XFM-1 13 मिलीग्राम / एमएल पुनः संयोजक एचएसए (RHSA) के साथ विशेष रूप से पूरक में उत्पादन क्षेत्रों पर PGE2 एलिसा और वास्तविक समय आरटी पीसीआर assays, या नैदानिक ग्रेड एचएसए (cHSA) मानव रक्त शिराओं से तैयार किया। गुना परिवर्तन पक्षपाती monolayer MSCs (RQ = 1) से निर्धारित किया गया है। डेटा ± एसडी मतलब के रूप में दिखाया जाता है और (** पी <0.01, *** पी <0.001, की तुलना में छात्र की टी परीक्षण द्वारा विश्लेषण किया गयाmonolayer MSCs)। पैनलों सी और डी में कुछ डेटा प्रकाशक 14 से अनुमति के साथ मूल लेख से प्राप्त किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: इन विट्रो कार्यात्मक assays में एमएससी-मुख्यमंत्री के विरोधी भड़काऊ और विरोधी कैंसर गुण बूंद संस्कृतियों फांसी से एकत्र के मूल्यांकन के लिए। (ए) एलपीएस उत्तेजित माउस मैक्रोफेज (MQ) द्वारा क्षेत्र सीएम TNFα और आईएल -10 के उत्पादन पर (सीसीएम और XFM-1 / एचएसए) के प्रभाव दिखा ELISAs से प्रतिनिधि परिणाम है। (बी) एलिसा से प्रतिनिधि परिणाम गोले मुख्यमंत्री माउस splenocytes (एसपीएल) एक विरोधी CD3 एंटीबॉडी के साथ प्रेरित द्वारा IFNγ के उत्पादन पर (सीसीएम और XFM-1 / एचएसए) के प्रभाव को दर्शाता है। सीसीएम और XFM-1 / एचएसए में तैयार एमएससी क्षेत्रों से बुनियादी सीसीएम और XFM-1 / एचएसए या वातानुकूलित मध्यम (मुख्यमंत्री) के साथ इलाज LNCaP प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं की (सी) चरण विपरीत micrographs। LNCaP कोशिकाओं RPMI मध्यम (नियंत्रण) में सुसंस्कृत थे। स्केल बार 200 माइक्रोन है। (डी) LNCaP प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं के विकास में मात्रात्मक परिवर्तन एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए आधारित सेल मात्रा का ठहराव अभिकर्मक / किट के साथ निर्धारित किया गया था। बिंदीदार रेखा अच्छी तरह से प्रति 5,000 कोशिकाओं के बोने घनत्व इंगित करता है। सभी पैनलों में डेटा के रूप में मतलब ± एसडी दिखाए जाते हैं, और छात्र के टी परीक्षण (*** पी <0.001) द्वारा विश्लेषण किया गया। सभी पैनलों में कुछ डेटा प्रकाशक 14 से अनुमति के साथ मूल लेख से प्राप्त किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 6: बरकरार MSCs spheroids, एक्सएफ शर्तों के तहत तैयार, एक 20G चतुर्थ सुई / कैथेटर प्रणाली का उपयोग करने के कुशल स्थानांतरण। (ए) XFM-1 / एचएसए एमएससी HBSS में इंजेक्शन के लिए तैयार क्षेत्रों 0.2% एचएसए युक्त के साथ एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के प्रतिनिधि तस्वीर। (बी) के एक 200 μl विंदुक टिप में आकांक्षा के बाद एमएससी क्षेत्रों के प्रतिनिधि तस्वीर। (सी) 20 जी सुई / कैथेटर चूहों में बरकरार एमएससी spheroids प्रशासन के लिए इस्तेमाल किया विधानसभा की छवि। (डी) छवि polyurethane कैथेटर की एडाप्टर में पिपेट टिप के उचित स्थिति का प्रदर्शन है। (ई) तुरंत एक संस्कृति डिश में कैथेटर के माध्यम से उन्हें गुजर जाने के बाद एमएससी क्षेत्रों की छवि। लगभग 100 में से 95 क्षेत्रों स्थानांतरित कर दिया गया। (एफ) चूहों के पेरिटोनियल गुहा में क्षेत्र के वितरण की दक्षता संग्रह / lysing में बनाए रखा क्षेत्रों द्वारा निर्धारित किया गया थापिपेट / कैथेटर और मापने सेल नंबर, एक वाणिज्यिक डीएनए आधारित सेल मात्रा का ठहराव परख के माध्यम से, lysed क्षेत्रों की एक पूरी पूरक से प्राप्त कोशिकाओं की संख्या के सापेक्ष। बिंदीदार लाल रेखा 90% की स्थानांतरण क्षमता को दर्शाता है। गरीब क्षेत्र वितरण (71%) एक इंजेक्शन (तीर) के साथ मनाया गया। (G) पैनल ई में क्षेत्रों के चरण विपरीत micrographs (आवर्धित दृश्य)। स्केल बार = 200 माइक्रोन। (एच) एक टिशू कल्चर पकवान पर हस्तांतरण के बाद एक XFM-1 / एचएसए क्षेत्र 16 घंटा के चरण विपरीत माइक्रोग्राफ। MSCS की fibroblastic, धुरी के आकार आकृति विज्ञान कोशिकाओं है कि क्षेत्र से बाहर चले गए में बनाए रखा है। स्केल बार = 200 माइक्रोन। विरोधी भड़काऊ कारकों TSG6 और PGE2 मुख्यमंत्री पर प्रदर्शन किया गया (i) एलिसा assays 2 मिलीलीटर αMEM / 2% FBS युक्त 6 अच्छी तरह प्लेटों में क्षेत्रों के हस्तांतरण के बाद 6 घंटा एकत्र। एक्सएफ मध्यम XFM-1 में तैयार क्षेत्रों / एचएसए TSG6 और PGE2 स्राव (लाल बक्से) के उच्चतम स्तर से पता चला है। डाटा, मतलब के रूप में व्यक्त किया± एसडी, छात्र की टी परीक्षण द्वारा विश्लेषण किया गया (*** पी <0.001, αMEM नमूना की तुलना में)। कुछ डेटा प्रकाशक 14 से अनुमति के साथ मूल लेख से प्राप्त किया गया। (जे) spheroids के लिए क्षमता, पेरिटोनियल गुहा में इंजेक्शन, जबकि (एलपीएस) endotoxin की नसों में इंजेक्शन द्वारा चुनौती दी चूहों में TNFα का स्तर कम पेरिटोनियल PGE2 और आईएल -10 बढ़ाने के लिए illustrating प्रतिनिधि रेखांकन। नमूने सूजन और 80 spheroids के वितरण के शामिल होने के बाद पानी से धोना पेरिटोनियल 6 घंटा द्वारा प्राप्त किया गया। डाटा, के रूप में व्यक्त मतलब ± एसडी, छात्र की टी परीक्षण द्वारा विश्लेषण किया गया (* पी <0.05, ** पी <0.01, नियंत्रण की तुलना में)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

कुछ अनुसंधान और नैदानिक ​​अनुप्रयोगों में प्रयोग के लिए इष्टतम एमएससी अत्यधिक उनके लाभ को अधिकतम करने के लिए सक्रिय हो जाना चाहिए, और रियायत के तौर पर रासायनिक परिभाषित एक्सएफ शर्तों के तहत तैयार ऐसे FBS के रूप में xenogeneic मध्यम घटकों से संभावित एंटीजन की डिलीवरी कम से कम। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल में, हम करने के लिए 1 तरीकों से पता चला है) spheroids के गठन के द्वारा 3 डी संस्कृति में MSCs सक्रिय, 2) एक्सएफ की शर्तों के तहत MSCs के 3 डी सक्रियण प्राप्त करने, 3) अपने विरोधी के संबंध में अंडाकार आकृति MSCs की सक्रियता के स्तर का मूल्यांकन भड़काऊ, प्रतिरक्षा modulatory, और कैंसर रोधी क्षमता है, और 4) चूहों में बरकरार spheroids के रूप में सक्रिय MSCs देने के लिए।

MSCs multipotent स्टेम कोशिकाओं अस्थि मज्जा और वसा ऊतकों सहित कई वयस्क ऊतकों से प्लास्टिक पालन के माध्यम से अलग किया जा सकता है कि कर रहे हैं। MSCs आसानी से अपेक्षाकृत अधिक (10-20%) FBS सांद्रता के तहत टिशू कल्चर प्लास्टिक पर प्रचारित कर रहे हैं, सतह मार्कर का एक अलग सेट एक्सप्रेस, औरadipogenic, osteogenic, और chondrogenic प्रजातियों 1, 16, 17, 18 में कम से कम भेदभाव किया जा सकता है। MSCs मानव रोगों के विभिन्न पशु मॉडल में लाभकारी प्रभाव डालती प्रदर्शन किया गया है, भले ही वे विवो में उनके प्रशासन के बाद ही क्षणिक जारी रहती है दिखाई देते हैं। MSCs का असर इसलिए "हिट और रन" नाम दिया गया है और अक्सर इस तरह के PGE2, टीएसजी-6, और indoleamine 2,3-dioxygenase (भाषायें), के रूप में विरोधी भड़काऊ और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी पैराक्राइन कारकों, MSCs 2 से स्रावित द्वारा मध्यस्थता है , 3, 11, 19, 20, 21। हालांकि, के लिए इन कारकों का उत्पादन करने के लिए, MSCs सक्रियण की आवश्यकता होती है या तो एक क्षतिग्रस्त ऊतकों से संकेतों के माध्यम से या प्रतिरक्षा सी सेप्राप्तकर्ता के एल। इसके बाद, वहाँ जानवरों या रोगियों 22 में कोशिकाओं के प्रसव से पहले एमएससी पूर्व सक्रियण या भड़काना प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए एक उभरती हुई रुचि रही है। इसके अलावा, मानक एमएससी तैयारी में प्रतिजनी FBS घटकों की उपस्थिति में चिंताओं को उठाया गया है। इसलिए, अध्ययन एमएससी संस्कृतियों के लिए इष्टतम रासायनिक परिभाषित एक्सएफ की स्थिति निर्धारित करने के लिए आयोजित किया गया है। हाल ही में हमारे काम में, हम पहली बार पता चला कि MSCs spheroids के गठन से 3 डी में सक्रिय किया जा सकता है, और फिर पता चला कि सेल सक्रियण भी विशिष्ट एक्सएफ शर्तों 8, 12, 13, 14 के तहत प्राप्त किया जा सकता है।

3 डी सेल संस्कृति तकनीक सेल आधारित अनुसंधान के क्षेत्र में वास्तविक शारीरिक स्थिति प्रदान करने के लक्ष्य के साथ दशकों के लिए नियोजित किया गया है। 2 डी में संस्कृतियों के ऊतकों के 3 डी प्रकृति की उपेक्षा और इसलिए हमेशा पुनरावृत्ति नहीं हैसेल करने वाली सेल और सेल के लिए मैट्रिक्स बातचीत सेल संकेतन में महत्वपूर्ण है। कई 3 डी तकनीक संस्कृति घूर्णन वाहिकाओं, स्पिनर बोतल, या विभिन्न गैर पक्षपाती सतहों का उपयोग करें, हालांकि, इन तरीकों में से कई में सबसे बड़ी कमी उत्पन्न अंडाकार आकृति आकार और / या विशिष्ट महंगे उपकरण की आवश्यकता की विविधता है। शोध यह भी फांसी ड्रॉप संस्कृतियों है कि अनिवार्य रूप से MSCs प्रोत्साहित का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है अनायास कुल एक भी अंडाकार आकृति 4, 5, 6, 7, 8, 9, 23 में। विशेष रूप से, फांसी ड्रॉप संस्कृतियों अपेक्षाकृत वर्दी सूक्ष्म ऊतकों / समुच्चय की विधानसभा का समर्थन है, आसानी से सेल एकाग्रता और / या ड्रॉप मात्रा का समायोजन करके सेल कुल के आकार में हेरफेर करने में सक्षम होने का जोड़ा लाभ के साथ। इसके अलावा, फांसी डी की महारतROP संस्कृति तकनीक व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है। 25-40 μl की बूंदों आसानी से उच्च सांद्रता सेल, आम तौर पर μl प्रति 500-1,000 कोशिकाओं पर MSCs के साथ तैयार किया जा सकता है। गिरता छोटे से अधिक 20 μl तेजी से लुप्त हो जाते हैं, और उन से बड़ा 45 μl अक्सर उलटा दौरान ढक्कन भर धब्बा। हालांकि, जब एक ढक्कन के किसी भी आकार, गति और दिशात्मकता की बूंदों से युक्त flipping महत्वपूर्ण पैरामीटर सतह तनाव और ड्रॉप / अंडाकार आकृति की उचित आकार को बनाए रखने के लिए विचार कर रहे हैं। निर्बाध संस्कृति और इनक्यूबेटर में उचित airflow भी एक बूंद के भीतर एक ही क्षेत्र में MSCs कुल सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

इस तकनीक का एक नुकसान यह है कि फांसी की बूंदों से युक्त प्लेटों रोगी उपचारों मुश्किल के लिए बड़े पैमाने अप बनाने इनक्यूबेटर में खड़ी नहीं की जानी चाहिए या क्षेत्र विधानसभा के दौरान ले जाया गया है। इसके अलावा, ड्रॉप संस्कृतियों फांसी में मध्यम बदलने बेहद चुनौतीपूर्ण है, इस प्रकार लंबी अवधि संस्कृतियों ए वी होना चाहिएoided। इसके अलावा, फांसी बूंदों में कम मीडिया के लिए सेल अनुपात पोषक तत्व की कमी और अपशिष्ट संचय अंततः महत्वपूर्ण सेलुलर कार्यों और / या कोशिका मृत्यु के नुकसान के लिए अग्रणी हो सकता है।

हालांकि, उचित फांसी ड्रॉप तकनीक के साथ, हम दिखा दिया है कि spheroids में MSCs, अत्यधिक सक्रिय या primed हो जाते हैं कि कोशिकाओं को शक्तिशाली विरोधी भड़काऊ अणुओं PGE2 और TSG6, साथ ही कैंसर रोधी अणुओं आईएल 24 और कारखानों के बनने में निशान। हमें पता चला है कि एमएससी spheroids वास्तव में विरोधी भड़काऊ और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी हैं, और सुसंस्कृत मैक्रोफेज, splenocytes, और प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं को 8, 12, 13, 14 का उपयोग कर कई कार्यात्मक assays में अपने 2 डी monolayer समकक्षों से बेहतर विरोधी कैंसर गुण होते हैं। इसके अलावा, हम पता चला है कि एमएससी spheroids प्रबल विरोधी भड़काऊ प्रभाव जब प्रशासित लागू कर सकते हैंपेरिटोनिटिस 8 के साथ चूहों के पेरिटोनियल गुहा में। विशेष रूप से, हम पता चला है कि लगभग 400-500 मीटर व्यास में की बड़ी spheroids (25,000-30,000 MSCs प्रत्येक) कुशलता से एक 20G सुई / कैथेटर विधानसभा और एक मानक पिपेट का उपयोग HBSS की एक छोटी मात्रा में दिया जा सकता है। इस तकनीक, अनुचित कैथेटर नियुक्ति, जो द्रव का प्रवाह करने के लिए उच्च प्रतिरोध में परिणाम के साथ, आसानी से पहली प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में HBSS / एचएसए की एक छोटी मात्रा इंजेक्शन द्वारा हस्तांतरण अंडाकार आकृति के लिए पहले से निर्धारित किया जा सकता है। एक ठीक से तैनात कैथेटर में spheroids बशर्ते कि HBSS प्लास्टिक टयूबिंग के लिए क्षेत्र के आसंजन को कम करने के एचएसए के साथ पूरक है, स्वतंत्र रूप से प्रवाह होगा, और आसानी से देखे जा सकते हैं। इसके अलावा, इस तकनीक कोशिकाओं जो इंजेक्शन के लिए एक मानक सुई / सिरिंज का उपयोग हो सकता है पर कतरनी तनाव को रोकता है, और एक शल्य चीरा संक्रमण का खतरा अधिक किया जाता है और अधिक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है जिसके लिए जरूरत से बचा जाता। एक बड़ा नुकसान टी हैspheroids की टोपी बड़ी संख्या केवल इस तरह के पेरिटोनियल गुहा के रूप में विशाल शरीर cavities में इंजेक्ट किया जा सकता के रूप में कैथेटर के माध्यम से क्षेत्र के हस्तांतरण के खिलाफ प्रतिरोध constricted क्षेत्रों में अधिक है।

हम यह भी हाल ही में प्रदर्शन किया है कि spheroids में एमएससी सक्रियण का एक ही स्तर पर एक विशिष्ट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एक्सएफ माध्यम का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है, XFM-1 के रूप में यहाँ करने के लिए भेजा है, जब तक यह एचएसए के साथ पूरक था मानव रक्त से प्राप्त या पुनः संयोजक तकनीकों के माध्यम से तैयार 14। यहां यह ध्यान दें कि एमएससी spheroids एक्सएफ मीडिया 14 के सभी प्रकार में PGE2 और TSG6 के उच्च स्तर का उत्पादन नहीं करते महत्वपूर्ण है, शायद इसलिए क्योंकि MSCs के लिए सबसे एक्सएफ मीडिया के शुरू में 2 डी में कोशिकाओं का इष्टतम विस्तार के लिए तैयार किए गए थे। यह भी ध्यान दें कि एचएसए के विभिन्न प्रकार अपनी शक्ति 14 में भिन्नता महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, PGE2 के पूर्ण स्तर सक्रिय spheroids के मुख्यमंत्री में पता चला मामूली भिन्न हो सकते हैंएलिसा PGE2 के लिए नियोजित रूप Ly वास्तव में एक प्रतियोगिता परख है। इस प्रकार, यह हर PGE2 एलिसा में उचित नियंत्रण शामिल करने के लिए और सीधे अलग अलग समय पर यत्न नमूनों के बीच या अलग प्लेट में आंकड़ों की तुलना से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, MSCs अच्छी तरह से पहले फांसी की तैयारी के लिए एक्सएफ माध्यम में धोया जाना चाहिए अवशिष्ट सीसीएम और इसलिए, FBS घटकों की सीमा भार को दूर करने के क्रम में चला जाता है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल आसानी से क्षेत्र के गठन और चिकित्सीय जीन अभिव्यक्ति पर अन्य मीडिया योगों का मूल्यांकन करने के लिए अपनाया जा सकता है।

जाहिर है, कई सेल संकेत घटनाओं है कि सामान्य रूप से 2 डी MSCs में नहीं होती है प्रस्ताव में निर्धारित जब MSCs 3 डी में संवर्धित कर रहे हैं। सेल के लिए सेल और सेल के लिए मैट्रिक्स बातचीत, cadherins और इंटेग्रिन गाइड अंडाकार आकृति के गठन और संघनन 24, 25, 26 के द्वारा मध्यस्थता की संभावना है और अंडाकार आकृति उपचार के लिए महत्वपूर्ण हैं। के रूप में कोशिकाओं समग्र और सहspheroids, विभिन्न तनाव का संकेत है, नाबालिग apoptosis, कि कई संभावित चिकित्सीय कारकों 4, 5 के उत्पादन में परिणाम एमएससी सक्रियण की प्रक्रिया में सहायता सहित में mpact। हम पहले से एमएससी सक्रियण और PGE2 और TSG6 12 के उत्पादन में ऑटोक्राइन आईएल -1 सिगनल की महत्वपूर्ण भूमिका दिखाया। ज्यादा विभिन्न संकेत दे रास्ते के बारे में अनजान बनी हुई है जबकि एमएससी सक्रियण में सहायता, फांसी ड्रॉप संस्कृति मंच इस घटना का अध्ययन करने और एमएससी आधारित चिकित्सा में सुधार करने के लिए एक व्यावहारिक तरीका देता है। कुल मिलाकर, हम प्रोटोकॉल इधर, सक्रिय या 3 डी संस्कृतियों में MSCs भड़काना, रासायनिक परिभाषित एक्सएफ की शर्तों के तहत करने के साधन के रूप में वर्णित किया है, विरोधी भड़काऊ, इम्यूनोमॉड्यूलेटरी, और विरोधी कैंसर के कारकों का उत्पादन। हम यह भी बताया कि कैसे इन बरकरार एमएससी spheroids विवो में दिया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
MEM-α (minimal essential medium alpha) ThermoFisher/Gibco 12561049; 12561056; 12561072 minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium select Atlanta Biologicals S11595; S11510; S11550; S11595-24 component of complete culture media for all types of cells
L-glutamine ThermoFisher/Gibco 25030081; 25030149; 25030164 component of complete culture media for all types of cells
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher/Gibco 15070063 component of complete culture media for all types of cells
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane MilliporeSigma SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE media sterilization
150 mm cell culture dish Nunc D8554 SIGMA cell culture
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator Thermo Fisher Model 3110 incubation of cultured cells
Early passage MCSs Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White NA preparation of 2D and 3D cultures of MSCs
water bath VWR 89501-468 warming media to 37 °C
Pipettes Eppendorf 492000904 manual liquid handling
Pipete-Aid Drummond Scientific Company 4-000-300 handling sereological pipetes
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml) Corning 4487; 4101; 4251; 4490 liquid handling
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4 ThermoFisher/Gibco 10010023; 10010072; 10010031; 10010049 cell culture processing
0.25% trypsin/EDTA solution ThermoFisher/Gibco 25200056; 25200072; 25200114 lifting adherent cells and dispersing cell aggregates
15 ml conical tube Corning/BD Falcon 352097 cell centrifugation
50 ml conical tube Corning/BD Falcon 352098 cell centrifugation
Eppendor refrigerated centrifuge Eppendorf/Fisher Scientific Model 5810R cell centrifugation
hemocytometer Fisher Scientific 26716 cell counting
trypan blue Sigma-Aldrich T8154 SIGMA dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1) ThermoFisher/Gibco A1067501 Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2) Stem Cell Technologies 5420 Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells
HSA (Human serum albumin) Gemini 800-120 Component of xeno-free MSC media
rHSA (recombinant Human serum albumin) Sigma-Aldrich A9731 SIGMA Component of xeno-free MSC media
Total RNA isolation Mini Kit Qiagen 74104 Total RNA extraction
Qiashredder Qiagen 79654 Sample homogenization prior to total RNA extraction
RNAse-free DNase Set  Qiagen 79254 On-column DNA elimination during total RNA extraction
β-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250 ALDRICH inhibition of RNAses in RLT buffer
Vortex VWR 97043-562 mixing sample
Spectrophotometer Biorad NA RNA concentration and quality
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit ThermoFisher/Applied Biosystems 4368814 transcription of total RNA into cDNA
Gene Expression Assays ThermoFisher/Applied Biosystems varies primer/probe combination for real-time PCR
Fast Universal PCR Master Mix ThermoFisher/Applied Biosystems 4352042; 4364103; 4366073; 4367846 master mix for real-time PCR reaction
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System) ABI Prizm NA real-time PCR
1.5 ml centrifuge tube Eppendorf 22364111 cell centrifugation, sample collection and storage
(-80 °C) freezer Thermo Fisher Model Thermo Forma 8695 sample storage
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit R&D Systems KGE004B estimation of cytokine concentration in the sample
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) ThermoFisher/Gibco 10566-016; 10566-024;10566-032 macrophage culture media
J774 mouse macrophages ATCC TIB-67 mouse macrophage cell line
12-well plate Corning 3513 in vitro macrophage stimulation
LPS (lipopolysaccharide) Sigma-aldrich L4130 in vitro macrophage stimulation
Mouse TNF-a ELISA kit R&D Systems MTA00B estimation of cytokine concentration in the sample
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit R&D Systems M1000B estimation of cytokine concentration in the sample
RPMI-1640 medium ThermoFisher/Gibco 11875-085 splenocyte culture media
BALB/c mice The Jackson Laboratory 651 in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified eBioscience 145-2C11 in vitro splenocyte stimulation
70 μm strainer  Corning 352350 Splenocyte preparation
Red blood cell lysis solution (1x) Affymetrix eBioscience 00-4333 removal of red blood cells during splenocyte isolation
Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kit R&D Systems MIF 00 estimation of cytokine concentration in the sample
LNCaP prostate cancer cells  ATCC CRL-1740 study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro
DNA-based cell proliferation assay kit ThermoFisher C7026 cell number measurement based on DNA content
NaCl Sigma-Aldrich S5150 component of lysis reagent
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) ThermoFisher FERR1021 calcium chelator, component of lysis reagent
Rnase A Qiagen 19101 RNA degradation for measurement of DNA
Filter-based multi-mode microplate reader BMG Technology NA Microplate assays (ELISA, cell quantification, etc.)
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red ThermoFisher/Gibco 14175079 resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections
Isoflurane MWI Vet Supply 502017 Anesthesia for in vivo injections
Oxygen, compressed gas Praxair NA For use with isoflurane
Thermo Forma BSL-2 cabinet Thermo Fisher Model 1385 Sterile cell culture
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch Terumo SR*FNP2025 Delivery of shperoids into peritoneal cavity
Sterile micropipette tips Eppendorf varies liquid/cells handling

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References

  1. Keating, A. Mesenchymal stromal cells: New directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
  2. English, K., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells in transplantation rejection and tolerance. Cold Spring Harb Perspect.Med. 3 (5), a015560 (2013).
  3. Le Blanc, K., Mougiakakos, D. Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system. Nat.Rev.Immunol. 12 (5), 383-396 (2012).
  4. Follin, B., Juhl, M., Cohen, S., Perdersen, A. E., Kastrup, J., Ekblond, A. Increased Paracrine Immunomodulatory Potential of Mesenchymal Stromal Cells in Three-Dimensional Culture. Tissue Eng.Part B.Rev. , (2016).
  5. Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 9176357 (2016).
  6. Achilli, T. M., Meyer, J., Morgan, J. R. Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids. Expert Opin.Biol. Ther. 12 (10), 1347-1360 (2012).
  7. Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng.Part B.Rev. 20 (5), 365-380 (2014).
  8. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  9. Potapova, I. A., et al. Mesenchymal stem cells support migration, extracellular matrix invasion, proliferation, and survival of endothelial cells in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
  10. Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng.Part C.Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
  11. Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs Improve Myocardial Infarction in Mice because Cells Embolized in Lung Are Activated to Secrete the Anti-inflammatory Protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
  12. Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Kuhlman, J., Prockop, D. J. Dynamic compaction of human mesenchymal stem/precursor cells into spheres self-activates caspase-dependent il1 signaling to enhance secretion of modulators of inflammation and immunity (PGE2, TSG6, and STC1). Stem Cells. 31 (11), 2443-2456 (2013).
  13. Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Coble, K., Prockop, D. J. Human mesenchymal stem/stromal cells cultured as spheroids are self-activated to produce prostaglandin E2 that directs stimulated macrophages into an anti-inflammatory phenotype. Stem Cells. 30 (10), 2283-2296 (2012).
  14. Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Tiblow, A., Prockop, D. J. Unique characteristics of human mesenchymal stromal/progenitor cells pre-activated in 3-dimensional cultures under different conditions. Cytotherapy. 16 (11), 1486-1500 (2014).
  15. Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White. , http://www.medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html (2016).
  16. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  17. Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat.Rev.Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  18. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  19. Fontaine, M. J., Shih, H., Schafer, R., Pittenger, M. F. Unraveling the Mesenchymal Stromal Cells' Paracrine Immunomodulatory Effects. Transfus.Med.Rev. 30 (1), 37-43 (2016).
  20. Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nat.Med. 15 (1), 42-49 (2009).
  21. Prockop, D. J. Concise review: two negative feedback loops place mesenchymal stem/stromal cells at the center of early regulators of inflammation. Stem Cells. 31 (10), 2042-2046 (2013).
  22. Krampera, M. Mesenchymal stromal cell 'licensing': a multistep process. Leukemia. 25 (9), 1408-1414 (2011).
  23. Saleh, F. A., Genever, P. G. Turning round: multipotent stromal cells, a three-dimensional revolution? Cytotherapy. 13 (8), 903-912 (2011).
  24. Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Eng.Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
  25. Yeh, H. Y., Liu, B. H., Hsu, S. H. The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes. Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).
  26. Lee, E. J., et al. Spherical bullet formation via E-cadherin promotes therapeutic potency of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood for myocardial infarction. Mol.Ther. 20 (7), 1424-1433 (2012).

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विकास जीवविज्ञान अंक 121 स्टेम सेल थेरेपी mesenchymal स्टेम सेल 3 डी संस्कृति Xeno मुक्त spheroids कोशिका प्रत्यारोपण विरोधी भड़काऊ Immunomodulation विरोधी कैंसर पेरिटोनियम
उत्पादन और चिकित्सीय mesenchymal स्टेम के प्रशासन / stromal सेल (एमएससी) Spheroids Primed 3-डी संस्कृतियों में अंडर Xeno मुक्त परिस्थितियों
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Ylostalo, J. H., Bazhanov, N.,… More

Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Mohammadipoor, A., Bartosh, T. J. Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions. J. Vis. Exp. (121), e55126, doi:10.3791/55126 (2017).

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