L'adulto Drosophila cervello è un sistema utile per studiare circuiti neuronali, le funzioni cerebrali superiori, e malattie complesse. Un metodo efficace per sezionare intero tessuto cerebrale dalla testa piccola mosca faciliterà gli studi del cervello-based. Qui si descrive un semplice, one-step protocollo dissezione del cervello adulto con ben conservato morfologia.
Vi è un crescente interesse nell'uso di Drosophila per modellare cervello malattie degenerative umane, la mappa circuiterie neuronali nel cervello adulto, e studiare le basi molecolari e cellulari delle funzioni cerebrali superiori. Una preparazione tutto il montaggio del cervello adulto con ben conservato la morfologia è fondamentale per tali studi intero cervello-based, ma può essere tecnicamente impegnativo e richiede molto tempo. Questo protocollo descrive un approccio dissezione one-step facile da imparare, di una testa adulta mosca in meno di 10 s, mantenendo il cervello intatto attaccato al resto del corpo per facilitare le successive fasi di lavorazione. La procedura aiuta a rimuovere la maggior parte dei tessuti oculari e tracheali normalmente associati con il cervello che può interferire con la fase di imaging più tardi, e pone anche meno domanda sulla qualità delle dissettore. Inoltre, si descrive un metodo semplice che consente comoda capovolgimento dei campioni cerebrali montati su un vetrino, che è importante per l'imaging entrambi i lati della bpiogge con intensità di segnale simile e qualità. Come esempio di protocollo, presentiamo un'analisi dopaminergici (DA) neuroni nel cervello adulto di WT (w 1118) mosche. L'elevata efficacia del metodo di dissezione lo rende particolarmente utile per gli studi basati su cervello adulto su larga scala in Drosophila.
L'organismo modello Drosophila, comunemente nota come la mosca della frutta, è stato a lungo apprezzato per i suoi eleganti strumenti genetici, tempi brevi riproduttivi, e altamente conservata percorsi molecolari e cellulari. Il moscerino della frutta è stato impiegato con successo per analizzare i percorsi di base di segnalazione, i meccanismi patterning di organismi multicellulari, nonché i meccanismi alla base dello sviluppo neuronale, le funzioni e le malattie 1,2. Con i recenti progressi nelle tecnologie di etichettatura delle cellule e di imaging, il cervello mosca della frutta è diventato particolarmente potente nella mappatura fine di circuiti neuronali e nella dissezione delle basi molecolari e cellulari delle funzioni cerebrali superiori, come l'apprendimento e la memoria, e il ritmo circadiano 1,3, 4,5,6,7,8.
Un particolare vantaggio del sistema Drosophila è la sua dimensione relativamente piccola, permettendo tutto il montaggio la preparazione e l'esame del cervello utilizzando un composto regolare o microscopio confocale. ThiFunzione s consente analisi dettagliate anatomiche e funzionali di circuiti neuronali, o anche un singolo neurone, a livello cellulare e subcellulare, nel contesto di un tessuto cerebrale intera, fornendo quindi sia una visione olistica del soggetto studiato e la sua geometria precisa all'interno dell'intero cervello. Tuttavia, date le dimensioni piuttosto miniatura del cervello, presenta anche una sfida tecnica in sezionare in modo efficiente un tessuto cerebrale intatto fuori dalla custodia protettiva testa esoscheletro in una mosca adulta. Vari metodi dissezione efficaci e relativamente semplici sono state descritte in dettaglio, che di solito comporta un'attenta e graduale rimozione del caso testa ei relativi tessuti compresi gli occhi, trachea, e grasso dal cervello corretta 9, 10. Questi metodi di dissezione microchirurgia pone spesso domande piuttosto stringenti sulla qualità delle pinze dissezione, basandosi su una pinza con punte sottili ben allineati che possono essere facilmente danneggiati. Inoltre, come i cervelli sezionati sono spesso separatcato dal resto del corpo, i cervelli possono essere facilmente perse durante i successivi processi di colorazione e lavaggio a causa delle loro piccole dimensioni e la loro trasparenza nel buffer di elaborazione. Qui, descriviamo un relativamente semplice e facile da imparare, protocollo di dissezione one-step per cervello adulto che mantiene il cervello sezionati attaccati al torso. Il processo di dissezione spesso cancella facilmente via la maggior parte dei tessuti cerebrali associate come l'occhio e la trachea e riduce la domanda di pinze dissezione di buona qualità.
Inoltre, quando l'imaging del cervello al microscopio composto fluorescente o microscopio confocale, la parte del cervello che è lontano dalla sorgente di luce fluorescente spesso produce un segnale più debole e immagini meno chiare a causa dello spessore del cervello intero montaggio. Qui, descriviamo anche un semplice metodo di montaggio che consente una facile capovolgimento dei campioni cerebrali, consentendo comoda immagini di entrambi i lati del cervello con simili intensi segnalety e qualità.
Come un proof-of-concept per l'applicazione di questo metodo per studiare il cervello adulto, abbiamo esaminato ulteriormente la presenza di neuroni DA nel cervello di w 1118 mosche; un genotipo che viene spesso utilizzato come la linea dei genitori per la generazione di mosche transgeniche e il controllo di tipo selvatico in molti studi di Drosophila.
Con un crescente interesse ad utilizzare per adulti Drosophila cervello per studiare malattie umane del cervello, circuiti neuronali, e le funzioni cerebrali superiori, è necessario sviluppare metodi semplici e veloci per ottenere il cervello della mosca intatto per tutto il montaggio analisi, che è particolarmente importante per larga scalare schermi cervello-based. Il nostro metodo fornisce una semplice e facile da imparare approccio per sezionare una testa di mosca (spesso in meno di 10 s con esperienza) c…
The authors have nothing to disclose.
Riconosciamo Mr. Enes Mehmet, la signora Kiara Andrade, la signora Pilar Rodriguez, Chris Kwok, e la signora Danna Ghafir per il loro immenso sostegno al progetto.
w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22µ Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
Zen lite software | Quote |