Den voksne Drosophila hjernen er et verdifullt system for å studere nevrale kretser, høyere hjernefunksjoner, og sammensatte lidelser. En effektiv metode for å dissekere hele hjernevev fra den lille flua hodet vil lette hjernebaserte studier. Her beskriver vi en enkel, ett-trinns disseksjon protokoll av voksne hjerner med godt bevarte morfologi.
Det er en økende interesse for å bruke Drosophila å modellere menneskelige hjerne degenerative sykdommer, kart nevrale kretser i voksne hjerner, og studere molekylære og cellulære grunnlag av høyere hjernefunksjoner. En hel-mount forberedelse av voksne hjerner med godt bevarte morfologi er kritisk for slike hele hjernebaserte studier, men kan være teknisk utfordrende og tidkrevende. Denne protokollen beskriver en lett-å-lære, ett-trinns metode disseksjon av en voksen flue hode på mindre enn 10 s, samtidig som den intakte hjerne festet til resten av legemet for å lette etterfølgende behandlingstrinn. Fremgangsmåten bidrar til å fjerne mesteparten av øyet og tracheal vev som normalt er forbundet med hjernen som kan forstyrre den senere billeddannelsestrinn, og også setter mindre krav til kvaliteten på dissekere tang. I tillegg, beskriver vi en enkel fremgangsmåte som tillater praktisk flipping av de monterte hjerneprøver på et dekkglass, som er viktig for å avbilde begge sider av bregner med samme signalintensitet og kvalitet. Som et eksempel på protokoll presenterer vi en analyse av dopaminergiske (DA) neuroner i voksne hjerner av WT (w 1118) fluer. Den høye effekten av disseksjon metoden gjør det spesielt nyttig for store voksen hjerne-baserte studier i Drosophila.
Modellen organismen Drosophila, vanligvis kjent som bananflue, har lenge vært verdsatt for sine elegante genetiske verktøy, korte reproduktive ganger, og svært konservert molekylære og cellulære veier. Bananflue har blitt ansatt for å dissekere grunnleggende signalveier, Mønstringen mekanismer for flercellede organismer, samt mekanismene bak nevronale utvikling, funksjoner og sykdommer 1,2. Med nylige fremskritt i celle merking og bildeteknologi, har bananflue hjernen bli spesielt kraftig i fin kartlegging av neuronal kretser og i dissekere den molekylære og cellulære grunnlag av høyere hjernefunksjoner, slik som læring og hukommelse, og døgnrytme 1,3, 4,5,6,7,8.
En spesiell fordel med Drosophila-system er for sin relativt liten størrelse, slik at hel-mount fremstilling og undersøkelse av hjernen ved hjelp av en vanlig forbindelse eller et konfokalt mikroskop. This-funksjonen gjør det mulig detaljerte anatomiske og funksjonelle analyser av nervekretser, eller til en enkelt nervecelle, på cellulære og subcellulære nivåer, i sammenheng med en hel hjernevev, og dermed gi både et helhetlig syn på studert faget og dets eksakte geometri i hele hjerne. Imidlertid gitt heller miniatyrstørrelse av hjernen, representerer den også en teknisk utfordring på en effektiv måte å dissekere et intakt hjernevev ut av den beskyttende ytre skjelett hodet tilfelle i en voksen fly. Forskjellige effektive og relativt enkle disseksjon fremgangsmåter er blitt beskrevet i detalj, som vanligvis innebære forsiktig og trinnvis fjerning av hodet saken og tilhørende vev innbefattende øynene, luftrøret, og fett fra hjernen riktig 9, 10. Disse mikro disseksjon metodene ofte plasserer heller strenge krav til kvaliteten på disseksjon tang, avhengig av tang med fin godt justert tips som lett kan skades. Videre, ettersom de dissekerte hjerner er ofte separated fra resten av kroppen, kan hjernen lett gå tapt i løpet av de påfølgende farging og vaskeprosesser på grunn av sine små størrelser og deres transparens i behandlingen buffer. Her beskriver vi en relativt enkel og lett å lære, ett-trinns disseksjon protokoll for voksne hjerner som holder de dissekerte hjerner festet til overkroppen. Disseksjon prosessen ofte lett rydder unna det meste av hjerne-forbundet vev som øyet og luftrøret og reduserer behovet for god kvalitet disseksjon tang.
I tillegg, når avbilding av hjernen under fluorescerende forbindelse mikroskop eller konfokalt mikroskop, den side av hjernen som er borte fra det fluorescerende lyskilde frembringer ofte et svakere signal og mindre klare bilder på grunn av tykkelsen av det hel-mount hjernen. Her beskriver vi også en enkel montering metode som gjør det mulig enkelt å bla i hjerneprøvene, slik at praktisk avbildning av begge sider av hjernen med tilsvarende signal intensiTy og kvalitet.
Som et proof-of-concept for anvendelsen av denne metoden for å studere den voksne hjernen, vi videre undersøkt tilstedeværelsen av DA nevroner i hjernen til w 1118 fluer; en genotype som ofte brukes som foreldrelinjen for å generere transgene fluer og villtype kontroll i mange Drosophila studier.
Med en økende interesse for å bruke voksen Drosophila hjernen for å studere menneskelige hjerne sykdommer, nevronale kretser, og høyere hjernefunksjoner, er det nødvendig å utvikle enkle og raske metoder for å få intakte flue hjerner for hel-mount analyser, noe som er spesielt viktig for stor- skalere hjerne-baserte skjermer. Vår metode gir en enkel og lett-å-lære tilnærming til å dissekere ut en flue hode (ofte i mindre enn 10 sek med erfaring) med godt bevarte morfologi som er i stor grad ryddet …
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner Mr. Enes Mehmet, Ms Kiara Andrade, Ms Pilar Rodriguez, Chris Kwok, og Ms Danna Ghafir for deres enorme støtte til prosjektet.
w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22µ Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
Zen lite software | Quote |