O adulto de Drosophila cérebro é um sistema valioso para estudar circuitos neuronais, funções cerebrais superiores, e doenças complexas. Um método eficiente para dissecar tecido do cérebro inteiro do cabeça pequena mosca facilitará estudos baseados em cerebrais. Aqui nós descrevemos um de uma etapa simples protocolo, dissecação de cérebros adultos com morfologia bem preservada.
Há um interesse crescente na utilização de Drosophila para modelar doenças degenerativas do cérebro humano, mapa circuitos neuronais em cérebros adultos, e estudar a base molecular e celular de funções cerebrais superiores. A preparação de toda a montagem dos cérebros adultos com morfologia bem preservado é fundamental para tais estudos baseadas no cérebro inteiro, mas pode ser tecnicamente desafiadora e demorada. Este protocolo descreve uma abordagem dissecção um passo fácil de aprender, de uma cabeça de mosca adulta em menos de 10 s, ao mesmo tempo manter o cérebro intacto ligado ao resto do corpo para facilitar os passos de processamento subsequentes. O procedimento ajuda a remover a maior parte dos tecidos do olho e da traqueia, normalmente associadas com o cérebro que pode interferir com a imagiologia passo posterior, e também reduz a procura da qualidade do fórceps de dissecação. Além disso, descreve-se um método simples que permite a inversão conveniente das amostras de cérebro montados sobre uma lamela, o que é importante para imagiologia de ambos os lados da bchuvas com intensidade de sinal semelhante e qualidade. Como um exemplo do protocolo, apresentamos uma análise de neurônios dopaminérgicos (DA) em cérebros adultos de WT (w 1118) voa. A elevada eficácia do método de dissecação torna-o particularmente útil para estudos baseados no cérebro adulto em larga escala em Drosophila.
O organismo modelo Drosophila, vulgarmente conhecida como a mosca da fruta, tem sido valorizado por suas ferramentas genéticas elegantes, tempos reprodutivos curtos e altamente conservadas vias moleculares e celulares. A mosca da fruta tem sido empregue com sucesso para dissecar as vias de sinalização de base, os mecanismos de padronização de organismos multicelulares, bem como os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento neuronal, funções e doenças 1,2. Com os recentes avanços em tecnologias de rotulagem de células e de imagem, o cérebro da mosca de fruta tornou-se especialmente poderosa in fine mapeamento dos circuitos neuronais e em dissecar a base molecular e celular das funções superiores do cérebro, tais como a aprendizagem ea memória, e ritmo circadiano 1,3, 4,5,6,7,8.
Uma vantagem particular do sistema de Drosophila é o seu tamanho relativamente pequeno, permitindo que toda a montagem de preparação e análise do cérebro utilizando um composto regular ou microscópio confocal. This recurso permite análises detalhadas anatômicas e funcionais de circuitos neuronais, ou mesmo um único neurônio, em níveis celulares e subcelulares, no contexto de um tecido do cérebro inteiro, proporcionando assim uma visão holística do assunto estudado e sua geometria exata dentro do todo cérebro. No entanto, dado o tamanho diminuto em vez do cérebro, ela também apresenta um desafio técnico em dissecar de forma eficiente um tecido cerebral intacta fora do caso cabeça exoesqueleto de proteção em uma mosca adulta. Vários métodos de dissecação eficaz e relativamente simples têm sido descritos em pormenor, que geralmente envolvem cuidadosa e passo a passo de remoção do processo cabeça e os tecidos associados, incluindo os olhos, a traqueia, e gordura do cérebro correcta 9, 10. Estes métodos de dissecação microcirúrgicos muitas vezes colocam exigências bastante rigorosas sobre a qualidade do fórceps de dissecação, contando com uma pinça com pontas bem alinhadas finos que podem ser facilmente danificados. Além disso, como os cérebros dissecados são muitas vezes separated do resto do corpo, o cérebro pode ser facilmente perdido durante os processos de coloração e lavagem subsequente, devido às suas pequenas dimensões e a sua transparência no tampão de processamento. Aqui, descrevemos um protocolo de dissecção de uma etapa relativamente simples e fácil de aprender, por cérebros adultos que mantém os cérebros dissecados anexados ao tronco. O processo de dissecção muitas vezes facilmente afasta a maioria dos tecidos associada ao cérebro, tais como o olho e traquéia e reduz a demanda por uma pinça de dissecação de boa qualidade.
Além disso, quando imagiologia do cérebro, ao microscópio composto fluorescente ou microscópio confocal, o lado do cérebro que está distante da fonte de luz fluorescente, muitas vezes produz um sinal mais fraco e menos imagens claras devido à espessura do cérebro inteiro de montagem. Aqui, nós também descrevem um método de montagem simples que permite um fácil inversão das amostras de cérebro, permitindo imagiologia conveniente de ambos os lados do cérebro com intensificação de sinal semelhantety e qualidade.
Como uma prova de conceito para a aplicação do presente método para estudar o cérebro adulto, examinámos ainda mais a presença de neurónios DA no cérebro de moscas W 1118; um genótipo que é frequentemente utilizado como a linha parental para a geração de moscas transgénicas e o controlo de tipo selvagem, em muitos estudos de Drosophila.
Com um interesse crescente no uso adulto Drosophila cerebral para estudar doenças humanas cérebro, circuitos neuronais e as funções cerebrais superiores, é necessário o desenvolvimento de métodos simples e rápidos para obter cérebros da mosca intactas para as análises todo-mount, que é especialmente importante para grande- dimensionar telas baseadas no cérebro. Nosso método fornece uma maneira simples e fácil de aprender abordagem para dissecar uma cabeça mosca (muitas vezes em menos de 10 s com …
The authors have nothing to disclose.
Nós reconhecemos o Sr. Enes Mehmet, Ms. Kiara Andrade, Ms. Pilar Rodriguez, Chris Kwok, e Ms. Danna Ghafir por seu imenso apoio ao projeto.
w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22µ Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
Zen lite software | Quote |