Reconstruções em larga escala e, Clustering imparcial independente baseado no morfológicas Métricas para classificar Neurônios no seletivos Populações

Summary

Este protocolo descreve reconstruções em larga escala de populações neuronais selectivos, marcados após a infecção retrógrada com um vírus da raiva modificado expressando marcadores fluorescentes, e análises independentes cluster, imparcial que permitem a caracterização abrangente de métricas morfológicas entre subclasses neuronais distintas.

Abstract

Este protocolo descreve reconstruções em larga escala de neurônios combinados com o uso de agrupamento independente e imparcial análises para criar um completo levantamento das características morfológicas observadas entre uma população neuronal selectiva. Combinação destas técnicas constitui uma nova abordagem para a recolha e análise de dados neuroanatômicos. Em conjunto, estas técnicas permitem em grande escala, e, portanto, mais abrangente, a amostragem de populações neuronais selectivos e estabelecer métodos quantitativos imparciais para descrever as classes neuronais morfologicamente únicos dentro de uma população.

O protocolo descreve o uso de vírus da raiva modificado para etiquetar selectivamente neurónios. G-excluído atos de vírus da raiva como um traçador retrógrado após injecção estereotáxica em uma estrutura do cérebro alvo de interesse e serve como um veículo para a entrega e expressão de EGFP em neurônios. Um grande número de neurônios estão infectados usando estetécnica e expressar GFP ao longo de suas dendrites, produzindo "Golgi-like" preenchimentos completos de neurônios individuais. Por conseguinte, o método de rastreamento retrógrado mediada por vírus melhora nas técnicas tradicionais de rastreamento retrógrado à base de corantes, produzindo preenchimentos intracelulares completos.

Neurónios individuais bem isoladas que abrangem todas as regiões do cérebro a área sob estudo são seleccionados para a reconstrução, a fim de obter uma amostra representativa de neurónios. O protocolo descreve os procedimentos para reconstruir corpos celulares e completar padrões de arborização dendrítica de neurônios marcados abrangendo vários cortes de tecido. Os dados morfológicos, incluindo as posições de cada neurónio dentro da estrutura do cérebro, são extraídas para análise posterior. funções de programação padrão foram utilizados para realizar conjunto independente de análises e avaliações de cluster com base em métricas morfológicas. Para verificar a utilidade destas análises, a avaliação estatística de uma análise de agrupamento performada em 160 neurônios reconstruídos no núcleo reticular talâmico do tálamo (TRN) do macaco macaque foi feita. Tanto a análise de cluster original e as avaliações estatísticas realizadas aqui indicam que os neurônios TRN são separados em três subpopulações, cada um com características morfológicas únicas.

Introduction

Neuroanatomia é um dos fundamentos da neurociência ¹ e interesse recente no "conectonomia" renovou o entusiasmo para a compreensão da diversidade morfológica de populações neuronais e as conexões entre os neurônios específicos ^2. Métodos para a rotulagem e neurônios reconstruindo melhoraram muito com as recentes inovações, incluindo o rastreamento circuito genético e mediada por vírus aproxima ^{3, 4,} permitindo pesquisas morfológicas mais abrangentes de populações neuronais ^5. Além de melhorias na rotulagem neurônios individuais, técnicas de análise de dados quantitativos também surgiram que permitem a classificação independente e imparcial de neurônios em subpopulações distintas com base em dados morfológicos ^{5, 6.} Estas técnicas imparciais são uma melhoria em cima mais traditional métodos de classificação qualitativos que têm sido o padrão no campo por mais de um século. O objetivo deste estudo é delinear, passo-a-passo, a combinação de rotulagem mediada por vírus de neurônios dentro de uma população seletiva, reconstruções em larga escala de uma amostra abrangente desses neurônios, e análise quantitativa dos dados baseados em agrupamento independente com avaliação estatística. Ao combinar esses métodos, destacamos uma nova abordagem para a recolha e análise de dados neuroanatômicos para facilitar a amostragem completa e classificação imparcial de tipos neuronais morfologicamente únicas dentro de uma população neuronal selectiva.

Como um exemplo destes métodos, que descrevem a análise de uma grande população de neurónios dentro de um único sector de o núcleo reticular talâmico (TRN) do macaco macaque. Estes dados são de um estudo prévio ^7. Métodos para marcar seletivamente neurônios TRN salientes ao latera dorsall geniculate núcleo do tálamo (dLGN) usando a injeção cirúrgica do vírus da raiva modificado que codifica EGFP ^{4, 8} (ver Tabela de materiais específicos / Equipamentos, linha 2) são delineadas. Este vírus da raiva modificada não tem o gene que codifica para uma proteína de revestimento essencial, eliminando o movimento trans-sináptica do vírus. Uma vez que o virus entra terminais de axónios no local da injecção, ela age como um traçador retrógrado tradicional com a importante vantagem de dirigir a expressão de EGFP em toda a arborização dendrítica completa de neurónios infectados ^{5, 9, 10.} Por conseguinte, este vírus da raiva suprimida-G pode ser utilizada para infectar selectivamente e rotular qualquer população de neurónios a seguir à injecção e transporte retrógrado.

Para realizar uma análise global de uma população neuronal específica, é importante para provar a partir deuma ampla distribuição dos neurónios dentro da população. Uma vez que a técnica de marcação mediada por vírus produz intracelular completo ", de Golgi-like" enche de muitos neurónios com axónios no local da injecção do vírus, é possível reconstituir uma amostra muito grande dos neurónios dentro de toda a extensão de uma estrutura do cérebro. Além disso, porque o vírus da raiva modificado é tão eficaz em infectar e rotulagem de grandes números de neurónios, é possível reconstruir centenas de neurónios por animal. Os procedimentos de amostragem 160 neurónios em todo o sector visual da TRN ^11, a fim de gerar uma amostra global de dLGN-se projectam neurónios TRN são descritas. O processo de reconstrução neurônios individuais usando um sistema de reconstrução neurônio incluindo um microscópio, câmera e software de reconstrução é descrito. Também são descritos métodos para determinar as posições de neurônios individuais dentro de uma estrutura cerebral (neste caso dentro da TRN) e verificar vírus injecção site volume e localização dentro de uma estrutura (neste caso, dentro do dLGN) usando reconstruções contorno volumétricos. Etapas para exportar dados morfológicos e executar agrupamento independente análises com base em métricas morfológicas medidos para cada neurônio são delineadas. Existem limitações para métodos de agrupamento e também há uma variedade de diferentes algoritmos de agrupamento disponíveis. Assim, estas opções e os benefícios de alguns dos algoritmos mais comumente utilizados são descritos. A análise de cluster não fornece verificação estatística da singularidade de clusters. Por conseguinte, os passos adicionais são descritos para verificar agrupamento óptima, bem como as relações entre os dados morfológicos dentro e entre grupos. métodos estatísticos para avaliar os clusters para o conjunto de dados de TRN para confirmar que os neurônios TRN são agrupados em três grupos exclusivos com base em 10 métricas morfológicas independentes são descritos.

Assim, por delinear passos para a rotulagem selectiva, Reconstruir, e análise de dados morfológicos a partir de uma população neuronal específica, que descrevem métodos para quantificar diferenças morfológicas entre os neurónios dentro de uma população. achados anteriores de tipos neuronais distintas dentro do setor visual da TRN macaco macaque são confirmadas com métodos distintos de avaliação estatística. Juntos, esperamos que estas técnicas serão amplamente aplicável a conjuntos de dados neuroanatômicos e ajudar a estabelecer a classificação quantitativa da diversidade de populações neuronais através do cérebro.

Protocol

Nota: O tecido examinado neste estudo foi preparado como parte de um estudo independente ^5. Por isso, todos os métodos experimentais que envolvem a utilização de animais foram descritas em detalhe na secção de Métodos Experimentais de Briggs et ai. (2016). Todos os procedimentos com animais realizados como parte do estudo anterior foram aprovados pelos Comitês Animal Care e uso institucional. As etapas para a injeção de vírus no dLGN e processamento histológico de tecido cerebral são brevemente descritos abaixo nas seções 1 - 2.

1. A injeção estereotáxica

1. Efectuar todos os procedimentos cirúrgicos num ambiente estéril, utilizando técnicas assépticas. Steam-esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos de metal, gaze e material de cortina em autoclave. Esterilizar todos os materiais que possam ser danificados pelo vapor usando esterilização química (por exemplo, óxido de etileno).
2. Induzir e manter a anestesia de acordo com a sanidade animal e prequisitos específicos do ROTOCOLO.
   1. Para a injecção de vírus em macacos, induzir a anestesia com cetamina (10 mg / kg) e manter os animais sob anestesia cirúrgica completa com isoflurano (1-3% inalado em oxigênio) monitorização expirado CO _2, ECG, taxa de respiração e temperatura continuamente e verificar periodicamente o tom de mandíbula para assegurar a profundidade da anestesia adequada.
3. Coloque o animal em um quadro estereotáxico para estabilizar a posição da cabeça e para permitir a utilização de coordenadas estereotáxica para localizar a estrutura de injeção de interesse (por exemplo dLGN). Se medir as respostas visuais, local colírio (1% atropina colírio se dilatação da pupila é desejada, caso contrário, olho gotas salinas) e, em seguida, as lentes de contato em ambos os olhos para evitar a secura. Se não medir as respostas visuais, coloque pomada oftálmica nos olhos.
4. Faça uma incisão na linha média do couro cabeludo e retrair a pele e os músculos.
5. De acordo com coordenadas estereotáxicas para a estrutura de interesse (dLGN) em um hemisphere, fazer uma pequena craniotomia.
6. Pode baixar gradualmente um eléctrodo de registo (por exemplo tungsténio ou eléctrodo de platina / irídio (ver Tabela de materiais específicos / Equipamento, linha 3) presa a um micromanipulador que está posicionada manualmente) através da craniotomia para o cérebro. A menor impedância (<1 mohms) e ligeiramente mais espessa (~ 250 um de diâmetro) eléctrodos podem ser utilizados para penetrar a dura-máter, se desejado.
7. O registo da posição do manipulador na superfície cortical e no ponto em que as respostas visuais são medidos. respostas visuais são audíveis, em tempo bloqueado respostas neuronais à luz brilhou nos olhos com um oftalmoscópio ou LED pequena / lanterna.
8. Determinar a localização e a espessura da dLGN observando posições do manipulador no início, meio e fim de respostas visuais e subtraindo a posição da superfície cortical a partir destes valores. Grave as profundidades para cada local de injecção concebido dentro do dLGN.
   NOTA: procedu Similarres podem ser usados ​​para localizar estruturas não visuais, utilizando estímulos sensoriais adequadas. Além disso, os sistemas acoplados de gravação / injecção também podem ser utilizados para direccionar pequenas estruturas do cérebro.
9. Uma vez que os locais de injecção óptimas são anotados, remover o eléctrodo de registo e colocar uma pipeta de injecção (pipeta de vidro ou de uma seringa de injecção) na mesma posição estereotáxico e inferior à profundidade apropriada para cada injecção, começando com o local de injecção mais profundo e de prosseguir para o mais raso, esperar pelo menos 1 min após a injecção antes de mudar de posição do eletrodo. pipetas de vidro com diâmetro exterior de cerca de 50 pM pode reduzir o refluxo de vírus em comparação com pontas de seringa (~ 200 um de diâmetro).
10. Usando um sistema de injecção (ver Tabela de materiais específicos / Equipmen t, linha 4), Picospritzer, ou bomba de seringa, injetar pequenos volumes (1 - 5 jul; consulte as instruções do fabricante para os procedimentos de injeção) do vírus da raiva modificado mais de múltipla (3 - 10) profundidadesa uma taxa de ~ 100 nL / min dentro da estrutura alvo (dLGN). Nota: penetrações de injecção separados podem ser feitas em estruturas de alvo maiores (por exemplo, macaco dLGN). Ajustar o volume total de injecção de acordo com tamanho da estrutura alvo.
11. Pause, pelo menos, 5 minutos antes da retracção da pipeta de injecção. Quando a pipeta de injeção é removido, preencher a craniotomia com material de proteção (pedaço de osso cola no lugar, aplicar a cera óssea ou gelfoam), então suturar o músculo ea pele volta juntos.
12. Administrar analgésicos (por exemplo, cetoprofeno) e antibióticos antes do final da cirurgia e monitorar animais continuamente até que animal é ambulatorial.
13. Por pelo menos 3 dias e até 10 dias após a cirurgia, monitorar animais diariamente para garantir suturas são limpos, secos e intactos e animal não mostra sinais de dor ou desconforto. Administrar analgésicos diários e antibióticos, conforme necessário. Comece a habitação social de animais pós-cirúrgico após animais está totalmente recuperado de uma cirurgia.
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2. Tecido de colheita, o seccionamento e coloração

1. Permitir 7 - 14 dias para o transporte retrógrado de vírus, em seguida sacrificar o animal por overdose de solução eutanásia (por exemplo Euthasol) e perfundir o animal transcardialmente com fosfato 0,1 M de solução salina tamponada, paraformaldeído a 4%, depois 4% de paraformaldeído com 10% de sacarose.
2. Remover o cérebro (ver ¹² para as etapas análogas em um modelo de roedor) e coloque em 20 - 30% de sacarose com paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1 M e leve à geladeira por 1 - 2 dias.
3. Quando o cérebro afundou para o fundo do recipiente, removê-lo e cortar o tecido em blocos contendo a região do cérebro com neurónios marcados de modo retrógrado (por exemplo córtex visual) e a estrutura de alvo de injecção (por exemplo, dLGN). Corte os mesmos blocos de tecido a partir do hemisfério não injectada - estes servirão como seções de controle. Para melhores resultados, comece procedimentos histológicos immediatelY sobre o tecido recém-seccionado.
4. Secção de tecido coronário com uma espessura de 50 mm por seção usando um micrótomo de congelação (ver Tabela de materiais específicos / Equipamentos, linha 5).
5. Manchar todas as seções para a atividade do citocromo-oxidase (ver Tabela de materiais específicos / equipamentos, linhas 5 - 8) para visualizar camadas corticais e estruturas subcorticais ^13. Nota: As secções podem ser armazenados durante a noite no frigorífico na lavagem final após a mancha de citocromo-oxidase.
6. Rotular todas as secções com um anticorpo primário contra GFP (diluição de 1: 1.000, ~ 12 horas de incubação; ver Tabela de materiais específicos / Equipamento, linha 9) seguidos por um anticorpo secundário que corresponde ao hospedeiro primário e marcado com biotina ⁵ (diluição 1: 500 , 2-4 horas de incubação; consulte a Tabela de materiais específicos / Equipamentos, linha 10). Recomenda-se a incubar seções na noite anticorpo secundário.
7. Seções de etiqueta com um complexo de avidina / biotina, em seguida reagir com DAB e peróxido de manchar permanentemente todos os neurónios marcados ^5.
8. Montar secções em lâminas de vidro subbed e deixar secar durante a noite.
9. Seções secar utilizando uma série de álcool e xileno lavagens em seguida, cobrir de deslizamento ^14.

3. Reconstrução Neuronal

NOTA: Todas as reconstruções para experimentos originais foram feitas usando um sistema de neurônios reconstrução composta de um microscópio (ver Tabela de materiais específicos / Equipamentos, linha 14), câmera acoplada (ver Tabela de materiais específicos / Equipamentos, linha 13) e software de reconstrução pacote (ver Tabela de materiais específicos / equipamentos, linhas 11 - 12). reconstrução neuronal assistida por software permite a visualização de lâminas de tecido cobertas com desenhos baseados em computador de processos neuronais. Importante, o software digitaliza reconstruçâo morfológicaDados ção em três dimensões, permitindo a extração de informações morfológicas posição específica. O programa de extração de dados associados (ver Tabela de materiais específicos / Equipamentos, linha 12) permite a extração de um rico conjunto de dados morfológicos de cada reconstrução salvo.

1. Coloque um slide no porta corrediça do microscópio e se concentrar em uma única seção de interesse utilizando uma objectiva de baixa ampliação (por exemplo, 2X ou 10X). Certifique-se a imagem da câmara é visível na vista de software, posicionando adequadamente o obturador da câmera.
2. Escolha neurónios marcados no interior da estrutura do cérebro de interesse (por exemplo, TRN) que são razoavelmente isolado, de modo a reconstruir de forma inequívoca, tanto da arborização dendrítica quanto possível. Preferencialmente escolher neurônios se o corpo da célula está totalmente dentro de uma única secção, a fim de capturar a maior extensão de cada corpo celular e estimar com precisão a sua área e redondeza. Use 10X objectivo microscópio para identificar células bOdy na secção de casa.
3. Uma vez que um bem-manchado, bem isolado neurônio é identificado, adicionar a seção "casa" contendo o corpo da célula para a Seção Manager clicando no botão "Novo capítulo". Digite o número de seções para incluir (recomendado 2 - 3 seções para começar). Atribuir uma espessura de corte de 50 mm quando solicitado (ver Passo 2.3).
4. Seguir os contornos das estruturas do cérebro relevantes na casa secção contendo o corpo da célula. Use o 2X objetivo / ampliação para o traçado de contorno.
   1. Primeiro, selecione "Contour" no menu drop-down na barra de ferramentas superior e, em seguida, selecione o tipo de contorno a partir do menu drop-down (por exemplo, "LGN" ou "TRN").
   2. Seguir a contornos da estrutura de alvo (por exemplo, TRN), bem como estruturas adjacentes, se desejado, clicando em pontos ao longo do contorno usando o rato como uma ferramenta de desenho.
   3. Selecione "Fechar contorno" clicando com o botão direito do mouse e selecionar esta opçãoa partir do menu para ser concluído e coloque cada contorno traçado.
5. Coloque um marcador no centro da estrutura de alvo, clicando no símbolo de marcador desejado na barra de ferramentas para a direita e depois clicar no local desejado na reconstrução para colocar o marcador nessa localização. Utilizar o mesmo tipo de marcador para marcar o centro da estrutura de alvo em todas as reconstruções.
6. Uma vez que os contornos são completa, traçar o contorno do corpo da célula usando 40 - 60X objectivos / ampliação. Para fazer isso, primeiro selecione "Neuron" a partir do menu drop-down na barra de ferramentas superior e, em seguida, selecione a estrutura do neurônio para rastrear, neste caso "Cell Body". Próximo rastrear o corpo da célula como em 3.4.
7. Coloque um marcador estilo diferente no centro do corpo da célula, seguindo as etapas descritas em 3.5.
8. Rastrear todas as dendrites começam no corpo celular.
   1. Primeiro, selecione "Dendrite" a partir do menu drop-down. Em seguida, rastrear cada dendrite começando no bod celulary e usando o mouse como uma ferramenta de desenho. Certifique-se de ajustar a profundidade Z em todo o rastreamento para capturar com precisão o ângulo e direcção da dendrite.
   2. Coloque um nó em cada ponto de ramificação ao longo do dendrito, clicando com o botão direito do mouse e selecionando "bifurcando Node" ou "Trifurcating nó" no menu drop-down. Use 40 - 60X objetivo / ampliação para todas as reconstruções dendríticos.
   3. No final de cada dendrite, clique com o botão direito do mouse e selecione "Terminar" a partir do menu drop-down.
9. Identificar terminações dendríticas que são susceptíveis de continuar para a secção adjacente e pô-los em foco na z-profundidade adequada na imagem do microscópio. Incluir os principais marcos históricos nas proximidades, tais como vasos sanguíneos ou facilmente padrões dendríticos reconhecíveis ou pacotes na imagem do microscópio.
   1. Reduzir a ampliação para 20X ou 10X no microscópio (escolha a ampliação que permite maior visualização marco), e tomarum retrato da imagem do microscópio usando uma câmera digital (por exemplo, telefone celular, tablet) de mão para a tela do computador.
10. Mover para a secção adjacente na corrediça e alinham-se os contornos da secção previamente traçadas com os limites da dLGN e TRN na nova área.
11. Devolver o campo de visão para a área geral do corpo celular (com base em contornos e principais marcos) e trazer a ampliação de volta até 10 - 20X.
12. Use a foto das terminações dendríticas a partir da secção previamente traçadas para ajudar a alinhar as terminações com o início das dendrites na nova seção.
    1. Para girar o traçado e movê-lo para alinhar dendrites, use a ferramenta de seta para selecionar a reconstrução, clique com o botão direito e selecione "Mover" no menu drop-down.
    2. Alternativamente, use a ferramenta "Match" para coincidir com terminações dendríticas para começos. Selecione a ferramenta Jogo da barra de ferramentas superior e, quando solicitado, clique no finalna reconstrução e o ponto de continuação correspondente na imagem. Repita o procedimento para 3 ou mais terminações.
13. Uma vez que o traçado da seção anterior está alinhada com as dendrites na nova seção, certifique-se a nova seção correspondente é selecionado na seção gerente clicando na seção atual. Ou, adicione uma nova seção para a seção do gerente, conforme descrito acima em 3,3, ajustando o z-profundidade e posição de cada seção nova em relação à secção de origem desse facto e definir cada espessura de corte de 50 mm (ver Passo 2.3).
14. Aumentar a ampliação para 40 - 60X e traçar as continuações dendríticos clicando com o mouse no final do dendrite da reconstrução e selecionando "Adicionar à Ending" a partir do menu drop-down, em seguida, traçando a dendrite usando o mouse como um chamar a ferramenta. Siga pronta para especificar se a continuação é na nova seção.
15. Siga dendritos através de pelo menos 3 secções adjacentes (um em cada lado doseção casa) seguindo os passos 3,8-3,15. Adicionar à reconstrução até pelo menos 3 secções totais são rastreados para o neurónio, ou até que os dendritos já não podem ser encontrados ou seguido. Traçar contornos em seções vizinhas, seguindo os passos acima, se desejado.

4. Agrupamento Independente

Nota: Conjunto Independente analisa permitir análises imparciais de grandes conjuntos de dados, multi-dimensionais que poderiam ser difíceis de visualizar e, mais importante, fornecer uma avaliação quantitativa da diversidade morfológica. Uma plataforma de programação à base de matriz é bastante útil para a análise dos conjuntos de dados multi-dimensional de dados e permite manipulações sofisticadas e análises estatísticas. As funções listadas nos passos 4 - 6 são definidos na plataforma de programação listados na tabela de materiais específicos / Equipamentos, linha 15.

1. Extrair dados morfológicos de cada reconstrução neuronal indivíduo que utiliza o extprograma raction associado com o sistema de neurônios reconstrução (ver Tabela de materiais específicos / equipamentos, linhas 11 - 12).
   1. Primeiro, escolha os dados morfológicos desejados para cada reconstrução incluindo: informações contorno, informações marcador, dados morfológicos do corpo celular e arborização dendrítica, etc.
   2. A partir do menu drop-down em Editar na barra de ferramentas superior, selecione "Selecione todos os objetos". Em seguida, selecione "Análise de estrutura ramificada" a partir do menu drop-down Analysis na barra de ferramentas superior e clique em cada guia e selecione as opções de análise desejados em cada guia.
   3. Extrair todos os dados desejados, clicando no botão "OK" na janela de Análise e salvar em um formato de planilha clicando com o botão direito nas janelas de saída e selecionando "Exportar para Excel".
2. Compilar uma planilha Master (ver Tabela de materiais específicos / Equipamentos, linha 16) em que cada variável morfológica / metric é representado por uma única observação numérica por neurônio. Nesta planilha Mestre, manter um registro do identificador de linha para cada neurônio.
3. Verificar que todas as variáveis incluídas na análise de agrupamentos (por exemplo métricas morfológicas) são independentes um do outro. Por exemplo, o número de nós irá correlacionar-se com o número de ramificações numa arborização dendrítica ou axonal. Por conseguinte, apenas uma destas duas variáveis ​​devem ser incluídos numa análise de agrupamento.
4. Certifique-se de cada medição contém uma observação para cada variável, ou seja, cada neurônio (medição), deve ter um ponto de dados (observação) correspondente a cada métrica morfológica (variável). Se as observações de uma variável em particular (por exemplo, comprimento axónio) faltam para um subconjunto de neurónios, esta variável (comprimento axónio) não podem ser incluídos na análise de agrupamento.
5. Organizar os dados na planilha principal em uma única matriz em que cada linha representa um neurônio e each coluna contém dados numéricos para cada métrica morfológicas (Figura 1). Por exemplo, um conjunto de dados incluindo neurónios 100 para os quais existem observações para 5 variáveis ​​independentes seria representado por uma matriz de 100 x 5 (linha-a-coluna). Não é necessário incluir qualquer identificação para cada neurônio dentro da matriz - o índice da linha servirá como identificador único de cada neurônio. Também deve haver lacunas ou "nan" s na matriz. Salvar a matriz como uma única variável (por exemplo, dados = [100 x 5 matriz], ver arquivo de código suplementar para código de exemplo).
6. Escolha um algoritmo para calcular as distâncias entre os pontos que representam os neurónios individuais de um espaço n-dimensional, onde n é definido pelo número de variáveis. A função 'pdist' permite flexibilidade no cálculo de distâncias entre-neurônio. O cálculo da distância padrão é a distância euclidiana e tem sido usado anteriormente para análises semelhantes de morphologica neuronalDados L ^{5, 6.}
7. Com o entre-neurônio distâncias saída da função 'pdist', usar a função 'ligação' para formar clusters. Mais uma vez, várias opções de agrupamento estão disponíveis. O método de Ward e distância centroid produziram resultados semelhantes em análises de conjuntos de dados morfológicos ^{5, 6.}
8. Se desejar, use a função 'kmeans' como uma abordagem de agrupamento alternativa para 'pdist "e funções" Linkage ". '' kmeans emprega quadrado distância euclidiana para calcular distâncias entre-neurônio e, em seguida, distância centróide para atribuir clusters.
9. Para visualizar uma árvore hierárquica de agrupamento, utilizar a função 'dendrograma' na saída da operação de "ligação". Esta função tem uma configuração padrão que limita a visualização para 30 medições, mas pode ser substituído, especificando o número de medições (<em> por exemplo, neurônios) exibido. O dendrograma ilustra as distâncias de ligação no eixo Y para cada um dos neurónios, identificados pelo seu índice de linha no eixo x.
   NOTA: As saídas de 'ligação' e 'dendrograma' não definir o número ideal de clusters. A saída do 'kmeans' não atribuir medições para grupos, mas não testar se estes conjuntos são ideais. comparações estatísticas separadas e a verificação de agrupamento óptimo pode ser executada (ver abaixo).

5. Verificação de Clustering

Observação: Como referido acima, a análise de agrupamento em si não proporciona directamente uma avaliação estatística do facto de os grupos representados no dendrograma conjunto são únicos e representativa da amostra. Métodos de verificação clusters a partir do dendrograma foram propostos ^15, no entanto, estes não fornecem verificação estatística de agrupamento ideal. Existem váriasmétodos de PLE para verificar o agrupamento ideal.

1. Método 1: Avaliando agrupamento:
   1. Use a função 'evalclusters' especificar o método utilizado para o cálculo aglomerados, tais como 'kmeans' ou 'ligação'. A Gaussian saída modelo de mistura também pode ser avaliada (ver Passo 5.2 abaixo; ver arquivo de código suplementar para código de exemplo).
   2. Especifique o critério de avaliação a partir de um número de opções (por exemplo, 'CalinskiHarabasz' - para obter descrições de opções de critério, consulte o menu Ajuda, em busca de "evalclusters").
   3. Especifique um intervalo de números de clusters ideais para testar (por exemplo, [1: 6] para testar se 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 conjuntos são ideais).
      Nota: A saída do 'evalclusters' é um número ideal de agrupamentos dado o algoritmo de agrupamento e de critério especificado.
2. Método 2: Gaussian modelo de mistura de agrupamento:
   NOTA: mistura Gaussian modelo de cluster algorithms (MGM) assumir que observações para cada variável vêm de uma mistura de distribuições gaussianas que definem cada cluster putativa, cada um com sua própria média e covariância. O GMM, em seguida, usa um algoritmo de maximização expectativa para atribuir probabilidades posteriores de cada medição, indicando a probabilidade de pertencer a um cluster específico ^16.
   1. Implementar um GMM utilizando a função 'fitgmdist' introduzindo o número putativo de clusters observáveis ​​nos dados. Como alternativa, para evitar uma atribuição priori do número de clusters, use Análise de Componentes Principais (PCA) com uma série de números do conjunto ideais diferentes, utilizando as etapas descritas aqui (ver arquivo de código suplementar para código de exemplo).
   2. Use a função 'PCA' na matriz de dados originais e salvar os principais escores dos componentes como uma saída.
   3. Em um loop começando em 1 e passando por algum número de clusters ideais putativos, use thfunção 'fitgmdist' e sobre os principais escores dos componentes e gerar MGM para cada número de clusters ideais putativos.
   4. Avalie cada GMM examinando a probabilidade negativa log, critério de informação de Akaike e critério de informação de Bayes. O GMM com os mais baixos critérios é o ideal.
   5. Se desejado, testar se os valores médios para cada grupo são significativamente diferentes, quando o número de grupos é óptima (meio de cada grupo são armazenados no "mu" de saída de cada GMM).

6. As análises estatísticas dos dados em cluster

1. Uma vez que o número ideal de clusters é determinada utilizando agrupamento hierárquico e avaliados, retornar aos dados originais, os neurônios separados em grupos, e determinar quais métricas morfológicas contribuir para o agrupamento de neurônios em classes únicas.
2. Organizar os dados de métrica morfológicas originais, que os neurônios são agrupados de acordo com a atribuição de cluster. Para verificar as relações entre dados morfológicos através neurônios (para todos os neurônios ou para neurônios separados em grupos), realize a regressão linear se encaixa para 2 e 3 vias comparações de observações métricas morfológicas. Estes ataques pode ser estimada utilizando a função 'Ajuste' e avaliado com a função 'fitlm ", no qual a bondade de saídas de ajuste incluem valores de R ² e P para ajustes de regressões.
3. Para examinar as relações estatísticas entre os neurônios em cada cluster, use não-paramétrico de duas amostras (Wilcoxon teste rank-sum) ou múltiplos amostra testes de comparações (ANOVA), dependendo do número de clusters. Mais importante, o uso de múltiplos amostra ANOVAs garante que os valores de p são corrigido para comparações múltiplas.

Representative Results

Nós mostramos anteriormente que reconstruções em larga escala de neurónios dentro de uma população selectiva é viável injecção seguinte de vírus da raiva modificado no dLGN ^5. Recentemente, o mesmo tecido foi utilizada para reconstruir 160 neurónios no sector visual da TRN (Bragg et ai, na avaliação;. A Figura 2A-B) seguindo os passos metodológicos detalhados descritos acima. No estudo TRN, três conjuntos únicos de neurónios TRN foram identificados com base na análise independente aglomerado de 10 métricas morfológicas: área do corpo celular, arredondamento corpo celular, medial-lateral posição em relação ao centro da TRN, posição dorsal-ventral dentro do TRN , número de árvores dendríticas, distância dendrítica média para nós, comprimento médio de ^3ª e dendrites de ordem superior, ângulo médio de 1 dendrites ordem ^st, ângulo médio fase da arborização dendrítica total e desvio angular do quetal arborização dendrítica. Neurônios TRN foram distribuídos equivalentemente entre os três grupos (Figura 2C). comparações estatísticas separadas de todos os 10 métricas morfológicas em todo neurônios nos três grupos produziram diferenças estatisticamente significativas entre os grupos para todos, mas dois dos indicadores morfológicos incluídos na análise cluster original. Assim, com base no dendrograma hierárquica em árvore gerada a partir da análise de agrupamentos (Figura 2C) e as comparações estatísticas separadas de métricas morfológicas através aglomerados, TRN neurónios são classificados em três grupos originais.

Neste estudo, nós queríamos especificamente para aplicar métodos estatísticos para avaliar separadamente os clusters determinadas com uma análise de cluster. O conjunto de dados a partir do estudo TRN antes foi avaliada para determinar se as três agrupamentos foram observados óptima. análises separadas de cluster adicional, ou seja, PCA e GMM clusintroduzi-, foram realizados para verificar os métodos de agrupamento anteriores (Figura 1). Três resultados principais verificar separadamente a análise de agrupamento prévio. Em primeiro lugar, quando o método de análise de cluster original foi avaliada usando a função dos evalclusters 'especificando a função de' ligação 'para gerar agrupamentos, o número ideal de grupos foi de 3, correspondentes a conclusão original baseado na dendrograma árvore hierárquica (Figura 2C). Em segundo lugar, PCA foi realizada na matriz de dados originais de 10 métricas morfológicas para 160 neurônios TRN como um meio alternativo de agrupamento de neurônios com base nas contribuições de métricas morfológicas. Três MGM foram gerados, assumindo neurónios TRN foram agrupados em 1, 2, ou 3 grupos originais. A probabilidade log negativo (NLL) e critério de informação de Akaike (AIC) produziu o menor e, portanto, mais informativo, valores e ambos os valores foram ideal quando o MGM usado 3 clusters para descrever dados morfológicos TRN (Figure 3). Em terceiro lugar, o agrupamento baseado no GMM foi avaliado separadamente utilizando a função 'evalclusters' e o número ideal de agrupamentos era 3. Assim observações do dendrograma árvore hierárquica, comparações estatísticas de métricas morfológicas em todo neurônios separados em três grupos, PCA e GMM- agrupamento com base, e as avaliações individuais de cada método de agrupamento (ligação e GMM), todos produziram o mesmo resultado que os neurônios TRN são perfeitamente separadas em 3 grupos com base nos 10 métricas morfológicos utilizados.

Figura 1: Formato de dados. Exemplo matriz de dados com n linhas correspondentes ao número de neurónios e m = 5 colunas correspondente ao número total de variáveis ​​independentes a incluir na análise de agrupamento (não incluem cabeçalhos na matriz de dados).

Figura 2: Clustering Independente de 160 TRN neurônios. A. Esquerda, fotografia de secção coronal único através da dLGN de um animal, manchado para a atividade do citocromo-oxidase para visualizar camadas dLGN e contra GFP para visualizar injeção de vírus. A seta indica regiões densas de neurónios marcados de modo retrógrado TRN. Orientação seção segue a bússola dorsal-ventral / médio-lateral (DV / ML) abaixo e barra de escala representa 500 mm para todos os painéis em A. Segunda da esquerda, contorno contornos de dLGN (vermelho) e TRN (marrom) para todas as seções contendo injecção de vírus (contornos pretos). estrelas amarelas indicam centros no local da injecção. Barras de orientação e escala como em um. Terceiro da esquerda, renderizações 3D de contornos e local da injecção, orientação e barras de escala como em um. Certo, mapas de locais de reconstruída Neurônios TRN, codificados por cores de acordo com a atribuição de cluster (C) dentro de um único contorno TRN agregada (marrom). Barras de orientação e escala como em um. B. Esquerda, contornos agregados de TRN (preto) e dLGN (cinza) com 5 neurônios TRN reconstruídos cores quentes para esfriar acordo com sua posição medial-lateral dentro da TRN. Orientação de acordo com a bússola DV / ML em A, barra de escala representa 500 mm. Certo, fotografias dos mesmos neurônios 5 TRN com barras de escala de cores combinadas representando 100 mm. C. dendrograma árvore hierárquica seguinte análise de cluster ilustrando distâncias de ligação entre 160 neurônios TRN reconstruídos com base em 10 métricas morfológicas independentes. Três grupos ilustrado em azul, verde e vermelho. Todas as partes desta figura são adaptadas das figuras incluídas no Bragg et al. (em revisão).lank "> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Avaliação Cluster. Lote de dois valores critério diferente, a probabilidade log negativo (NLL, vermelho) e critério de informação de Akaike (AIC, azul) gerada a partir de três MGM assumindo 1, 2, ou 3 clusters. MGM com 3 clusters fornecer os mais baixos valores de critério.

Suplementar arquivo de código: Exemplo de código, escrito em uma linguagem Matlab-compatível, para realizar a análise de cluster em uma matriz de dados exemplo seguido por avaliação cluster usando PCA e GMM se aproxima. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

Discussion

estudos neuroanatômicos mantiveram-se um dos pilares da neurociência e recente interesse em conectonomia e relações estrutura-função renovou o entusiasmo para a caracterização morfológica detalhada de populações neuronais selectivos. Tradicionalmente, os estudos neuroanatômicos têm contado com classificações qualitativas de neurônios em classes morfologicamente distintas de neurônios definidos pela neuroanatomistas especializados. Com os avanços nas técnicas de reconstrução de neurônios e extração de dados morfológicos, é agora possível utilizar métodos de análise de dados mais sofisticados e quantitativos para classificar as classes neuronais morfologicamente distintas de uma maneira imparcial. Neste estudo, os métodos passo-a-passo são descritas por 1) rotulagem seletivamente centenas de neurônios individuais usando métodos de marcação retrógrada mediada por vírus; 2) sistematicamente reconstruindo centenas de neurônios individuais para formar uma amostra abrangente e, portanto, representativa dos neurônios dentro de um população selectiva; e 3) o agrupamento independente analisa com avaliação estatística para determinar os clusters ideais de neurônios dentro de uma população seletiva com base em métricas morfológicas. Estes métodos de análise são verificados através da aplicação de diferentes métodos de agrupamento para um conjunto de dados existente de neurônios TRN e demonstramos com base em três métodos de avaliação distintos que os neurônios TRN são perfeitamente agrupados em três subpopulações morfologicamente distintas.

Uma grande vantagem dos protocolos descritos neste estudo é a sua flexibilidade. O vírus da raiva suprimida-G tem sido eficaz no aumento de expressão EGFP em centenas de neurónios marcados de modo retrógrado a seguir à injecção em uma estrutura alvo. A mesma cepa do vírus da raiva é igualmente eficaz em várias espécies, incluindo macacos ^{5, 9,} furões (Hasse & Briggs, em revisão), e roedores ^7,"> 8. Assim, o vírus da raiva modificado pode ser utilizado para etiquetar selectivamente os padrões de arborização dendrítica completa de qualquer população de neurónios a seguir à injecção em uma estrutura alvo. Coloração com anticorpo contra GFP seguido de DAB reacção / peróxido é recomendada porque isto provoca a coloração permanente de marcado neurónios e permite que as secções de tecido a ser visualizado sob um microscópio, sem a ajuda de microscopia de fluorescência (que branqueia marcador fluorescente com uma exposição mais longa). no entanto, métodos de coloração alternativos estão disponíveis e / ou a fluorescência pode ser visualizado directamente, se desejado. uma vantagem de medir fluorescência em bruto é que os diferentes vírus expressão de diferentes moléculas fluorescentes de condução pode ser combinado, por exemplo, para determinar se neurónios projectam para várias estruturas cerebrais alvo. Além disso, os passos descritos acima pode ser aplicado a todos os dados morfológicos disponíveis (por exemplo, os axónios e dendrites) para permitir morfo cada vez mais robustaclassificação lógica dos neurônios. É também importante notar que as quantidades mais pequenas de vírus da raiva também pode ser injectado, a fim de gerar mais esparsos rotulagem retrógrada, que pode ser vantajoso para as reconstruções de axónios em adição aos dendritos.

Uma vantagem adicional de os métodos de análise descritos no presente estudo é que várias abordagens diferentes de agrupamento pode ser utilizado e comparados. Em cada etapa da análise de cluster, diferentes opções estão disponíveis para calcular distâncias entre-neurônio em espaço de parâmetros, bem como diferentes algoritmos para gerar clusters. Além disso, vários métodos de avaliação estão disponíveis. Este último é especialmente útil como um meio para verificar o agrupamento óptima, como descrito na secção de resultados representativos. Sem dúvida, os algoritmos adicionais para gerar clusters e para avaliar o agrupamento ideal ficará disponível como o campo se move para frente. Juntos, esses métodos de análise irá continuar a Improve abordagens quantitativas no domínio da neuroanatomia e aumentar a robustez dos resultados.

Há um interesse crescente na automatização das reconstruções neuronais porque reconstruções por mão de neurônios marcados individuais são demorados, exigem formação e experiência, e ainda são um tanto subjetiva. Porque reconstruções neuronais automáticos baseados em computador são ainda propensa a erro, os dados neuroanatomical baseados em microscopia electrónica são ainda analisados por pessoas (ver por exemplo ^17). No entanto, é provável que a reconstrução neuronal automatizado estará disponível no futuro próximo. reconstrução neuronal automatizado vai exigir ainda mais de análise sobre o final de análise de dados, portanto, analisa o clustering e métodos de avaliação descritos aqui vai se tornar ainda mais importante como o campo continua a avançar tecnologicamente.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SADΔG-EGFP	E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute		Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core
Recording electrode: platinum/iridium or tungsten	FHC	UEPSGGSE1N2M	Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications
Nanoject II	Drummod Scientific	3-000-204, 110V	Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe
Freezing microtome	Thermo Scientific
DAB	Sigma Aldrich	D5905-50TAB	3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen - must be bleached before discarding
Cytochrome C	Sigma Aldrich	C2037-100MG
Catalase	Sigma-Aldich	C9322-5G
Rabbit anti-GFP	Life Technologies/Thermo Fisher	#A-11122	Primary antibody
Biotinylated goat anti-rabbit	Vector Laboratories	#BA-1000	Secondary antibody
Neurolucida System	MicroBrightField		Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida
Neurolucida Explorer	MicroBrightField		Data export software
Microfire Camera	Optronics		2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf
Nikon E800 Microscope	Nikon Instruments Inc.		Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html
Matlab	The MathWorks Inc.		Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com
Microsoft Office Excel	Microsoft		Spreadsheet program