Reconstruções em larga escala e, Clustering imparcial independente baseado no morfológicas Métricas para classificar Neurônios no seletivos Populações
Summary
Este protocolo descreve reconstruções em larga escala de populações neuronais selectivos, marcados após a infecção retrógrada com um vírus da raiva modificado expressando marcadores fluorescentes, e análises independentes cluster, imparcial que permitem a caracterização abrangente de métricas morfológicas entre subclasses neuronais distintas.
Abstract
Este protocolo descreve reconstruções em larga escala de neurônios combinados com o uso de agrupamento independente e imparcial análises para criar um completo levantamento das características morfológicas observadas entre uma população neuronal selectiva. Combinação destas técnicas constitui uma nova abordagem para a recolha e análise de dados neuroanatômicos. Em conjunto, estas técnicas permitem em grande escala, e, portanto, mais abrangente, a amostragem de populações neuronais selectivos e estabelecer métodos quantitativos imparciais para descrever as classes neuronais morfologicamente únicos dentro de uma população.
O protocolo descreve o uso de vírus da raiva modificado para etiquetar selectivamente neurónios. G-excluído atos de vírus da raiva como um traçador retrógrado após injecção estereotáxica em uma estrutura do cérebro alvo de interesse e serve como um veículo para a entrega e expressão de EGFP em neurônios. Um grande número de neurônios estão infectados usando estetécnica e expressar GFP ao longo de suas dendrites, produzindo "Golgi-like" preenchimentos completos de neurônios individuais. Por conseguinte, o método de rastreamento retrógrado mediada por vírus melhora nas técnicas tradicionais de rastreamento retrógrado à base de corantes, produzindo preenchimentos intracelulares completos.
Neurónios individuais bem isoladas que abrangem todas as regiões do cérebro a área sob estudo são seleccionados para a reconstrução, a fim de obter uma amostra representativa de neurónios. O protocolo descreve os procedimentos para reconstruir corpos celulares e completar padrões de arborização dendrítica de neurônios marcados abrangendo vários cortes de tecido. Os dados morfológicos, incluindo as posições de cada neurónio dentro da estrutura do cérebro, são extraídas para análise posterior. funções de programação padrão foram utilizados para realizar conjunto independente de análises e avaliações de cluster com base em métricas morfológicas. Para verificar a utilidade destas análises, a avaliação estatística de uma análise de agrupamento performada em 160 neurônios reconstruídos no núcleo reticular talâmico do tálamo (TRN) do macaco macaque foi feita. Tanto a análise de cluster original e as avaliações estatísticas realizadas aqui indicam que os neurônios TRN são separados em três subpopulações, cada um com características morfológicas únicas.
Introduction
Neuroanatomia é um dos fundamentos da neurociência 1 e interesse recente no "conectonomia" renovou o entusiasmo para a compreensão da diversidade morfológica de populações neuronais e as conexões entre os neurônios específicos 2. Métodos para a rotulagem e neurônios reconstruindo melhoraram muito com as recentes inovações, incluindo o rastreamento circuito genético e mediada por vírus aproxima 3, 4, permitindo pesquisas morfológicas mais abrangentes de populações neuronais 5. Além de melhorias na rotulagem neurônios individuais, técnicas de análise de dados quantitativos também surgiram que permitem a classificação independente e imparcial de neurônios em subpopulações distintas com base em dados morfológicos 5, 6. Estas técnicas imparciais são uma melhoria em cima mais traditional métodos de classificação qualitativos que têm sido o padrão no campo por mais de um século. O objetivo deste estudo é delinear, passo-a-passo, a combinação de rotulagem mediada por vírus de neurônios dentro de uma população seletiva, reconstruções em larga escala de uma amostra abrangente desses neurônios, e análise quantitativa dos dados baseados em agrupamento independente com avaliação estatística. Ao combinar esses métodos, destacamos uma nova abordagem para a recolha e análise de dados neuroanatômicos para facilitar a amostragem completa e classificação imparcial de tipos neuronais morfologicamente únicas dentro de uma população neuronal selectiva.
Como um exemplo destes métodos, que descrevem a análise de uma grande população de neurónios dentro de um único sector de o núcleo reticular talâmico (TRN) do macaco macaque. Estes dados são de um estudo prévio 7. Métodos para marcar seletivamente neurônios TRN salientes ao latera dorsall geniculate núcleo do tálamo (dLGN) usando a injeção cirúrgica do vírus da raiva modificado que codifica EGFP 4, 8 (ver Tabela de materiais específicos / Equipamentos, linha 2) são delineadas. Este vírus da raiva modificada não tem o gene que codifica para uma proteína de revestimento essencial, eliminando o movimento trans-sináptica do vírus. Uma vez que o virus entra terminais de axónios no local da injecção, ela age como um traçador retrógrado tradicional com a importante vantagem de dirigir a expressão de EGFP em toda a arborização dendrítica completa de neurónios infectados 5, 9, 10. Por conseguinte, este vírus da raiva suprimida-G pode ser utilizada para infectar selectivamente e rotular qualquer população de neurónios a seguir à injecção e transporte retrógrado.
Para realizar uma análise global de uma população neuronal específica, é importante para provar a partir deuma ampla distribuição dos neurónios dentro da população. Uma vez que a técnica de marcação mediada por vírus produz intracelular completo ", de Golgi-like" enche de muitos neurónios com axónios no local da injecção do vírus, é possível reconstituir uma amostra muito grande dos neurónios dentro de toda a extensão de uma estrutura do cérebro. Além disso, porque o vírus da raiva modificado é tão eficaz em infectar e rotulagem de grandes números de neurónios, é possível reconstruir centenas de neurónios por animal. Os procedimentos de amostragem 160 neurónios em todo o sector visual da TRN 11, a fim de gerar uma amostra global de dLGN-se projectam neurónios TRN são descritas. O processo de reconstrução neurônios individuais usando um sistema de reconstrução neurônio incluindo um microscópio, câmera e software de reconstrução é descrito. Também são descritos métodos para determinar as posições de neurônios individuais dentro de uma estrutura cerebral (neste caso dentro da TRN) e verificar vírus injecção site volume e localização dentro de uma estrutura (neste caso, dentro do dLGN) usando reconstruções contorno volumétricos. Etapas para exportar dados morfológicos e executar agrupamento independente análises com base em métricas morfológicas medidos para cada neurônio são delineadas. Existem limitações para métodos de agrupamento e também há uma variedade de diferentes algoritmos de agrupamento disponíveis. Assim, estas opções e os benefícios de alguns dos algoritmos mais comumente utilizados são descritos. A análise de cluster não fornece verificação estatística da singularidade de clusters. Por conseguinte, os passos adicionais são descritos para verificar agrupamento óptima, bem como as relações entre os dados morfológicos dentro e entre grupos. métodos estatísticos para avaliar os clusters para o conjunto de dados de TRN para confirmar que os neurônios TRN são agrupados em três grupos exclusivos com base em 10 métricas morfológicas independentes são descritos.
Assim, por delinear passos para a rotulagem selectiva, Reconstruir, e análise de dados morfológicos a partir de uma população neuronal específica, que descrevem métodos para quantificar diferenças morfológicas entre os neurónios dentro de uma população. achados anteriores de tipos neuronais distintas dentro do setor visual da TRN macaco macaque são confirmadas com métodos distintos de avaliação estatística. Juntos, esperamos que estas técnicas serão amplamente aplicável a conjuntos de dados neuroanatômicos e ajudar a estabelecer a classificação quantitativa da diversidade de populações neuronais através do cérebro.
Protocol
Representative Results
Discussion
estudos neuroanatômicos mantiveram-se um dos pilares da neurociência e recente interesse em conectonomia e relações estrutura-função renovou o entusiasmo para a caracterização morfológica detalhada de populações neuronais selectivos. Tradicionalmente, os estudos neuroanatômicos têm contado com classificações qualitativas de neurônios em classes morfologicamente distintas de neurônios definidos pela neuroanatomistas especializados. Com os avanços nas técnicas de reconstrução de neurônios e extraçã…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nós gostaríamos de agradecer Drs. Ed Callaway e Marty Usrey por nos permitir usar o tecido preparado como parte de um estudo prévio e Libby Fairless e Shiyuan Liu para ajudar com reconstruções neuronais. Este trabalho foi financiado pelo NIH (NEI: EY018683) e da Fundação Whitehall.
Materials
| SADΔG-EGFP | E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute | Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core | |
| Recording electrode: platinum/iridium or tungsten | FHC | UEPSGGSE1N2M | Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications |
| Nanoject II | Drummod Scientific | 3-000-204, 110V | Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe |
| Freezing microtome | Thermo Scientific | ||
| DAB | Sigma Aldrich | D5905-50TAB | 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen – must be bleached before discarding |
| Cytochrome C | Sigma Aldrich | C2037-100MG | |
| Catalase | Sigma-Aldich | C9322-5G | |
| Rabbit anti-GFP | Life Technologies/Thermo Fisher | #A-11122 | Primary antibody |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | #BA-1000 | Secondary antibody |
| Neurolucida System | MicroBrightField | Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida | |
| Neurolucida Explorer | MicroBrightField | Data export software | |
| Microfire Camera | Optronics | 2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf | |
| Nikon E800 Microscope | Nikon Instruments Inc. | Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html | |
| Matlab | The MathWorks Inc. | Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Spreadsheet program |
References
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