Forskolin-indusert Hevelse i tarmen Organoids: An<em> In Vitro</em> Analyse for å vurdere Drug Response i pasienter med cystisk fibrose
Summary
This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.
Abstract
Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 °C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.
Introduction
CF er forårsaket av mutasjoner i cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator (CFTR) genet som koder for en epitelial anion kanal. CF påvirker om lag 85 000 mennesker over hele verden en. Over 2000 CFTR mutasjoner er blitt identifisert ( www.genet.sickkids.on.ca ). Dette mangfoldet delvis forklarer et bredt spekter av observerte sykdoms fenotyper ( www.CFTR2.org ) 2, 3. Seks klasser av CFTR mutasjoner er definert på grunnlag av deres virkning på CFTR protein ekspresjon og funksjon: (I) ingen syntese, (II) svekket handel, (III) defekt kanal gating, (IV) endret konduktans, (V) reduserte nivåer av vanlig fungerende CFTR, og (VI) svekket celleoverflaten stabilitet fire. Selv om felles CFTR mutasjoner er godt studert, CFTR funksjon og relasjon med klinisk status forbli poorly forstått på nivå med den enkelte, spesielt for den store gruppen av sjeldne "orphan" mutasjoner ( www.CFTR2.org ) 1, 3.
Nylig, narkotika har blitt utviklet som målrette CFTR protein i en mutasjonsspesifikk måte. To klasser av CFTR protein-måls narkotika er nå i klinisk bruk, og har forskjellige moduser av handlingen. Potensiatorer, så som VX-770, forbedre den åpne sannsynlighet for apikalt-lokaliserte mutant CFTR, og virker direkte på deres tilsetning til celler 5. Korrektur, slik som VX-809, gjenopprette smugling av endoplasmatiske retikulum-lokaliserte misfolded CFTR og krever pre-inkubasjon med celler før effekten er observert seks. CFTR-potensiator, VX-770, er blitt registrert for fag med G551D mutasjon 7, 8, så vel som for andre åtteCFTR gating mutasjoner, inkludert S1251N 9; sammen, er disse mutasjonene båret av 5% av CF-individer. Andre kliniske forsøk har indikert at VX-770, kombinert med korrigeringsanordningen VX-809, har begrenset ennå betydelige virkninger på lungefunksjonen og fører til en reduksjon i forverring priser fag homozygote for mutasjonen F508del båret av 45-50% av pasientene 10, 11.
Vanlige kliniske forsøk for å identifisere medikament responsive fag innenfor de resterende 50% av CF-pasienter er kostbare og tidkrevende, og er ikke gjennomførbare for personer med ekstremt sjeldne CFTR genotyper. Novel, kostnadseffektive, tilpassede metoder er avgjørende for å matche det økende antall CFTR modulatorer til enkeltpersoner som frakter alle typer CFTR mutasjon. Til nå har rettssaken inkludering av pasientgrupper som bærer spesifikke CFTR mutasjoner vært ledet av studier med mutant CFTR genet transfeksjon i heterologous cellesystemer, etterfulgt av elektrofysiologiske studier i Ussing-kammere 5, 6, 12. På grunn av mangel på tilstrekkelige CF dyremodeller, narkotika effektstudier i luft-væske-grensesnittet differensiert bronkiale epitelceller avledet fra CF lunge eksplantering materialer har blitt brukt for legemiddelutvikling 13, 14, 15. Men den begrensede tilgjengeligheten av lunge eksplantering vev og invasiv undersøkelse innhente bronkial celler fra individer uten sluttstadiet sykdom hemme analysen av mindre vanlige CFTR mutasjoner og forebygge narkotikatesting i en personlig måte. For å overvinne disse begrensningene, "lett tilgang" vev, for eksempel tykktarms organoids, nese Airway celler, og luftveis celler avledet fra induserte pluripotente stamceller, blir nå undersøkt for personlige medikamentelle behandlinger.
<p class= "jove_content"> Tidligere etablerte vi protokoller til kultur epiteliale stamceller fra enhver gastrointestinal organ i form av 3D organoids 16, 17. For den humane tykktarm / endetarm, involverer dyrkningsforholdene definerte vekstfaktorer (epithelial vekstfaktor (EGF), Gastrin, Wnt-3A, R-spondin 3 (Rspo3), og Noggin) kombinert med små molekyler (nikotinamid, A83-01, og SB202190) i en basalmembran matrise. Under disse betingelser, enkelt stamceller eller små vevsfragmenter vokse ut i lukket, cystisk, 3D-strukturer dannet av høyt-polarisert epitel med sin basal side er rettet mot utsiden. Alle celletyper vanligvis vises i sine normale forhold og posisjoner. Organoids kan utvides over lange tidsperioder etter ukentlig mekanisk ødeleggelse og re-plating. De er genetisk og fenotypisk stabil og kan lagres, slik at langvarig utvidelse og bio-bank 17. De er mottagelig foralle standard celle-biologiske / genetiske manipulasjoner og analytiske teknikker utviklet for 2D cellelinjer 18.Vi har nylig vist at CFTR funksjon lett kan måles i kolorektale organoids i en forskolin-indusert svelling (FIS) assay 19, 20. Når de utsettes for forskolin (Fsk) eller, alternativt, til koleratoksin, organoids raskt øke sin cyklisk adenosin monofosfat (cAMP) nivåer, noe som igjen resulterer i åpningen av kanalen 19 CFTR. Organoids fra friske individer, eller fra individer med CFTR mutasjoner assosiert med restfunksjon, vil deretter hovne som en konsekvens av ion og vann transport til organoid lumen, in vitro tilsvarer sekretorisk diaré. FIS responsen av kolorektale organoids ble tidligere vist å være fullt ut CFTR-avhengige, som angitt ved organoids avledet fra CFTR-null individer ennd ved bruk av spesifikke farmakologiske CFTR-hemmere 19. Store fagspesifikke datasett kan utledes innenfor flere uker etter å ha tatt en biopsi.
For FIS analysen beskrevet i detalj her, organoids dyrkes fra endetarms biopsier som kan fås i alle aldre og med bare begrenset ubehag 21. Organoids passeres ukentlig av mekanisk avbrudd i enkelt krypter som lett forsegle og danner nye organoids. For å kjøre FIS-analysen, ~ 30-80 av disse forstyrret små organoids er belagt i hver brønn av en 96-brønns plate 19. På dagen for analysen, blir organoids farget med calcein grønn, en fluorescerende celle-gjennomtrengelige fargestoff som det kan beholdes i levende celler, legge til rette for levende avbildning. Deretter Fsk, noe som øker intracellulært cAMP og derved aktiverer CFTR, tilsettes for å stimulere organoid hevelse. Potensiatorer som virker på apikal CFTR tilsettes samtidig wed forskolin, mens korrektur som gjenoppretter CFTR menneskehandel legges 24 timer før tilsetting av Fsk. Den organoid svelling er kvantifisert ved en automatisert bildeanalyse som beregner den relative økning i det totale areal av alle fluorescerende gjenstander for hvert tidspunkt ved tilsetning forskolin.
3D organoid hevelse gir fordeler og ulemper i forhold til eksisterende elektro CFTR avlesninger i 2D kultivert Airway celler i Ussing-kammere. En stor fordel er at gjennomstrømningen av den svellende analysen. Celler dyrkes og analyseres ved hjelp av en enkelt type dyrkingsmedium, og en erfaren tekniker kan kultur opptil 25 organoid prøver på en ukentlig basis, mens kvantifisering av ca 1200 datapunkter per uke i 12 pasientprøver. Vi konvensjonelt skriver en enkelt eksperimentell tilstand ved like eller tredoble målinger per plate og gjenta slike målinger på tre uavhengige inkubasjon tidspunkter. Totalt, ca 300-500 single organoid strukturer er deretter målt per eksperimentell tilstand, noe som fører til svært nøyaktige målinger av CFTR-funksjon med begrenset teknisk variasjon. Dette presisjons tillater oss å klart definere forskjeller i rest funksjon og respons til CFTR modulatorer og tillater oss å lett plukke opp genetiske bakgrunn effekter mellom pasienter bærer identiske CFTR mutasjoner 19, 22, 23, 24, 25. Datakvalitet lett kan vurderes fra mikroskop bilder. Mens FIS er fullt CFTR-avhengig, er det en indirekte effektmål for CFTR-funksjon, dens utlesning forårsaket av kobling av ione-transporten til fluid-transport. Dette i motsetning til direkte målinger CFTR funksjon i Ussing kamre, som måler transepitelial ion strømninger 26. Ussing kamre tillater velger stimulering av apikale eller basolateral compartments (som organoid analysen ikke tillater); av permeabilizing basolaterale membraner, kan den apikale CFTR-avhengig anion sekresjon selektivt målt 27.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her gir vi en komplett protokoll for generering, ekspansjon, frysing og tining av menneskelige kolorektal organoids. Mens vi har etablert menneskelige organoid kulturer for en tid siden 17, har det noen ganger vist seg vanskelig å etablere teknologien i andre laboratorier uten hands-on trening. Vi forventer at disse protokollene vil erstatte slik opplæring.
Wnt-3A-kondisjonert medium er en av de mest avgjørende reagenser for å lykkes i å etablere og opprettholde …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av HIT-CF program av den nederlandske CF foundation (NFH), ZonMW (40-00812-98-14103), Wilhelmina Barnas Hospital Research Fund og CZ og Zilverenkruis / Achmea. Vi vil gjerne takke S. Heida-Michel, M. Geerdink, KM de Winter-de Groot, og G. Berkers (Department of Pediatric Lunge, Wilhelmina barnesykehus, UMC Utrecht), og RHJ Houwen (Department of Pediatric Gastroenterology, Wilhelmina barne~~POS=TRUNC, UMC Utrecht) for nærmer pasientene og få biopsier for generering av et CF Biobank.
Materials
| Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #12634 | stored at 4 °C |
| GlutaMax | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #35050 | stored at 4 °C |
| Hepes | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | # 15630-056 | stored at 4 °C |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #15140-122 | stored at -20 °C |
| 96 well culture plate | Cellstar | #655180 | |
| 24 well culture plate | Cellstar | #662160 | |
| 6 well culture plate | Cellstar | #657160 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) | Life Technologies: Gibco | #14190-094 | stored at 4 °C |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM) 500ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #31966-021 | For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | #SFBS LOT#11113 | For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C |
| L Wnt3A cell line | ATCC | #CRL-2647 | For Wnt-3A Conditioend Medium Production. |
| TOP/FOP plasmids | Millipore | #17-285 | For measuring Wnt activity |
| pTK-Renilla | Promega | #E2241 | For measuring Wnt activity |
| HEK-293 | ATCC | #CRL-1573 | For measuring Wnt activity |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | #E1910 | For measuring Wnt activity |
| Zeocin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #R250-01 | For Wnt-3A Cell line selection |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #17504-044 | stored at -20 °C |
| N-Acetylcysteine | Sigma Aldrich | #A9165-5G | stored at -20 °C |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | #N0636 | stored at -20 °C |
| Human Epithelial Growth Factor (hEGF) | PrepoTech | #AF-100-15 | stored at -20 °C |
| Gastrin | Sigma Aldrich | #G9145 | stored at -20 °C |
| TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) | Tocris | #2939 | stored at -20 °C |
| Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) | Selleckchem | #S1049 | stored at -20 °C |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma Aldrich | #S7067 | stored at -20 °C |
| Primocin | InvivoGen | #ant-pm-1 | stored at -20 °C |
| Human Noggin (hNoggin) | PrepoTech | #120-10C | stored at -20 °C |
| Human R-spondin 3 (hRspo-3) | R&D Systems | #3500-RS/CF | stored at -20 °C |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | #861987- 250mg | stored at -20 °C |
| Gentamycin | Life Technologies: Gibco | #15710-049 | stored at -20 °C |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | #431788 | Stored at 4 °C |
| Matrigel | Corning | #354230 | stored at -80 °C |
| TryplE Express | Life Technologies: Gibco | #12605-010 | for trypsinizing organoids for freezing |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies: Gibco | #12648010 | for freezing |
| Calcein | Life Technologies: Gibco | #C3100MP | stored at -20 °C |
| Forskolin | R&D Systems | #1099-50 mg | stored at -80 °C |
| Lumacaftor (VX-809) | Selleckchem | #s1565 | stored at -80 °C |
| Ivacaftor (VX-770) | Selleckchem | #s1144 | stored at -80 °C |
| Name of Reagents/Material | Solvent | Stock Concentration | Final Concentration |
| GlutaMax | 200 mM | 2m M | |
| Hepes | 1 M | 10 mM | |
| Penicillin/Streptomycin | 10K U/ml 10K µg/ml | 100 U/ml 100 µg/ml | |
| Zeocin | 100 mg/ml | 125 µg/ml | |
| B27 supplement | 100 x | 1 x | |
| N-Acetylcysteine | MiliQ H20 | 500 mM | |
| Nicotinamide | DPBS | 1 M | 10 mM |
| Human Epithelial Growth Factor (hEGF) | DPBS 0.1%BSA | 0.5 mg/ml | 50 ng/ml |
| Gastrin | DPBS | 100 µM | 10 nM |
| TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) | DMSO | 5 mM | 500 nM |
| Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) | DMSO | 10 mM | 10 µM |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | DMSO | 30 mM | 10 µM |
| Primocin | 50 mg/ml | 100 µg/ml | |
| Human Noggin (hNoggin) | DPBS 0.1%BSA | 100 µg/ml | 100 ng/ml |
| Human R-spondin 3 (hRspo-3) | varies per lot | 300 ng/ml | |
| Vancomycin | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
| Gentamycin | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | MiliQ H20 | 0.5 M | 2 mM |
| Calcein | DMSO | 10 µg/ml | 3.3 ng/ml |
| Forskolin | DMSO | 10 mM | variable |
| Lumacaftor (VX-809) | DMSO | 20 mM | variable |
| Ivacaftor (VX-770) | DMSO | 20 mM | variable |
References
- De Boeck, K., Amaral, M. D. Progress in therapies for cystic fibrosis. Lancet Respir Med. 4 (8), 662-674 (2016).
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Rev Genet. 16 (1), 45-56 (2015).
- Sosnay, P. R., Siklosi, K. R., et al. Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene. Nature Genet. 45 (10), 1160-1167 (2013).
- Zielenski, J. Genotype and phenotype in cystic fibrosis. Respiration. 67 (2), 117-133 (2000).
- Van Goor, F., Hadida, S., et al. Rescue of CF airway epithelial cell function in vitro by a CFTR potentiator, VX-770. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 106 (44), 18825-18830 (2009).
- Van Goor, F., Hadida, S., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 108 (46), 18843-18848 (2011).
- Accurso, F. J., Rowe, S. M., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).
- Ramsey, B. W., Davies, J., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
- De Boeck, K., Munck, A., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).
- Boyle, M. P., Bell, S. C., et al. A CFTR corrector (lumacaftor) and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 2 (7), 527-538 (2014).
- Wainwright, C. E., Elborn, J. S., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).
- Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B. J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. J Cyst Fibros. 13 (1), 29-36 (2014).
- Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods Mol Biol. 741, 39-54 (2011).
- Randell, S. H., Fulcher, M. L., O’Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
- Karp, P. H., Moninger, T. O., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods Mol Biol. 188, 115-137 (2002).
- Sato, T., Vries, R. G., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., Stange, D. E., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Clevers, H. Modeling development and disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Dekkers, J. F., Wiegerinck, C. L., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Med. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., van der Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1 (1), e27112 (2014).
- Servidoni, M. F., Sousa, M., et al. Rectal forceps biopsy procedure in cystic fibrosis: technical aspects and patients perspective for clinical trials feasibility. BMC gastroenterology. 13, 91 (2013).
- Ommen, D. D. Z. -. V., Vijftigschild, L. A. W., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. 15 (2), 158-162 (2016).
- Dekkers, J. F., Gogorza Gondra, R. A., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. , (2016).
- Dekkers, J. F., Van Mourik, P., et al. Potentiator synergy in rectal organoids carrying S1251N, G551D, or F508del CFTR mutations. J Cyst Fibros. , (2016).
- Dekkers, J. F., Berkers, G., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Sci Transl Med. 8 (344), 344ra84 (2016).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. J Cyst Fibros. 3, 123-126 (2004).
- Sheppard, D. N., Carson, M. R., Ostedgaard, L. S., Denning, G. M., Welsh, M. J. Expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in a model epithelium. Am J Physiol. 266 (4 Pt 1), L405-L413 (1994).
- Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
- Vijftigschild, L. A. W., Berkers, G., et al. β2-adrenergic receptor agonists activate CFTR in organoids and subjects with cystic fibrosis. Eur Respir J. 48 (3), 768-779 (2016).
- Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR in human plasma. J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).
- Graeber, S. Y., et al. Intestinal Current Measurements Detect Activation of Mutant CFTR in Patients with Cystic Fibrosis with the G551D Mutation Treated with Ivacaftor. Am J Respir Crit Care Med. 192 (10), 1252-1255 (2015).
- Van Goor, F., et al. Ivacaftor potentiation of multiple CFTR channels with gating mutations. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the Eur Cyst Fibrosis. 11 (3), 237-245 (2012).
