Форсколин-индуцированной Отек в кишечном органоидов:<em> In Vitro</em> Анализ для оценки ответа на наркотики в больных муковисцидозом
Summary
This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.
Abstract
Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 °C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.
Introduction
CF обусловлена мутацией в муковисцидоз трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) гена , который кодирует эпителиальный канал анион. CF затрагивает около 85 000 человек во всем мире 1. Более 2000 CFTR мутации были идентифицированы ( www.genet.sickkids.on.ca ). Это разнообразие частично объясняет широкий спектр наблюдаемых болезненных фенотипов ( www.CFTR2.org ) 2, 3. Шесть классов CFTR мутаций определяются на основе их влияния на экспрессию CFTR белка и функции: (I) не синтеза, (II) нарушение оборота, (III) литниковой дефектный канал, (IV) изменен проводимости, (V) пониженные уровни нормально функционирование CFTR, и (VI) нарушение клеточной устойчивости поверхности 4. Хотя общие мутации CFTR хорошо изучены, функция CFTR и связь с клиническим статусом остаются poorlу понимается на уровне индивидуума, особенно для большой группы редких "бесхозных" мутаций ( www.CFTR2.org ) 1, 3.
В последнее время препараты были разработаны, которые нацелены на белок CFTR в мутации конкретной моды. Два класса CFTR белка таргетирования препаратов в настоящее время используется в клинической практике и имеют различные способы действия. Потенциаторы, такие как VX-770, повышения открытой вероятность апикально локализованной мутантного CFTR и действовать непосредственно после их добавления к клеткам 5. Корректоры, такие как VX-809, восстановить торговлю эндоплазматического ретикулума локализованы неправильно свернутых CFTR и требуют предварительной инкубации с клетками до воздействия наблюдаются 6. CFTR , потенцирующее, VX-770, было зарегистрировано для субъектов с мутацией G551D 7, 8, а также для восьми другихCFTR стробирования мутации, в том числе S1251N 9; вместе, эти мутации переносятся на 5% всех субъектов МВ. Другие клинические испытания показали , что VX-770, в сочетании с корректором VX-809, имеет ограниченную еще значительное влияние на функцию легких и вызывает снижение темпов обострений у субъектов , гомозиготных по мутации F508del переносимой 45-50% пациентов , 10, 11.
Обычные клинические испытания по выявлению субъектов с наркотиками реагировать в течение оставшихся 50% пациентов с МВ являются дорогостоящими и отнимает много времени и не представляется возможным для людей с крайне редкими CFTR генотипов. Роман, экономически эффективные, персонифицированные методы имеют решающее значение, чтобы соответствовать все большее число CFTR модуляторов для лиц, осуществляющих любые виды мутации CFTR. До сих пор суд включение групп пациентов, несущих специфические мутации CFTR не руководствовался исследований с использованием мутантного гена CFTR трансфекции в часeterologous клеточные системы, за которыми следуют электрофизиологических исследований в Ussing камеры 5, 6, 12. Из – за отсутствия адекватных моделей CF животных, исследования эффективности лекарственного средства в воздушно-жидкостным интерфейсными-дифференцированный бронхиальных эпителиальных клеток , полученных из CF легких эксплантов материалов были использованы для разработки лекарственных средств 13, 14, 15. Тем не менее, ограниченная доступность легких тканей эксплантов и инвазивных процедур для получения бронхиальных клеток от субъектов без терминальной стадии болезни затрудняют анализ менее часто встречающихся мутаций CFTR и предотвратить испытывать снадобья в персонализированным способом. Чтобы преодолеть эти ограничения, «легкий доступ» тканей, таких как колоректальный органоидов, назальных клеток в дыхательных путях и клетки дыхательных путей, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, которые в настоящее время изучаются для персонализированного медикаментозного лечения.
<p class= "jove_content"> Ранее мы разработали протоколы к культуре эпителиальных стволовых клеток из любого органа желудочно – кишечного тракта в виде 3D органоиды 16, 17. Для толстой кишки человека / прямой кишки, условия культивирования, определенные вовлекают факторы роста (эпителиального фактора роста (ЭФР), гастрин, Wnt-3A, R-spondin 3 (Rspo3), и Noggin) в сочетании с малыми молекулами (никотинамид, A83-01, и SB202190) в матрице базальной мембраны. В этих условиях, одиночные стволовые клетки или фрагменты тканей небольшие вырастают из в закрытые, кистозный, 3D структуры, образованные высоко-поляризованного эпителия с базальной стороне, ориентированной в направлении наружу. Все типы клеток, как правило, появляются в их нормальных соотношениях и положениях. Органоидами может быть расширен в течение длительного периода времени путем еженедельного механического разрушения и повторного покрытия. Они генетически и фенотипически стабильны и могут быть сохранены, что позволяет долгосрочное расширение и био-банкинг 17. Они поддаютсявсе стандартные клеточные биологические / генетические манипуляции и аналитические методы , разработанные для клеточных линий 2D 18.Недавно мы показали , что функция CFTR , можно легко измерить в колоректальных органоидам в форсколин-индуцированной набухание (ФИС) анализа 19, 20. При воздействии форсколина (FSK) или, в качестве альтернативы, холерного токсина, органоиды быстро увеличить их циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) уровней, что в свою очередь приводит к открытию канала CFTR 19. Органоидам от здоровых людей, или из субъектов с CFTR мутаций , ассоциированных с остаточной функцией, будет впоследствии набухают в результате ионного и водного транспорта к Органоид просветом, эквивалент в пробирке секреторной диареи. Реакция ФИС колоректального органоидам было показано ранее, является полностью CFTR-зависимой, как указано органоидам, полученных из CFTR-нулевые лицами Анаходим путем использования специфических фармакологических ингибиторов CFTR 19. Большие наборы данных по конкретным темам может быть получена в течение нескольких недель после взятия биопсии.
Для анализа ФИС подробно описаны здесь, органоиды культивируют из ректальных биопсий , которые могут быть получены в любом возрасте , и лишь с ограниченным дискомфорта 21. Органоидами пассируют еженедельно механическим разрушением в отдельных склепах, которые легко Reseal и образуют новые органоиды. Для проведения анализа ФиС, ~ 30-80 из этих маленьких разрушенными органоидам высевают в каждую лунку 96-луночного планшета 19. В день анализа, органоидов окрашивают кальцеин зеленый флуоресцентный клеток проницаемой для красителя, который он удерживается в живых клетках, облегчая живых изображений. Затем Fsk, что повышает внутриклеточный цАМФ и тем самым активирует CFTR, добавляется для того, чтобы стимулировать Органоид отек. Потенциаторы которые действуют на апикальной CFTR одновременно добавляют WIth в форсколин, в то время как корректоры, восстанавливающих оборотом CFTR добавляют 24 ч перед добавлением FSK. Органоид набухание количественно с помощью анализа изображения в автоматическом режиме, который вычисляет относительное увеличение общей площади всех флуоресцентных объектов для каждой временной точки при форсколина дополнение.
3D Органоид набухание обеспечивает преимущества и недостатки по сравнению с существующими электрофизиологических CFTR считываниями в 2D-клетках, культивируемых в дыхательных путях Ussing камер. Основным преимуществом является то, пропускная способность набухать анализа. Клетки культивировали и анализировали с использованием одного типа культуральной среды, и опытный специалист может культура до 25 Органоид образцов на еженедельной основе в то время как количественной оценки приблизительно 1200 точек данных в неделю в течение 12 образцов пациентов. Мы условно ввести одну экспериментальную условие по дублированию или трехкратных измерений на пластину и повторить подобные измерения в трех независимых точках времени инкубации. В общей сложности около 300-500 летИнгл Органоид структуры затем измеряются в экспериментальных условиях, что приводит к очень точные измерения функции CFTR с ограниченной технической изменчивости. Такая точность позволяет четко определить различия в остаточной функции и реакции на CFTR модуляторов и позволяет легко подобрать генетические фоновые эффекты между пациентами , несущих идентичные мутации CFTR 19, 22, 23, 24, 25. Качество данных можно легко оценить с микроскопом изображений. В то время как ФИС полностью CFTR-зависимой, это является косвенным мера результата для функции CFTR, ее считыванием, вызванным взаимодействием транспорта ионов к транспортировке жидкости. Это контрастирует с прямых измерений функции CFTR в Ussing камерах, измеряющих трансэпителиальная ионных токов 26. Ussing камеры позволяют выберите стимуляцию апикальной или базолатеральной Compartments (которых Органоид анализ не позволяет); по permeabilizing базолатеральной мембраны, секреция анион верхушечный CFTR-зависимые могут быть выборочно измерены 27.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы предоставляем полный протокол для поколения, расширения, замораживания и оттаивания колоректального органоидов человека. В то время как мы установившиеся культуры Органоид людских некоторое время назад 17, это иногда оказалось трудно установить технологию в дру?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана программой HIT-CF голландского CF фонда (NCFS), ZonMw (40-00812-98-14103), Вильгельмины Детский фонд научно-исследовательского госпиталя и CZ и Zilverenkruis / Achmea. Мы хотели бы поблагодарить С. Heida-Мишель, М. Geerdink, К. де Винтер-де Гроот и Г. Berkers (кафедра детской пульмонологии, Вильгельмины детской больницы, UMC Utrecht), и RHJ Хоувен (отдел детской гастроэнтерологии, Вильгельмине Детская больница, УМС Утрехт) для приближения к пациентам и получать биопсию для генерации CF Биобанка.
Materials
| Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #12634 | stored at 4 °C |
| GlutaMax | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #35050 | stored at 4 °C |
| Hepes | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | # 15630-056 | stored at 4 °C |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #15140-122 | stored at -20 °C |
| 96 well culture plate | Cellstar | #655180 | |
| 24 well culture plate | Cellstar | #662160 | |
| 6 well culture plate | Cellstar | #657160 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) | Life Technologies: Gibco | #14190-094 | stored at 4 °C |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM) 500ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #31966-021 | For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | #SFBS LOT#11113 | For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C |
| L Wnt3A cell line | ATCC | #CRL-2647 | For Wnt-3A Conditioend Medium Production. |
| TOP/FOP plasmids | Millipore | #17-285 | For measuring Wnt activity |
| pTK-Renilla | Promega | #E2241 | For measuring Wnt activity |
| HEK-293 | ATCC | #CRL-1573 | For measuring Wnt activity |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | #E1910 | For measuring Wnt activity |
| Zeocin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #R250-01 | For Wnt-3A Cell line selection |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #17504-044 | stored at -20 °C |
| N-Acetylcysteine | Sigma Aldrich | #A9165-5G | stored at -20 °C |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | #N0636 | stored at -20 °C |
| Human Epithelial Growth Factor (hEGF) | PrepoTech | #AF-100-15 | stored at -20 °C |
| Gastrin | Sigma Aldrich | #G9145 | stored at -20 °C |
| TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) | Tocris | #2939 | stored at -20 °C |
| Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) | Selleckchem | #S1049 | stored at -20 °C |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma Aldrich | #S7067 | stored at -20 °C |
| Primocin | InvivoGen | #ant-pm-1 | stored at -20 °C |
| Human Noggin (hNoggin) | PrepoTech | #120-10C | stored at -20 °C |
| Human R-spondin 3 (hRspo-3) | R&D Systems | #3500-RS/CF | stored at -20 °C |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | #861987- 250mg | stored at -20 °C |
| Gentamycin | Life Technologies: Gibco | #15710-049 | stored at -20 °C |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | #431788 | Stored at 4 °C |
| Matrigel | Corning | #354230 | stored at -80 °C |
| TryplE Express | Life Technologies: Gibco | #12605-010 | for trypsinizing organoids for freezing |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies: Gibco | #12648010 | for freezing |
| Calcein | Life Technologies: Gibco | #C3100MP | stored at -20 °C |
| Forskolin | R&D Systems | #1099-50 mg | stored at -80 °C |
| Lumacaftor (VX-809) | Selleckchem | #s1565 | stored at -80 °C |
| Ivacaftor (VX-770) | Selleckchem | #s1144 | stored at -80 °C |
| Name of Reagents/Material | Solvent | Stock Concentration | Final Concentration |
| GlutaMax | 200 mM | 2m M | |
| Hepes | 1 M | 10 mM | |
| Penicillin/Streptomycin | 10K U/ml 10K µg/ml | 100 U/ml 100 µg/ml | |
| Zeocin | 100 mg/ml | 125 µg/ml | |
| B27 supplement | 100 x | 1 x | |
| N-Acetylcysteine | MiliQ H20 | 500 mM | |
| Nicotinamide | DPBS | 1 M | 10 mM |
| Human Epithelial Growth Factor (hEGF) | DPBS 0.1%BSA | 0.5 mg/ml | 50 ng/ml |
| Gastrin | DPBS | 100 µM | 10 nM |
| TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) | DMSO | 5 mM | 500 nM |
| Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) | DMSO | 10 mM | 10 µM |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | DMSO | 30 mM | 10 µM |
| Primocin | 50 mg/ml | 100 µg/ml | |
| Human Noggin (hNoggin) | DPBS 0.1%BSA | 100 µg/ml | 100 ng/ml |
| Human R-spondin 3 (hRspo-3) | varies per lot | 300 ng/ml | |
| Vancomycin | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
| Gentamycin | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | MiliQ H20 | 0.5 M | 2 mM |
| Calcein | DMSO | 10 µg/ml | 3.3 ng/ml |
| Forskolin | DMSO | 10 mM | variable |
| Lumacaftor (VX-809) | DMSO | 20 mM | variable |
| Ivacaftor (VX-770) | DMSO | 20 mM | variable |
References
- De Boeck, K., Amaral, M. D. Progress in therapies for cystic fibrosis. Lancet Respir Med. 4 (8), 662-674 (2016).
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Rev Genet. 16 (1), 45-56 (2015).
- Sosnay, P. R., Siklosi, K. R., et al. Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene. Nature Genet. 45 (10), 1160-1167 (2013).
- Zielenski, J. Genotype and phenotype in cystic fibrosis. Respiration. 67 (2), 117-133 (2000).
- Van Goor, F., Hadida, S., et al. Rescue of CF airway epithelial cell function in vitro by a CFTR potentiator, VX-770. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 106 (44), 18825-18830 (2009).
- Van Goor, F., Hadida, S., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 108 (46), 18843-18848 (2011).
- Accurso, F. J., Rowe, S. M., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).
- Ramsey, B. W., Davies, J., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
- De Boeck, K., Munck, A., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).
- Boyle, M. P., Bell, S. C., et al. A CFTR corrector (lumacaftor) and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 2 (7), 527-538 (2014).
- Wainwright, C. E., Elborn, J. S., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).
- Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B. J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. J Cyst Fibros. 13 (1), 29-36 (2014).
- Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods Mol Biol. 741, 39-54 (2011).
- Randell, S. H., Fulcher, M. L., O’Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
- Karp, P. H., Moninger, T. O., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods Mol Biol. 188, 115-137 (2002).
- Sato, T., Vries, R. G., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., Stange, D. E., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Clevers, H. Modeling development and disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Dekkers, J. F., Wiegerinck, C. L., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Med. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., van der Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1 (1), e27112 (2014).
- Servidoni, M. F., Sousa, M., et al. Rectal forceps biopsy procedure in cystic fibrosis: technical aspects and patients perspective for clinical trials feasibility. BMC gastroenterology. 13, 91 (2013).
- Ommen, D. D. Z. -. V., Vijftigschild, L. A. W., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. 15 (2), 158-162 (2016).
- Dekkers, J. F., Gogorza Gondra, R. A., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. , (2016).
- Dekkers, J. F., Van Mourik, P., et al. Potentiator synergy in rectal organoids carrying S1251N, G551D, or F508del CFTR mutations. J Cyst Fibros. , (2016).
- Dekkers, J. F., Berkers, G., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Sci Transl Med. 8 (344), 344ra84 (2016).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. J Cyst Fibros. 3, 123-126 (2004).
- Sheppard, D. N., Carson, M. R., Ostedgaard, L. S., Denning, G. M., Welsh, M. J. Expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in a model epithelium. Am J Physiol. 266 (4 Pt 1), L405-L413 (1994).
- Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
- Vijftigschild, L. A. W., Berkers, G., et al. β2-adrenergic receptor agonists activate CFTR in organoids and subjects with cystic fibrosis. Eur Respir J. 48 (3), 768-779 (2016).
- Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR in human plasma. J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).
- Graeber, S. Y., et al. Intestinal Current Measurements Detect Activation of Mutant CFTR in Patients with Cystic Fibrosis with the G551D Mutation Treated with Ivacaftor. Am J Respir Crit Care Med. 192 (10), 1252-1255 (2015).
- Van Goor, F., et al. Ivacaftor potentiation of multiple CFTR channels with gating mutations. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the Eur Cyst Fibrosis. 11 (3), 237-245 (2012).
