Protokollen nedenfor beskriver metoden til: microplastics prøvetagning på havoverfladen, adskillelse af microplastic og kemisk identifikation af partikler. Denne protokol er i tråd med anbefalingerne for microplastics overvågning udgivet af havstrategirammedirektivet Tekniske Undergruppe på Marine kuld.
Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of scientific publications address microplastic pollution of the sea surface. The protocol below describes the methodology for sampling, sample preparation, separation and chemical identification of microplastic particles. A manta net fixed on an »A frame« attached to the side of the vessel was used for sampling. Microplastic particles caught in the cod end of the net were separated from samples by visual identification and use of stereomicroscopes. Particles were analyzed for their size using an image analysis program and for their chemical structure using ATR-FTIR and micro FTIR spectroscopy. The described protocol is in line with recommendations for microplastics monitoring published by the Marine Strategy Framework Directive (MSFD) Technical Subgroup on Marine Litter. This written protocol with video guide will support the work of researchers that deal with microplastics monitoring all over the world.
Microplastic pollution in the sea represents a growing concern to contemporary society, due to the constant increase in plastic production and its subsequent disposal and accumulation in the marine environment1. Even if plastic macro litter would no longer enter the seas, microplastic pollution would continue to grow due to fragmentation of already existing plastic litter in the sea2. The majority of microplastic pollution studies were carried out in marine and fresh water ecosystems and mainly addressed sea surface pollution3.
The term microplastic refers to plastic particles smaller than 5 mm in size4. This term describes a heterogeneous mixture of particles, which can differ in size (from a few microns to several millimeters), color and shape (from very different shapes of fragments to long fibers). Microplastic particles can be of a primary or secondary origin5. Microplastic of primary origin is manufactured as small particles used in the cosmetics industry (pilling crème etc.) or chemical industry as precursor for other plastic products (e.g. plastic pellets used in plastic industry). Microplastic of secondary origin arise via the degradation of larger plastic pieces in the environment due to physical and chemical processes, induced by light, heat, oxygen, water and organisms6. In 2015, four types of microplastic sources were defined: larger plastic litter, cleaning products, medicines and textiles6. The main source (80 %) of larger plastic litter is assumed to be land based7. Microplastic from cosmetic products, medicines and textile enters water ecosystems through sewage and storm waters6. Microplastic particles most frequently found in water ecosystems are fragments from larger plastic litter and textile fibers8.
Microplastics have several negative effects on the environment. Their small size allows them to enter the food web through ingestion by marine organisms9, 10. Ingested particles can cause physical damage or block the digestive system of animals11. Particles can also be carriers of persistent organic pollutants (POPs). Their hydrophobic surface and favorable ratio of large surface area to small volume, enables POPs to adsorb onto the microplastics12. In the environment or digestive systems of animals who ingest them, POPs and other plastic additives can be leached from microplastic particles13.
Previous studies reported the ubiquitous presence of microplastics in the marine environment3, from the water column to the bottom sediments. The threat of microplastic pollution was already identified by the Marine Strategy Framework Directive in the EU and, consequently, mandatory monitoring of microplastics was advised14. Accordingly, the EU Technical Subgroup on Marine Litter (TSG-ML) prepared recommendations for monitoring of microplastics in the European seas15. Thus, the video guidelines for microplastics sampling are of high importance, as they support comparative monitoring and a coherent management process all over the world.
This protocol was developed within the DeFishGear project for the first monitoring of microplastic pollution in the Adriatic Sea. Recommendations from the document “Guidance on Monitoring of Marine Litter in European Seas” by TSG-ML15 were taken into account. This protocol describes the methodology for microplastics sampling on the sea surface, separation of microplastics from the samples, and chemical analysis of microplastic particles to confirm that particles are from plastic material and to identify the type of plastic. Sampling was done by the use of a manta net, which is the most suitable equipment for sampling in calm waters16. Separation of microplastics from the samples was carried out by visual identification using a stereomicroscope. Isolated particles were later chemically identified using Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and micro FTIR spectroscopy.
Microplastics prøvetagning på havoverfladen ved manta nettet er et meget anvendt til prøveudtagning af microplastics på havoverfladen, men til dato har der ikke været nogen samlet metodologi. En stor mængde vand kan filtreres gennem manta net, således muligheden for klemning et relevant antal microplastics er høj, og resultaterne opfattes at være pålidelige. Sammenlignelighed af resultater blandt forskellige prøver sikres ved normalisering. I vores tilfælde blev koncentrationer relateret til den samplede område ved at gange trawl afstand af den horisontale bredde af nettet åbning. En anden mulighed er at bruge en flowmåler, fastsat til nettet åbning. Anvendelsen af et flowmeter er muligt, fordi den manta nettet med sine laterale vinger er meget stabil på havoverfladen og derfor hopping på bølgerne er minimal. En flowmåler registrerer mængden af filtreret vand og dermed muliggør en normalisering af resultater pr volumen samplet vand 16.
<p class="jove_content"> De hyppigst anvendte manta net har omkring 300 um maskestørrelse og er 3-4,5 m lang. Disse dimensioner blev optimeret for at undgå tilstopning af nettet og for at tillade prøveudtagning en mængde vand så stor som muligt. Trawling hastighed anbefales at være mellem 2 – 3 i knob, men den er afhængig af bølgehøjde, vindhastighed og havstrømme. Det er meget vigtigt, at manta nettet er under opsyn hele tiden under prøvetagning og hvis det begynder hopping, skal anvende trawl hastigheden reduceres. Det anbefales at trawlfiskeri tid til at være omkring 30 minutter, men afhænger af seston koncentrationer. Det kan ske, at seston sommetider træsko manta nettet. I dette tilfælde har trawlfiskeri skal stoppes omgående, ellers microplastic partikler kan gå tabt, og nettet kan blive beskadiget. Manta net er den mest ofte fastsat fra den side af fartøjet. Dette er også den mest egnede løsning, mens manta nettet er sikkert ude af kølvandet zone. I nogle undersøgelser manta netto blev fastsat fra agterende17, 18, men i så fald er du nødt til at være sikker på, at nettet er ud af kølvandet zone. Afstanden, som trawlet er indstillet til prøveudtagning, skal bestemmes individuelt, eftersom den zone af turbulens forårsaget af fartøjet varierer fra størrelsen af fartøjet og ved den hastighed af båden 19, 20.Adskillelse af microplastic partikler fra havoverfladen prøverne er oftest gjort netop ved visuel identifikation 21. Partikler større end 1 mm kan identificeres let med det blotte øje, mens partikler mindre end 1 mm kræver brug af et stereomikroskop. For at reducere muligheden for forvirrende ikke-plast partikler med plastic dem, ved hjælp af polarisering lys på stereomikroskoper anbefales. Muligheden for fejlagtig identifikation af plast partikler bliver højere med mindre partikler. Således partikler> 0,5 mm kan kun identificeres visuelt 21, ved anvendelse af stereomikroskop. For partikler mindre end 0,5 mmen ekstra, mere præcis metode er nødvendig f.eks micro ATR-FTIR spektroskopi 21.
Under processen med microplastics adskillelse fra prøven muligheden for kontaminering prøve med de luftbårne filamenter er meget høj. Af denne grund, styre petriskåle efterladt åben på arbejdsbordet er stærkt anbefales til identifikation af potentielle forurenende luftbårne partikler. Nemlig, at kvaliteten af de data, afhænger meget af: 1) præcisionen af den person, der arbejder med prøven, 2) kvalitet og forstørrelse af stereomikroskop, og 3) mængden af organisk stof i prøven 16. Efter visuel identifikation anbefales det kraftigt at analysere de sorterede partikler med en af de tilgængelige teknikker til kemisk identifikation af materialet 8.
Der findes flere metoder til polymer identifikation, blandt hvilke FTIR spektroskopi og Raman spektroskopi er de fleste freTly brugt 22. FTIR og Raman-spektroskopi er komplementære teknikker og deres nøjagtighed er ens. I vores protokol, er FTIR og mikro FTIR spektroskopi med "svækket total reflektans" (ATR) præsenteres. De er enkel at bruge og de gør det muligt hurtige og præcise resultater. Plastpolymerer besidder særdeles specifik infrarød (IR) spektre med distinkte båndmønstre, hvilket gør IR-spektroskopi en optimal teknik til identificering af microplastics 21. Energien af IR-stråling ophidser en specifik molekylær vibration, når interagere med en prøve, som gør det muligt at måle karakteristiske IR spektre 22. FTIR spektroskopi kan også give yderligere oplysninger om partikler, såsom intensiteten af oxidation 23 og niveau af nedbrydning 24. Mens ATR-FTIR er velegnet til kemisk identifikation af større partikler (> 0,5 mm), kan mikro ATR-FTIR spektroskopi giver oplysninger om den kemiske struktur af partikler & #60; 0,5 mm, da det kombinerer funktionen af et mikroskop og et infrarødt spektrometer.
Før du bruger FTIR og mikro FTIR spektroskopi, microplastic partikler skal forinden tørret, da vand kraftigt absorberer IR-stråling 22, og renset, hvis de er dækket med biofilm og / eller andre organiske og uorganiske tilhængere, som kan påvirke IR-spektre. Den mest ikke-invasiv måde at oprense prøverne er ved omrøring og skylning med ferskvand 25. Hvis dette ikke er nok, så anbefales brug af 30% hydrogenperoxid. Alle andre metoder kan have negative virkninger på de microplastic partikler (f.eks ultralyds rengøring kan yderligere bryde partikler, kan stærkt sure eller alkaliske opløsninger skade flere plastikpolymerer mv) og dermed deres anvendelse ikke anbefales. Mere lovende er anvendelsen af en sekventiel enzymatisk fordøjelse som en plast venlig oprensningstrin. Oprensning ved hjælp af forskellige tekniske enzymer (f.eks lipase, enmylase, proteinase, chitinase, cellulase, proteinase-K) er blevet anvendt med succes til at reducere en biologisk matrix af plankton og dermed vist sig at være en værdifuld teknik til at minimere matrix artefakter under FTIR spektroskopi målinger 22.
Adskillelse af microplastics ved visuel identifikation og kemisk identifikation af udvalgte partikler er begge ekstremt tidskrævende processer. Dette arbejde skal udføres af en nøjagtig og tålmodig person, der har erfaring med stereomikroskoper, ikke blot i at anerkende plast partikler, men også i erkendelse biologisk materiale. Selv en erfaren person kan ikke diskriminere alle potentielle microplastic partikler utvetydigt af chitin eller diatoméarter fragmenter 22. Derfor fejlraten af visuel sortering i området fra 20% 26 til 70% 21 og stiger med faldende partikelstørrelse.
The authors have nothing to disclose.
Udviklingen af denne protokol blev grundlagt af IPA Adriatic grænseoverskridende samarbejdsprogram 2007-2013, inden for DeFishGear projektet (1 ° str / 00010).