Summary
हम रेटिना की सतह के समानांतर सेक्शनिंग के विमान के साथ वयस्क स्तनधारी रेटिना के एक क्षैतिज टुकड़ा तैयारी विकसित की है। nonradially उन्मुख रेटिना न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान क्षेत्रों छोटा नहीं कर रहे थे, पैच दबाना और इमेजिंग तकनीक के साथ सिग्नल प्रोसेसिंग के अध्ययन की अनुमति।
Abstract
कार्यक्षेत्र टुकड़ा तैयारी अच्छी तरह से वयस्क स्तनधारी रेटिना में circuitry और संकेत संचरण अध्ययन करने के लिए स्थापित कर रहे हैं। इन तैयारियों में सेक्शनिंग के विमान रेटिना की सतह को सीधा है, यह फोटोरिसेप्टर और द्विध्रुवी कोशिकाओं की तरह त्रिज्यात उन्मुख न्यूरॉन्स के अध्ययन के लिए आदर्श बना रही है। हालांकि, क्षैतिज कोशिकाओं, व्यापक क्षेत्र amacrine कोशिकाओं, और नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के बड़े वृक्ष के समान arbors ज्यादातर छोटा हैं, इन कोशिकाओं में स्पष्ट रूप से कम synaptic गतिविधि को छोड़कर। नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं और विस्थापित amacrine कोशिकाओं रेटिना की एक पूरी मुहिम शुरू की तैयारी में अध्ययन किया जा सकता है, जबकि, क्षैतिज कोशिकाओं और amacrine भीतर परमाणु परत में स्थित कोशिकाओं केवल खराब पूरे रेटिना के ऊतकों में इलेक्ट्रोड के लिए पहुंच रहे हैं।
अधिकतम पहुंच और synaptic अखंडता को प्राप्त करने के लिए, हम माउस रेटिना के एक क्षैतिज टुकड़ा तैयारी विकसित की है, और फोटोरिसेप्टर और क्षैतिज के बीच अन्तर्ग्रथन में संकेत संचरण का अध्ययनकोशिकाओं। क्षैतिज सेक्शनिंग क्षैतिज सेल डेन्ड्राइट को बरकरार है और कार्यात्मक कोन synaptic इनपुट के लिए एक शर्त के रूप में, (1) आसान और स्पष्ट इलेक्ट्रोड लक्ष्य-निर्धारण के लिए क्षैतिज सेल शरीर के दृश्य पहचान, और (2) विस्तारित क्षैतिज सेल वृक्ष के समान क्षेत्रों के संरक्षण के लिए अनुमति देता है।
क्षैतिज स्लाइस से क्षैतिज कोशिकाओं अंधेरे में टॉनिक synaptic गतिविधि का प्रदर्शन किया है, और वे आवक वर्तमान और कम synaptic गतिविधि की कमी के साथ प्रकाश की चमक जानकारी देने के लिए प्रतिक्रिया व्यक्त की। Immunocytochemical सबूत इंगित करता है कि एक क्षैतिज सेल के वृक्ष के समान क्षेत्र के भीतर लगभग सभी शंकु अपने परिधीय डेन्ड्राइट के साथ synapses की स्थापना। क्षैतिज टुकड़ा तैयारी इसलिए अच्छी तरह से चयनित synapses पार क्षैतिज बढ़ाया रेटिना न्यूरॉन्स के शारीरिक गुणों के साथ ही संवेदी संकेत संचरण और एकीकरण का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है।
Introduction
विजुअल जानकारी फोटोरिसेप्टर सक्रियण के एक गतिशील स्थानिक-सामयिक पैटर्न के रूप में कोडित है, और फोटोरिसेप्टर और दूसरे क्रम न्यूरॉन्स के बीच रिबन अन्तर्ग्रथन दृश्य सूचना के बहाव के हस्तांतरण निर्धारित करता है। स्तनधारी रेटिना के ऊर्ध्वाधर टुकड़ा तैयारी, खड़ी रास्ते में सिग्नल प्रोसेसिंग अध्ययन करने के लिए यानी फोटोरिसेप्टर और द्विध्रुवी कोशिकाओं के बीच, और द्विध्रुवी कोशिकाओं और amacrine सेल 1, 2, 3, 4 के कुछ प्रकार के बीच एक बेहद महत्वपूर्ण उपकरण है।
हालांकि, खड़ी सेक्शनिंग हमेशा की तरह, कई रेटिना न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान क्षेत्रों के गंभीर ट्रंकेशन का कारण बनता है synaptic संपर्कों का काफी नुकसान के लिए अग्रणी। विशेष रूप से बाहरी रेटिना में क्षैतिज कोशिकाओं उनके laterally फैल बढ़ाया वृक्ष के समान क्षेत्रों और अक्षतंतु टर्मिनल सिस्टम 5 की वजह से प्रभावित कर रहे हैं। एक ऊर्ध्वाधर मेंटुकड़ा तैयारी, एक क्षैतिज सेल के डेन्ड्राइट के लिए कोन फोटोरिसेप्टर टर्मिनलों के सैकड़ों synaptic इनपुट इस प्रकार कुछ विरल संपर्क करने के लिए कम है। यह synapses व्यक्ति के गुणों का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त हो सकता है, लेकिन किसी भी तरह से सिग्नल प्रोसेसिंग फोटोरिसेप्टर रिबन synapses के सिंक्रनाइज़ सक्रियण अंतर्निहित क्षमताओं का प्रतिनिधित्व करता है।
इसलिए हम एक क्षैतिज टुकड़ा तैयारी है, जो बरकरार है और कार्यात्मक क्षैतिज सेल डेन्ड्राइट के लिए लगभग सभी कोन फोटोरिसेप्टर की synaptic इनपुट के पत्तों का विकास किया। सेक्शनिंग रन के विमान रेटिना की सतह के समानांतर, आदर्श क्षैतिज कोशिकाओं और amacrine कोशिकाओं के बीच भीतर परमाणु परत के माध्यम से काटने। इस प्रकार, बाहरी रेटिना की क्षैतिज स्लाइस युक्त बनाई गई हैं, प्रेस्य्नाप्तिक साइट पर, भीतरी और बाहरी क्षेत्रों के साथ-साथ synaptic टर्मिनलों, और क्षैतिज कोशिकाओं और द्विध्रुवी कोशिकाओं पोस्टअन्तर्ग्रथनी साइट पर साथ फोटोरिसेप्टर। यह तैयारी अच्छी तरह से टी अनुकूल हैओ इसकी वृक्ष के समान क्षेत्र के भीतर सभी कोन फोटोरिसेप्टर से क्षैतिज सेल dendrites में समन्वित अन्तर्ग्रथनी आदानों की जाँच। यह इस तरह बेहतर फोटोरिसेप्टर रिबन अन्तर्ग्रथन, जो फोटोरिसेप्टर सक्रियण के मैट्रिक्स से दृश्य सूचना के हस्तांतरण के एक पोस्टअन्तर्ग्रथनी प्रतिक्रिया में के लिए महत्वपूर्ण है के कामकाज को समझने के लिए उपयोगी साबित हो सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
सभी प्रक्रियाओं जर्मनी के संघीय गणराज्य द्वारा जारी किए गए पशु प्रयोगों के लिए दिशा-निर्देशों के अनुसार किया गया था।
नोट: क्योंकि रेटिना ऊतक इस प्रक्रिया के लंबे समय तक भागों के दौरान ऑक्सीजन से रहित हो जाएगा, सभी कदम के रूप में तेजी से संभव के रूप में बाहर किया जाना चाहिए। चूहे काले अनुकूलित विच्छेदन पहले कम से कम 3 घंटा होना चाहिए। रेटिना, तैयारी की रोशनी से बचने के लिए अनुकूलन और टुकड़ा करने की क्रिया मंद लाल बत्ती के तहत बाहर किया जाना चाहिए।
1. मीडिया और अन्य रसायनों की तैयारी
- एम्स 'मध्यम 6 तैयार करें। विच्छेदन के बाद, हर समय एम्स 'मध्यम में रेटिना ऊतक विसर्जित कर दिया।
- एम्स 'मध्यम से 2.2 जी और 250 मिलीलीटर आसुत जल में 298 मिलीग्राम HEPES भंग। HEPES की एकाग्रता 5 मिमी होना होगा। धीरे हलचल जब तक सभी कणों भंग कर रहे हैं।
- carbogen के साथ कमरे के तापमान पर बुलबुला एम्स 'मध्यम (95% ऑक्सीजन, 5% कारबॉन डाइऑक्साइड) में कम से कम 5 मिनट के लिए। समाधान के लिए एक गिलास पाश्चर विंदुक के साथ आपूर्ति carbogen। गैस नियामक के आउटलेट के लिए उचित ट्यूबिंग के माध्यम से पाश्चर विंदुक कनेक्ट करें।
- समाधान के लिए 475 मिलीग्राम सोडियम बिकारबोनिट जोड़ें। बुदबुदाती के बाद बाइकार्बोनेट के अलावा कैल्शियम कार्बोनेट की वर्षा से बचाता है।
- कम तापमान बीच बढ़िया तालमेल agarose तैयार करें। Agarose vibratome सेक्शनिंग दौरान रेटिना ऊतक के embedding के लिए आवश्यक है।
- 9 मिलीलीटर एम्स 'मध्यम में 180 मिलीग्राम agarose और 1 मिलीलीटर आसुत जल भंग। एक माइक्रोवेव का उपयोग धीरे-धीरे agarose समाधान गर्म करने के लिए जब तक सभी ठोस भंग कर रहे हैं। 5 में हीट - 10 सेकंड के वेतन वृद्धि बाढ़ से बचने के लिए। समाधान स्पष्ट और पारदर्शी होना चाहिए।
- स्टोर प्रक्रिया की अवधि के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नहाने के पानी में agarose भंग कर दिया।
2. Vibratome की स्थापना
नोट: सभी सेक्शनिंग के साथ बाहर किया गया हैvibratome सामग्री तालिका में सूचीबद्ध है। दिया सेटिंग्स केवल vibratome के इस प्रकार के लिए देखें। तंत्रिका ऊतक के vibratome सेक्शनिंग पर आगे की जानकारी के लिए कृपया संदर्भ के लिए 7 देखें।
- vibratome इंजेक्टर ब्लेड ब्लेड धारक में रखें।
- "Vibrocheck" डिवाइस के साथ ब्लेड के ऊर्ध्वाधर विक्षेपन उपाय। ब्लेड झुकाव के लिए जब तक यह काटने विमान के समानांतर है ब्लेड धारक पर समायोजन पेंच का प्रयोग करें। ब्लेड की सटीक स्थिति अनुभाग सतह पर वेनिस अंधा प्रभाव को रोकने के लिए और एक फ्लैट खंड इसकी सतह पर जीवित कोशिकाओं में शामिल है कि उत्पादन के लिए आवश्यक है।
- निम्नलिखित सेटिंग्स को vibratome सेट: आयाम, 1.00; गति, 0.20; मोटाई, 180 - 200 माइक्रोन।
3. माउस रेटिना के विच्छेदन
- एक एयर टाइट कंटेनर में लगभग 1 मिलीलीटर isoflurane के वाष्पीकरण द्वारा चतनाशून्य वयस्क C57BL / 6 माउस। जब संज्ञाहरण पूरा हो गया है, ग्रीवा अव्यवस्था से पशु euthanize।माउस से अधिक उम्र के 3 महीने के लिए नहीं होना चाहिए, अन्यथा स्लाइस की गुणवत्ता खराब हो जाएगा।
- आंखों के नीचे एक घुमावदार संदंश रखकर आंख गेंद निकालें। धीरे आंख गेंद को ऊपर उठाने ऑप्टिक तंत्रिका का खुलासा होगा। एक वसंत कैंची के साथ ऑप्टिक तंत्रिका कट और एक 35 मिमी पेट्री युक्त 2 मिलीलीटर एम्स 'मध्यम डिश के लिए आंख गेंद हस्तांतरण।
- एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के मंच पर बाद के सभी चरणों को बाहर ले। कि निम्न कार्यविधियों (- 3.9 कदम 3.4) का इष्टतम दृश्य नियंत्रण की अनुमति देता है एक मूल्य के लिए बढ़ाई समायोजित करें।
- बताया संदंश के साथ श्वेतपटल या एक 20 जी सुई के लिए संक्रमण पर कॉर्निया पंचर। इस कदम के दौरान, एक और संदंश के साथ आंख गेंद स्थिर। puncturing डिवाइस के साथ रेटिना को नुकसान नहीं सावधान रहें।
- 3.3 कदम में किए गए छोटे से छेद में वसंत कैंची डालें और कॉर्निया चारों ओर एक घेरे में कटौती। फिर, जबकि काटने संदंश के साथ आंख गेंद स्थिर। चीरा बहुत क्रम में सतह के करीब ग के लिए नहीं रखेंरेटिना में संघ राज्य क्षेत्र।
- ध्यान से संदंश के साथ कॉर्निया, लेंस, और कांच का शरीर को हटा दें। कांच का शरीर आंखों के पीछे केवल एक पतली पारदर्शी परत शामिल हैं। हालांकि, यह vibratome सेक्शनिंग कि कांच का शरीर पूरी तरह से हटा दिया जाता है के लिए आवश्यक है।
- पेट्री डिश में, एक ही रास्ता है कि एक रेटिना पर नीचे छेद के माध्यम से लग रहा है में eyecup स्थिति। उद्घाटन के रिम scleral ऊतक केवल से मिलकर चाहिए। अगर परिपत्र कटौती (3.4 कदम) भी eyecup की भूमध्य रेखा के करीब बाहर किया गया है, रेटिना ऊतक भी चीरा करने के लिए उपस्थित करीब हो जाएगा। सावधान तो 3.8 चरण में रेटिना को नुकसान नहीं हो।
- संदंश के साथ श्वेतपटल ले लो और ध्यान से ऊतक फाड़। यह इस चरण के दौरान रेटिना टूटना करने के लिए आवश्यक नहीं है। यदि आवश्यक हो, संदंश के साथ ऊतक के scleral हिस्सा steadying और ध्यान से अन्य संदंश के साथ रेटिना बंद छीलने द्वारा ओरा सेराटा से रेटिना अलग। संदंश बंद रखें; कभी नहीं फिर से संभालऊतक के बाद से संदंश के साथ टीना बहुत नरम है और जिस तरह से तुरंत दे देंगे।
नोट: इस चरण में, रेटिना और eyecup के बाकी केवल ऑप्टिक तंत्रिका सिर पर जोड़ा जाएगा। - वसंत कैंची से ऑप्टिक तंत्रिका सिर पर कुर्की साइट कट। रेटिना अब स्वतंत्र रूप से एम्स 'मध्यम में ऊतक का एक टुकड़ा के रूप में चल जाना चाहिए।
- संदंश के साथ किनारों के साथ रेटिना पकड़े, स्थिति में हेरफेर करने के द्वारा एक घुमावदार स्केलपेल ब्लेड का उपयोग लगभग 23 मिमी 6 छोटे आयतों - 4 में रेटिना कट। आयतों के भीतर रेटिना ऊतक बन्द रखो बचें। रेटिना, नहीं दूर परिधि के मध्य भाग से टुकड़े ले लो।
- एक 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश के लिए एक बड़े व्यास प्लास्टिक पाश्चर विंदुक के साथ रेटिना टुकड़े स्थानांतरण, जिनमें से नीचे ग्रिड 1 मिमी से कम आकार के साथ एक जाल द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है। एक बीकर या शंक्वाकार कुप्पी के ऊपरी सिरे भीतर पेट्री डिश को ठीक और एम्स 'मध्यम बू में रेटिना टुकड़े डूबcarbogen साथ bbled।
4. agarose में रेटिना मोहरे के embedding
- एम्स 'मध्यम से कुछ के साथ एक साथ एक 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में 3 रेटिना टुकड़े - ध्यान से 2 हस्तांतरण। यह सबसे हस्तांतरण के लिए एक बड़े व्यास प्लास्टिक पाश्चर विंदुक का उपयोग करने के लिए सुविधाजनक है। इस चरण में, रेटिना के टुकड़े की सही उन्मुखीकरण फर्क नहीं पड़ता।
- शेष एम्स 'मध्यम से जितना संभव हो उतना हटाये एक गिलास पाश्चर विंदुक के साथ। जैसे ही तरल पदार्थ हटा दिया गया कदम 4.3 के साथ आगे बढ़ें। रेटिना ऊतक सूखी मत देना।
- तुरंत (37 डिग्री सेल्सियस) agarose भंग के 2 मिलीलीटर के साथ रेटिना टुकड़े को कवर किया। आकार कदम 3.10 में उल्लेख देखते हुए टुकड़े agarose भीतर कर्ल नहीं होंगे।
- तरल agarose के भीतर, धीरे पेट्री डिश के नीचे करने के लिए रेटिना के टुकड़े धक्का। नाड़ीग्रन्थि सेल परत नीचे का सामना करना पड़ जाना चाहिए। सही स्थिति के फैसले के लिए एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। स्थिति के लिए, रेटिना गड़बड़ी संभालएक छोटा सा रंग के साथ eces। रेटिना के रूप में तेजी है और संभव के रूप में सटीक बाद agarose जल्दी से स्थिर करना होगा स्थिति।
- रेटिना टुकड़े कांच डिश के तल के समानांतर व्यवस्थित; अन्यथा वर्गों स्पर्शरेखा या परोक्ष होगा। व्यक्तिगत टुकड़े एक दूसरे को स्पर्श नहीं करना चाहिए, लेकिन यह भी बहुत दूर नहीं होना चाहिए। रेटिना टुकड़े और अधिक या एक ही क्षैतिज स्तर पर कम जगह की कोशिश करो।
- कम से कम 2 मिनट के लिए - (6 डिग्री सेल्सियस 4) फ्रिज में एम्बेडेड रेटिना टुकड़े के साथ कांच पेट्री डिश में डाल दिया। यह जल्दी से आगे की प्रक्रिया के लिए agarose कठोर होगा। जैसे ही agarose polymerized गया है अगले कदम के साथ आगे बढ़ें।
5. रेटिना मोहरे के बढ़ते
- ध्यान agarose पेट्री डिश से रेटिना टुकड़ों से युक्त ब्लॉक को हटा दें। कांच से agarose ब्लॉक उठाने के लिए एक रंग या एक इसी तरह के उपकरण का प्रयोग करें। चिपकने वाला बलों के कारण, यह बाहर बारी के लिए काफी मुश्किल हो सकता है। हालांकि, तोड़ने से बचनेagarose ब्लॉक। कमरे के तापमान पर इस और बाद के सभी चरणों को बाहर ले।
- एक गिलास coverslip पर agarose ब्लॉक प्लेस और एक स्केलपेल ब्लेड के साथ अपने आकार को समायोजित। रेटिना टुकड़े के प्रत्येक पक्ष पर agarose 2 मिमी - 1 छोड़ दें। ब्लॉक के अंतिम आकार लगभग 1,066 मिमी होना चाहिए (10 मिमी ब्लॉक, अपनी बढ़त लंबाई करने के लिए 6 मिमी की ऊंचाई को संदर्भित करता है)।
- एक पल चिपकने का उपयोग vibratome का नमूना धारक को agarose ब्लॉक गोंद। रेटिना के टुकड़े, इसकी सतह के लिए 10 मिमी उच्च ब्लॉक के ऊपर और उन्मुख समानांतर पर स्थित होना चाहिए, जबकि नीचे धारक को चिपका है।
- vibratome के बफर ट्रे में पहले से bubbled एम्स 'मध्यम गिरने से तुरंत ब्लॉक कवर।
6. क्षैतिज vibratome वर्गों की तैयारी
- सेक्शनिंग शुरू करो। सबसे पहले, मैन्युअल टुकड़ा करने की क्रिया की मोटाई निर्धारित जब तक रेटिना ऊतक के टुकड़े टुकड़ा में दिखाई देते हैं। तो 2.3 कदम में सेटिंग्स के लिए बदल जाते हैं। के बाद सेमाउस रेटिना के बारे में केवल 200 माइक्रोन मोटी है, वहाँ कोई 2 से अधिक हो जाएगा - agarose ब्लॉक प्रति स्लाइस 3।
- एक गिलास छड़ी के साथ बफर ट्रे से वर्गों निकालें और एक 35 मिमी पेट्री डिश में 2 मिलीलीटर एम्स 'मध्यम के लिए उन्हें स्थानांतरित।
- तुरंत 37 डिग्री सेल्सियस (5% सीओ 2/55% हे 2) पर एक मशीन में स्टोर वर्गों। वर्गों आसपास agarose इनक्यूबेटर में ठोस रहना होगा और रेटिना को नुकसान पहुँचाए बिना वर्गों को संभालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। बेहतर गुणवत्ता टुकड़ा जब आरटी पर ऑक्सीजन एम्स 'मध्यम की तुलना में संबंधित वातावरण के भीतर 37 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण प्राप्त की है। धारा तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या अच्छा शारीरिक परिणामों के साथ इनक्यूबेटर में 4 घंटा के लिए भंडारित किया जा सकता है।
- 6 - agarose और दोहराने की धारा 4 में अगले रेटिना टुकड़े शामिल करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
माउस रेटिना की क्षैतिज स्लाइस में, क्षैतिज सेल निकायों आसानी से कई प्राथमिक एक बहुभुज सेल शरीर (चित्रा 1 ए) से उभर डेन्ड्राइट के साथ अपनी अनूठी आकृति विज्ञान के अनुसार पहचाना जा सकता है। क्षैतिज सेल टुकड़ा की सतह के निकट स्थित शव पैच दबाना इलेक्ट्रोड के लिए नियमित रूप से सुलभ थे। रिकॉर्डिंग के दौरान कोशिकाओं को एक फ्लोरोसेंट रंजक से भर गए, उनके जटिल वृक्ष के समान द्रुमायण, जो निकट बरकरार माउस रेटिना 8 (चित्रा 1 बी) के अक्षतंतु असर क्षैतिज कोशिकाओं की आकृति विज्ञान मची खुलासा। Fluorescein युग्मित मूंगफली agglutinin साथ शंकु pedicles की लेबलिंग कोन pedicles और क्षैतिज सेल डेन्ड्राइट (चित्रा 1 सी) के बीच एक करीबी स्थानिक संबंध दिखाया। कुछ अपवादों के साथ, क्षैतिज सेल के वृक्ष के समान क्षेत्र के भीतर सभी शंकु pedicles वृक्ष के समान प्रक्रियाओं से संपर्क किया गया।
ईएनटी "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> साबित करने के लिए कि शंकु और क्षैतिज कोशिकाओं के बीच संपर्क कार्यात्मक, पैच दबाना रिकॉर्डिंग क्षैतिज सेल शरीर से बाहर किए गए काले अनुकूलित शर्तों के तहत किया गया है, वर्तमान प्रतिक्रियाओं थे। एक बड़ी आवक वर्तमान उच्च आवृत्ति synaptic गतिविधि के लिए उदार के साथ (2A चित्रा) से होती है। आधारभूत से विचलन और उत्तेजक पोस्टअन्तर्ग्रथनी धाराओं अंधेरे में ग्लूटामेट की लगातार रिहाई की वजह से थे, पोस्टअन्तर्ग्रथनी AMPA- और kainate प्रकार ग्लूटामेट सक्रिय 9 रिसेप्टर्स। अलग-अलग घटनाओं में एक synaptic monophasic तरंग या अधिक जटिल प्रक्षेप पथ वर्तमान (चित्रा 2 बी)। टॉनिक पोस्टअन्तर्ग्रथनी गतिविधि की उपस्थिति पता चलता है कि ग्लूटामेट कोन फोटोरिसेप्टर और क्षैतिज सेल डेन्ड्राइट के बीच synaptic संपर्कों चित्रा 1C में दिखाया गया पर जारी किया गया था की विशेषता थे।Horizontal दर्ज की कोशिकाओं को प्रकाश की तीव्रता में परिवर्तन करने के लिए प्रतिक्रिया व्यक्त की है, यह दर्शाता है कि कोन फोटोरिसेप्टर में संकेत पारगमन झरना भी बरकरार है और एक क्षैतिज टुकड़ा तैयारी में कार्यात्मक था। ट्रांसमीटर रिहाई की कमी के कारण, काले अनुकूलित क्षैतिज कोशिकाओं की वर्तमान आवक टॉनिक हिचकते किया गया था, और synaptic गतिविधि स्पष्ट रूप से एक पूरे क्षेत्र प्रकाश प्रोत्साहन (1300 डब्ल्यू / 2 सेमी, 470 40 एनएम) की उपस्थिति (चित्रा के दौरान कम दिखाई दिया 3 ए)। इसी तरह, एक प्रकाश अनुकूलित राज्य से अंधेरे को एक स्विच एक आवक चालू कारण होता है और synaptic गतिविधि (चित्रा 3 बी) की वृद्धि हुई। इसके अलावा, संक्षिप्त बिजली दालों (1-15 वी, 1 मिसे) एक क्षैतिज सेल शरीर के आसपास के क्षेत्र में सभी कोन फोटोरिसेप्टर बिगाड़ना करने के लिए एक प्लैटिनम इरीडियम द्विध्रुवी उत्तेजना इलेक्ट्रोड के माध्यम से लागू किया गया। ग्लूटामेट की उत्तेजना प्रेरित रिहाई दर्ज की क्षैतिज सेल (चित्रा -3 सी) में बड़े आयाम उत्तेजक पोस्टअन्तर्ग्रथनी धाराओं पैदा की। एस मेंummary, इन निष्कर्षों खांसने चलता है कि कोन फोटोरिसेप्टर और क्षैतिज कोशिकाओं के बीच अन्तर्ग्रथन या तो अंतर्जात प्रोत्साहन प्रकाश द्वारा या प्रेस्य्नाप्तिक तत्वों की नियंत्रित विध्रुवण द्वारा प्रयोगात्मक चालाकी से किया जा सकता है।
चित्रा 1: आकृति विज्ञान और एक क्षैतिज टुकड़ा तैयारी में क्षैतिज कोशिकाओं की synaptic संपर्कों। एक क्षैतिज सेल (तीर) टुकड़ा की सतह के निकट स्थित Dodt विपरीत प्रकाशिकी के साथ कल्पना की गई थी। स्केल बार = 10 माइक्रोन (ए)। इमेजिंग प्रयोगों के लिए, एक क्षैतिज सेल एक पैच-इलेक्ट्रोड, जो अभी भी सेल से जुड़ा हुआ है के माध्यम से ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1 (100 माइक्रोन) के साथ भरा हुआ था। स्केल बार = 10 माइक्रोन (बी)। एक डाई इंजेक्शन क्षैतिज सेल और fluorescein युग्मित मूंगफली agglutinin के साथ लेबल कोन pedicles की सरणी के ओवरले ख्यात synaptic संपर्कों का पता चलता है। स्केल बार = 10 माइक्रोन (सी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: synaptic गतिविधि एक क्षैतिज सेल शरीर से दर्ज की गई। -60 एम वी के एक होल्डिंग क्षमता पर पूरे सेल वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग उच्च आवृत्ति टॉनिक synaptic गतिविधि (ए) से पता चलता है। उच्च अस्थायी समाधान (बी) में synaptic घटनाओं monophasic waveforms (तीर) या अधिक जटिल वर्तमान प्रक्षेप पथ (तीर) प्रदर्शित करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
g3.jpg "/>
चित्रा 3: लाइट और बिजली की उत्तेजना के द्वारा पैदा की क्षैतिज सेल शरीर के वर्तमान प्रतिक्रियाओं। एक काले अनुकूलित क्षैतिज सेल -60 एम वी पर दर्ज की संभावित पकड़े शरीर के प्रकाश प्रतिक्रिया। पूरे क्षेत्र रोशनी वर्तमान आवक टॉनिक को रोकता है और synaptic गतिविधि (ए) कम कर देता है। एक प्रकाश अनुकूलित क्षैतिज सेल शरीर में एक ही शर्तों के तहत दर्ज एक आवक वर्तमान एक अंधेरे फ्लैश अंधेरे (बी) के दौरान वृद्धि हुई synaptic गतिविधि के साथ निम्न प्रदर्शित करता है। ए और बी में क्षैतिज लाइनों प्रोत्साहन के समय प्रतिनिधित्व करते हैं। संक्षिप्त बिजली दालों द्वारा कोशिकी उत्तेजना कोन फोटोरिसेप्टर से ग्लूटामेट की सिंक्रनाइज़ रिहाई (सी) के कारण बड़े आयाम उत्तेजक पोस्टअन्तर्ग्रथनी धाराओं लाती है। होल्डिंग क्षमता: -60 एम वी। तीर उत्तेजना नाड़ी के समय इंगित करता है। ट्रेस की शुरुआत में छोटा धाराओं उत्तेजना कलाकृतियों प्रतिनिधित्व करते हैं।.com / फ़ाइलें / ftp_upload / 55173 / 55173fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ऊर्ध्वाधर स्लाइस के विपरीत, क्षैतिज कोशिकाओं और amacrine कोशिकाओं की तरह त्रिज्यात उन्मुख न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान आकृति विज्ञान अच्छी तरह से संरक्षित है। पूरे रेटिना की तैयारी की तुलना में, इन प्रकार की कोशिकाओं microelectrodes के लिए आसानी से सुलभ हैं और दोनों electrophysiological और इमेजिंग तकनीक के द्वारा अध्ययन किया जा सकता है। यहाँ, हम बाहरी रेटिना पर ध्यान केंद्रित; हालांकि, एक समान दृष्टिकोण विशेष रूप से आंतरिक रेटिना 10 की amacrine कोशिकाओं के लिए सूचित किया गया है।
क्षैतिज टुकड़ा तैयारी के गुणों कार्यात्मक अध्ययन के लिए कई निहितार्थ हैं। कोन फोटोरिसेप्टर और पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षैतिज कोशिकाओं के बीच synaptic संपर्कों की संख्या बरकरार रेटिना से लगभग पृथक किया गया था। Synaptic संपर्कों कार्यात्मक थे, अंधेरे में न्यूरोट्रांसमीटर का टॉनिक रिहाई दिखा। अन्तर्ग्रथन प्रकाश / अंधेरे संक्रमण की तरह या तो अंतर्जात उत्तेजनाओं से या बाहरी द्विध्रुवी उत्तेजना से सक्रिय किया जा सकता है।
यहाँ प्रस्तुत तकनीक ज्यादातर क्षैतिज उन्मुख न्यूरॉन्स तक सीमित है। इसलिए, यह एक क्षैतिज टुकड़ा में फोटोरिसेप्टर और बरकरार द्विध्रुवी कोशिकाओं से रिकॉर्ड करने के बाद द्विध्रुवी सेल एक्सोन काटा जायेगा संभव नहीं है। इसके अलावा, यह पूरी तरह से सेक्शनिंग के स्तर को नियंत्रित करने के लिए असंभव है। एक एकल रेटिना टुकड़ा मीटरइस प्रकार फोटोरिसेप्टर के बाहरी और भीतरी क्षेत्रों के बीच उदाहरण के लिए, किसी अवांछित स्तर पर कटौती की जा ight। एक टुकड़ा में कम से कम सेक्शनिंग की सही विमान के agarose बढ़ जाती मौके का एक ब्लॉक के भीतर रेटिना टुकड़ों की संख्या बढ़ रही है।
क्षैतिज टुकड़ा तैयारी अच्छी तरह से रॉड और कोन फोटोरिसेप्टर के रिबन synapses के अद्वितीय गुण का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है। अब तक हम 3 complexin और कोन फोटोरिसेप्टर और क्षैतिज 11 कोशिकाओं के बीच synaptic प्रसारण पर 4 complexin प्रेस्य्नाप्तिक प्रोटीन की भूमिका की जांच के लिए एक जानवर नाक आउट सिस्टम का इस्तेमाल किया है। यह भी रूप में पहले 9 दिखाया गया है, पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स के गुणों का अध्ययन करने के लिए संभव है।
भविष्य अनुप्रयोगों electrophysiological और इमेजिंग तकनीक के साथ ट्रांसजेनिक माउस लाइनों के आधार पर synaptic प्रोटीन के अध्ययन में शामिल होंगे। यह भी biophysical समर्थक जांच करने के लिए संभव हो जाएगाक्षैतिज कोशिकाओं के बीच की खाई को जंक्शनों के perties। प्रकाश प्रतिक्रियाओं को मापा जा सकता है, तकनीक भी दृश्य प्रणाली के पहले अन्तर्ग्रथन में अंतर्जात उत्तेजनाओं की एन्कोडिंग जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। यह अंधेरे में तैयारी के ऊतकों के प्रकाश अनुकूलन को रोकने के लिए बाहर ले जाने के लिए संभव है, अन्यथा प्रकाश प्रतिक्रियाओं काफी हद तक कोन-संचालित किया जाएगा।
सारांश में, क्षैतिज टुकड़ा तैयारी एक उपन्यास दृष्टिकोण स्तनधारी रेटिना 12 में उनके कार्यात्मक गुणों का अध्ययन करने के लिए एक शर्त के रूप में synapses व्यक्ति की पहुंच बढ़ाने के लिए प्रतिनिधित्व करता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ames' Medium | Sigma | A1420 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Carbogen | Air Liquide | ||
| Agarose | Sigma | A9045 | |
| 35 mm Petri dish (plastic) | Nunc Thermofisher | 150318 | |
| Glass Petri dish | Chemoline | 50-1470-40 | |
| Isoflurane | Dispensary university hospital | ||
| Vibratome injector blade | Biosystems | 39053250 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200 | |
| Vibrocheck | Leica Microsystems | ||
| Microwave | |||
| Water bath | |||
| Forceps | |||
| 20 G needles | |||
| Spring scissors | |||
| Curved scalpel blades | |||
| Stereo microscope | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Glass Pasteur pipette |
References
- DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse. Neuron. 50, 735-748 (2006).
- Jackman, S. L., et al. Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response. Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).
- Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods. J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).
- Singer, J. H., Lassová, L., Vardi, N., Diamond, J. S. Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse. Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).
- Peichl, L., González-Soriano, J. Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig. Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).
- Ames, A., Nesbett, F. B. In vitro retina as an experimental model of the central nervous system. J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).
- Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J. Vis. Exp. (49), (2011).
- Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells. Development of the Retina. , Plenum Press. New York. (1998).
- Feigenspan, A., Babai, N. Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).
- Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A.
- Babai, N., et al. Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses. J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).
- Thoreson, W. B. Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan & Babai). Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).
