Framställning av horisontella skivor Adult mus Retina för elektrofysiologiska studier

Summary

Vi utvecklat en horisontell skiva beredning av den vuxna däggdjurs näthinnan med planet för snittning parallellt med retinal ytan. Dendritiska områden nonradially orienterade näthinnans nervceller inte trunkerade, vilket gör att studier av signalbehandling med patch-clamp och avbildningstekniker.

Abstract

Vertikala skiva preparat är väl etablerade för att studera kretsar och signalöverföring i den vuxna däggdjur näthinnan. Planet snitt i dessa preparat är vinkelrät mot näthinnans yta, vilket gör den idealisk för att studera radiellt orienterade nervceller som fotoreceptorer och bipolära celler. Emellertid de stora dendritiska hållare av horisontella celler, bredfälts amakrina celler och ganglieceller är mestadels stympad, lämnar markant reducerad synaptisk aktivitet i dessa celler. Medan ganglion celler och fördrivna amakrina celler kan studeras i en hel monterad beredningen av näthinnan, horisontella celler och amakrina celler som finns i det inre kärnskiktet är endast dåligt tillgängliga för elektroder i hela näthinnan vävnad.

För att uppnå maximal tillgänglighet och synaptiska integritet har vi utvecklat en horisontell skiva beredning av mus näthinnan, och studerade signalöverföring vid synapsen mellan fotoreceptorer och horisontellceller. Horisontell sektionering gör (1) lätt och entydig visuell identifiering av horisontella cellkroppar för elektrodinriktning och (2) bevarande av de förlängda horisontella cell dendritiska fält, som en förutsättning för intakt och funktionell kon synaptiska ingång till horisontella cell dendriter.

Horisontella celler från horisontella skivor uppvisade tonic synaptisk aktivitet i mörkret, och de svarade att informera ljusblixtar med en minskning av aktiv ström och minskad synaptisk aktivitet. Immunocytokemisk bevis tyder på att nästan alla koner i den dendritiska området en horisontell cell skapa synapser med dess perifera dendriter. Den horisontella skiva preparatet därför väl lämpad för att studera de fysiologiska egenskaperna hos horisontellt utsträckta näthinnans nervceller samt sensoriska signalöverföring och integration över utvalda synapser.

Introduction

Visuell information kodas som en dynamisk tid och rum mönster av fotoreceptor-aktivering, och bandet synapsen mellan fotoreceptorer och andra ordningens neuron bestämmer nedströms överföring av visuell information. Den vertikala skiva beredning av däggdjurs näthinnan är ett mycket värdefullt verktyg för att studera signalbehandling i vertikala vägar, det vill säga mellan fotoreceptorer och bipolära celler, och mellan bipolära celler och vissa typer av amakrina cell ^{1, 2, 3, 4.}

Men vertikal sektionering orsakar alltid svår trunkering av de dendritiska områdena många näthinnans nervceller, vilket leder till betydande förlust av synaptiska kontakter. Speciellt i den yttre näthinnan, är horisontella celler påverkas på grund av deras sidled spridda utökade dendritiska fält och axon terminalsystem ^5. I en vertikalförberedelser skiva, den synaptiska ingång hundratals kon fotoreceptor terminaler till dendriter i en horisontell cell således reduceras till några glesa kontakter. Detta kan räcka för att studera egenskaperna hos enskilda synapser, men det gör inte på något sätt representerar signalbehandlingsfunktioner ligger till grund för synkroniserad aktivering av fotoreceptorer band synapser.

Vi utvecklade därför en horisontell skiva beredning, vilket lämnar nästan alla könen ljusmätare synaptiska ingång till horisontella cell dendriter intakt och funktionell. Planet för sektione löper parallellt med ytan av näthinnan, helst skära genom det inre kärnskiktet mellan horisontella celler och amakrina celler. Sålunda är horisontella skivor av den yttre näthinnan skapas som innehåller, på den presynaptiska plats, fotoreceptorer med inre och yttre segment samt synaptiska terminaler, och horisontella celler och bipolära celler på den postsynaptiska stället. Detta preparat är väl lämpad to undersöka samordnade synaptiska ingångar i horisontella cell dendriter av alla kon fotoreceptorer inom sitt dendritiska fält. Det således kan vara användbar för att bättre förstå hur fotoreceptorn band synapsen, vilket är avgörande för överföring av visuell information från matrisen av fotoreceptoraktivering i en postsynaptiska svar.

Protocol

Alla förfaranden genomfördes i enlighet med riktlinjerna för djurförsök som utfärdats av Förbundsrepubliken Tyskland.

OBS! Eftersom näthinnans vävnad kommer att vara i avsaknad av syre under förlängda delarna av detta förfarande, bör alla steg utföras så snabbt som möjligt. Möss bör vara mörk-anpassad åtminstone 3 h före dissektion. Att undvika ljus anpassning av näthinnan, förberedelse och skivning bör utföras under svagt rött ljus.

1. Beredning av media och andra kemikalier

1. Förbered Ames Medium ^6. Efter dissektion, sänk näthinnans vävnad i Ames Medium vid alla tidpunkter.
   1. Lös 2,2 g Ames Medium och 298 mg HEPES i 250 ml destillerat vatten. Koncentrationen av HEPES kommer att vara 5 mM. Rör om försiktigt tills alla partiklar är upplösta.
   2. Bubbla Ames 'Medium vid rumstemperatur med karbogen (95% syre, 5% bildioxid) i minst fem minuter. Tillförsel karbogen med ett glas pasteurpipett till lösningen. Anslut pasteurpipett via lämpliga slangar till utloppet av gasen regulatorn.
   3. Lägg 475 mg natriumvätekarbonat till lösningen. Tillsats av bikarbonat efter bubblande förhindrar utfällning av kalciumkarbonat.
2. Förbereda låg agaros gelningstemperatur. Agaros krävs för inbäddning av retinal vävnad under vibratome sektionering.
   1. Lös 180 mg agaros i 9 ml Ames Medium och 1 ml destillerat vatten. Använda en mikrovågsugn för att långsamt värma agaroslösningen tills alla fasta substanser är upplösta. Värme i 5 - 10 steg sek för att undvika spill. Lösningen ska vara klar och tydlig.
   2. Store upplöst agaros i vattenbad vid 37 ° C under hela förfarandet.

2. Ställa in Vibratome

NOTERA: Alla sektione har utförts medvibratome anges i materialtabellen. De angivna inställningar hänvisar till denna typ av endast vibratome. För ytterligare information om vibratome sektionering av nervvävnad se referens ^7.

1. Placera vibratom injektor bladet i bladhållaren.
2. Mät vertikal böjning av bladet med "vibrocheck" enhet. Använd justeringsskruven på bladhållaren för att luta bladet tills den är parallell med skärplanet. Exakt positionering av bladet är nödvändig för att förhindra persienn effekter på snittytan och för att producera en platt sektion som innehåller levande celler på sin yta.
3. Ställ vibratom till följande inställningar: amplitud, 1,00; hastighet, 0,20; tjocklek, 180-200 | j, m.

3. Dissektion av mus Retina

1. Söva vuxna C57BL / 6-mus genom förångning av ca 1 ml isofluran i en lufttät behållare. När anestesi är fullständig, avliva djuret genom cervikal dislokation. Demus bör inte vara äldre än 3 månader, annars kvaliteten på skivorna kommer att försämras.
2. Ta bort ögongloben genom att placera en böjd pincett under ögat. Försiktigt lyfta upp ögongloben kommer att utsätta den optiska nerven. Skär synnerven med en fjäder sax och överföra ögat bollen till en 35 mm petriskål innehållande 2 ml Ames Medium.
3. Genomföra alla efterföljande steg på scenen av ett stereomikroskop. Ställ in förstoringen till ett värde som möjliggör optimal visuell kontroll av följande procedurer (steg från 3,4 till 3,9).
4. Punktera hornhinnan vid övergången till sklera med spetsiga pincett eller en 20 G nål. Under detta steg, stadig ögongloben med en annan pincett. Var noga med att inte skada näthinnan med punkteringsanordningen.
5. Sätt fjäder saxen i det lilla hålet i steg 3,3 och skär en cirkel runt hornhinnan. Återigen, stadig ögongloben med pincett samtidigt minska. Hålla snittet mycket nära ytan för att inte cut in i näthinnan.
6. Försiktigt bort hornhinnan, linsen och glaskroppen med pincett. Glaskroppen innefattar endast ett tunt transparent skikt i den bakre delen av ögat. Det är dock viktigt för vibratome sektionering att glaskroppen är helt bort.
7. I petriskål, positionera ögonmusslan på ett sätt som man ser genom hålet ned på näthinnan. Kanten på öppningen bör bestå av endast skleral vävnad. Om den cirkulära snittet (steg 3,4) har utförts för nära ekvatorn av ögonmusslan, kommer näthinnevävnad också vara närvarande nära snittet. Var försiktig så att inte skada näthinnan i steg 3,8.
8. Ta tag i sklera med pincett och försiktigt riva vävnaden isär. Det är viktigt att inte brista näthinnan under detta steg. Om så erfordras, lossa näthinnan från ora serrata genom stabilisering den sklerala delen av vävnaden med pincett och försiktigt skala av näthinnan med de andra pincett. Håll tången stängd; aldrig hantera retina med pincett eftersom vävnaden är mycket mjuk och kommer att ge vika omedelbart.
   OBS: I detta steg, näthinnan och resten av ögonmusslan kommer att anslutas endast vid papillen.
9. Skär fäststället vid papillen med fjäder sax. Näthinnan bör nu fritt flytande som ett enda stycke av vävnad i Ames Medium.
10. Skär näthinnan i 4 - 6 små rektanglar av cirka 23 mm med hjälp av en krökt skalpellblad genom att hålla näthinnan längs kanterna med pincett, för att manipulera den på plats. Undvik att klämma näthinnans vävnad i rektanglarna. Ta bitar från de centrala delarna av näthinnan, inte långt periferin.
11. Överför näthinnans bitar med en stor diameter plast pasteurpipett till en 35 mm plastpetriskål, vars botten har ersatts med en mask med galler storlek mindre än 1 mm. Fäst petriskål i den övre tredjedelen av en bägare eller konisk kolv och dränka retinala bitar i Ames Medium bubbled med karbogen.

4. Inbäddning av retinal Pieces i agaros

1. Försiktigt överföra 2 - 3 näthinnans bitar i en 35 mm plast petriskål tillsammans med några av Ames Medium. Det är mest lämpligt att använda en stor diameter plast pasteurpipett för överföring. I detta steg innebär den exakta orienteringen av de retinala bitarna ingen roll.
2. Ta bort så mycket som möjligt av den återstående Ames Medium med ett glas pasteurpipett. Så snart vätskan har avlägsnats fortsätter med steg 4,3. Låt inte näthinnans vävnad torr.
3. Omedelbart täcka retinala bitar med 2 ml upplöst agaros (37 ° C). Med tanke på storleken som nämns i steg 3,10, kommer bitarna inte krypa upp i agarosen.
4. Inom vätske agaros, tryck försiktigt retinala bitar till botten av petriskålen. Ganglion cellager ska vara vänd nedåt. Använd en stereolupp för bedömning av exakt position. För positionering, handtag retinal piECES med en liten spatel. Placera näthinnan så snabbt och exakt som möjligt, eftersom agarosen stelnar snabbt.
   1. Ordna retinala stycken parallellt med botten av glaset skålen; annars sektioner kommer att vara tangentiell eller sned. Enskilda delar bör inte röra vid varandra, men också bör inte vara alltför långt ifrån varandra. Försök att placera näthinnan stycken mer eller mindre på samma horisontella nivå.
5. Sätt glas petriskål med inbäddade retinal bitar i kylskåpet (4-6 ° C) under minst två minuter. Detta kommer snabbt att härda agarosen för vidare bearbetning. Så snart agarosen har polymeriserats vidare med nästa steg.

5. Montering av retinal Pieces

1. Försiktigt bort agarosen block som innehåller retinala bitar från petriskålen. Använd en stekspade eller en liknande anordning för att lyfta agarosen kvarter från glaset. På grund av vidhäftningskrafter, kan detta visa sig vara ganska svårt. Men undvika att brytaagaros blocket. Utföra denna och alla efterföljande steg vid rumstemperatur.
2. Placera agarosen blocket på ett täckglas och justera dess storlek med ett skalpellblad. Lämnar 1 - 2 mm av agaros på varje sida av de retinala bitarna. Den slutliga storleken av blocket bör vara cirka 1066 mm (10 mm avser höjden av blocket, 6 mm till dess kantlängd).
3. Limma agarosen blocket till preparathållaren av vibratome med hjälp av ett snabblim. Retinala bitar ska placeras på toppen av 10 mm höga blocket och orienterade parallellt med dess yta, medan den nedre är fäst till hållaren.
4. Täck blocket omedelbart genom att hälla tidigare bubblade Ames Medium i buffertfacket på vibratome.

6. Beredning av horisontell vibratome avsnitt

1. Börja sektionering. Först ställer tjockleken på skiv manuellt tills fragment av retinal vävnad visas i segmentet. sedan ändra inställningarna i steg 2,3. eftersommus näthinnan är endast ca 200 pm tjockt, blir det ingen mer än 2-3 skivor per agaros block.
2. Ta bort sektioner från buffertbrickan med en glasstav och överföra dem till 2 ml Ames Medium i en 35 mm petriskål.
3. Butikssektioner omedelbart i en inkubator vid 37 ° C (5% CO _{2/55% O2).} Agarosen omgivande sektionerna kommer att stanna fast ämne i inkubatorn och kan användas för att hantera sektionerna utan att skada näthinnan. Bättre slice kvalitet erhålls vid lagring vid 37 ° C inom respektive atmosfären jämfört med syresatt Ames 'Medium vid RT. Sektioner kan användas omedelbart eller kan lagras upp till fyra timmar i inkubatorn med goda fysiologiska resultat.
4. Bädda nästa retinala bitar i agaros och upprepa avsnitten 4 - 6.

Representative Results

I horisontella skivor av mus näthinnan, kan horisontella cellkroppar lätt identifieras i enlighet med deras unika morfologi med flera primära dendriter som fram en polygonal cellkroppen (Figur 1A). Horisontella cellkroppar belägna nära ytan av den del var rutinmässigt åtkomlig för patch-clamp-elektroder. Under inspelningarna cellerna fylls med ett fluorescerande färgämne, avslöjar deras intrikata dendritiska arborization, som liknade morfologin av axon bärande horisontella celler i intakta mus näthinnan ⁸ (Figur 1B). Märkning av kon pediklar med fluorescein kopplade jordnötsagglutinin visade en nära rumslig relation mellan kon pediklar och horisontella cell dendriter (Figur 1C). Med få undantag har samtliga kon pediklar inom den horisontella cellens dendritiska fält kontaktad av dendritiska processer.

ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> För att bevisa att kontakterna mellan konerna och horisontella celler var funktionell, var patch-clamp inspelningar utförs från horisontella cellkroppar under mörka anpassade förhållanden, nuvarande svaren var. kännetecknas av en stor aktiv ström tillsammans med måttlig till hög frekvens synaptisk aktivitet (Figur 2A). avvikelsen från baslinjen och excitatoriska postsynaptiska strömmar orsakades av konstant frisättning av glutamat i mörkret, aktiverar postsynaptiska AMPA- och kainat-typ glutamat receptorer ^9. Individuella synaptiska händelser kännetecknades av en monofasisk vågform eller mer komplexa nuvarande banor (Figur 2B). antyder förekomsten av tonic postsynaptisk aktivitet som glutamat släpptes på synaptiska kontakter mellan kon fotoreceptorer och horisontella cell dendriter som visas i figur 1C.

Horizospecialist- celler inspelade svarade på förändringar i ljusintensitet, vilket indikerar att signalomvandlingskaskad i kon fotoreceptorer var också intakt och funktionell i en horisontell skiva beredning. På grund av den minskning av transmittorfrisättning, var tonic inåtgående ström av mörka anpassade horisontella celler inhiberas och synaptisk aktivitet verkade klart minskat under närvaron av en full-fält ljus stimulus (1300 W / cm ^2, 470 40 nm) (Figur 3A). På samma sätt, en övergång till mörker från en ljus anpassat tillstånd orsakade en aktiv ström och ökad synaptisk aktivitet (Figur 3B). Dessutom har korta elektriska pulser (1-15 V, en ms) tillämpas genom en platina-iridium bipolär stimuleringselektrod att depolarisera alla kon fotoreceptorer i närheten av en horisontell cellkropp. Stimuleringen-inducerad frisättning av glutamat framkallade stor amplitud excitatoriska postsynaptiska strömmar i den inspelade horisontella cellen (Figur 3C). i sSAMMANFATTNING dessa resultat visar på ett övertygande sätt att synapsen mellan kon fotoreceptorer och horisontella celler kan manipuleras experimentellt genom antingen den endogena stimulans ljus eller genom kontrollerad depolarisering av presynaptiska element.

Figur 1: Morfologi och synaptiska kontakter inom Horisontella celler i en horisontell skiva Förberedelse. En horisontell cell (pil) som är belägen nära ytan av den del visualiserades med Dodt kontrastoptik. Skalstreck = 10 | am (A). För avbildningsexperiment framställdes en horisontell cell fylld med Oregon Grön 488 BAPTA-1 (100 | iM) via en patch-elektrod, som fortfarande är fäst vid cellen. Skalstreck = 10 | im (B). Överlagring av en färg injicerat horisontella cellen och matrisen kottar pediklar märkta med fluorescein kopplade jordnötsagglutinin avslöjar förmodade synaptiska kontakter. Skalstreck = 10 | im (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Synaptic som registrerats från en horisontell cellkropp. Helcell-spänningsklämma inspelning vid en hållpotential av -60 mV visar högfrekvent tonic synaptiska aktivitet (A). Vid högre tidsupplösning (B), synaptiska händelser visar monofasiska vågformer (pil) eller mer komplexa nuvarande banor (pilspetsar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

g3.jpg "/>
Figur 3: Aktuellt svar inom Horisontella cellkroppar framkallade av ljus och elektrisk stimulering. Ljus svar på en mörk anpassad horisontell cellkroppen registrerades vid -60 mV hållpotential. Fullfältsbelysning inhiberar tonic inåtgående ström och minskar synaptisk aktivitet (A). En lätt-anpassad horisontell cellkroppen registreras under samma betingelser visar en inåtgående ström efter en mörk blixt tillsammans med ökad synaptisk aktivitet under mörker (B). Horisontella linjer i A och B representerar tidpunkten för stimulans. Extracellulär stimulering av korta elektriska pulser inducerar stora amplitud excitatoriska postsynaptiska strömmar på grund av den synkroniserade frisättning av glutamat från kon fotoreceptorer (C). Hållpotential: -60 mV. Pilen indikerar tidpunkten för stimuleringspulsen. Trunkerade strömmarna vid början av spårningen representerar stimuleringsartefakter..com / filer / ftp_upload / 55.173 / 55173fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

I motsats till vertikala skivor, är den dendritiska morfologi radiellt orienterade neuroner som horisontella celler och amakrina celler väl bevarade. Jämfört med hela näthinnan preparat dessa celltyper är lätt åtkomliga för mikroelektroder och kan studeras genom både elektrofysiologiska och avbildningstekniker. Här har vi fokuserat på den yttre näthinnan; har dock ett liknande tillvägagångssätt har rapporterats speciellt för amakrina cellerna i inner näthinnan ^10.

Egenskaperna hos den horisontella skiva beredning har flera konsekvenser för funktionella studier. Antalet synaptiska kontakter mellan kon fotoreceptorer och postsynaptiska horisontella celler var nästan omöjlig att skilja från den intakta näthinnan. Synaptiska kontakter var funktionella, visar toniska frisättningen av neurotransmittor i mörker. Synapsen kunde aktiveras genom antingen endogena stimuli som ljus / mörker-övergångar eller genom extern bipolär stimulering.

Tekniken som presenteras här är oftast begränsad till horisontellt orienterade nervceller. Därför är det inte möjligt att spela in från fotoreceptorer och intakta bipolära celler i en horisontell skiva, eftersom bipolär cell axoner kommer att förkortas. Dessutom är det omöjligt att perfekt kontrollera nivån av snittning. En enda retinal bit might således skäras vid en oönskad nivå, till exempel mellan yttre och inre segment av fotoreceptorer. En ökning av antalet retinala bitar inom ett block av agaros ökar chanserna för en korrekt plan snittåtminstone i ett stycke.

Den horisontella skiva beredning är väl lämpad för att studera de unika egenskaperna hos band synapser tappar och stavar fotoreceptorer. Hittills har vi använt ett djur knock-out-system för att undersöka vilken roll presynaptiska proteiner complexin 3 och complexin 4 på synaptisk transmission mellan kon fotoreceptorer och horisontella celler ^11. Det är också möjligt att studera egenskaperna hos postsynaptiska neurotransmittorreceptorer, såsom visas tidigare ^nio.

Framtida tillämpningar kommer att omfatta studier av synaptiska proteiner som bygger på transgena möss linjer med elektrofysiologiska och avbildningstekniker. Det kommer också att bli möjligt att undersöka den biofysiska proegenskaper till kanalförbindelser mellan horisontella celler. Eftersom ljussvar kan mätas, kommer den teknik även användas för att undersöka kodningen av endogena stimuli vid den första synapsen av det visuella systemet. Det är möjligt att utföra beredningen i mörker för att förhindra ljus anpassning av vävnaden, annars ljussvar kommer att vara till stor del kon-driven.

Sammanfattningsvis, den horisontella skiva beredning representerar en ny metod för att öka tillgängligheten av enskilda synapser som en förutsättning för att studera deras funktionella egenskaper i däggdjurs näthinnan ^12.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ames' Medium	Sigma	A1420
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
Hepes	Sigma	H3375
Carbogen	Air Liquide
Agarose	Sigma	A9045
35 mm Petri dish (plastic)	Nunc Thermofisher	150318
Glass Petri dish	Chemoline	50-1470-40
Isoflurane	Dispensary university hospital
Vibratome injector blade	Biosystems	39053250
Vibratome	Leica Microsystems	VT1200
Vibrocheck	Leica Microsystems
Microwave
Water bath
Forceps
20 G needles
Spring scissors
Curved scalpel blades
Stereo microscope
Plastic Pasteur pipette
Glass Pasteur pipette