Summary
Nous avons développé une préparation de tranche horizontale de la rétine adulte de mammifère avec le plan de la coupe parallèle à la surface de la rétine. champs dendritiques des neurones rétiniens orientés nonradially ne sont pas tronquées, permettant l'étude du traitement du signal avec des techniques de patch-clamp et d'imagerie.
Abstract
préparations de tranches verticales sont bien établis pour étudier les circuits et la transmission du signal dans la rétine des mammifères adultes. Le plan de sectionner dans ces préparations est perpendiculaire à la surface de la rétine, le rendant idéal pour l'étude des neurones orientés radialement comme photorécepteurs et des cellules bipolaires. Toutefois, les grandes arborisation dendritique de cellules horizontales, de cellules amacrines grand champ, et les cellules ganglionnaires sont le plus souvent tronquées, en laissant l'activité synaptique nettement réduite dans ces cellules. Alors que les cellules ganglionnaires et les cellules amacrines déplacées peuvent être étudiés en tout monté sur une préparation de la rétine, les cellules amacrines et de cellules horizontales situées dans la couche nucléaire interne ne sont que difficilement accessibles pour les électrodes dans le tissu de la rétine entière.
Pour obtenir un maximum d'accessibilité et de l'intégrité synaptique, nous avons développé une préparation tranche horizontale de la rétine de la souris, et étudié la transmission du signal à la synapse entre les photorécepteurs et horizontalecellules. tronçonnage horizontale permet (1) identification visuelle facile et sans ambiguïté des corps cellulaires horizontales pour électrode ciblage, et (2) la préservation des champs de cellules dendritiques horizontale étendue, comme condition préalable à cône d'entrée synaptique intacte et fonctionnelle pour dendrites des cellules horizontales.
Les cellules horizontales de tranches horizontales présentent une activité synaptique tonique dans l'obscurité, et ils ont répondu à de brefs éclairs de lumière avec une réduction de l'activité synaptique actuelle et diminuée vers l'intérieur. la preuve immunocytochimique indique que presque tous les cônes dans le champ dendritique d'une cellule horizontale établissent des synapses avec ses dendrites périphériques. La préparation de tranche horizontale est donc bien adapté pour étudier les propriétés physiologiques des neurones rétiniens étendus horizontalement, ainsi que la transmission du signal sensoriel et de l'intégration à travers les synapses sélectionnés.
Introduction
l'information visuelle est codée en tant que modèle spatio-temporel dynamique de l'activation du photorécepteur, et la synapse du ruban entre les photorécepteurs et les neurones de second ordre détermine le transfert en aval de l'information visuelle. La préparation de la tranche verticale de la rétine de mammifère est un outil très utile pour étudier le traitement des signaux dans les voies verticales, soit entre les photorécepteurs et les cellules bipolaires, et entre les cellules bipolaires et certains types de cellules amacrines 1, 2, 3, 4.
Cependant, tronçonnage vertical provoque toujours troncature sévère des champs dendritiques de nombreux neurones rétiniens, conduisant à une perte considérable de contacts synaptiques. Surtout dans la rétine externe, les cellules horizontales sont affectées en raison de leurs champs dendritiques étendus latéralement répartis et des systèmes de terminaux axone 5. Dans un plan verticalpréparation de tranches, l'entrée synaptique des centaines de terminaux cône photorécepteurs aux dendrites d'une cellule horizontale est ainsi réduite à quelques contacts rares. Cela pourrait suffire pour étudier les propriétés des synapses individuelles, mais elle en aucun cas représentent les capacités de traitement du signal sous-tendent l'activation synchronisée des synapses de ruban photorécepteur.
Nous avons donc développé une préparation de tranche horizontale, ce qui laisse presque tout le photorécepteur de cône d'entrée synaptique pour dendrites des cellules intactes et fonctionnelles horizontales. Le plan des pistes de sectionnement parallèle à la surface de la rétine, idéalement coupant à travers la couche nucléaire interne entre les cellules horizontales et les cellules amacrines. Ainsi, les tranches horizontales de la rétine externe est créée et contient, sur le site présynaptique photorécepteurs avec des segments intérieur et extérieur, ainsi que des terminaisons synaptiques, et des cellules horizontales et les cellules bipolaires du site postsynaptique. Cette préparation est bien adapté to enquêter sur les entrées synaptiques coordonnés dans dendrites des cellules horizontales par tous les cônes photorécepteurs dans son champ dendritique. Il pourrait donc se révéler utile pour mieux comprendre le fonctionnement de la synapse ruban de photorécepteur, ce qui est crucial pour le transfert de l'information visuelle de la matrice de l'activation du photorécepteur en une réponse post-synaptique.
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Protocol
Toutes les procédures ont été effectuées en conformité avec les lignes directrices pour les expériences sur les animaux émis par la République fédérale d'Allemagne.
NOTE: Parce que le tissu rétinien sera dépourvue d'oxygène pendant les parties prolongées de cette procédure, toutes les mesures doivent être effectuées aussi rapidement que possible. Les souris doivent être adaptés à l'obscurité au moins 3 heures avant la dissection. Pour éviter la lumière adaptation de la rétine, la préparation et le découpage doit être effectuée sous faible lumière rouge.
1. Préparation des médias et d'autres produits chimiques
- Préparer Ames moyenne 6. Après dissection, immerger le tissu rétinien dans le Moyen Ames en tout temps.
- Dissoudre 2,2 g d'Ames de moyenne et 298 mg HEPES dans 250 ml d'eau distillée. La concentration de l'HEPES sera de 5 mM. Remuer doucement jusqu'à ce que toutes les particules sont dissoutes.
- le milieu de bulle Ames à la température ambiante avec du carbogène (95% d'oxygène, 5% voiturele dioxyde de bon) pendant au moins 5 min. carbogène alimentation avec une pipette Pasteur en verre à la solution. Raccorder la pipette de Pasteur par l'intermédiaire d'un tube approprié à la sortie du régulateur de gaz.
- Ajouter 475 mg de bicarbonate de soude à la solution. L'addition de bicarbonate après barbotage empêche la précipitation du carbonate de calcium.
- Préparer agarose à faible température de gélification. Agarose est nécessaire pour l' intégration du tissu rétinien lors de vibratome tronçonnage.
- Dissoudre 180 mg d'agarose dans 9 ml Ames 'Medium et 1 ml d'eau distillée. Utilisez un micro-ondes pour chauffer lentement la solution d'agarose jusqu'à ce que tous les solides soient dissous. Chauffer dans 5 - 10 incréments sec pour éviter le débordement. La solution doit être claire et transparente.
- Magasin dissous agarose dans un bain d'eau à 37 ° C pendant la durée de la procédure.
2. Mise en place du Vibratome
Remarque: tous tronçonnage a été effectuée avec levibratome énumérés dans le tableau des matériaux. Les réglages indiqués se réfèrent à ce type de vibratome seulement. Pour plus de détails sur vibratome sectionner tissu neural s'il vous plaît se référer à la référence 7.
- Placez vibratome lame d'injecteur dans le porte-lame.
- Mesurer la déviation verticale de la lame avec le dispositif "de Vibrocheck". Utiliser la vis de réglage sur le support de lame pour faire basculer la lame jusqu'à ce qu'il soit parallèle au plan de coupe. Le positionnement exact de la lame est nécessaire pour éviter les effets de stores vénitiens sur la surface de la section et pour produire un profilé plat qui contient des cellules vivantes sur sa surface.
- Réglez vibratome les paramètres suivants: amplitude, 1,00; la vitesse, 0,20; épaisseur 180-200 nm.
3. Dissection de la souris Retina
- Anesthésier adulte souris C57BL / 6 par vaporisation d'environ 1 ml isoflurane dans un récipient étanche à l'air. Lorsque l'anesthésie est terminée, euthanasier des animaux par dislocation cervicale. lela souris ne devrait pas être plus de 3 mois, sinon la qualité des tranches va se détériorer.
- Retirer boule d'oeil en plaçant une pince courbées sous l'œil. soulevant délicatement la balle des yeux va exposer le nerf optique. Couper le nerf optique avec une paire de ciseaux à ressort et transférer la balle des yeux à une boîte de Pétri de 35 mm contenant 2 ml Ames 'Medium.
- Effectuer toutes les étapes suivantes sur la scène d'un microscope stéréo. Réglez l'agrandissement à une valeur qui permet un contrôle visuel optimal des procédures suivantes (étapes 03/04 au 03/09).
- Perforer la cornée à la transition vers la sclère avec une pince à pointes ou à une aiguille G 20. Au cours de cette étape, stabiliser le globe oculaire avec une autre pince. Veillez à ne pas endommager la rétine avec le dispositif de ponction.
- Insérer les ciseaux à ressort dans le petit trou fait dans l'étape 3.3 et découper un cercle autour de la cornée. Encore une fois, stabiliser le globe oculaire avec des pinces pendant la coupe. Gardez l'incision très proche de la surface afin de ne pas cut dans la rétine.
- Retirez soigneusement la cornée, le cristallin et le corps vitré avec une pince. Le corps vitré ne comprend qu'une mince couche transparente à l'arrière de l'œil. Cependant, il est essentiel pour sectionner vibratome que le corps vitreux est complètement enlevé.
- Dans la boîte de Pétri, positionner l'œilleton d'une manière que l'on regarde à travers le trou vers le bas sur la rétine. Le rebord de l'ouverture devrait être composé de tissu scleral seulement. Si la coupe circulaire (étape 3.4) a été réalisée trop près de l'équateur de la bonnette, le tissu rétinien sera également présent à proximité de l'incision. Veillez alors à ne pas endommager la rétine à l'étape 3.8.
- Prenez la sclérotique avec une pince et déchirer soigneusement le tissu à part. Il est essentiel de ne pas rompre la rétine au cours de cette étape. Si nécessaire, détacher la rétine de l'ora serrata par stabiliser la partie scléral du tissu avec la pince et soigneusement décoller la rétine avec les autres pinces. Gardez la pince fermée; jamais manipuler le retina avec une pince depuis le tissu est très doux et cédera immédiatement.
NOTE: A ce stade, la rétine et le reste de l'œilleton sera connectée seulement à la tête du nerf optique. - Couper le site de fixation à la tête du nerf optique avec les ciseaux à ressort. La rétine devrait maintenant être flotte librement en une seule pièce de tissu à Ames de la moyenne.
- Couper la rétine en 4 - 6 petits rectangles d'environ 23 mm avec une lame de scalpel incurvée en maintenant la rétine le long des bords avec les pinces, pour le manipuler en position. Évitez de pincer le tissu rétinien dans les rectangles. Prendre des morceaux provenant des parties centrales de la rétine, non loin de la périphérie.
- Transférer des morceaux de rétine avec un grand diamètre pipette Pasteur en matière plastique dans une boîte de Petri en plastique de 35 mm, dont le fond a été remplacée par une maille ayant une taille de grille inférieure à 1 mm. Fixer la boîte de Pétri dans le tiers supérieur d'un ballon de bécher ou conique et immergez morceaux rétiniennes dans bu Medium Amesbbled carbogène.
4. Embedding de Retinal Pieces en Agarose
- Soigneusement transférer 2 - 3 pièces rétiniennes dans une boîte de 35 mm en plastique Petri, avec certains de moyen de l'Ames. Il est plus pratique d'utiliser un grand diamètre en plastique pipette Pasteur pour le transfert. Dans cette étape, l'orientation exacte des pièces de la rétine n'a pas d'importance.
- Éliminer autant que possible de la moyenne du reste de Ames avec une pipette Pasteur en verre. Dès que le liquide a été éliminé passer à l'étape 4.3. Ne pas laisser sécher le tissu rétinien.
- Recouvrir immédiatement les pièces rétiniennes avec 2 ml d'agarose dissous (37 ° C). Compte tenu de la taille mentionnée à l'étape 3.10, les morceaux ne se recroquevillent dans le agarose.
- Dans l'agarose liquide, pousser doucement pièces rétiniennes au fond de la boîte de Pétri. La couche de cellules ganglionnaires doit être orientée vers le bas. Utiliser un microscope stéréo pour le jugement de la position exacte. Pour le positionnement, la poignée pi rétinienneeces avec une petite spatule. Positionner la rétine aussi rapide et précis que possible, car l'agarose se solidifie rapidement.
- Disposer les morceaux de rétine parallèles au fond du récipient en verre; sinon sections seront tangentielle ou oblique. Des pièces individuelles ne doivent pas toucher les uns les autres, mais ne devraient pas être trop éloignés. Essayez de placer des morceaux de la rétine plus ou moins au même niveau horizontal.
- Mettez boîte de Pétri en verre avec des morceaux rétiniennes intégrés dans le réfrigérateur (4-6 ° C) pendant au moins 2 min. Cela va rapidement durcir l'agarose pour un traitement ultérieur. Dès que la gélose a polymérisé procéder à l'étape suivante.
5. Montage de Retinal Pieces
- Retirez délicatement le bloc d'agarose contenant des morceaux rétiniennes de la boîte de Pétri. Utilisez une spatule ou d'un dispositif similaire pour soulever le bloc d'agarose du verre. En raison des forces d'adhérence, ce qui peut se révéler très difficile. Cependant, éviter de casser labloc d'agarose. Réaliser cela et toutes les étapes ultérieures à la température ambiante.
- Placer le bloc d'agarose sur une lamelle de verre et d'ajuster sa taille avec une lame de scalpel. Laissez 1 - 2 mm d'agarose sur chaque côté des pièces de la rétine. La taille finale du bloc devrait être d'environ 1,066 mm (10 mm se réfère à la hauteur du bloc, 6 mm à la longueur de son bord).
- Coller le bloc d'agarose pour le porte-échantillon de l'vibratome en utilisant un adhésif instantané. rétiniennes pièces doivent être situés à la partie supérieure du bloc haut de 10 mm et orienté parallèlement à sa surface, tandis que le fond est fixé sur le support.
- Couvrir le bloc immédiatement en versant le Ames précédemment barboter de la moyenne dans le bac tampon du vibratome.
6. Préparation de sections vibratome Horizontal
- Démarrez sectionner. Dans un premier temps, définir l'épaisseur de tranchage manuellement jusqu'à ce que des fragments de tissu rétinien apparaissent dans la tranche. Ensuite, changer les paramètres dans l'étape 2.3. Étant donné que lerétine de souris est seulement d'environ 200 um d'épaisseur, il n'y aura pas plus de 2 - 3 tranches par bloc d'agarose.
- Retirer les sections du bac tampon avec une tige de verre et de les transférer à 2 ml Ames moyenne dans un plat de 35 mm de Pétri.
- Sections de magasins immédiatement dans un incubateur à 37 ° C (5% de CO 2/55% O 2). L'agarose entourant les sections restera solide dans l'incubateur et peut être utilisé pour gérer les sections sans endommager la rétine. Une meilleure qualité de découpe est obtenue lors du stockage à 37 ° C dans l'atmosphère respective par rapport à la moyenne de oxygénées Ames à TA. Les sections peuvent être utilisées immédiatement ou peuvent être conservés jusqu'à 4 heures dans l'incubateur avec de bons résultats physiologiques.
- Incluez prochaines pièces rétiniennes en agarose et de répétition Sections 4 - 6.
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Representative Results
En tranches horizontales de la rétine de souris, les corps cellulaires horizontaux peuvent être facilement identifiés en fonction de leur morphologie unique avec plusieurs dendrites primaires sortant d'un corps de cellule polygonale (figure 1A). les corps cellulaires horizontales situées à proximité de la surface de la tranche sont couramment accessibles pour des électrodes de patch-clamp. Pendant l' enregistrement, les cellules ont été remplis avec un colorant fluorescent, révélant leur arborisation dendritique complexe, qui ressemblait de près la morphologie des cellules horizontales axonales portant de la rétine de la souris intacte 8 (figure 1B). Étiquetage des pédicules de cône avec fluorescéine couplé agglutinine d' arachide a montré une relation spatiale étroite entre pédicules de cône et dendrites de cellules horizontales (Figure 1C). À quelques exceptions près, tous les pédicules de cône au sein de champ dendritique de la cellule horizontale ont été contactés par des processus dendritiques.
ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Pour prouver que les contacts entre les cônes et les cellules horizontales étaient fonctionnelles, patch-clamp enregistrements ont été réalisés à partir des corps cellulaires horizontales Dans des conditions adaptés à l'obscurité, les réponses actuelles étaient. caractérisé par un grand courant entrant accompagné de modérée à haute fréquence l' activité synaptique (figure 2A). l'écart par rapport à la ligne de base et les courants post - synaptiques excitateurs ont été causés par la libération constante de glutamate dans l'obscurité, l' activation postsynaptique AMPA- et de type kainate glutamate récepteurs 9. événements synaptiques individuels ont été caractérisés par une forme d' onde monophasique ou des trajectoires de courant plus complexes (figure 2B). La présence d' une activité postsynaptique tonique suggère que le glutamate est libéré au niveau des contacts synaptiques entre les photorécepteurs des cônes et des dendrites de cellules horizontales représentées sur la figure 1C.Horizocellules NTAL enregistrées ont répondu aux changements d'intensité lumineuse, ce qui indique que la cascade de transduction du signal dans les photorécepteurs de cône était aussi intact et fonctionnel dans une préparation de tranche horizontale. En raison de la réduction de la libération du transmetteur, la tonique intérieure actuelle de cellules horizontales adaptés à l' obscurité a été inhibée et l' activité synaptique est apparu clairement diminué au cours de la présence d'un stimulus de lumière de plein champ (1.300 W / cm 2, 470 40 nm) (Figure 3A). De même, le passage à l' obscurité d'un état de lumière adapté a provoqué un courant vers l' intérieur et augmentation de l' activité synaptique (figure 3B). De plus, de brèves impulsions électriques (1-15 V, 1 ms) ont été appliquées par l'intermédiaire d'une électrode de stimulation bipolaire platine-iridium pour dépolariser les photorécepteurs de cône dans le voisinage d'un corps de cellule horizontale. La libération induite par stimulation de glutamate évoquée grande amplitude des courants postsynaptiques excitateurs dans la cellule horizontale enregistrée (figure 3C). En sommaire, ces résultats montrent de façon convaincante que la synapse entre les cônes photorécepteurs et des cellules horizontales peut être manipulée expérimentalement soit par la lumière de stimulus endogène ou par la dépolarisation contrôlée d'éléments présynaptiques.
Figure 1: Morphologie et les contacts synaptiques de cellules horizontales dans une tranche Préparation Horizontal. Une cellule horizontale (flèche) situé à proximité de la surface de la tranche a été visualisée avec Dodt optique de contraste. Barre d'échelle = 10 pm (A). Pour les expériences d'imagerie, une cellule horizontale était remplie d'Oregon Green 488 BAPTA-1 (100 uM) par l'intermédiaire d'une plaque-électrode, qui est toujours fixée à la cellule. Barre d'échelle = 10 pm (B). Superposition d'une cellule horizontale de colorant injecté et le réseau de pédicules de cône marqués à la fluorescéine couplée à agglutinine d'arachide révèle des contacts synaptiques putatifs. Barre d'échelle = 10 pm (C). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Activité Synaptic enregistrée à partir d' une cellule du corps horizontal. Le total des cellules d' enregistrement voltage-clamp à un potentiel de maintien de -60 mV montre à haute fréquence l' activité synaptique tonique (A). À la résolution temporelle plus élevée (B), les événements synaptiques afficher des formes d' ondes monophasiques (flèche) ou plus trajectoires actuelles complexes (pointes de flèche). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3: Les réponses actuelles des organismes cellulaires horizontaux évoqués par la lumière et la stimulation électrique. réponse Lumière d'un corps cellulaire horizontale adaptée à l'obscurité enregistrée à -60 mV potentiel de maintien. Illumination plein champ inhibe la tonique courant entrant et réduit l' activité synaptique (A). Un corps de cellule horizontale lumière adaptée enregistrée dans les mêmes conditions affiche un courant entrant suivant un flash sombre accompagnée d'augmentation de l' activité synaptique dans l' obscurité (B). Les lignes horizontales en A et B représentent le moment de la relance. Stimulation extracellulaires par de brèves impulsions électriques induit de grande amplitude des courants postsynaptiques excitateurs en raison de la libération synchronisée de glutamate de photorécepteurs de cône (C). potentiel de maintien: -60 mV. La flèche indique le cadencement de l'impulsion de stimulation. courants tronqués au début de la trace représentent des artefacts de stimulation..com / fichiers / ftp_upload / 55173 / 55173fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Contrairement aux tranches verticales, la morphologie dendritique des neurones orientés radialement comme cellules horizontales et cellules amacrines est bien conservé. Par rapport aux préparations de la rétine entière, ces types de cellules sont facilement accessibles pour les microélectrodes et peuvent être étudiés par les techniques d'électrophysiologie et d'imagerie. Ici, nous nous sommes concentrés sur la rétine externe; Cependant, une approche similaire a été rapporté en particulier pour les cellules amacrines de la rétine interne 10.
Les propriétés de la préparation de tranche horizontale ont plusieurs implications pour les études fonctionnelles. Le nombre de contacts synaptiques entre les cônes photorécepteurs et des cellules horizontales postsynaptiques était presque impossible à distinguer de la rétine intacte. contacts synaptiques étaient fonctionnels, montrant la libération tonique de neurotransmetteur dans le noir. La synapse pourrait être activé soit par des stimuli endogènes comme la lumière / transitions sombres ou par stimulation bipolaire externe.
La technique présentée ici est principalement limitée aux neurones orientés horizontalement. Par conséquent, il est possible d'enregistrer les photorécepteurs et les cellules bipolaires intactes dans une tranche horizontale, étant donné que les axones des cellules bipolaires sont tronqués. En outre, il est impossible de contrôler parfaitement le niveau de sectionner. Une seule pièce rétinienne might donc être coupé à un niveau indésirable, par exemple entre les segments extérieurs et intérieurs de photorécepteurs. L'augmentation du nombre de pièces de la rétine dans un seul bloc d'augmentations agarose chances d'un bon plan de sectionner au moins en une seule pièce.
La préparation de tranche horizontale est bien adapté à l'étude des propriétés uniques de ruban synapses de bâtonnets et des cônes photorécepteurs. Jusqu'à présent, nous avons utilisé un système knock-out animal pour étudier le rôle des protéines présynaptiques complexin 3 et complexin 4 sur la transmission synaptique entre les cônes photorécepteurs et des cellules horizontales 11. Il est également possible d'étudier les propriétés des récepteurs post - synaptiques de neurotransmetteur, comme indiqué précédemment 9.
Les applications futures comprendront l'étude des protéines synaptiques basées sur des lignées de souris transgéniques avec des techniques électrophysiologiques et d'imagerie. Il sera également possible d'enquêter sur la pro biophysiquepriétés de jonctions lacunaires entre les cellules horizontales. Etant donné que les réponses de lumière peut être mesurée, la technique est également utilisée pour étudier le codage de stimuli endogènes au premier synapses du système visuel. Il est possible d'effectuer la préparation dans l'obscurité pour éviter adaptation à la lumière du tissu, sinon les réponses de lumière seront en grande partie conique entraînée.
En résumé, la préparation tranche horizontale représente une nouvelle approche pour accroître l'accessibilité des synapses individuelles comme condition préalable à l' étude de leurs propriétés fonctionnelles dans la rétine des mammifères 12.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ames' Medium | Sigma | A1420 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Carbogen | Air Liquide | ||
| Agarose | Sigma | A9045 | |
| 35 mm Petri dish (plastic) | Nunc Thermofisher | 150318 | |
| Glass Petri dish | Chemoline | 50-1470-40 | |
| Isoflurane | Dispensary university hospital | ||
| Vibratome injector blade | Biosystems | 39053250 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200 | |
| Vibrocheck | Leica Microsystems | ||
| Microwave | |||
| Water bath | |||
| Forceps | |||
| 20 G needles | |||
| Spring scissors | |||
| Curved scalpel blades | |||
| Stereo microscope | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Glass Pasteur pipette |
References
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