Summary
Hemos desarrollado una preparación rebanada horizontal de la retina de mamíferos adultos con el plano de seccionamiento en paralelo a la superficie de la retina. campos dendríticas de las neuronas de la retina orientadas nonradially no fueron truncados, lo que permite el estudio de las técnicas de procesamiento de señales con patch-clamp y de imagen.
Abstract
el tramo preparativos verticales están bien establecidos para estudiar los circuitos y la transmisión de la señal en la retina de mamíferos adultos. El plano de seccionamiento en estas preparaciones es perpendicular a la superficie de la retina, lo que es ideal para el estudio de las neuronas orientados radialmente como fotorreceptores y células bipolares. Sin embargo, las grandes cenadores dendríticas de las células horizontales, células amacrinas de campo amplio, y las células ganglionares son en su mayoría truncado, dejando marcadamente reducida la actividad sináptica en estas células. Mientras que las células ganglionares y células amacrinas desplazadas se pueden estudiar en una preparación de todo ello montado de la retina, células horizontales y células amacrinas ubicadas en la capa nuclear interna sólo son de difícil acceso para los electrodos en el tejido retina conjunto.
Para lograr la máxima accesibilidad y la integridad sináptica, hemos desarrollado una rodaja de preparación horizontal de la retina del ratón, y estudiamos la transmisión de señales en la sinapsis entre los fotorreceptores y horizontalCélulas. seccionamiento horizontal permite (1) la identificación visual fácil e inequívoca de los cuerpos celulares horizontales para la orientación del electrodo, y (2) la preservación de los campos dendríticas de células horizontales extendidos, como requisito previo para el cono de entrada sináptica intacta y funcional a las dendritas de células horizontales.
Las células horizontales de los cortes horizontales exhibieron actividad sináptica tónica en la oscuridad, y ellos respondieron a breves destellos de luz con una reducción de la actividad sináptica actual y la disminución hacia el interior. pruebas de inmuno indica que casi todos los conos dentro del campo de una célula dendrítica horizontal establecen sinapsis con las dendritas sus periféricos. La preparación rebanada horizontal es por lo tanto muy adecuado para estudiar las propiedades fisiológicas de las neuronas de la retina horizontalmente extendidos, así como la transmisión de la señal sensorial y la integración a través de las sinapsis seleccionados.
Introduction
La información visual se codifica como un patrón espacio-temporal dinámica de la activación de los fotorreceptores, y la sinapsis cinta entre los fotorreceptores y neuronas de segundo orden determina la transferencia de aguas abajo de la información visual. La preparación rebanada vertical de la retina de mamífero es una herramienta muy valiosa para estudiar el procesamiento de señales en las vías verticales, es decir, entre los fotorreceptores y células bipolares, y entre las células bipolares y algunos tipos de células amacrinas 1, 2, 3, 4.
Sin embargo, seccionamiento verticales siempre provoca el truncamiento grave de los campos dendríticas de muchas neuronas de la retina, lo que lleva a una pérdida considerable de los contactos sinápticos. Especialmente en la retina externa, las células horizontales se ven afectados debido a sus campos dendríticas extendidos lateralmente extendidas y sus sistemas de terminales del axón 5. En una línea verticalrodaja de preparación, la entrada sináptica de cientos de terminales de cono fotorreceptores a las dendritas de una célula horizontal se reduce a unos pocos contactos dispersos. Esto podría ser suficiente para estudiar las propiedades de las sinapsis individuales, pero lo hace de ninguna manera representan las capacidades de procesamiento de señal que subyacen a la activación sincronizada de las sinapsis cinta fotorreceptor.
Por lo tanto, hemos desarrollado una preparación rebanada horizontal, lo que deja casi todo el fotorreceptor cono de entrada sináptica a las dendritas de células horizontales intacto y funcional. El plano de carreras de seccionado paralelo a la superficie de la retina, idealmente corte a través de la capa nuclear interna entre las células horizontales y células amacrinas. Por lo tanto, las rebanadas horizontales de la retina externa son creados que contienen, en el sitio presináptico, fotorreceptores con segmentos interior y exterior, así como terminales sinápticas, y células horizontales y células bipolares en el sitio postsináptica. Esta preparación es muy adecuado to investigar las entradas sinápticas coordinadas en las dendritas de células horizontales por todos los conos dentro de su campo dendríticas. Por lo tanto, podría resultar útil para comprender mejor el funcionamiento de la sinapsis cinta fotorreceptor, que es crucial para la transferencia de la información visual de la matriz de la activación de los fotorreceptores en una respuesta postsináptica.
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Protocol
Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices para los experimentos con animales emitidos por la República Federal de Alemania.
NOTA: Debido a que el tejido de la retina esté desprovisto de oxígeno durante prolongados partes de este procedimiento, todos los pasos que deben llevarse a cabo lo más rápido posible. Los ratones deben ser adaptados a la oscuridad, al menos 3 horas antes de la disección. Para evitar la adaptación a la luz de la retina, la preparación y el corte debe ser llevado a cabo bajo la luz roja tenue.
1. Preparación de los medios de comunicación y otros productos químicos
- Preparar Ames 'Medium 6. Después de la disección, sumergir tejido de la retina en el medio de Ames 'en todo momento.
- Disolver 2,2 g de Ames medio y 298 mg en HEPES 250 ml de agua destilada. La concentración de HEPES será de 5 mM. Agitar suavemente hasta que se disuelven todas las partículas.
- Medio burbuja Ames 'a temperatura ambiente con carbógeno (95% de oxígeno, 5% cochedióxido de Bon) durante al menos 5 min. carbógeno de alimentación con una pipeta Pasteur de vidrio a la solución. Conectar la pipeta Pasteur través de un tubo apropiado a la salida del regulador de gas.
- Añadir 475 mg de sodio-bicarbonato a la solución. La adición de bicarbonato después de burbujeo evita la precipitación de carbonato de calcio.
- Preparar agarosa de baja temperatura de gelificación. Se requiere de agarosa para incrustar de tejido de la retina durante el corte vibratome.
- Disolver 180 mg de agarosa en 9 ml de medio de Ames y 1 ml de agua destilada. Utilizar un microondas para calentar lentamente la solución de agarosa hasta que se disolvieron todos los sólidos. El calor dentro de 5 - 10 seg incrementos para evitar el desbordamiento. Solución debe ser clara y transparente.
- Tienda disolvió agarosa en baño de agua a 37 ° C durante la duración del procedimiento.
2. Configuración de la Vibratome
NOTA: Todas seccionamiento se ha llevado a cabo con lavibratome enumerados en la Tabla de Materiales. Los ajustes indicados se refieren a este tipo de solamente vibratome. Para más detalles sobre vibratome seccionamiento de tejido neural por favor refiérase a la referencia 7.
- Coloque la cuchilla vibratome inyector en soporte de la cuchilla.
- Medir la desviación vertical de la hoja con el dispositivo "VibroCheck". Utilice el tornillo de ajuste en el soporte de la cuchilla para inclinar la pala hasta que quede paralela al plano de corte. La posición exacta de la hoja es necesaria para evitar efectos de persianas venecianas en la superficie de sección y para producir una sección plana que contiene células vivas en su superficie.
- Establecer vibratome a los siguientes parámetros: amplitud, 1,00; velocidad, 0,20; espesor, 180-200 micras.
3. La disección de la retina del ratón
- Anestesiar a adultos C57BL / 6 ratones por vaporización de aproximadamente 1 ml de isoflurano en un recipiente hermético. Cuando la anestesia es completa, la eutanasia a los animales por dislocación cervical. losratón no debe ser mayor de 3 meses, de lo contrario la calidad de las rodajas se deteriorará.
- Retire la bola del ojo mediante la colocación de una pinza curva debajo del ojo. levantando suavemente la bola del ojo expondrá el nervio óptico. Cortar el nervio óptico con una tijera primavera y transferir la bola del ojo a una placa de Petri de 35 mm que contiene 2 ml de Ames Medium.
- Llevar a cabo todos los pasos subsiguientes en el escenario de un microscopio estereoscópico. Ajuste el aumento a un valor que permite un control visual óptimo de los siguientes procedimientos (pasos 3.4 a 3.9).
- Perforar la córnea en la transición a la esclerótica con unas pinzas de punta o una aguja 20 G. Durante este paso, estabilizar el globo ocular con otros fórceps. Tenga cuidado de no dañar la retina con el dispositivo de punción.
- Inserte las tijeras de primavera en el pequeño orificio realizado en el paso 3.3 y cortar un círculo alrededor de la córnea. Una vez más, estabilizar la bola del ojo con pinzas durante el corte. Mantenga la incisión muy cerca de la superficie a fin de no cut en la retina.
- Retire cuidadosamente la córnea, el cristalino y el cuerpo vítreo con una pinza. El cuerpo vítreo comprende sólo una fina capa transparente en la parte posterior del ojo. Sin embargo, es esencial para vibratome seccionamiento que el cuerpo vítreo es completamente eliminado.
- En la placa de Petri, la posición de la copa ocular de una manera que se mira a través del agujero hacia abajo sobre la retina. El borde de la abertura debe consistir solamente tejido de la esclerótica. Si el corte circular (paso 3.4) se ha llevado a cabo demasiado cerca del ecuador de la copa ocular, tejido de la retina también estará presente cerca de la incisión. Tenga cuidado de no dañar a continuación, la retina en el paso 3.8.
- Coge la esclerótica con unas pinzas y romper cuidadosamente el tejido de separación. Es esencial no se rompa la retina durante este paso. Si es necesario, separar la retina de la ora serrata estabilizando la parte escleral del tejido con las pinzas y con cuidado despegando de la retina con las otras pinzas. Mantener las pinzas cerradas; Nunca manejar la retina con pinzas ya que el tejido es muy suave y dará paso inmediatamente.
NOTA: En este paso, la retina y el resto de la copa ocular se conecta sólo a la cabeza del nervio óptico. - Cortar el sitio de unión en la cabeza del nervio óptico con las tijeras de primavera. La retina ahora debe estar flotando libremente como una sola pieza de tejido en el medio de Ames.
- Cortar la retina en 4 - 6 pequeños rectángulos de aproximadamente 23 mm utilizando una hoja de bisturí curvo mediante la celebración de la retina a lo largo de los bordes con el fórceps, para manipularlo en su posición. Evitar pellizcar el tejido de la retina dentro de los rectángulos. Tome las piezas de la parte central de la retina, no muy lejos de la periferia.
- Transferencia de piezas de la retina con un diámetro grande pipeta de plástico Pasteur a una placa petri de plástico 35 mm, el fondo de la cual ha sido sustituida por una malla con tamaño de malla de menos de 1 mm. Fijar la placa de Petri en el tercio superior de un matraz de vaso de precipitados o cónica y sumergir piezas de la retina en bu Medium Ames 'bbled con Carbógeno.
4. Incorporación de la Retina Piezas de agarosa
- transferir cuidadosamente 2 - 3 piezas de la retina en una placa Petri de plástico de 35 mm junto con algunos de los Ames 'Medium. Es más conveniente usar un plástico de gran diámetro pipeta Pasteur para la transferencia. En este paso, la orientación exacta de las piezas de la retina no importa.
- Eliminar la mayor cantidad posible de Medio el restante Ames 'con una pipeta Pasteur de vidrio. Tan pronto como el fluido ha sido retirado continúe con el paso 4.3. No deje que la retina seco del tejido.
- Inmediatamente cubrir piezas de la retina con 2 ml de agarosa disuelto (37 ° C). Dado el tamaño mencionado en el paso 3.10, las piezas no se cerrarán hasta dentro de la agarosa.
- Dentro de la agarosa líquido, empujar suavemente piezas de la retina a la parte inferior de la placa de Petri. La capa de células ganglionares debe estar boca abajo. Use un microscopio estereoscópico para la determinación de la posición exacta. Para el posicionamiento, manejar pi retinaeces con una pequeña espátula. Coloque la retina tan rápido y preciso como sea posible ya que la agarosa se solidifica rápidamente.
- Organizar piezas retinianas paralelos al fondo de la placa de vidrio; de lo contrario secciones serán tangencial u oblicua. Las piezas individuales no deben tocarse entre sí, sino que además no deben estar demasiado separados. Trate de colocar las piezas de la retina más o menos en el mismo nivel horizontal.
- Ponga el vidrio placa de Petri con piezas de retina incrustados en el refrigerador (4 - 6 ° C) durante al menos 2 minutos. Esto se endurecerá rápidamente la agarosa para su posterior procesamiento. Tan pronto como la agarosa ha polimerizado proceder con el paso siguiente.
5. Montaje de la Retina Piezas
- Retirar con cuidado el bloque de agarosa que contiene piezas de la retina de la placa de Petri. Utilice una espátula o un dispositivo similar para levantar el bloque de agarosa del vidrio. Debido a las fuerzas de adhesión, esto puede llegar a ser bastante difícil. Sin embargo, no romper labloque de agarosa. Llevar a cabo esta y todas las etapas posteriores a la temperatura ambiente.
- Coloque el bloque de agarosa sobre un cubreobjetos de vidrio y ajustar su tamaño con una hoja de bisturí. Deja de 1 - 2 mm de agarosa en cada lado de las piezas de la retina. El tamaño final del bloque debe ser alrededor de 1,066 mm (10 mm se refiere a la altura del bloque, 6 mm a la longitud de la arista).
- Pegue el bloque de agarosa para el soporte de la muestra de la vibratome utilizando un adhesivo instantáneo. piezas de retina se debe colocar en la parte superior de la alta bloque de 10 mm y paralelos orientados a su superficie, mientras que la parte inferior está fijada en el soporte.
- Cubrir el bloque inmediatamente vertiendo el Medio Ames previamente burbujeado 'en la bandeja de amortiguamiento de la vibratome.
6. Preparación de Secciones Vibratome Horizontal
- Empezar a cortar. En primer lugar, establecer el grosor de cortar manualmente hasta fragmentos de tejido de la retina aparecen en el corte. A continuación, cambie a la configuración en el paso 2.3. Dado que laretina del ratón es de sólo 200 m de espesor, habrá no más de 2-3 rebanadas por bloque de agarosa.
- Retire las secciones de la bandeja de tampón con una varilla de vidrio y transferirlos a 2 ml de medio de Ames 'en una placa de Petri de 35 mm.
- Secciones de las tiendas inmediatamente en una incubadora a 37 ° C (5% CO2 / 55% O2). La agarosa que rodea las secciones permanecerá sólido en la incubadora y puede ser usado para manipular las secciones sin dañar la retina. se obtiene una mejor calidad de la rebanada al almacenar a 37 ° C dentro de la atmósfera respectivo en comparación con Medio oxigenada Ames 'a TA. Las secciones se pueden utilizar inmediatamente o se pueden almacenar hasta 4 horas en la incubadora con buenos resultados fisiológicos.
- Incrustar siguientes piezas de la retina en agarosa y repetir las Secciones 4 - 6.
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Representative Results
En rebanadas horizontales de la retina del ratón, los cuerpos celulares horizontales podrían ser identificados fácilmente de acuerdo con su morfología única con varias dendritas primarias que salen de un cuerpo de células poligonales (Figura 1A). cuerpos celulares horizontales situados cerca de la superficie de la rebanada fueron rutinariamente accesible para los electrodos de patch-clamp. Durante las grabaciones, las células se llenaron con un colorante fluorescente, revelando su arborización dendrítica intrincada, que se parecía mucho a la morfología de las células horizontales de los axones de soporte de la retina del ratón intacto 8 (Figura 1B). Etiquetado de los pedículos de cono con aglutinina de cacahuete con fluoresceína junto mostró una estrecha relación espacial entre los pedículos de cono y las dendritas de células horizontales (Figura 1C). Con pocas excepciones, todos los pedículos de cono dentro del campo de la célula dendrítica horizontal fueron contactados por procesos dendríticas.
ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Para demostrar que los contactos entre los conos y las células horizontales eran funcionales, patch-clamp grabaciones se llevaron a cabo desde los cuerpos celulares horizontales En condiciones adaptados a la oscuridad, las respuestas actuales eran. caracterizado por una gran corriente de entrada acompañado de moderado a la actividad sináptica de alta frecuencia (Figura 2A). la desviación de la línea de base y las corrientes excitatorios postsinápticos fueron causadas por la constante liberación de glutamato en la oscuridad, la activación postsináptica AMPA y kainato tipo glutamato receptores 9. eventos sinápticas individuales se caracterizan por una forma de onda monofásica o trayectorias de corriente más complejos (Figura 2B). La presencia de la actividad postsináptica tónico sugiere que el glutamato fue lanzado en los contactos sinápticos entre los conos y las dendritas de células horizontales mostradas en la Figura 1C.horizoNTAL células grabadas respondieron a los cambios en la intensidad de la luz, lo que indica que la cascada de transducción de señales en los conos también estaba intacto y funcional en una rebanada preparación horizontal. Debido a la reducción de la liberación de transmisores, la tónica corriente de entrada de las células horizontales adaptados a la oscuridad fue inhibida, y la actividad sináptica apareció claramente disminuida durante la presencia de un estímulo luminoso de campo completo (1.300 W / cm2, 470 40 nm) (Figura 3A). Del mismo modo, el cambio a la oscuridad de un estado adaptado a la luz provocó una corriente hacia el interior y el aumento de la actividad sináptica (Figura 3B). Además, pulsos eléctricos breves (1-15 V, 1 ms) se aplicaron a través de un electrodo de estimulación bipolar de platino-iridio para despolarizar todos los fotorreceptores de los conos en las proximidades de un cuerpo celular horizontal. La liberación inducida por estimulación del glutamato evocada gran amplitud excitatorios postsinápticos corrientes en la celda horizontal grabada (Figura 3C). en sesumen, estos resultados demuestran de forma convincente que la sinapsis entre los conos y las células horizontales puede ser manipulado experimentalmente ya sea por la luz de estímulo endógeno o controlada por la despolarización de los elementos presinápticos.
Figura 1: Morfología y contactos sinápticos de las células horizontales en una rebanada Preparación Horizontal. Una célula horizontal (flecha) situado cerca de la superficie de la rodaja se visualizó con óptica de contraste de Dodt. Barra de escala = 10 m (A). Para experimentos de imagen, una célula horizontal se llenó con Oregon Green 488 BAPTA-1 (100 mM) a través de un parche de electrodo, que todavía está unido a la célula. Barra de escala = 10 micras (B). Superposición de una célula horizontal tinte inyectado y la matriz de los pedículos de cono marcadas con aglutinina de cacahuete con fluoresceína junto revela contactos sinápticos putativos. Barra de escala = 10 micras (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La actividad sináptica grabadas de un cuerpo celular horizontal. De células enteras de grabación de fijación de voltaje a un potencial de mantenimiento de -60 mV muestra de alta frecuencia la actividad sináptica tónico (A). A mayor resolución temporal (B), eventos sinápticos muestran formas de onda monofásica (flecha) o trayectorias actuales más complejos (puntas de flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3: respuestas actuales de los cuerpos de las células horizontales provocados por la luz y la estimulación eléctrica. respuesta a la luz de un cuerpo celular horizontal adaptada a la oscuridad grabado a -60 mV potencial de mantenimiento. Iluminación de campo completo inhibe la tónica corriente de entrada y reduce la actividad sináptica (A). Un cuerpo celular horizontal adaptado a la luz registrado en las mismas condiciones muestra una corriente hacia el interior siguiendo un destello oscuro acompañado por un aumento de la actividad sináptica en la oscuridad (B). Las líneas horizontales en A y B representan el momento del estímulo. Estimulación extracelular por pulsos eléctricos breves induce corrientes postsinápticas excitatorias de gran amplitud debido a la liberación sincronizada de glutamato de los fotorreceptores de los conos (C). Potencial de mantenimiento: -60 mV. La flecha indica el tiempo del impulso de estimulación. corrientes truncado en el comienzo de la traza representan los artefactos de estimulación..com / archivos / ftp_upload / 55173 / 55173fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En contraste con las rebanadas verticales, la morfología dendrítica de las neuronas orientados radialmente, como las células horizontales y amacrinas está bien conservado. En comparación con las preparaciones de retina enteros, estos tipos de células son fácilmente accesibles para los microelectrodos y pueden ser estudiados por ambas técnicas electrofisiológicas y de imagen. Aquí, nos centramos en la retina externa; Sin embargo, un enfoque similar se ha informado sobre todo para las células amacrinas de la retina interna 10.
Las propiedades del preparado en corte horizontal tienen varias implicaciones para los estudios funcionales. El número de contactos sinápticos entre conos fotorreceptores y células horizontales postsinápticos era casi indistinguible de la retina intacta. contactos sinápticos eran funcionales, muestra la liberación tónica de neurotransmisor en la oscuridad. La sinapsis podría ser activado por cualquiera de los estímulos endógenos como luz / oscuridad transiciones o por estimulación bipolar externo.
La técnica que aquí se presenta se limita principalmente a las neuronas orientados horizontalmente. Por lo tanto, no es posible grabar de fotorreceptores y células bipolares intactas en una rebanada horizontal, ya que se truncarán los axones de las células bipolares. Además, es imposible controlar perfectamente el nivel de corte. Una pieza única de la retina might así ser cortado en un nivel no deseado, por ejemplo entre los segmentos exteriores e interiores de los fotorreceptores. El aumento del número de piezas de la retina dentro de un bloque de agarosa aumenta las posibilidades de un plano correcto de seccionar al menos en una sola pieza.
La preparación rebanada horizontal es muy adecuado para el estudio de las propiedades únicas de las sinapsis cinta de conos y bastones fotorreceptores. Hasta ahora, se ha utilizado un sistema de knock-out animales para investigar el papel de las proteínas presinápticas complexina 3 y 4 complexina sobre la transmisión sináptica entre los conos y las células horizontales 11. También es posible estudiar las propiedades de receptores de neurotransmisores post-sinápticos, como se muestra anteriormente 9.
Las aplicaciones futuras incluirán el estudio de las proteínas sinápticas en base a líneas de ratones transgénicos con técnicas electrofisiológicas y de imagen. También será posible investigar la pro biofísicopiedades de las uniones comunicantes entre las células horizontales. Desde respuestas de la luz se puede medir, la técnica también se puede utilizar para investigar la codificación de los estímulos endógenos en la primera sinapsis del sistema visual. Es posible llevar a cabo la preparación en la oscuridad para evitar la adaptación a la luz del tejido, de lo contrario las respuestas de la luz serán en gran parte impulsado por el cono.
En resumen, la preparación rebanada horizontal representa un nuevo enfoque para aumentar la accesibilidad de las sinapsis individuales como requisito previo para el estudio de sus propiedades funcionales en la retina de mamíferos 12.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ames' Medium | Sigma | A1420 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Carbogen | Air Liquide | ||
| Agarose | Sigma | A9045 | |
| 35 mm Petri dish (plastic) | Nunc Thermofisher | 150318 | |
| Glass Petri dish | Chemoline | 50-1470-40 | |
| Isoflurane | Dispensary university hospital | ||
| Vibratome injector blade | Biosystems | 39053250 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200 | |
| Vibrocheck | Leica Microsystems | ||
| Microwave | |||
| Water bath | |||
| Forceps | |||
| 20 G needles | |||
| Spring scissors | |||
| Curved scalpel blades | |||
| Stereo microscope | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Glass Pasteur pipette |
References
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