Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

לא פולשני Published: May 8, 2017 doi: 10.3791/55180
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1, 1
1Werner Siemens Imaging Center, Department of Preclinical Imaging and Radiopharmacy, Eberhard Karls University of Tübingen, 2Department of Nuclear Medicine, Eberhard Karls University of Tübingen, 3Department of Dermatology, Eberhard Karls University of Tübingen

Summary

מאמר זה מסביר את היישום של הדמיה פלואורסצנטי באמצעות בדיקת הדמיה אופטית activatable לדמיין את הפעילות vivo של metalloproteinases מטריצה ​​מפתח בשני מודלים ניסיוניים שונים של דלקת.

Abstract

מאמר זה מתאר שיטה לא פולשנית metalloproteinases מטריצה ​​הדמיה (MMP) - פעילות על ידי בדיקה פלואורסצנטי activatable, באמצעות in vivo פלואורסצנטי הדמיה אופטית (OI), בשני מודלים עכבר שונים של דלקת: דלקת מפרקים שגרונית (RA) ואיש קשר מודל תגובה רגישות (CHR). אור עם אורך גל בחלון אינפרא אדום הקרוב (NIR) 650 - 950 ננומטר) מאפשר חדירת רקמה עמוקה יותר וקליטה אות מינימלית לעומת אורכי גל מתחת 650 ננומטר. היתרונות העיקריים באמצעות פלואורסצנטי OI היא שזה זול, מהיר וקל ליישם דגמים שונים של בעלי חיים.

בדיקות ניטור Activatable הם שתיקה אופטית במדינות שלהם מומת, אבל להיות מאוד פלורסנט כאשר מופעל על ידי פרוטאז. הופעל MMPs להוביל להרס רקמות לשחק תפקיד חשוב להתקדמות המחלה בתגובות hyperersensitivity סוג מתעכב (DTHRs) כגון RA ו CHR. יתר על כן, MMPs הםאת פרוטאזות מפתח עבור סחוס העצם השפלה והם המושרה על ידי מקרופאגים, fibroblasts ו chondrocytes בתגובה לציטוקינים פרו דלקתיים. כאן אנו משתמשים בדיקה כי הוא מופעל על ידי MMPs מפתח כמו MMP-2, -3, -9 ו -13 ו לתאר פרוטוקול הדמיה עבור קרוב הקרינה אינפרא אדום OI של פעילות MMP ב RA ו עכברים שליטה 6 ימים לאחר אינדוקציה המחלה גם כן כמו בעכברים עם אקוטי (1x אתגר) וכרוני (5x אתגר) CHR על האוזן הימנית לעומת האוזניים בריא.

Introduction

מחלות אוטואימוניות כגון דלקת מפרקים שגרונית (RA) או vulgaris פסוריאזיס מדורגות כמו תגובות של רגישות יתר מסוג מתעכב (DTHRs). RA 1 היא מחלה אוטואימונית נפוצה המאופיינת סינוביטיס מכרסמת והרס המפרק. 2 דלקת מפרקים מוסתים להפגין חדירה והתפשטות של תאי דלקת, ביטוי מוגבר של תאי פרו-דלקתיים מובילים להיווצרות pannus, סחוס והרס עצם. מחשוף 3, 4 של מולקולות תא מטריקס, כגון קולגן על ידי metalloproteinases מטריצה (MMPs), הוא חיוני עבור המרת רקמות אנגיוגנזה וגורם הרס רקמות. 5, 6 תגובות רגישות-יתר לתקשר (CHR) מאופיין צבירה של נויטרופילים שמובילים פרץ חמצונים. 7 בדומה RA, MMPs ב CHR הם involVed ב המרה רקמות, הגירה תא אנגיוגנזה על מנת ליצור דלקת כרונית.

כדי לחקור RA, גלוקוז 6-פוספט איזומראז (GPI) - סרום מזרק עכבר המודל שימש. 8 סרום מעכברים K / BxN מהונדס המכיל נוגדנים נגד GPI, הוזרק לתוך BALB / עכברים c נאיבי לאחר מכן דלקת ראומטית החלה להתפתח בתוך 24 שעות עם מקסימום של נפיחות בקרסול ביום 6 לאחר הזרקה בסרום GPI (ראה 1.1). כדי לנתח CHR כרונית, C57BL / 6 עכברים היו רגיש עם trinitrochlorobenzene (TNCB) על הבטן. האוזן הימנית נתגלתה עד 5 פעמים החל משבוע לאחר הרגישות (ראה גם 1.1 ו -1.2).

Noninvasive חיה קטנה OI היא טכניקה המבוססת על in vivo החקירה של אותות ניאון, chemiluminescent ו- bioluminescent, אשר משמשים בעיקר במחקר פרה קליני. הנתונים הכמותיים הנרכשים מספקים תובנות למולקמנגנוני ular באיברים ורקמות של בריא כמו גם במודלים של בעלי חיים חולים ניסיוני, ומאפשר האורך מעקב מדידות (למשל להעריך פרופילים בתגובה טיפוליים in vivo). יתרון גדול של מחקרים ארוכים טווח הוא ההפחתה של מספרי בעלי חיים, כמו באותן החיות ניתן למדוד במחקרי מעקב במספר נקודות זמן במקום להשתמש בעכברים שונים לכל נקודת זמן. הרזולוציה של OI מאפשרת הדמיה תפקודית מפורטת של איברים ואף מבני רקמות קטנים יותר בחיות מעבדה.

השימוש מסנן עירור ופליטה ספציפי עם ספקטרום שידור צר, הגנה נגד אור מפוזר על ידי lightproof "תיבה כהה" ואת מכשיר טעון מצמידים רגיש (CCD) מצלמה, אשר מקורר במכשירים רבים עד -70 ° C , מאפשר מאוד מדידות ספציפיות ורגישות של אותות הקרינה.

באמצעות סוכני ניאון עם excitation- ופליטה-ספקטרה בחלון הקרינה האינפרה-אדום הקרוב (650 - 950 ננומטר), אות-לרעש ניתן לשפר יחסים משמעותיים. חלון הקרינה האינפרה-אדום הקרוב מתאפיין קליטה נמוכה יחסית של האות על ידי ההמוגלובין ומים וכן קרינה אוטומטית רקע נמוך. 9 זה מאפשר עומק החדירה של עד 2 ס"מ רקמות של חיות קטנות. OI-בדיקות יכולות לטפל יעד ישירות (למשל על ידי נוגדן הנקרא קרינה) או יכולות להיות מופעלת ברקמת היעד (למשל על ידי פרוטאזות). בדיקות OI Activatable שותקים אופטיים בצורתם המומתת בשל העברת אנרגית תהודת פורסטר (סריג) כדי מחצית מרווה, אשר מעבירה את אנרגית העירור בתוך מולקולת לתחום אחר. אם הצבע הוא ביקע (על ידי הפרוטאז למשל) האנרגיה כבר לא יועברו בתוך המולקולה אות ניאון יכול להיות מזוהים על ידי OI. זה מאפשר תכנון של בדיקות OI עם specificit גבוההy עבור תהליכים ביולוגיים ברורים אות לרעש-יחסים מעולים.

הפרוטוקול הבא מסביר בפירוט על הכנת החיות, מדידות OI באמצעות בדיקת OI Activatable לתמונת MMP-2, -3, -9 ו -13 פעילות in vivo ושני דגמים ניסיוניים של דלקת (RA, CHR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים המתוארים במאמר זה, בעקבות הקווים המנחים והסטנדרטים הבינלאומיים של טיפול ושימוש בבעלי מעבדה, אושרו על ידי הוועדה המקומית לרווחת בעלי חיים ואתיקה של ועדת המדינה Tuebingen, גרמניה. 8 - 12 שבועות BALB / C ו C57BL / 6 עכברים נשמרו על 12 שעות: 12 שעות אור: מחזור כהה היו שוכנו IVCs ותנאים סביבתיים סטנדרטיים ב 22 ± 1 מעלות צלזיוס בקבוצות של 2 - 5 עם מים גישה למודעה .

1. הכנה חומרית

  1. לדלל את צבע OI עבור קרוב אינפרא אדום הדמיה פלואורסצנטי על פי גיליון הנתונים בהתאמה ישירות לפני ההזרקה. צבע oi activatable (בדיקה מסחרית עם עירור ב 680 ננומטר) כדי למדוד MMPs ב vivo מוכן להשתמש בריכוז של 20 nmol ב 1.5 מ"ל 1x PBS. נער בעדינות או מערבולת את הפתרון לפני השימוש. OI צבע ניתן לאחסן 2 - 8 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים כאשר מוגן מפני האור. לקבלת תוך ורידי (IV) זריקות להכין צנתר ורידי. השתמש 20 U (0.5 מ"ל) מזרק אינסולין מלאים תמיסת מלח 0.9% (המכיל 10 יחידות הזרקה של הפרין 50 מ"ל), ו מחט 30-מד מחובר קטטר פוליאתילן. להזריק את המינון המומלץ של 2 nmol לכל עכבר של צבע OI.

אינדוקציה 2. של דלקת מפרקים שגרונית לבין התגובה לתקשר רגישות יתר כרונית

  1. דלקת מפרקים שגרונית:
    1. לדלל 100 μL של בסרום (שנצבר K / BxN עכברים 10) נוגדנים המכיל (AB) נגד איזומראז גלוקוז-6-פוספט (GPI) 1: 1 עם PBS 1x (200 μL) כדי לגרום RA. אחסן את הסרום המדולל ב -80 מעלות צלזיוס. נהלים מפורטים אינדוקציה של RA מתוארים על ידי ואח Monach. 8.
    2. כדי לגרום RA, להרים כל עכבר בעדינות בזנב להזריק 200 μL של intraperitoneal בסרום מדולל (IP) ביום 0 של tהוא הניסוי. לאחר הזריקה במקום העכבר ישירות לתוך הכלוב שלה.
    3. לחלופין, למדוד את קוטר הקרסול של כל הקרסול, לפני זריקות א.ב. ולהגדיר "ניקוד מפרקי" ( איור 1 א ). המשך המדידה של נפיחות בקרסול יומי עד יום 6 לאחר הסרום GPI באמצעות מכשיר מדידה מכני (מיקרומטר).
    4. להזריק את הצבע oi activatable (שלב 1.1 - 1.2), כדי למדוד vivo MMP פעילות IV לתוך הווריד הזנב של עכברים RA ביום 5 לאחר הזרקת GPI-serum לתוך וריד הזנב של עכברים שליטה. בצע ניסויים הדמיה אופטי 24 שעות לאחר הזרקת הווריד הזנב.
  2. תגובה רגישות תגובה:
    1. עבור רגישות של C57BL / 6 עכברים, להכין פתרון TNCB 5% מומס תערובת של 4: 1 של אצטון / שמן.
    2. להרדים C57BL / 6 עכברים באמצעות 1.5% isoflurane vaporized ב 100% חמצן (1.5 L / min). לאחר עכברים מורדמים, למקם אותו עצמית מטורף חרוט האף (חתך 5 מ"ל פוליאתילן מזרק, המחובר צינור 1.5% isoflurane%) ולשמור על הרדמה. החל משחת עיניים וטרינר על בעלי חיים הרדים כדי למנוע יובש בעיניים בזמן הרדים.
    3. לגלח את הבטן בזהירות (2 x 2 ס"מ) באמצעות גוזם שיער קטן חיה. הימנע מפגיעה בעור, שכן זה יכול להוביל אותות ניאון ספציפיים בתוך החיה והוא יכול להשפיע על תוצאות המחקר.
    4. החל 80 μL של פתרון TNCB 5% באיטיות באזור הבטן מגולח באמצעות פיפטה 100 μL כדי לרגש את החיה. מניחים את העכבר בעדינות בחזרה לתוך הכלוב שלה דואג להבטיח כי העיניים של העכבר לא באים במגע עם מצעים כדי למנוע פגיעה בקרנית ולהימנע טמפרטורות גוף נמוך במהלך שלב ההחלמה.
    5. שישה ימים לאחר רגישות, להכין פתרון TNCB 1% (מומס בתערובת של 9: 1 של אצטון / שמן) ולהחיל 20 μL באוזן ימין באמצעות פיפטה כדי לעורר CHSR חריפה כרונית."> 1
      1. התחל עם האתגר 1 st משני צידי האוזן הימנית עם 20 μL של פתרון 1% TNCB בעזרת פיפטה 100 μL וחזור האתגר מדי יום שני עד חמש פעמים (יום 15 לאחר סנסיטיזציה) כדי לעורר CHR (איור 1B) . למדוד עובי האוזן יומי, באמצעות מכשיר מדידה מיקרומטר.
    6. להזריק את צבע OI activatable (בדיקה מסחרית עם עירור ב 680 ננומטר) (שלב 1.1-1.2) כדי למדוד את פעילות MMP in vivo בעכברי CHR 12 שעות לאחר האתגר. בצע ניסויי הדמיה אופטית 24 שעות לאחר זנב וריד להזרקה (iv).

3. הכנת בעלי חיים עבור דימות אופטי

  1. עכבר חלף צ'או (לפחות הדמית 3 ימים לפני כן) צ'או נמוכה או שאינו פלואורסצנטי (למשל, מנגן חינם) כדי למנוע את ההפרעה של קרינה אוטומטית (סביב 700 ננומטר) עם אות הקרינה של סוכני OI בשימוש.
  2. מניח את החיהכדי הרדמה תיבת להרדים באמצעות 1.5% ISO% isoflurane vaporized עם חמצן (1.5 L / min) (חמצן יכול להיות מוחלף על ידי אוויר אבל צריך להיות סטנדרטי בתוך ניסוי אחד).
  3. כאשר העכבר הוא הרדים בעליל, למקם אותו חרוט האף עצמו (לבנות על ידי לחתוך 5 מזרק פוליאתילן מ"ל, מחובר צינור 1.5% isoflurane%) ולשמור על הרדמה.
  4. לגלח את החיה בזהירות באתר היעד (2 ס"מ x 2 ס"מ) באמצעות גוזם שיער קטן חיה. הימנע מפגיעה בעור, שכן זה יכול להוביל אותות ניאון ספציפיים בתוך החיה והוא יכול להשפיע על תוצאות המחקר.
    הערה: השיער יכול לספוג את האות הקרינה במהלך OI (תלוי בלחץ העכבר, ספיגה פחות או יותר הוא ציין) בהתאם לאזור של ריבית (החזר ROI).
  5. עבור הזרקת iv , מניחים את זנב העכבר במים מחוממים, כדי לעורר vasodilation, בעדינות לטהר את העור באתר ההזרקה עם אלכוהול, ולהתחיל על ידי הצבת catheter בבאתר הדיסטלי של הזנב. מניח את "לחתוך" קצה המחט, בזווית של 20 מעלות לתוך וריד הזנב ולבדוק את הנחת הנכון של הקטטר על ידי מחדש השעיית המזרק.
  6. אם את הקטטר ממוקם כראוי, להחליף את המזרק ולהזריק את החללית OI (2 ננומול). לאחר הזרקה, להחליף את המזרק להזריק 25 μL של תמיסת מלח 0.9% ל מלא ברור הנפח המת של צינור פוליאתילן.
    הערה: בפעם מחצית חי הרקמות של צבע OI בשימוש (בדיקה מסחרית עם עירור ב 680 ננומטר) למדידת פעילות MMP in vivo היא 72 h. כדי להבטיח אישור מלא, מחדש הזרקה של הצבע אינה מומלצת לפני 7 ימים לאחר הזרקה מוקדמת.

4. דימות אופטי

  1. מניחים פלסטיק שחור או גיליון נייר את הקופסה השחורה של הסורק-OI במרכז שדה הראייה (FOV).
  2. הגדרת פרוטוקול מדידה ולבחור את הגל הנכון (עירור: 680 ± 10 ננומטר ו eמשימה: 700 ± 10 ננומטר) ופרמטרים הדמיה.
    הערה: במערכות OI מסוימות, ההגדרה עבור מספר צבעי הדמיה מוגדרת מראש.
  3. כדי לבחור את הפרוטוקול הנכון עבור הדמיה פלואורסצנטי, לפתוח את תוכנת הדמיה (המסופקים על ידי היצרן) ולאתחל את המערכת. רוב מצלמות CCD צריך להתקרר לטמפרטורת העבודה שלהם, וזה יכול לקחת 10 דקות. לקבלת תוצאות אמינות, המתן עד שהמערכת תהיה מוכנה.
  4. שים לב ב vivo מערכת הדמיה רכישת לוח הבקרה צצים למעלה וכל זוג מסנן נבחר ייצג תמונה אחת ברצף. במקרה זה, לרכוש תמונה אחת עם זוגות המסנן עבור צבע מסחרי עם גירוי ואת פליטת אורך גל של 680 ± 10 ננומטר ו 700 ± 10 ננומטר, בהתאמה, ולהתחיל את המדידה (לחץ על "רצף רכישת"). לקבלת הוראות מפורטות יותר, עיין במדריך של היצרן.
  5. לייבל את התמונות כראוי ולשמור את המידע "ערוך תמונהתוויות "חלון, אשר יהיה לצוץ בעקבות" רצף לרכוש ".
  6. קח סריקה בסיסית של כל חיה לפני ההזרקה של צבע OI, או להשתמש בחיות שליטה נאיבי כדי להבדיל את הרקע האות.
  7. H לאחר הזרקת הווריד הזנב של צבע OI, במקום החיות במרכז של FOV, בעמדה כדי למדוד את האות הגבוהה ביותר במערכת OI, ולהתחיל את המדידות.
    הערה: חשוב: היפותרמיה יכולה להשפיע באופן משמעותי על התפלגות חומרי ההדמיה. ודא כי הבמה מחומם עד 37 ° C, כדי למנוע היפותרמיה של החיה. הדמיה יכולה להתבצע בו זמנית עם בעלי חיים בקבוצות של 1 עד 5 עכברים. בחר את הגודל של FOV בהתאם למספר בעלי חיים למדוד בו זמנית. באפשרותך לצלם תמונת שדה בהירה כדי לבדוק אם כל עכבר גלוי.

5. ניתוח נתונים

הערה: בצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנת התמונה הבאההפרוטוקול של היצרן.

  1. עבור מדידות של RA, השתמש יחידת מכויל של פליטת הפוטון כפי שמוצג באיור 2 , בעוד CHSR כרונית הם בתמונה כמו עוצמת האות באחוזים (יעילות).
  2. כדי לצייר ROIs באופן ידני, השתמש בצלחת הכלי. לניתוח של תמונות RA להשתמש במעגל סטנדרטי, ממוקם סביב האות הגבוהה ביותר בכל הקרסוליים וכפות של כל חיה. כדי לנתח את CHSR, מניחים את החזרים ROI סביב האוזן הימנית והשמאלית בהתאם לתמונת השדה הבהיר.
  3. כדי למדוד את פליטת הפוטון או ערכי עוצמת האות בהחזר ROI המסוים, לחץ על "מדידה". המערכת תספק ערכים בהחזר על ההשקעה המתואר לניתוח סטטיסטי תיאורתי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לגרום דלקת מפרקים שגרונית (RA) בעכברים BALB / ג נאיבי, חיות הוזרקו IP עם נוגדנים עצמיים (1: 1 דילול עם PBS 1x) נגד GPI ביום 0. הדלקת המרבי (הקרסול ונפיחות) ב GPI-סרום זה המושרה דגם RA הוא על הזרקה פוסט יום 6 11. לכן, 2 ננומול של צבע OI activatable הוכן והזריק iv ב וריד הזנב של עכברים מפרקים ובעלי חיים בריאים ביום 5. 24 שעות לאחר הזרקה (יום 6), עכברים היו מורדמים צלמו כמתואר בסעיף 3 ( איור 1A).

כדי לגרום CHR, C57BL / 6 עכברים היו רגישים עם 5% TNCB ביום 0 בבית הבטן המגולחת. על רגישות פוסט יום 7 אתגר 1 st על האוזן הימנית באמצעות 1% TNCB נכתב. עד חמישה אתגרים (יום 15) בוצעו לגרום לדלקת כרונית. 7 12 שעות לאחר הדואר האתגר האחרון, 20 ננומול של צבע OI הוזרק IV. ביום 15, 24 הזרקה h פוסט, OI בוצע כמתואר לעיל (1B איור).

איור 2 מציג אות הקרינה משופרת בבירור רגליו האחוריות, בקרסוליים ובכפות רגליו הקדמיות של העכבר RA ביום 6 לאחר אינדוקציה המחלה, לעומת שליטה הקרסוליים (איור 2 א). ניתוח biodistribution של פעילות MMP באיברים של עכברי RA ועכברים בריאים הציג אות משופרת בחריפות את רגליו האחוריות, בקרסוליים ובכפות קדמיים כפות בלעדי המפרקים של עכברי RA. מעניין, קבענו אות MMP משופרת בשתי הכליות של כל העכברים RA נמדד, כשמשווים את הכליות של עכברים שליטה בריאים (איור 2 א; מימין). יתר על כן, מדדנו אות MMP משופרות לפעילות הכבד והמעי משנה אם עכברים הסובלים מדלקת מפרקים. אין הבדלים בין RA ועכברים בריאים נמצאו tהוא לבלב, ריאה, טחול ולב.

במהלך CHR כרונית (חמישה אתגרים TNCB באוזן ימין), מדדנו פעילות MMP מוגברת על האוזן דלקת ימין לעומת האוזן שליטה בריאה שמאל ( איור 2 ב ).

לפיכך, הנתונים שלנו מצביעים על תפקיד מרכזי של פעילות MMP במהלך התקדמות המחלה הן במודלים של מחלות דלקתיות.

Toolsets עבור פליטת אור פלואורסצנטי לאפשר כימות, למשל pmol של fluorochrome או מספר תאים אשר להביע הקרינה. ניתן להציג את הנתונים ב 1. ספירת: מציג מדידה לא מכויל של האירוע פוטון על המצלמה, 2. קרינה (פוטונים): מציין מדידה מכויל של פליטת הפוטון "פוטונים / השני / ס"מ 2 / סטראדיאן", אשר מומלץ עבור הדמיה הארה או 3. Rיעילות יעילות (פלואורסצנציה): מראה הקרינה פליטת הקרינה לכל כוח עירור האירוע, מומלץ מדידות פלואורסצנטי.

יתרון גדול של עבודה עם יחידות קרינה בזמן ניתוח תמונות OI הוא, כי הגדרות המצלמה ניתן לשנות במהלך ניסוי אחד, וזה אין כל השפעה על התמונות עצמה או את נתוני ROI נמדד, אשר נוסף מאפשר השוואת תמונות ממערכות IVIS שונים.

אזור הריבית (החזר ROI) מציין את תחום העניין הספציפי מהמשתמש בתמונה אופטית. סרגל הכלים מאפשר לצייר 3 החזרים ROI שונים: מדידה (מודד את עוצמת האות בהחזר על ההשקעה של התמונה), הרקע הממוצע (מודד את עוצמת האות הממוצעת באזור המוגדר על ידי המשתמש עבור הרקע), או נושא החזר ROI (מזהה נושא בעל חיים תמונה).

אם הנושא disממלא רקע נוקב גבוה לאותת עוצמה, לקבל מדידת ROI-מתוקן רקע ידי הפחתת אות הרקע (ROI) מן ROI היעד. קבע את מינימום התמונה קרוב לאפס כדי לקבוע את הקרינה האוטומטית או התרחשות הארת רקע טבעי התמונה שלך. קישור את התמונה (משתמש ספציפי) מוגדר עצמית רקע תמונה (ROI) אשר נמדדו בעיקר את התמונה הספציפית שנמדדה.

חצי כמותית ניתוחים של התמונות בוצעו על ידי ציור אזורים סטנדרטיים של עניין (ROIs) בשני קרסוליים שגרוניים לשלוט, כמו גם דלקת אוזניים בריאות באמצעות תוכנת תמונת חיים. רק ניתוחים סטטיסטיים תיאוריים בוצעו על נתונים vivo ב בכתב היד הזה, בשל מספר מספיק של בעלי חיים. ניתוח של עוצמת האות של קרסוליים שגרוניים בריאים או כפות הראה עוצמת אות MMP משופרת 7 של פי שיגרון, לעומת שליטת קרסוליים. עוצמת האות MMP גבוהה פי 3 זוהה בכפות הקדמיות של עכברים דלקתיים לעומת זה של בעלי חיים בריאים ( איור 3 א ).

ניתוח של האוזניים עם CHR חריפה כרונית לעומת אוזן שמאל שמאל שליטה הראה עלייה משמעותית MMP האות גם לאחר האתגר 1 st , אשר גדל עוד לאחר 3 ו נשאר באותה רמה עד האתגר 5 ( איור 3 ב ) . כתוצאה מזיהום עם אלרגן קשר על האוזן השמאלית עקב שריטה של ​​העכברים, קבענו עלייה קלה MMP האות בצד שמאל (לא TNCB תיגר) אוזן שליטה. התוצאות מציינות תפקיד חשוב של MMPs, evinced על ידי אות הקרינה מוגברת מאוד במהלך GPI- דלקת פרקים דלקת כרונית, כפי שנמדד על ידי OI.

עומס / 55,180 / 55180fig1.jpg"/>
איור 1: RA ו CHR דגם, זמן מהלך המחלה אינדוקציה נקודות זמן OI. (א) כמובן זמן של אינדוקציה RA BALB / ג עכברים (B) ו אינדוקציה CHR כרונית C57BL / 6 עכברים. סקירה כללית של בהתאמה נקודת זמן הדמית vivo ונקודות זמן ההזרקה קשורה של צבע OI למדידת פעילות MMP בשני הדגמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: MMP OI ב RA, CHR ובקרה בעלי חיים. (א) נציג תוצאות של פעילות MMP נמדדה עכבר מפרקי 6 ימים לאחר אינדוקצית GPI-דלקת פרקי עכבר בריא (צד שמאל). ראוי לציין אות גבוהה (Radiance (P / S / סנטימטר 2 / sr)) intההבדלים נצפו ב דלקת פרקים לעומת העכבר בריא. התמונה מימין מציגה את פעילות MMP בכפות האחוריות וכוללת את הקרסוליים, כפות הרגליים הקדמיות, הלבלב, הריאות, הטחול, הלב, הכליות, הכבד והמעיים של עכבר ה- GPI-Arthritis המקריב לאחר הזרקת צבע OI. OI חשף איתות גבוה בכפותיו הקדמיות, בקרסוליו ובכפותיו האחוריות של עכברי RA ובכבד ובמעיים, ללא קשר לשאלה אם העכברים הוזרקו בסרום GPI (עכברי RA) או בסרום שליטה (עכברי בקרה בריאים). (B) האות הקרינה MMP באוזניים עם CHR כרונית (משמאל) ושליטה בעלי חיים (מימין). האוזן הימנית דלקת (לערער 5 פעמים) מציג אות משופרת מאוד לעומת אוזניים שליטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2 <Br /> איור 3: ניתוח כמותי חצי של דלקתית וקרקעות דלקתיות ואוזן רקמות באמצעות OI. (א) חצי ניתוח כמותי של האות הקרינה ב RA ו חיות בריאה בכפות הקדמי מפרקים הקרסול. כפות קדמיות ארתריטיות ומפרקי קרסול מציגים איתות MMP (** p <0.05) (n = 3) גבוה יותר בהשוואה למפרקים בריאים ולכפות הקדמיות. הנתונים מוצגים כממוצע SD. (ב) ניתוח חצי כמותי של אוזניים שמאל וימין (תיגר) לאחר האתגר 1, 3 ו -5 th . אות MMP גדל באופן משמעותי מהאתגר הראשון ועד האתגר ה -5 וכבר הראה עוצמת אות מקסימלית באוזן הנכונה לאחר האתגר השלישי (** p <0.05) (n = 3) (אוזניים בקרה מזוהמות חלקית עם TNCB בשל העכברים שגירדו, דבר שיצר אות משופר שלא היה משמעותי). הנתונים מוצגים כממוצע± SEM. מבחן t של 2 זנב הסטודנטים שמש לנתח הבדלים בין הדלקת (קרסולי GPI-שיגרון, נכון אוזני מטופלים) ובקרה (קרסוליים מלאים, עזב אוזני מטופל) עבור שני הדגמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

OI הוא כלי מאוד שימושי, מהיר ולא יקר עבור פולשני בתחום ההדמיה המולקולרית vivo במחקר פרה-קליניים. חוסנה החברתי בפרט של OI הוא היכולת לנטר תהליכים דינמיים מאוד כמו תגובות דלקתיות. יתר על כן, OI מאפשר לעקוב אחר מהלך מחלה במשך תקופה ארוכה של זמן, החל מספר ימים עד שבועות.

יש OI מספר יתרונות על פני שיטות הדמיה vivo אחרים כגון טומוגרפיה פוזיטרונים-פליטה (PET) או הדמיה בתהודה מגנטית (MRI), כפי שהוא מאוד הזמן-, וחסכוני. ניתוח תפוקה גבוהה עם עד חמש חיות לרכישה אפשרי. יתר על כן, מספר רב של בדיקות, מיקוד בתהליכים ביולוגיים שונים, זמין. 12 כדי לספק מידע אנטומי נוסף, OI ניתן לשלב עם שיטות הדמיה אחרות כגון MRI או רנטגן. מגבלה נוספת היא עומק החדירה לרקמות הנמוך בהשוואה למשל ל Fבבדיקת PET unctional. יתר על כן כמות גדולה של בדיקות שמטרתן מטרות רבות ביולוגיות שונות זמינה. 12

השפעת ההרדמה אין לזלזל ב in vivo הדמיה. בעוד השפעות ספציפיות של הרדמה על תוצאות OI אינן מתאפיינות גם, הקבוצה שלנו הוכיחה בכמה מחקרי השפעת ההרדמה על תוצאות בבדיקת PET. 13, 14, 15 לדוגמה, פוקס ואח '. פרמטרי דם נתחו, כגון 2 PCO, pH ו לקטט לפני ואחרי סריקות PET באמצעות פרוטוקולי נשימת הרדמה שונים. זה היה מראה כי, שינויים משמעותיים PCO 2 רמות לקטט הרדים לעומת עכברי חמצן או אוויר לנשימה מודעים הובילו לשינויים משמעותיים בתוצאות PET. 14 הם מסיקים כי אפקט זה נגרם בעיקר על ידי נשימת חמצן subsequenלא חומצה הנשימה אצל בעלי חיים, המוביל לתוצאות שונות הדמיה PET.

סטנדרטיזציה של פרמטרים הרדמה, כמו O 2 ריכוז ומנות של תרופות הרדמה, כמו גם מניעת היפותרמיה לעזור למנוע כשלים שיטתית. כמובן, OI מוגבל על ידי תכונות פיזיות כגון פיזור אור, רקמות אוטומטי הקרינה ואת הנחתה אור 9 . מספר קבוצות מתמודדות עם בעיות אלה על ידי שילוב של תוצאות מקרוסקופיות של OI עם טכניקות אחרות כמו מיקרוסקופ פלואורסצנטי vivo או cytometry הזרימה.

ב vivo הדמיה של פעילות MMP על ידי MMP ספציפיים בדיקות activatable ניאון כבר בשימוש במספר מודלים ניסיוניים של דלקת כמו CHS, 7 אבל גם במחלות כמו איסכמיה מוחית, 16 מפרצת אבי העורקים, 17 אוטם שריר הלב 18ו 19 לוחיות טרשת עורקים וכן מודלים שונים של גידול. 20

לדוגמה, Cortez-Retamozo et al. חקר את הפעילות vivo של MMPs במודל של דלקת דרכי הנשימה אלרגית על ידי הזרקת בדיקה MMP activatable, 24 שעות לאחר יישום intranasal של ovalbumin בעכברים רגישים בעבר. 21 כדי לזהות את המיקום של פעילות MMP עוד קבוצה זו בשילוב טומוגרפי OI, סיבים אופטיים ברונכוסקופיה סיבים מיקרוסקופיה intravital על מנת לפקח על מהלך המחלה התגובה לטיפול בפירוט רב יותר. 21

גישות אחרות למדוד פעילות MMP vivo בעיקר להשתמש inhibitors של MMP כי להיקשר לאתר הפעיל של MMPs. McIntyre et al. תיאר גידול vivo הקשורים MMP-7 זיהוי באמצעות "פולימר מבוססי fluorogenic המצע", אשר משמש "proteolytמשואת IC "עבור MMPs במודל של xenograft של עכבר .22 הם מראים שפעילות MMP-7 יכולה להיות מזוהה באופן סלקטיבי על ידי הדמיה אופטית .23 בנוסף, אולסון ואחרים חקרו" פפטידים חודרים לתאים פעילים "(ACPPs) אשר מסוגלים למקד מודלים רבים של גידולי Xenograft, אך לא ניתן לספוג לתוך התא עד שהקשר הוא proteolyzed הם חקרו ACPPs אשר סלקטיבית MMP-2 ו MMP-9. 24 , 25

סימון של מעכבי MMP עם איזוטופים רדיואקטיביים עבור טומוגרפיה ממוחשבת של פוטון יחיד (SPECT) או הדמיה של PET שימש לבדיקת ביטוי MMP בטרשת עורקים 26 וסרטן 27 . במחקר שנערך לאחרונה מעכב MMP שכותרתו פלואורסצנטי הושווה בדיקה MMP- activatable. 28 מעכב MMP שכותרתו fluorescently הראה אות נמוך יותר לרעשביחס לעומת בדיקה activatable אבל נדרש זמן ספיגת קצר יותר.

ביומרקרים חדשים להעריך תכונות מפתח של פתופיזיולוגיה יכול להיות מנוצל מאומת על ידי OI. לדוגמה, התגובה לסכנות הקשורות לדפוסים מולקולריים (DAMP) היא אירוע מוקדם במהלך תגובה דלקתית. Vogl et al. השתמשו נוגדן שכותרתו Cy5.5 נגד S100A9 מדאיגה במודלים של דרמטיטיס עור באוזן חריפה, דלקת מפרקים המושרה קולגן וזיהום עם לישמניה הגדולות לפתח ביומרקר רגיש עבור סימנים מוקדמים של דלקת. 29

לסיכום, OI מייצג שיטה מהירה ויעילה למחקר פרה-קליני, המסוגל לחשוף מנגנונים חדשים של מחלות ב- vivo , המאפיינים מטרות מולקולריות חדשות, כמו גם מעקב אחר השפעות טיפוליות . עם זאת, תהליך אימות לאחר מכן עם טכניקות כמותיות יותר כמו PET עשוי להיות נדרש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים דניאל Bukala, נטלי Altmeyer ו Funda קיי לקבלת תמיכה טכנית מעולה. אנו מודים יונתן גפן, גרג באודן ופול Soubiran לעריכת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי ורנר סימנס-קרן והפקולטה לרפואה של אוניברסיטת טובינגן אברהרד Karls ( "" Promotionskolleg "") ועל ידי DFG דרך 156 CRC (C3 הפרויקט).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cornergel Gerhard Mann GmbH 1224635 ophthalmic ointment 
Forene Abbott GmbH 4831850 isoflurane
U40 insulin syringe Becton Dickinson and Company 324876
Heparin Sintetica 6093089
High-Med-PE 0.28 x 0.61 mm Reichelt Chemietechnik GmbH+Co 28460 polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm 
BD Regular Bevel Needles, 30 G Becton Dickinson & Co. Ltd. 305106 30 G injection cannula
RTA-0011 isoflurane vaporizer Vetland Medical Sales and Services LLC -
Artagain drawing paper Strathmore Artist Paper 446-8 coal black
IVIS Spectrum Perkin Elmer 124262 Optical imaging system
BD Regular Bevel Needles, 25 G Becton Dickinson and Company 305122
2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene Sigma Aldrich GmbH 7987456F TNCB
MMPSense 680 Perkin Elmer  NEV10126 fluorescent imaging dye
Oditest  Koreplin GmbH C1X018 mechanical measurment
Miglyol 812 SASOL - Oil
 BALB/C, C57BL/6 Charles River Laboratories  - Mice used for experiements
PBS Sigma Aldrich GmbH For dilution of the RA serum 
Pipette (100 µL) Eppendorf  Used for TNCB application 
shaver  Wahl  9962 Animal hair trimmer
Living Image  Perkin Elmer  Imaging software to measure OI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Veale, D. J., Ritchlin, C., FitzGerald, O. Immunopathology of psoriasis and psoriatic arthritis. Ann Rheum Dis. 64, 26 (2005).
  2. Harris, E. D. Rheumatoid arthritis. Pathophysiology and implications for therapy. N Engl J Med. 322 (18), 1277-1289 (1990).
  3. Lee, D. M., Weinblatt, M. E. Rheumatoid arthritis. Lancet. 358 (9285), 903-911 (2001).
  4. Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. J Clin Rheumatol. 11, S39-S44 (2005).
  5. Pap, T., et al. Differential expression pattern of membrane-type matrix metalloproteinases in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 43 (6), 1226-1232 (2000).
  6. Firestein, G. S., Paine, M. M. Stromelysin and tissue inhibitor of metalloproteinases gene expression in rheumatoid arthritis synovium. Am J Pathol. 140 (6), 1309-1314 (1992).
  7. Schwenck, J., et al. In vivo optical imaging of matrix metalloproteinase activity detects acute and chronic contact hypersensitivity reactions and enables monitoring of the antiinflammatory effects of N-acetylcysteine. Mol Imaging. 13, (2014).
  8. Monach, P. A., Mathis, D., Benoist, C. The K/BxN arthritis model. Curr Protoc Immunol. 15, 22 (2008).
  9. Zelmer, A., Ward, T. H. Noninvasive fluorescence imaging of small animals. J Microsc. 252 (1), 8-15 (2013).
  10. Kouskoff, V., et al. Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity. Cell. 87 (5), 811-822 (1996).
  11. Fuchs, K., et al. In vivo imaging of cell proliferation enables the detection of the extent of experimental rheumatoid arthritis by 3'-deoxy-3'-18f-fluorothymidine and small-animal PET. J Nucl Med. 54 (1), 151-158 (2013).
  12. Schwenck, J., et al. Fluorescence and Cerenkov luminescence imaging. Applications in small animal research. Nuklearmedizin. 55 (2), 63-70 (2016).
  13. Mahling, M., et al. A Comparative pO2 Probe and [18F]-Fluoro-Azomycinarabino-Furanoside ([18F]FAZA) PET Study Reveals Anesthesia-Induced Impairment of Oxygenation and Perfusion in Tumor and Muscle. PLoS One. 10 (4), 0124665 (2015).
  14. Fuchs, K., et al. Oxygen breathing affects 3'-deoxy-3'-18F-fluorothymidine uptake in mouse models of arthritis and cancer. J Nucl Med. 53 (5), 823-830 (2012).
  15. Fuchs, K., et al. Impact of anesthetics on 3'-[18F]fluoro-3'-deoxythymidine ([18F]FLT) uptake in animal models of cancer and inflammation. Mol Imaging. 12 (5), 277-287 (2013).
  16. Liu, N., Shang, J., Tian, F., Nishi, H., Abe, K. In vivo optical imaging for evaluating the efficacy of edaravone after transient cerebral ischemia in mice. Brain Res. 1397, 66-75 (2011).
  17. Sheth, R. A., Maricevich, M., Mahmood, U. In vivo optical molecular imaging of matrix metalloproteinase activity in abdominal aortic aneurysms correlates with treatment effects on growth rate. Atherosclerosis. 212 (1), 181-187 (2010).
  18. Chen, J., et al. Near-infrared fluorescent imaging of matrix metalloproteinase activity after myocardial infarction. Circulation. 111 (14), 1800-1805 (2005).
  19. Wallis de Vries, B. M., et al. Images in cardiovascular medicine. Multispectral near-infrared fluorescence molecular imaging of matrix metalloproteinases in a human carotid plaque using a matrix-degrading metalloproteinase-sensitive activatable fluorescent probe. Circulation. 119 (20), e534-e536 (2009).
  20. Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).
  21. Cortez-Retamozo, V., et al. Real-time assessment of inflammation and treatment response in a mouse model of allergic airway inflammation. J Clin Invest. 118 (12), 4058-4066 (2008).
  22. McIntyre, J. O., et al. Development of a novel fluorogenic proteolytic beacon for in vivo detection and imaging of tumour-associated matrix metalloproteinase-7 activity. Biochem J. 377, 617-628 (2004).
  23. Scherer, R. L., VanSaun, M. N., McIntyre, J. O., Matrisian, L. M. Optical imaging of matrix metalloproteinase-7 activity in vivo using a proteolytic nanobeacon). Mol Imaging. 7 (3), 118-131 (2008).
  24. Olson, E. S., et al. In vivo characterization of activatable cell penetrating peptides for targeting protease activity in cancer. Integr Biol (Camb. 1 (5-6), 382-393 (2009).
  25. Duijnhoven, S. M., Robillard, M. S., Nicolay, K., Grull, H. Tumor targeting of MMP-2/9 activatable cell-penetrating imaging probes is caused by tumor-independent activation). J Nucl Med. 52 (2), 279-286 (2011).
  26. Schafers, M., Schober, O., Hermann, S. Matrix-metalloproteinases as imaging targets for inflammatory activity in atherosclerotic plaques. J Nucl Med. 51 (5), 663-666 (2010).
  27. Wagner, S., et al. A new 18F-labelled derivative of the MMP inhibitor CGS 27023A for PET: radiosynthesis and initial small-animal PET studies. Appl Radiat Isot. 67 (4), 606-610 (2009).
  28. Waschkau, B., Faust, A., Schafers, M., Bremer, C. Performance of a new fluorescence-labeled MMP inhibitor to image tumor MMP activity in vivo in comparison to an MMP-activatable probe. Contrast Media Mol Imaging. 8 (1), 1-11 (2013).
  29. Vogl, T., et al. Alarmin S100A8/S100A9 as a biomarker for molecular imaging of local inflammatory activity. Nat Commun. 5, 4593 (2014).

Tags

אימונולוגיה גליון 123 פלואורסצנטי הדמיה metalloproteinases מטריקס (MMPs) דלקת, דלקת מפרקים שגרונית (RA) קשר רגישות יתר (CHR)
לא פולשני<em&gt; בויבו</em&gt; פלואורסצנטי הדמיה אופטית של פעילות MMP דלקתית באמצעות Activatable פלואורסצנטי סוכן הדמיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schwenck, J., Maier, F. C.,… More

Schwenck, J., Maier, F. C., Kneilling, M., Wiehr, S., Fuchs, K. Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent. J. Vis. Exp. (123), e55180, doi:10.3791/55180 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter