Summary
هذه الورقة يفسر تطبيق التصوير الفلورسنت باستخدام مسبار التصوير الضوئي أكتيفاتابل لتصور النشاط في الجسم الحي من ميتالوبروتيناسس المصفوفة الرئيسية في اثنين من نماذج تجريبية مختلفة من الالتهاب.
Abstract
تصف هذه الورقة طريقة غير الغازية لتصوير المصفوفة ميتالوبروتيناسيس (مب) - النشاط من قبل التحقيق الفلورسنت أكتيفاتابل، عبر في الجسم الحي مضان التصوير البصري (أوي)، في اثنين من نماذج الماوس المختلفة من الالتهاب: التهاب المفاصل الروماتويدي (را) والاتصال فرط الحساسية رد فعل (شر) نموذج. ضوء مع الطول الموجي في الأشعة تحت الحمراء القريبة (نير) نافذة (650 - 950 نانومتر) يسمح اختراق أعمق الأنسجة والحد الأدنى من امتصاص إشارة مقارنة أطوال موجية أقل من 650 نانومتر. المزايا الرئيسية باستخدام مضان أوي هو أنها رخيصة وسريعة وسهلة التنفيذ في نماذج حيوانية مختلفة.
أكتيفاتابل تحقيقات الفلورسنت صامتة بصريا في الدول المعطل لها، ولكن تصبح الفلورسنت عالية عند تفعيلها من قبل الأنزيم البروتيني. تنشيط مبس تؤدي إلى تدمير الأنسجة وتلعب دورا هاما لتطور المرض في تأخر من نوع فرط الحساسية ردود الفعل (دثرس) مثل را و شر. وعلاوة على ذلك، مبس هيوالبروتياز الرئيسية للغضروف وتدهور العظام والتي تتسبب فيها الضامة، الخلايا الليفية والغضروفية استجابة للسيتوكينات الموالية للالتهابات. هنا نستخدم مسبار التي يتم تنشيطها من قبل مبس الرئيسية مثل مب-2، -3، -9 و -13 ووصف بروتوكول التصوير لمؤشر الأشعة تحت الحمراء القريب مضان أوي نشاط مب في را والسيطرة على الفئران بعد 6 أيام من تحريض المرض كذلك كما هو الحال في الفئران مع الحاد (التحدي 1X) والمزمنة (5X التحدي) شر على الأذن اليمنى مقارنة مع آذان صحية.
Introduction
تصنف أمراض المناعة الذاتية مثل التهاب المفاصل الروماتيزمي (RA) أو الشائع الصدفية كما من نوع تأخر تفاعلات فرط الحساسية (DTHRs). 1 RA هو مرض المناعة الذاتية شيوعا التي تتميز الزليل التآكل والتدمير المشترك. 2 التهاب المفاصل الملتهبة تثبت تسلل وانتشار خلايا التهابية، وزيادة التعبير الخلايا الموالية للالتهابات مما يؤدي إلى تشكيل متقطعة مزنية والغضاريف والعظام التدمير. 3، 4 انشقاق من جزيئات المصفوفة خارج الخلية، مثل مادة الكولاجين مصفوفة metalloproteinases (تقوم ال MMPs)، أمر ضروري لتحويل الأنسجة والأوعية الدموية ويسبب دمار الأنسجة. تتميز 5، 6 الاتصال فرط الحساسية ردود الفعل (لجنة حقوق الإنسان) من خلال تجميع العدلات مما يؤدي إلى انفجار الأكسدة. 7 على غرار RA، تقوم ال MMPs في لجنة حقوق الإنسان هي involفيد في تحويل الأنسجة، وهجرة الخلايا والأوعية الدموية من أجل إقامة التهاب مزمن.
للتحقيق RA، تم استخدام إيزوميراز الجلوكوز 6 فوسفات (GPI) حقن -serum نموذج الفأر. 8 من الأمصال المعدلة وراثيا الفئران K / BXN تحتوي على أجسام مضادة ضد GPI، تم حقنها ساذجة الفئران BALB / ج وبعد ذلك بدأ التهاب الروماتيزم لتطوير خلال 24 ساعة بحد أقصى من تورم الكاحل في يوم 6 بعد حقن GPI المصل (انظر 1.1). لتحليل CHR المزمن، وتوعية C57BL / 6 الفئران مع trinitrochlorobenzene (TNCB) على البطن. وطعن الأذن اليمنى تصل إلى 5 مرات بدءا 1 بعد أسبوع التوعية (انظر أيضا 1.1 و 1.2).
موسع OI الحيوانات الصغيرة هي تقنية تقوم على التحقيق في الجسم الحي من fluorescent-، chemiluminescent- وإضاءة الحيوية إشارات، والتي تستخدم أساسا في مجال البحوث قبل السريرية. البيانات نصف الكمية المكتسبة يعطي نظرة ثاقبة لmolecآليات ular في الأعضاء والأنسجة من صحية وكذلك نماذج تجريبية على الحيوانات المريضة، وتمكن طولية متابعة القياسات (على سبيل المثال لتقييم الشخصية الاستجابة العلاجية في الجسم الحي). وهناك ميزة كبيرة من الدراسات الطولية هي الحد من أعداد الحيوانات، كما يمكن قياس الحيوانات نفسها في متابعة الدراسات في عدة نقاط الوقت بدلا من استخدام الفئران مختلفة في نقطة زمنية. حل OI يسمح التصوير وظيفي مفصل لأجهزة وهياكل الأنسجة أصغر في حيوانات التجارب.
استخدام الإثارة وانبعاث المرشحات محددة مع مجموعة نقل الضيق، لتوفير الحماية ضد الضوء المتناثرة من قبل lightproof "مربع الظلام" وجهاز حساس اتهم جانب (CCD) وكاميرا، والتي يتم تبريد في العديد من الأجهزة وصولا الى -70 ° C ، ويسمح محددة للغاية والقياسات الحساسة من إشارات مضان.
باستخدام وكلاء الفلورسنت مع excitation- والانبعاثات الأطياف في إطار مضان القريب من الأشعة تحت الحمراء (650-950 نانومتر)، ونسب الإشارة إلى الضوضاء يمكن أن تحسن بشكل كبير. ويتميز نافذة مضان الأشعة تحت الحمراء القريبة من امتصاص منخفضة نسبيا من إشارة من الهيموجلوبين والمياه فضلا عن انخفاض الخلفية لصناعة السيارات في مضان. 9 وهذا ما يسمح عمق الاختراق تصل إلى 2 سم في أنسجة الحيوانات الصغيرة. يمكن OI-تحقيقات تتناول هدف مباشرة (مثلا عن طريق مضان الأجسام المضادة المسمى) أو يمكن تفعيلها في النسيج المستهدف (مثلا عن طريق البروتياز). تحقيقات منظمة اوكسفام الدولية Activatable صامتة بصريا في شكلها المعطل بسبب فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) إلى شاردة التبريد، والذي ينقل الطاقة الإثارة داخل جزيء إلى مجال آخر. إذا تم المشقوق الصبغة (بواسطة الأنزيم البروتيني على سبيل المثال) لم يعد يتم نقل الطاقة في جزيء ويمكن الكشف عن إشارة الفلورسنت التي كتبها OI. وهذا يسمح للتصميم تحقيقات OI مع specificit عاليةذ لعمليات بيولوجية متميزة والضوضاء نسب الإشارة إلى ممتازة.
ويوضح البروتوكول التالية بالتفصيل إعداد الحيوانات، القياسات OI OI باستخدام مسبار Activatable إلى صورة MMP-2، -3، -9 -13 والنشاط في الجسم الحي واثنين من نماذج تجريبية من التهاب (RA، لجنة حقوق الإنسان).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وجاءت جميع الإجراءات الموضحة في هذه الورقة، والمبادئ التوجيهية والمعايير الدولية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية الحيوان والأخلاق المحلية للبلد جنة توبنغن بألمانيا. تم الاحتفاظ بها 12 أسابيع من العمر BALB / ج و C57BL / 6 الفئران على 12 ساعة - 8: 12 ساعة ضوء: دورة الظلام وكان يضم في IVCs والظروف البيئية موحدة في 22 ± 1 ° C في مجموعات من 2-5 بالماء و الغذاء الإعلانية libitum الوصول.
1. تحضير المواد
- تخفيف الصبغة OI لالقريب التصوير مضان الأشعة تحت الحمراء وفقا لورقة البيانات الخاصة مباشرة قبل الحقن. الصبغة OI activatable (مسبار التجاري مع الإثارة في 680 نانومتر) لقياس تقوم ال MMPs في الجسم الحي هو على استعداد لاستخدام بتركيز 20 نانومول في 1.5 مل برنامج تلفزيوني 1X. يهز بلطف أو دوامة الحل قبل الاستخدام. ويمكن تخزين صبغ OI في 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر عندما محمية من الضوء. عن طريق الوريد ( 4 ) الحقن إعداد قسطرة الوريدية. استخدام حقنة الأنسولين 20 U (0.5 مل) مليئة محلول ملحي 0.9٪ (تحتوي على 10 وحدة حقن الهيبارين في 50 مل)، وإبرة 30 قياس تعلق على قسطرة البولي ايثيلين. حقن الجرعة الموصى بها من 2 نمول في الماوس من صبغ أوي.
2. تحريض التهاب المفاصل الروماتويدي والمزمن الاتصال فرط الحساسية رد فعل
- التهاب المفاصل الروماتويدي:
- تمييع 100 ميكرولتر من المصل (المكتسبة من الفئران K / بكسن 10 ) تحتوي على الأجسام المضادة (أب) ضد إيسوميراز الجلوكوز 6 الفوسفات (غي) 1: 1 مع برنامج تلفزيوني 1X (200 ميكرولتر) للحث را. تخزين المصل المخفف في -80 درجة مئوية. ويرد وصف الإجراءات التفصيلية لتحريض را من قبل موناش وآخرون. 8 -
- للحث را، ورفع كل الماوس بلطف عن طريق ذيله وحقن 200 ميكرولتر من المصل داخل الصفاق المخفف (إب) يوم 0 من tانه التجربة. بعد الحقن وضع الماوس مرة أخرى مباشرة في قفصه.
- اختياريا، وقياس أقطار الكاحل كل الكاحل، قبل الحقن AB وتعريف "نتيجة التهاب المفاصل" (الشكل 1A). مواصلة قياس تورم الكاحل يوميا حتى يوم 6 بعد GPI المصل باستخدام جهاز القياس الميكانيكية (ميكرومتر).
- حقن الصبغة OI activatable (خطوة 1،1-1،2)، لقياس النشاط في الجسم الحي MMP الرابع في الوريد ذيل الفئران RA في يوم 5 بعد الحقن GPI المصل وفي الوريد ذيل السيطرة على الفئران. إجراء تجارب التصوير الضوئي 24 ساعة بعد الحقن الذيل الوريد.
- الاتصال رد فعل فرط الحساسية:
- للتوعية C57BL / 6 الفئران، يعد حل TNCB 5٪ المذاب في 4: مزيج 1 من الأسيتون / النفط.
- تخدير C57BL / 6 الفئران باستخدام 1.5٪ الأيزوفلورين تبخيرها في الأكسجين 100٪ (1.5 لتر / دقيقة). مرة واحدة يتم تخدير الفئران، وضعه في جنون الذاتي البريد مخروط الأنف (خفض 5 مل البولي ايثيلين حقنة، متصلا 1.5 المجلد أنبوب٪ الأيزوفلورين) والحفاظ على التخدير. تطبيق البيطري مرهم العين على الحيوانات تخدير لمنع جفاف العينين في حين تخدير.
- حلق البطن بعناية (2 × 2 سم) باستخدام صغيرة الانتهازي شعر الحيوان. تجنب إصابة الجلد، وهذا يمكن أن يؤدي إلى إشارات الفلورسنت غير محددة داخل الحيوان ويمكن أن تؤثر على نتائج الدراسة.
- تطبيق 80 ميكرولتر من الحل TNCB 5٪ ببطء في منطقة البطن حلق باستخدام ماصة 100 ميكرولتر لتوعية الحيوان. ضع الماوس بلطف مرة أخرى إلى رعايتها أخذ القفص لضمان عيون الماوس، لا تأتي في اتصال مع الفراش لتجنب إصابة القرنية وتجنب درجة حرارة الجسم منخفضة خلال مرحلة الانتعاش.
- بعد ستة أيام التوعية، وإعداد حل TNCB 1٪ (المنحلة في 9: مزيج 1 من الأسيتون / النفط) وتطبيق 20 ميكرولتر في الأذن اليمنى باستخدام ماصة للحصول CHSR الحادة والمزمنة."> 1
- تبدأ مع التحدي 1ST على كلا الجانبين من الأذن اليمنى مع 20 ميكرولتر من محلول 1٪ تنب باستخدام ماصة 100 ميكرولتر وتكرار التحدي كل يوم ثان تصل إلى خمس مرات (يوم 15 بعد توعية) لاستخراج شر ( الشكل 1B ) . قياس سمك الأذن يوميا، وذلك باستخدام جهاز قياس ميكرومتر.
- حقن صبغ أوي أكتيفاتابل (التحقيق التجاري مع الإثارة في 680 نانومتر) (الخطوة 1.1-1.2) لقياس نشاط مب في الجسم الحي في الفئران شر 12 ساعة بعد التحدي. إجراء تجارب التصوير البصري 24 ساعة بعد الذيل حقن الوريد ( 4 ).
3. إعداد الحيوان للتصوير البصري
- التبديل تشاو الماوس (على الأقل 3 أيام قبل التصوير) إلى منخفضة أو عدم مضان تشاو (على سبيل المثال ، المنغنيز الحرة) لتجنب تدخل لصناعة السيارات في مضان (حوالي 700 نانومتر) مع إشارة مضان من وكلاء أوي المستخدمة.
- وضع الحيوان فيإلى مربع التخدير وتخدير باستخدام 1.5٪٪ إيسوفلوران يتبخر مع الأكسجين (1.5 لتر / دقيقة) (يمكن استبدال الأكسجين عن طريق الجو ولكن يحتاج إلى أن تكون موحدة في تجربة واحدة).
- عندما يتم تخدير الماوس بشكل واضح، ووضعه في مخروط الأنف عصامي (بناء من قبل حقنة 5 مل البولي ايثيلين قطع، متصلة أنبوب 1.5٪٪ إيسوفلوران) والحفاظ على التخدير.
- حلاقة الحيوان بعناية على الموقع المستهدف (2 سم × 2 سم) باستخدام الحيوانات الصغيرة المتقلب الشعر. تجنب إصابة الجلد، وهذا يمكن أن يؤدي إلى إشارات الفلورسنت غير محددة داخل الحيوان ويمكن أن تؤثر على نتائج الدراسة.
ملاحظة: الشعر يمكن أن تمتص إشارة مضان خلال أوي (تعتمد على سلالة الماوس، ويلاحظ أكثر أو أقل امتصاص) اعتمادا على المنطقة من الفائدة (روي). - لحقن الرابع ، ووضع ذيل الماوس في الماء تحسنت، للحث على توسع الأوعية، وتطهير بلطف الجلد في موقع الحقن مع الكحول، والبدء من خلال وضع القسطرة فيالموقع البعيدة من الذيل. وضع "قطع" حافة الإبرة في، في زاوية من 20 درجة في الوريد الذيل واختبار وضع الصحيح من القسطرة عن طريق إعادة تعليق حقنة.
- إذا تم وضع القسطرة بشكل صحيح، استبدال المحاقن وحقن التحقيق OI (2 نانومول). بعد الحقن، واستبدال المحاقن وحقن 25 ميكرولتر من 0.9٪ المالحة حل واضح تماما حجم القتلى من الأنبوب البولي ايثيلين.
ملاحظة: الأنسجة الوقت نصف عمر الصبغة OI المستخدمة (مسبار التجاري مع الإثارة في 680 نانومتر) لقياس النشاط MMP في الجسم الحي هو 72 ساعة. لضمان إزالة كاملة، إعادة حقن الصبغة لا ينصح في وقت سابق من 7 أيام بعد الحقن مسبق.
4. التصوير الضوئي
- وضع بلاستيكية سوداء أو ورقة ورقة في الصندوق الأسود للOI الماسح الضوئي في مركز مجال الرؤية (فوف).
- إعداد بروتوكول القياس واختيار الطول الموجي المناسب (الإثارة: 680 ± 10 نانومتر والبريدمهمة: 700 ± 10 نانومتر) و المعلمات التصوير.
ملاحظة: في بعض أنظمة أوي، الإعداد لعدة الأصباغ التصوير هو محدد مسبقا. - لاختيار البروتوكول الصحيح للتصوير مضان، وفتح برامج التصوير (المقدمة من قبل الشركة المصنعة) وتهيئة النظام. معظم كاميرات كسد تحتاج إلى تهدئة إلى درجة حرارة العمل، وهذا يمكن أن يستغرق 10 دقيقة. للحصول على نتائج موثوقة، انتظر حتى يصبح النظام جاهزا.
- مراقبة في الجسم الحي نظام التصوير اقتناء لوحة التحكم يطفو على السطح وسوف كل مرشح زوج مختارة تمثل صورة واحدة في التسلسل. في هذه الحالة، والحصول على صورة واحدة مع أزواج مرشح للصبغة التجارية مع والإثارة والانبعاث الموجي من 680 ± 10 نانومتر و 700 ± 10 نانومتر، على التوالي، وبدء القياس (اضغط على "الحصول على تسلسل"). لمزيد من التعليمات التفصيلية، يرجى الاطلاع على دليل الشركة المصنعة.
- تسمية الصور بشكل مناسب وحفظ المعلومات في "تحرير الصورةتسميات "، والتي سوف يطفو على السطح بعد" تسلسل اكتساب ".
- خذ مسح الأساس لكل حيوان قبل حقن صبغ أوي، أو استخدام الحيوانات السيطرة ساذجة للتمييز إشارة الخلفية.
- ساعة بعد حقن الوريد الذيل لصبغة أوي، ووضع الحيوانات في وسط فوف، في موقف لقياس أعلى إشارة في نظام أوي، وبدء القياسات.
ملاحظة: هام: انخفاض حرارة الجسم يمكن أن تؤثر بشكل كبير على توزيع وكلاء التصوير. تأكد من أن يتم تسخين المرحلة تصل إلى 37 درجة مئوية لتجنب انخفاض حرارة الجسم من الحيوان. التصوير يمكن أن يؤديها في وقت واحد مع الحيوانات في مجموعات من 1 إلى 5 الفئران. اختيار حجم فوف اعتمادا على عدد من الحيوانات لقياس في نفس الوقت. يمكنك التقاط صورة حقل مشرق للتحقق مما إذا كان كل فأرة مرئيا.
5. تحليل البيانات
ملاحظة: إجراء تحليل البيانات باستخدام برنامج الصورة التاليةبروتوكول الشركة الصانعة.
- لقياس RA، استخدام وحدة معايرة من انبعاث الفوتون كما هو مبين في الشكل 2، في حين أن الصورة CHSR المزمنة كما كثافة إشارة في المئة (الكفاءة).
- رسم رويس يدويا، استخدم لوحة الأداة. لتحليل الصور RA استخدام دائرة موحدة، توضع حول أعلى إشارة في كل الكاحلين والكفوف من كل حيوان. لتحليل CHSR، ضع رويس حول الحق كله، والأذن اليسرى وفقا للصورة حقل مشرق.
- لقياس الفوتون أو إشارة قيم الكثافة في العائد على الاستثمار، اضغط على "التدبير" رسم معين. وسيوفر النظام القيم في ROI رسمها للتحليل الإحصائي الوصفي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للحث على التهاب المفاصل الروماتيزمي (RA) في ساذجة الفئران BALB / ج، تم حقن الحيوانات الملكية الفكرية مع لصناعة السيارات في الأجسام المضادة (1: 1 تمييع مع برنامج تلفزيوني 1X) ضد GPI في يوم 0. الحد الأقصى للالتهاب (تورم الكاحل) في هذا GPI المصل التي يسببها RA النموذج هو يوم 6 وظيفة حقن 11. لذلك، تم إعداد 2 نانومول من الصبغة OI activatable وحقن الرابع في الوريد ذيل الفئران التهاب المفاصل والحيوانات الأصحاء في يوم 5. 24 ساعة بعد الحقن (اليوم 6)، تم تخدير الفئران وتصويرها كما هو موضح في في القسم 3 ( الشكل 1A).
للحث على لجنة حقوق الإنسان، وتوعية C57BL / 6 الفئران مع 5٪ TNCB يوم 0 في البطن حلق. في يوم 7 وظيفة التوعية الحادي والتحدي 1 على الأذن اليمنى باستخدام 1٪ TNCB بدأ. أجريت تصل إلى خمسة تحديات (يوم 15) للحث على التهاب مزمن. 7 12 ساعة بعد عشره التحدي الأخير، تم حقن 20 نانومتر من صبغ أوي الرابع . في يوم 15، 24 ساعة حقن بعد، تم تنفيذ أوي كما هو موضح أعلاه ( الشكل 1B ).
ويبين الشكل 2 إشارة مضان تعزيز واضح في الكفوف الخلفيتين والكاحلين والقدمين الكفوف من الماوس را في يوم 6 بعد تحريض المرض، مقارنة مع الكاحلين السيطرة ( الشكل 2A ). تحليل بيوديستريبوتيون من النشاط مب في أجهزة الفئران را والفئران صحية عرضت إشارة معززة بقوة في الكفوف الخلفيتين والكاحلين والقدمين الكفوف حصريا في المفاصل من الفئران را. ومن المثير للاهتمام، قررنا إشارة مب المحسنة في كلتا الكليتين من جميع الفئران را المقاسة، بالمقارنة مع الكلى من الفئران السيطرة الصحية ( الشكل 2A ، يمين). وعلاوة على ذلك، قمنا بقياس إشارة مب المحسنة في الكبد والأمعاء بغض النظر عما إذا كانت الفئران تعاني من التهاب المفاصل الروماتويدي. لم يتم العثور على أي اختلافات بين را والفئران صحية في روهو البنكرياس والرئة والطحال والقلب.
خلال كر المزمن (خمسة تحديات تنب في الأذن اليمنى)، قمنا بقياس نشاط مب زيادة عالية على الأذن الملتهبة الحق بالمقارنة مع الأذن السيطرة اليسرى صحية ( الشكل 2B ).
وهكذا، تشير بياناتنا دورا رئيسيا للنشاط مب أثناء تطور المرض في كل من نماذج الأمراض الالتهابية.
تولسيتس للتلألؤ بيولوجي ومضان تسمح الكمي، على سبيل المثال بمول من فلوريوكروم أو عدد الخلايا التي تعبر عن مضان. يمكن عرض البيانات في 1. التهم: يعرض قياس غير معايرة من حادث الفوتون على الكاميرا، 2. الإشعاع (الفوتونات): يشير إلى قياس معايرة للانبعاث الفوتون في "الفوتونات / الثانية / سم 2 / ستراديان"، وهو أوصت لالتلألؤ التصوير أو 3. rالكفاءة adiant (مضان): يظهر إشعاع الانبعاثات مضان في قوة الإثارة الحادث، وأوصت لقياسات مضان.
وهناك ميزة كبيرة للعمل مع وحدات الاشعاع في حين تحليل الصور OI هي، يمكن تغيير إعدادات الكاميرا التي خلال تجربة واحدة، وهذا ليس له أي تأثير على الصور نفسها أو بيانات قياس العائد على الاستثمار، والذي يسمح مزيد من الصور مقارنة من أنظمة IVIS مختلفة.
المنطقة ذات الاهتمام (ROI) يشير إلى منطقة معينة من الاهتمام من قبل المستخدم في صورة بصرية. شريط الأدوات تمكن من رسم 3 رويس مختلفة: القياس (تدابير كثافة إشارة في العائد على الاستثمار من الصورة)، متوسط الخلفية (التدابير متوسط كثافة إشارة في مجال المعرفة من قبل المستخدم لخلفية)، أو العائد على الاستثمار يخضع (يحدد الحيوان الموضوع في صورة).
إذا ديس تخضعيلعب خلفية غير محددة عالية إشارة نفسها، للحصول على قياس العائد على الاستثمار لتصحيح الخلفية عن طريق طرح إشارة الخلفية (ROI) من العائد على الاستثمار المستهدف. تعيين الحد الأدنى صورة قريبة من الصفر لتحديد مضان السيارات أو التي تحدث بشكل طبيعي التلألؤ الخلفية في الصورة. ربط الصورة إلى (بالمستخدم) محددة ذاتيا صورة الخلفية (ROI) والتي تم قياسها في المقام الأول إلى صورة معينة قياسها.
أجريت التحاليل شبه الكمية من الصور عن طريق رسم المناطق موحدة من الفائدة (رويس) في آذان كل من التهاب المفاصل والسيطرة على الكاحلين، وكذلك في الملتهبة وصحية باستخدام المعيشة البرمجيات صورة. أجريت فقط التحليلات الإحصائية الوصفية على المجراة البيانات في هذا المخطوط، وذلك بسبب قلة عدد الحيوانات. وأظهر تحليل لكثافة إشارة من الكاحلين التهاب المفاصل وصحية أو الكفوف 7 أضعاف تعزيز MMP كثافة إشارة في التهاب المفاصل، مقارنة للسيطرة على الكاحلين. تم الكشف عن 3 أضعاف أعلى كثافة إشارة مب في الكفوف الأمامية من الفئران التهاب المفاصل مقارنة مع أن من الحيوانات السليمة ( الشكل 3A ).
تحليل آذان مع الأورام الحادة والمزمنة شر مقارنة مع الأذن السيطرة دون منازع اليسار أظهرت زيادة كبيرة إشارة مب حتى بعد التحدي 1ST، والتي زادت بعد 3 وظل على نفس المستوى حتى التحدي 5 ال ( الشكل 3B ) . نتيجة للتلوث مع مسببات الحساسية الاتصال على الأذن اليسرى بسبب خدش الفئران، قررنا زيادة قليلا إشارة مب في اليسار (لا تنب تحدى) الأذن السيطرة. وتشير النتائج إلى دور مهم من مبس، يتضح من إشارة مضان زيادة عالية خلال التهاب المفاصل غي والتهاب مزمن، كما تقاس أوي.
لواد / 55180 / 55180fig1.jpg "/>
الشكل 1: را و شر نموذج، دورة الزمن من التعريفي المرض والنقاط الزمنية ل أوي. (A) دورة الزمن من تحريض را في الفئران بالب / ج (B) والتحريض شر المزمن في C57BL / 6 الفئران. نظرة عامة على كل منها في الجسم الحي التصوير نقطة الوقت ونقاط الحقن المرتبطة بها من صبغ أوي لقياس نشاط مب في كلا النموذجين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مب أوي في را، شر والحيوانات السيطرة. (A) ممثل النتائج من نشاط مب قياسها في الماوس المفاصل 6 أيام بعد غي-التهاب المفاصل تحريض وفأرة تحكم صحية (الجانب الأيسر). إشارة عالية بشكل ملحوظ (راديانس (p / s / سم 2 / سر)) إنتلوحظت إنسيتي في التهاب المفاصل مقارنة مع الماوس صحية. الصورة على اليمين يعرض النشاط مب في الكفوف الخلفيتين وتشمل الكاحلين، الكفوف الصدارة، البنكرياس، الرئة والطحال والقلب والكلى والكبد والأمعاء من التضحية الماوس التهاب المفاصل الروماتويدي بعد حقن صبغ أوي. كشفت أوي إشارة عالية في الكفوف الصدارة والكاحلين والقدمين الخلفيتين من الفئران را والكبد والأمعاء بغض النظر عما إذا كانت الفئران حقن مع مصل غبي (را الفئران) أو مصل السيطرة (الفئران السيطرة الصحية). (B) مب إشارة مضان في آذان مع كر المزمن (يسار) والحيوانات السيطرة (يمين). الأذن اليمنى الملتهبة (تحدى 5 مرات) يعرض إشارة معززة للغاية مقارنة مع آذان السيطرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
<ر /> الشكل 3: نصف التحليل الكمي من الملتهبة وصحي الكواحل والأنسجة الأذن عن طريق منظمة أوكسفام الدولية. (A) تحليل شبه كمي للإشارة مضان في RA والحيوانات السليمة في الكفوف الأمامية والمفاصل في الكاحل. الكفوف الأمامية التهاب المفاصل والمفاصل في الكاحل تعرض لكبير (** ف <0.05) (ن = 3) أعلى إشارة MMP مقارنة مفاصل الكاحل صحية والكفوف الأمامية. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD. (B) تحليل شبه كمي لليسار واليمين (تحدى) آذان بعد 1 ش، 3 الثالثة والتحدي ال 5. يتم زيادة MMP إشارة بشكل ملحوظ من أول من التحدي ال 5 وأظهر بالفعل الحد الأقصى لكثافة إشارة في حق الطعن في الأذن بعد التحدي 3 الثالثة (** ف <0.05) (ن = 3) (ملوثة آذان تحكم جزئيا مع TNCB بسبب الفئران الخدش. أنتجت هذه إشارة معززة لم يكن معتدا به). يتم تقديم البيانات كمتوسط± سيم. تم استخدام اختبار t-ستايل للطالب لتحليل الاختلافات بين الالتهابات (الكاحل المفصلي، آذان المعالجة الصحيحة) والسيطرة (الكاحلين السيطرة، الأذنين غير المعالجة اليسرى) لكلا النموذجين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أوي هو أداة مفيدة جدا وسريعة وغير مكلفة لغير الغازية في الجسم الحي التصوير الجزيئي في البحوث قبل السريرية. قوة معينة من أوي هو القدرة على رصد عمليات ديناميكية للغاية مثل الاستجابات الالتهابية. وعلاوة على ذلك، أوي يسمح واحد لمتابعة مسار المرض لفترة طويلة من الزمن، تتراوح بين أيام وأسابيع.
أوي لديه العديد من المزايا على غيرها في طرائق التصوير المجراة مثل التصوير المقطعي البوزيترون الانبعاثات (بيت) أو التصوير بالرنين المغناطيسي (مري)، كما هو الوقت جدا، وفعالة من حيث التكلفة. تحليل الإنتاجية العالية مع ما يصل إلى خمسة حيوانات في اكتساب ممكن. وعلاوة على ذلك، هناك عدد كبير من تحقيقات، تستهدف العديد من العمليات البيولوجية المختلفة، وتتوفر. 12 ولتوفير مزيد من المعلومات التشريحية، يمكن دمج أوي مع تقنيات التصوير الأخرى مثل التصوير بالرنين المغناطيسي أو الأشعة السينية. تقييد آخر هو انخفاض عمق اختراق الأنسجة مقارنة على سبيل المثال ل fغير وظيفي التصوير بيت. وعلاوة على ذلك كمية كبيرة من تحقيقات تهدف إلى العديد من الأهداف البيولوجية المختلفة المتاحة. 12
لا ينبغي الاستهانة بآثار التخدير في التصوير في الجسم الحي . في حين أن آثار محددة من التخدير على نتائج منظمة العفو الدولية لم يتم وصفها بشكل جيد، وقد أظهرت مجموعتنا في العديد من الدراسات تأثير التخدير على نتائج التصوير بيت. 13 ، 14 ، 15 على سبيل المثال، فوشس إت آل. تحليل المعلمات الدم، مثل بك 2 ، ودرجة الحموضة والاكتات قبل وبعد بيت تفحص باستخدام مختلف التنفس والبروتوكولات التخدير. وقد تبين أن تغييرات كبيرة في مستويات بك 2 والاكتات في تخدير مقارنة مع الأكسجين واعية أو الفئران التنفس الهواء أدت إلى تغييرات كبيرة في نتائج بيت. 14 وخلصوا إلى أن هذا التأثير يرجع أساسا إلى تنفس الأكسجين و سوبسينسنر إلى الحماض التنفسي في الحيوانات، مما يؤدي إلى نتائج مختلفة في التصوير بيت.
توحيد معايير التخدير، مثل O 2 -ccentration والجرعات من المخدرات مخدر، وكذلك الوقاية من انخفاض حرارة الجسم تساعد على تجنب الفشل المنهجي. بطبيعة الحال، أوي محدودة من قبل الخصائص الفيزيائية على سبيل المثال نثر الضوء، الأنسجة السيارات مضان وتوهين الضوء 9 . عدة مجموعات تعالج هذه المشاكل من خلال الجمع بين النتائج العيانية من أوي مع تقنيات أخرى مثل المجراة المجهر مضان أو التدفق الخلوي.
في الجسم الحي والتصوير من نشاط مب من قبل مب-أكتيفاتابل تحقيقات الفلورسنت محددة وقد استخدمت في عدة نماذج تجريبية من التهاب مثل تش، 7 ولكن أيضا في أمراض مثل نقص التروية الدماغية، 16 تمدد الأوعية الدموية الأبهر، 17 احتشاء عضلة القلب 18ولويحات تصلب الشرايين 19 وكذلك نماذج الورم المختلفة. 20
على سبيل المثال، كورتيز-Retamozo وآخرون. التحقيق في النشاط في الجسم الحي من تقوم ال MMPs في نموذج من التهاب الشعب الهوائية التحسسي عن طريق حقن اجراء تحقيق activatable MMP، 24 ساعة بعد تطبيق الأنف من ألبومين البيض في الفئران توعية سابقا. 21 لتحديد موقع النشاط MMP المزيد من هذه المجموعة مجتمعة تصوير الشعاعي الطبقي OI، القصبات NIR الألياف البصرية وintravital المجهري من أجل مراقبة سير استجابة المرض والعلاج بمزيد من التفصيل. 21
مناهج أخرى لقياس النشاط في الجسم الحي MMP في الغالب استخدام مثبطات MMP التي تربط لموقع نشط من تقوم ال MMPs. ماكنتاير وآخرون. ووصف في الجسم الحي الورم الكشف باستخدام "القائمة على مادة بوليمر الفلورة"، الذي يعمل بمثابة "proteolyt-MMP-7 مرتبطةجيم منارة "لتقوم ال MMPs في نموذج الفأر طعم أجنبي. 22 وهي تظهر أن نشاط يمكن أن يتم الكشف عن MMP-7 بشكل انتقائي من قبل التصوير الضوئي. 23 وعلاوة على ذلك، أولسون وآخرون. التحقيق" خلية اختراق الببتيدات activatable "(ACPPs) التي هي قادرة على استهداف العديد من النماذج طعم أجنبي الورم، ولكن لا يمكن أن يمتص إلى داخل الخلية حتى يتم بروتين محلل رابط. ودرس الباحثون ACPPs التي هي انتقائية لMMP-2 و MMP-9. 24، 25
تم استخدام وسم مثبطات MMP مع النظائر المشعة ل-فوتون واحد الانبعاثات التصوير المقطعي (SPECT) أو التصوير PET لدراسة التعبير MMP في تصلب الشرايين والسرطان 26 27. في دراسة حديثة تمت مقارنة لMMP المانع مضان المسمى لاجراء تحقيق MMP-activatable. أظهر 28 MMP المانع fluorescently المسمى إشارة أقل للضوضاءمقارنة مع التحقيق تفعيلها ولكن يتطلب وقتا أقصر امتصاص.
ويمكن استخدام المؤشرات الحيوية الجديدة لتقييم الملامح الرئيسية للفيزيولوجيا المرضية والتحقق من صحتها من قبل منظمة الشفافية الدولية. على سبيل المثال، فإن الاستجابة للأخطار المرتبطة أنماط الجزيئية (دامبس) هو حدث مبكر خلال رد فعل التهابات. فوغل إت آل. تستخدم الأجسام المضادة المسمى Cy5.5 ضد الألارمين S100A9 في نماذج التهاب الجلد الحاد الأذن الجلد، والتهاب المفاصل الناجم عن الكولاجين والعدوى مع الليشمانيا الكبرى لتطوير المؤشرات الحيوية الحساسة للعلامات المبكرة للالتهاب. 29
في الختام، أوي يمثل طريقة سريعة وفعالة للبحوث قبل السريرية، والتي هي قادرة على الكشف عن آليات جديدة من الأمراض في الجسم الحي ، وتوصيف الأهداف الجزيئية الجديدة، فضلا عن رصد الآثار العلاجية . ومع ذلك، قد تكون هناك حاجة لعملية التحقق اللاحقة مع المزيد من التقنيات الكمية مثل بيت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر دانيال بوكالا، ناتالي ألتمير وفوندا كاي للدعم الفني الممتاز. نشكر جوناثان كوتن، جريج بودين وبول سوبيران لتحرير المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل شركة سيمنز-مؤسسة فيرنر وكلية الطب في جامعة توبنغن ايبرهارد كرلس ( '' Promotionskolleg '') والتي DFG من خلال CRC 156 (C3 المشروع).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cornergel | Gerhard Mann GmbH | 1224635 | ophthalmic ointment |
| Forene | Abbott GmbH | 4831850 | isoflurane |
| U40 insulin syringe | Becton Dickinson and Company | 324876 | |
| Heparin | Sintetica | 6093089 | |
| High-Med-PE 0.28 x 0.61 mm | Reichelt Chemietechnik GmbH+Co | 28460 | polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm |
| BD Regular Bevel Needles, 30 G | Becton Dickinson & Co. Ltd. | 305106 | 30 G injection cannula |
| RTA-0011 isoflurane vaporizer | Vetland Medical Sales and Services LLC | - | |
| Artagain drawing paper | Strathmore Artist Paper | 446-8 | coal black |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Optical imaging system |
| BD Regular Bevel Needles, 25 G | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| 2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene | Sigma Aldrich GmbH | 7987456F | TNCB |
| MMPSense 680 | Perkin Elmer | NEV10126 | fluorescent imaging dye |
| Oditest | Koreplin GmbH | C1X018 | mechanical measurment |
| Miglyol 812 | SASOL | - | Oil |
| BALB/C, C57BL/6 | Charles River Laboratories | - | Mice used for experiements |
| PBS | Sigma Aldrich GmbH | For dilution of the RA serum | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf | Used for TNCB application | |
| shaver | Wahl | 9962 | Animal hair trimmer |
| Living Image | Perkin Elmer | Imaging software to measure OI |
References
- Veale, D. J., Ritchlin, C., FitzGerald, O. Immunopathology of psoriasis and psoriatic arthritis. Ann Rheum Dis. 64, 26 (2005).
- Harris, E. D. Rheumatoid arthritis. Pathophysiology and implications for therapy. N Engl J Med. 322 (18), 1277-1289 (1990).
- Lee, D. M., Weinblatt, M. E. Rheumatoid arthritis. Lancet. 358 (9285), 903-911 (2001).
- Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. J Clin Rheumatol. 11, S39-S44 (2005).
- Pap, T., et al. Differential expression pattern of membrane-type matrix metalloproteinases in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 43 (6), 1226-1232 (2000).
- Firestein, G. S., Paine, M. M. Stromelysin and tissue inhibitor of metalloproteinases gene expression in rheumatoid arthritis synovium. Am J Pathol. 140 (6), 1309-1314 (1992).
- Schwenck, J., et al. In vivo optical imaging of matrix metalloproteinase activity detects acute and chronic contact hypersensitivity reactions and enables monitoring of the antiinflammatory effects of N-acetylcysteine. Mol Imaging. 13, (2014).
- Monach, P. A., Mathis, D., Benoist, C. The K/BxN arthritis model. Curr Protoc Immunol. 15, 22 (2008).
- Zelmer, A., Ward, T. H. Noninvasive fluorescence imaging of small animals. J Microsc. 252 (1), 8-15 (2013).
- Kouskoff, V., et al. Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity. Cell. 87 (5), 811-822 (1996).
- Fuchs, K., et al. In vivo imaging of cell proliferation enables the detection of the extent of experimental rheumatoid arthritis by 3'-deoxy-3'-18f-fluorothymidine and small-animal PET. J Nucl Med. 54 (1), 151-158 (2013).
- Schwenck, J., et al. Fluorescence and Cerenkov luminescence imaging. Applications in small animal research. Nuklearmedizin. 55 (2), 63-70 (2016).
- Mahling, M., et al. A Comparative pO2 Probe and [18F]-Fluoro-Azomycinarabino-Furanoside ([18F]FAZA) PET Study Reveals Anesthesia-Induced Impairment of Oxygenation and Perfusion in Tumor and Muscle. PLoS One. 10 (4), 0124665 (2015).
- Fuchs, K., et al. Oxygen breathing affects 3'-deoxy-3'-18F-fluorothymidine uptake in mouse models of arthritis and cancer. J Nucl Med. 53 (5), 823-830 (2012).
- Fuchs, K., et al. Impact of anesthetics on 3'-[18F]fluoro-3'-deoxythymidine ([18F]FLT) uptake in animal models of cancer and inflammation. Mol Imaging. 12 (5), 277-287 (2013).
- Liu, N., Shang, J., Tian, F., Nishi, H., Abe, K. In vivo optical imaging for evaluating the efficacy of edaravone after transient cerebral ischemia in mice. Brain Res. 1397, 66-75 (2011).
- Sheth, R. A., Maricevich, M., Mahmood, U. In vivo optical molecular imaging of matrix metalloproteinase activity in abdominal aortic aneurysms correlates with treatment effects on growth rate. Atherosclerosis. 212 (1), 181-187 (2010).
- Chen, J., et al. Near-infrared fluorescent imaging of matrix metalloproteinase activity after myocardial infarction. Circulation. 111 (14), 1800-1805 (2005).
- Wallis de Vries, B. M., et al. Images in cardiovascular medicine. Multispectral near-infrared fluorescence molecular imaging of matrix metalloproteinases in a human carotid plaque using a matrix-degrading metalloproteinase-sensitive activatable fluorescent probe. Circulation. 119 (20), e534-e536 (2009).
- Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).
- Cortez-Retamozo, V., et al. Real-time assessment of inflammation and treatment response in a mouse model of allergic airway inflammation. J Clin Invest. 118 (12), 4058-4066 (2008).
- McIntyre, J. O., et al. Development of a novel fluorogenic proteolytic beacon for in vivo detection and imaging of tumour-associated matrix metalloproteinase-7 activity. Biochem J. 377, 617-628 (2004).
- Scherer, R. L., VanSaun, M. N., McIntyre, J. O., Matrisian, L. M. Optical imaging of matrix metalloproteinase-7 activity in vivo using a proteolytic nanobeacon). Mol Imaging. 7 (3), 118-131 (2008).
- Olson, E. S., et al. In vivo characterization of activatable cell penetrating peptides for targeting protease activity in cancer. Integr Biol (Camb. 1 (5-6), 382-393 (2009).
- Duijnhoven, S. M., Robillard, M. S., Nicolay, K., Grull, H. Tumor targeting of MMP-2/9 activatable cell-penetrating imaging probes is caused by tumor-independent activation). J Nucl Med. 52 (2), 279-286 (2011).
- Schafers, M., Schober, O., Hermann, S. Matrix-metalloproteinases as imaging targets for inflammatory activity in atherosclerotic plaques. J Nucl Med. 51 (5), 663-666 (2010).
- Wagner, S., et al. A new 18F-labelled derivative of the MMP inhibitor CGS 27023A for PET: radiosynthesis and initial small-animal PET studies. Appl Radiat Isot. 67 (4), 606-610 (2009).
- Waschkau, B., Faust, A., Schafers, M., Bremer, C. Performance of a new fluorescence-labeled MMP inhibitor to image tumor MMP activity in vivo in comparison to an MMP-activatable probe. Contrast Media Mol Imaging. 8 (1), 1-11 (2013).
- Vogl, T., et al. Alarmin S100A8/S100A9 as a biomarker for molecular imaging of local inflammatory activity. Nat Commun. 5, 4593 (2014).
