Summary
Questo articolo spiega l'applicazione dell'immagine fluorescente utilizzando una sonda ottica attivabile per la visualizzazione dell'attività in vivo delle metalloproteinasi di matrici chiave in due diversi modelli sperimentali di infiammazione.
Abstract
In questo articolo si descrive un metodo non invasivo per l'attività di matrice metalloproteinasi (MMP) di imaging mediante una sonda fluorescente attiva, tramite l' ottica ottica (OI) in fluorescenza in vivo , in due diversi modelli di infiammazione: un artrite reumatoide (RA) e un contatto Modello di reazione di ipersensibilità (CHR). La luce con una lunghezza d'onda nella finestra vicino a infrarossi (NIR) (650 - 950 nm) consente una penetrazione più profonda del tessuto e un assorbimento minimo del segnale rispetto alle lunghezze d'onda inferiori a 650 nm. I principali vantaggi che usano l'OI di fluorescenza è che è conveniente, veloce e facile da implementare in diversi modelli animali.
Le sonde fluorescenti attivatabili sono otticamente silenziose nei loro stati inattivati, ma diventano altamente fluorescenti quando attivata da una proteasi. I MMP attivati portano alla distruzione dei tessuti e svolgono un ruolo importante per la progressione della malattia nelle reazioni di ipersensibilità di tipo ritardato (DTHR) come RA e CHR. Inoltre, i MMP sonoLe proteasi chiave per la cartilagine e il degrado dell'osso e sono indotti da macrofagi, fibroblasti e condrociti in risposta a citochine pro-infiammatorie. Qui usiamo una sonda che viene attivata dai MMP chiave come MMP-2, -3, -9 e -13 e descrivono un protocollo di imaging per l'attività di fluorescenza vicino all'infrarosso OI dell'attività MMP in RA e nei topi di controllo 6 giorni dopo l'induzione della malattia Come nei topi con l'acuto (1x challenge) e la cronica (5x challenge) CHR sull'orecchio destro rispetto alle orecchie sane.
Introduction
Le malattie autoimmuni come l'artrite reumatoide (RA) o la psoriasi vulgaris sono classificate come reazioni di ipersensibilità di tipo ritardato (DTHR). 1 RA è una malattia autoimmune comune caratterizzata da sinovite erosiva e distruzione congiunta. 2 Le articolazioni artrite infiammate dimostrano l'infiltrazione e la proliferazione delle cellule infiammatorie, una maggiore espressione di cellule pro-infiammatorie che portano alla formazione di pannus, alla cartilagine e alle distruzioni dell'osso. 3 , 4 La scissione di molecole di matrice extracellulare, come il collagene mediante matrici metalloproteinasi (MMPs), è essenziale per la conversione e l'angiogenesi dei tessuti e provoca distruzioni del tessuto. 5 , 6 Le reazioni di ipersensibilità di contatto (CHR) sono caratterizzate dall'aggregazione di neutrofili che portano ad uno scoppio ossidativo. 7 Simili a RA, i MMP in CHR sono involved nella conversione dei tessuti, la migrazione cellulare e l'angiogenesi per stabilire infiammazione cronica.
Per studiare RA, il glucosio-6-fosfato isomerasi (GPI) iniezione -serum modello di topo è stato utilizzato. 8 siero di topi K / BXN transgeniche contenenti anticorpi contro GPI, è stato iniettato in topi BALB / c naive dopodiché infiammazione reumatica cominciato a svilupparsi entro 24 h con un massimo di edemi declivi il giorno 6 dopo l'iniezione GPI-siero (vedi 1.1). Per analizzare CHR cronica, topi C57BL / 6 sono stati sensibilizzati con trinitrochlorobenzene (TNCB) sull'addome. L'orecchio destro è stato sfidato fino a 5 volte a partire 1 settimana dopo la sensibilizzazione (vedi anche 1.1 e 1.2).
Non invasiva piccoli animali OI è una tecnica basata sulle indagini in vivo del fluorescente-, chemiluminescent- e bioluminescenti-segnali, che vengono utilizzati principalmente nella ricerca preclinica. I dati semiquantitativa acquisita dà intuizioni nel MolecMeccanismi Ular negli organi e tessuti sani e modelli animali sperimentali malati, e consente longitudinale follow up misure (ad esempio per valutare profili di risposta terapeutica in vivo). Un grande vantaggio di studi longitudinali è la riduzione del numero di animali, come gli stessi animali possono essere misurati in studi di follow up in diversi punti temporali invece di utilizzare mouse diversi per punto temporale. La risoluzione di OI permette imaging funzionale dettagliata di organi e strutture tissutali più piccole in animali da esperimento.
L'uso di specifici filtri eccitazione e di emissione con uno spettro di trasmissione ristretta, una protezione contro luce diffusa da una tenuta di luce "scatola scura" ed un dispositivo charged-coupled sensibili (CCD), che viene raffreddata in molti dispositivi fino a -70 ° C , permette altamente specifico e misurazioni sensibili dei segnali di fluorescenza.
Utilizzando agenti fluorescenti con excitation- eGli spettri di emissione nella finestra di fluorescenza ad infrarossi vicino (650 - 950 nm), i rapporti segnale-rumore possono essere migliorati significativamente. La finestra a fluorescenza a infrarossi vicino è caratterizzata da un assorbimento relativamente basso del segnale da parte dell'emoglobina e dell'acqua così come una bassa fluorescenza di fondo. 9 Questo permette una profondità di penetrazione fino a 2 cm nel tessuto dei piccoli animali. Le sonde OI possono indirizzare direttamente un bersaglio ( ad esempio mediante un anticorpo a fluorescenza) oppure possono essere attivate nel tessuto bersaglio (per es. Mediante proteasi). Le sonde OI attuabili sono otticamente silenziose nella loro forma inattivata a causa del trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) ad una parte di quenching, che trasferisce l'energia di eccitazione all'interno della molecola ad un altro dominio. Se il colorante viene ceduto (ad esempio da una proteasi), l'energia non è più trasferita all'interno della molecola e un segnale fluorescente può essere rilevato da OI. Ciò consente la progettazione di sonde OI ad alta specificitày per processi biologici distinti ed eccellenti segnale-rumore-ratio.
Il protocollo che segue illustra in dettaglio la preparazione degli animali, le misurazioni OI utilizzando una sonda OI Activatable all'immagine MMP-2, -3, -9 e -13 attività in vivo e due modelli sperimentali di infiammazione (RA, CHR).
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Protocol
Tutte le procedure descritte in questo documento, hanno seguito le linee guida e standard internazionali di cura e l'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato locale il benessere degli animali ed etica del Paese Commissione Tuebingen, in Germania. 8 - topi 12 settimane BALB / ce C57BL / 6 sono stati tenuti al 12 h: 12 h di luce: buio ciclo e sono stati alloggiati in IVCS e condizioni ambientali standard a 22 ± 1 ° C in gruppi di 2 - 5 con acqua e alimento accesso ad libitum.
1. Preparazione Materiale
- Diluire il colorante OI per vicino infrarosso fluorescenza secondo il rispettivo foglio dati direttamente prima dell'iniezione. Il colorante OI attivabile (sonda commerciale con eccitazione a 680 nm) per misurare MMP in vivo è pronto per l'uso ad una concentrazione di 20 nmol in 1,5 ml di PBS 1x. Agitare delicatamente o vortice la soluzione prima dell'uso. colorante OI può essere conservato a 2-8 ° C per un massimo di 6 mesi se protetto dalla luce. Per via endovenosa (iv) iniezioni preparare un catetere venoso. Utilizzare un 20 U (0,5 mL) di insulina siringa riempita con una soluzione salina allo 0,9% (contenente 10 unità di iniezione di eparina in 50 mL), e un ago da 30 attaccato ad un catetere di polietilene. Iniettare la dose raccomandata di 2 nmol per il mouse del colorante OI.
2. Induzione di artrite reumatoide e cronica reazione di ipersensibilità di contatto
- Artrite reumatoide:
- Diluire 100 ml di siero (ottenuto da K / BXN topi 10) anticorpi contenenti (AB) contro glucosio-6-fosfato isomerasi (GPI) 1: 1 con PBS 1x (200 mL) per indurre RA. Conservare il siero diluito a -80 ° C. Procedure dettagliate per l'induzione di RA sono descritti da Monach et al. 8.
- Per indurre RA, sollevare ciascun topo delicatamente per la coda e iniettare 200 microlitri di siero diluito intraperitoneale (ip) al giorno 0 di tLui sperimenta. Dopo l'iniezione, posizionare il mouse direttamente nella sua gabbia.
- Facoltativamente, misurare i diametri della caviglia di ciascuna caviglia, prima delle iniezioni AB e definire un "punteggio arthritico" ( Figura 1A ). Continuare la misurazione del gonfiore alla caviglia quotidianamente fino al giorno 6 dopo il siero GPI utilizzando un dispositivo di misura meccanico (micrometro).
- Iniettare il colorante OI attivo (punto 1.1 - 1.2), per misurare l'attività MMP in vivo IV nella vena di coda di topi RA Il giorno 5 dopo iniezione di siero GPI e nella vena di coda dei topi di controllo. Effettuare esperimenti di imaging ottico 24 h dopo l'iniezione della vena della coda.
- Reazione di ipersensibilità di contatto:
- Per la sensibilizzazione dei topi C57BL / 6, preparare una soluzione al 5% TNCB sciolta in una miscela di acetone / olio 4: 1.
- Anestetizzare i topi C57BL / 6 utilizzando l'1,5% di isoflurano vaporizzati in ossigeno al 100% (1,5 L / min). Una volta che i topi sono anestetizzati, metterlo in un automa-pazzo Cono nasale (una siringa da 5 ml di polietilene, collegata al tubo isoflurano da 1,5 vol%) e mantenere l'anestesia. Applicare unguento veterinario sugli animali anestetizzati per prevenire la secchezza degli occhi durante l'anestesia.
- Rasare l'addome con cura (2 x 2 cm) usando un piccolo trimmer di animali. Evitare di danneggiare la pelle, in quanto ciò può portare a segnali fluorescenti non specificati all'interno dell'animale e può influenzare i risultati dello studio.
- Applicare lentamente 80 μL della soluzione di TNCB del 5% all'area addominale rasata usando una pipetta da 100 μL per sensibilizzare l'animale. Riposiziona delicatamente il mouse nella sua gabbia, accertandosi che gli occhi del mouse non vengano a contatto con la biancheria per evitare lesioni corneali e evitare temperature corporee durante la fase di recupero.
- Sei giorni dopo la sensibilizzazione, preparare una soluzione TNCB da 1% (disciolta in una miscela di acetone / olio 9: 1) e applicare 20 μL all'orecchio destro usando una pipetta per provocare CHSR acuta e cronica."> 1
- Iniziare con la prima sfida su entrambi i lati dell'orecchio destro con 20 μL di 1% soluzione TNCB utilizzando una pipetta da 100 μL e ripetere la sfida ogni secondo giorno fino a cinque volte (giorno 15 dopo la sensibilizzazione) per ottenere la CHR ( figura 1B ) . Misurare lo spessore dell'orecchio ogni giorno, utilizzando un dispositivo di misurazione del micrometro.
- Iniettare il colorante OI attivo (una sonda commerciale con eccitazione a 680 nm) (fase 1.1-1.2) per misurare l'attività MMP in vivo in topi CHR 12 h dopo la sfida. Eseguire esperimenti di imaging ottico 24 h iniezione venosa della coda della coda ( iv ).
3. Preparazione degli animali per l'imaging ottico
- Spostare il topo del mouse (almeno 3 giorni prima dell'immagine) a bassa oa fluorescenza ( ad esempio , senza manganese) per evitare l'interferenza di auto-fluorescenza (circa 700 nm) con il segnale di fluorescenza degli agenti OI usati.
- Mettere l'animale inad una scatola di anestesia e anestetizzare con 1,5% vol isoflurano vaporizzato con ossigeno (1,5 L / min) (ossigeno può essere sostituita da aria, ma deve essere standardizzato entro un esperimento).
- Quando il mouse è visibilmente anestetizzato, collocarlo in un'ogiva fatto da sé (costruito da un taglio 5 mL polietilene siringa, collegato al tubo% isoflurano 1,5 vol) e mantenere l'anestesia.
- Radere l'animale con cura sul sito di destinazione (2 centimetri x 2 cm) con un piccolo trimmer peli. Evitare ferire la pelle, poiché ciò può portare a segnali fluorescenti aspecifici all'interno dell'animale e può influenzare i risultati dello studio.
NOTA: peli può assorbire il segnale di fluorescenza durante OI (dipendente dal ceppo di topi, più o meno si osserva assorbimento) a seconda della regione di interesse (ROI). - Per l'iniezione endovenosa, posizionare la coda del topo in acqua riscaldata, per indurre vasodilatazione, delicatamente detergere la pelle nel sito di iniezione con alcool, e inizia posizionando il catetereIl sito distale della coda. Posizionare il bordo "tagliato" dell'ago in un angolo di 20 ° nella vena della coda e verificare la corretta collocazione del catetere riattivando la siringa.
- Se il catetere è posizionato correttamente, sostituire la siringa e iniettare la sonda OI (2 nmol). Dopo l'iniezione, sostituire la siringa e iniettare 25 μL di soluzione salina di 0,9% per liberare completamente il volume morto del tubo in polietilene.
NOTA: Il tempo di dimezzamento del tessuto del colorante OI usato (una sonda commerciale con eccitazione a 680 nm) per misurare l'attività MMP in vivo è di 72 ore. Per garantire una completa libertà, non è raccomandata una reinserzione del colorante prima di 7 giorni dopo un'iniezione preventiva.
4. Imaging ottico
- Posizionare un foglio di plastica o carta nera nella scatola nera dello scanner OI al centro del campo visivo (FOV).
- Impostare un protocollo di misurazione e scegliere la lunghezza d'onda destra (eccitazione: 680 ± 10 nm e eMissione: 700 ± 10 nm) e parametri di imaging.
NOTA: in alcuni sistemi OI, è predefinito l'impostazione per diversi colori di imaging. - Per scegliere il protocollo corretto per l'imaging di fluorescenza, aprire il software di imaging (fornito dal produttore) e inizializzare il sistema. La maggior parte delle telecamere CCD deve raffreddarsi alla loro temperatura di funzionamento, e questo può richiedere 10 minuti. Per risultati affidabili, attendere che il sistema sia pronto.
- Osservate che il pannello di controllo di acquisizione del sistema di imaging in vivo si apre e ciascuna coppia di filtri selezionata rappresenterà un'immagine nella sequenza. In questo caso, acquisire un'immagine con le coppie di filtri per la tintura commerciale con una lunghezza d'onda di eccitazione e emissione rispettivamente di 680 ± 10 nm e 700 ± 10 nm e avviare la misurazione (premere "Acquisire sequenza"). Per istruzioni più dettagliate, consultare il manuale del produttore.
- Etichettare le immagini in modo appropriato e salvare le informazioni nella "Modifica immagine"Etichette ", che verrà visualizzata dopo la" sequenza Acquisizione ".
- Prendere una scansione di base di ciascun animale prima dell'iniezione del colorante OI, o utilizzare animali di controllo ingenui per differenziare il segnale di sfondo.
- H dopo l'iniezione della vena della coda del colorante OI, mettere gli animali al centro del FOV, in grado di misurare il segnale più alto nel sistema OI e avviare le misurazioni.
NOTA: Importante: l'ipotermia può influenzare sensibilmente la distribuzione degli agenti di imaging. Assicurarsi che la fase sia riscaldata fino a 37 ° C per evitare l'ipotermia dell'animale. L'imaging può essere eseguito simultaneamente con gli animali in gruppi da 1 a 5 topi. Scegliere la dimensione del FOV a seconda del numero di animali da misurare contemporaneamente. È possibile eseguire un'immagine a campo luminoso per verificare se ciascun mouse è visibile.
5. Analisi dei dati
NOTA: Esegui un'analisi dei dati utilizzando il seguente software di immagineProtocollo del produttore.
- Per le misurazioni di RA, utilizzare l'unità calibrata dell'emissione di fotoni come mostrato in Figura 2 , mentre la CHSR cronica è rappresentata come intensità del segnale in percentuale (efficienza).
- Per disegnare manualmente i ROI, utilizzare la piastra utensile. Per l'analisi delle immagini RA usate un cerchio standardizzato, posizionato intorno al segnale più alto in tutte le caviglie e zampe di ogni animale. Per analizzare il CHSR, posizionare i ROI intorno all'orecchio destro e sinistro in base all'immagine del campo luminoso.
- Per misurare le emissioni di fotoni oi valori di intensità del segnale nella specifica ROI disegnata, premere "misura". Il sistema fornirà valori nel ROI disegnato per analisi statistiche descrittive.
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Representative Results
Per indurre l'artrite reumatoide (RA) in topi naive BALB / c, gli animali sono stati iniettati ip con auto-anticorpi (1: 1 diluizione con PBS 1x) contro GPI al giorno 0. L'infiammazione massima (gonfiore alle caviglie) in questo GPI-siero indotta modello di RA è il giorno 6 dopo l'iniezione 11. Pertanto, 2 nmol del colorante OI attivabile stata preparata ed iniettata iv nella vena caudale di topi artritici e animali sani di controllo al giorno 5. 24 ore dopo l'iniezione (giorno 6), i topi sono stati anestetizzati e ripreso come descritto nella sezione 3 ( Figura 1A).
Per indurre CHR, topi C57BL / 6 sono stati sensibilizzati con 5% TNCB al giorno 0 all'addome rasata. Il giorno 7 dopo la sensibilizzazione al 1 ° sfida sull'orecchio destro usando 1% TNCB iniziato. Fino a cinque sfide (giorno 15) sono stati eseguiti per indurre l'infiammazione cronica. 7 12 h dopo °e ultima sfida, il 20 nmol del colorante OI è stato iniettato iv. Il giorno 15, post iniezione 24 h, OI è stata eseguita come descritto in precedenza (Figura 1B).
La Figura 2 mostra un segnale di fluorescenza chiaramente migliorato nelle zampe posteriori, caviglie e zampe anteriori del mouse RA il giorno 6 dopo induzione della malattia, rispetto al controllo caviglie (Figura 2A). Analisi biodistribuzione delle attività MMP negli organi dei topi RA e topi sani esposti un segnale fortemente migliorata nelle zampe posteriori, caviglie e Forè zampe esclusivamente nelle articolazioni di topi RA. È interessante notare, abbiamo determinato un segnale MMP migliorato in entrambi i reni di tutti i topi RA misurate, rispetto ai reni dei topi sani di controllo (Figura 2A; destra). Inoltre, abbiamo misurato un segnale maggiore MMP nel fegato e nell'intestino indipendentemente topi affetti da RA. Non ci sono differenze tra RA e topi sani sono stati trovati in tHa pancreas, polmone, milza e cuore.
Durante la CHR cronica (cinque sfide TNCB all'orecchio destro), abbiamo misurato un'attività altamente aumentata di MMP sull'orecchio destro a confronto con l'orecchio di controllo sinistro ( Figura 2B ).
Quindi, i nostri dati stanno indicando un ruolo importante dell'attività MMP durante la progressione della malattia in entrambi i modelli di malattie infiammatorie.
Gli utensili per la bioluminescenza e la fluorescenza consentono la quantificazione di, ad esempio, pmol di fluorochrome o il numero di cellule che esprimono la fluorescenza. I dati possono essere visualizzati in 1. Conteggi: visualizza una misura non calibrata dell'incidente fotonale sulla fotocamera 2. Radiance (fotoni): indica una misurazione calibrata dell'emissione di fotoni in "fotoni / secondi / cm 2 / steradiano" Raccomandato per la luminescenza imaging o 3. RAdiant Efficiency (fluorescence): mostra la radiazione di emissione di fluorescenza per potenza di eccitazione incidente, consigliata per le misurazioni della fluorescenza.
Un grande vantaggio di lavorare con le unità di radiazioni durante l'analisi delle immagini OI è che le impostazioni delle telecamere possono essere modificate durante un esperimento e ciò non ha alcun impatto sulle immagini o sui dati ROI misurati, che consente inoltre di confrontare le immagini da diversi sistemi IVIS.
La regione di interesse (ROI) indica l'area specifica di interesse dell'utente dall'immagine ottica. La barra degli strumenti consente di disegnare 3 diversi ROI: la misura (misura l'intensità del segnale nel ROI dell'immagine), lo sfondo medio (misura l'intensità del segnale medio nell'area definita dall'utente per lo sfondo) o il soggetto ROI (identifica un animale soggetto un'immagine).
Se il soggetto dissvolge un elevato background aspecifica stesso segnale, ottenere un fondo corretto misurazione ROI sottraendo il segnale di fondo (ROI) dalla ROI bersaglio. Impostare la minima dell'immagine vicino allo zero per determinare la fluorescenza automatico o naturale sfondo luminescenza nella vostra immagine. Collegare l'immagine a un auto-definito (utente specifico) immagine di sfondo (ROI) che sono stati misurati principalmente per l'immagine specifica misurata.
analisi semi-quantitative delle immagini sono stati eseguiti disegnando regioni standardizzati di interesse (ROI) nelle orecchie sia artritici e controllare le caviglie, così come in infiammate e sani con Living software Immagine. Solo analisi statistiche descrittive sono state effettuate su dati in vivo in questo manoscritto, a causa di insufficiente numero di animali. Analisi dell'intensità delle caviglie o zampe artritiche e sani segnale mostrato una maggiore intensità di segnale MMP-7 volte artritici, rispetto ai controlli caviglie. L'intensità del segnale MMP a 3 volte superiore è stata rilevata nelle zampe anteriori di topi artriti rispetto a quella degli animali sani ( Figura 3A ).
L'analisi delle orecchie con CHR acuta e cronica rispetto all'orecchio di controllo non consentito ha mostrato un significativo aumento del segnale MMP anche dopo la prima sfida, che è aumentata ulteriormente dopo il 3 ° giorno e rimane allo stesso livello fino alla 5a sfida ( figura 3B ) . Come conseguenza della contaminazione con il contatto allergene sull'orecchio sinistro a causa del graffio dei topi, abbiamo determinato un leggermente aumentato segnale MMP nell'orecchio di controllo a sinistra (non TNCB). I risultati indicano un ruolo importante di MMP, evidenziato da un elevato segnale di fluorescenza durante l'artrite GPI e l'infiammazione cronica, misurata da OI.
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Figura 1: RA e CHR Modella, Tempo decorso della malattia induzione e Time Punti per OI. (A) Tempo corso di induzione RA in BALB topi / c (B) e induzione CHR cronica nei topi C57BL / 6. Panoramica del rispettivo punto in tempo imaging in vivo e associati punti di tempo di iniezione del colorante OI per misurare l'attività di MMP in entrambi i modelli. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: MMP OI in RA, CHR e animali di controllo. (A) I risultati rappresentativi dell'attività MMP misurata in un mouse artritico 6 giorni dopo l'induzione GPI-artrite e un mouse di controllo sano (lato sinistro). Segnale significativamente maggiore (Radiance (/ s / cm 2 / sr) p) intL'assunzione è stata osservata nell'artrite rispetto al topo sano. L'immagine a destra mostra l'attività MMP nelle zampe posteriori e include le zampe, le zampe, il pancreas, il polmone, la milza, il cuore, i reni, il fegato e l'intestino di un gesto GPI-artrite sacrificato dopo l'iniezione di OI. OI ha scoperto un alto segnale nelle zampe, zampe posteriori e zampe posteriori dei topi RA e del fegato e dell'intestino, indipendentemente dal fatto che i topi siano stati iniettati con siero GPI (topi RA) o siero di controllo (topi di controllo sani). (B) Segnale di fluorescenza MMP nelle orecchie con CHR cronico (sinistra) e animali di controllo (a destra). L'orecchio infiammato destro (sfidato 5 volte) mostra un segnale fortemente migliorato rispetto alle orecchie di controllo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
<br /> Figura 3: Semi analisi quantitativa dei infiammato e sano caviglie e dei tessuti dell'orecchio Utilizzando OI. (A) L'analisi semiquantitativa del segnale di fluorescenza in RA e animali sani nelle zampe anteriori e le articolazioni della caviglia. zampe anteriori artritiche e articolazioni della caviglia mostrano un significativo (** p <0,05) (n = 3) del segnale MMP più elevato rispetto a articolazioni della caviglia sani e zampe anteriori. I dati sono presentati come media ± SD. (B) l'analisi semi-quantitativa del orecchio destro (contestato) a sinistra e dopo il 1 °, 3 ° e 5 ° sfida. MMP segnale è aumentato significativamente dal primo al 5 ° sfida e già mostrato un'intensità massima del segnale nell'orecchio destro sfidato dopo il challenge 3 ° (** p <0,05) (n = 3) (spighe controllo sono parzialmente contaminati TNCB a causa dei topi graffiare. Questo prodotto un segnale maggiore che non era significativo). I dati sono presentati come media± SEM. Il t-test dello studente a due cifre è stato utilizzato per analizzare le differenze tra i due tipi di infiammazione (caviglie GPI-artriti, orecchie correttamente trattate) e di controllo (le caviglie di controllo, le orecchie non trattate). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
OI è uno strumento molto utile, veloce e poco costoso per l'imaging molecolare non invasivo in vivo nella ricerca preclinica. Una particolare forza di OI è la capacità di monitorare processi altamente dinamici come risposte infiammatorie. Inoltre, l'OI permette di seguire il corso di una malattia per un lungo periodo di tempo, che va dai giorni alla settimana.
L'OI ha diversi vantaggi rispetto ad altre modalità di imaging in vivo , come la tomografia a emissione di positroni (PET) o la risonanza magnetica (MRI), in quanto è molto tempo e economicamente efficiente. È possibile analizzare l'analisi ad alta velocità con un massimo di cinque animali per acquisizione. Inoltre, sono disponibili numerosi sonde, che mirano a diversi processi biologici. 12 Per fornire ulteriori informazioni anatomiche, l'OI può essere combinato con altre tecniche di imaging come la MRI o il raggi x. Un'altra limitazione è la sua bassa profondità di penetrazione del tessuto rispetto ad esempio a fImmagini imaging PET. Inoltre è disponibile una grande quantità di sonde che mirano a diversi bersagli biologici diversi. 12
Gli effetti dell'anestesia non devono essere sottovalutati nell'immagine in vivo . Mentre gli effetti specifici dell'anestesia sui risultati dell'OI non sono ben caratterizzati, il nostro gruppo ha dimostrato in diversi studi l'influenza dell'anestesia sui risultati dell'imaging PET. 13 , 14 , 15 Ad esempio, Fuchs et al. Analizzato i parametri del sangue, quali pCO 2 , pH e lattato prima e dopo le scansioni PET usando diversi protocolli di respirazione e anestesia. È stato dimostrato che i cambiamenti significativi nei livelli di pCO2 e del lattato in anestetici rispetto a ossigeno cosciente o topi respiranti hanno determinato cambiamenti significativi nei risultati del PET. 14 Esse concludono che questo effetto è dovuto principalmente alla respirazione di ossigeno e successivamenteT all'acidosi respiratoria negli animali, portando ai diversi risultati dell'immagine PET.
La standardizzazione dei parametri di anestesia, come le concentrazioni di O 2 e le dosi di farmaci anestetici, nonché la prevenzione dell'ipotermia, aiutano ad evitare guasti sistematici. Naturalmente, l'OI è limitato dalle proprietà fisiche, ad esempio la dispersione della luce, la auto-fluorescenza dei tessuti e l'attenuazione della luce 9 . Diversi gruppi affrontano questi problemi combinando i risultati macroscopici dell'OI con altre tecniche come la microscopia in fluorescenza in vivo o la citometria a flusso.
In vivo l' imaging dell'attività MMP mediante sonde fluorescenti attive a MMP è stato utilizzato in diversi modelli sperimentali di infiammazione come CHS, 7 ma anche in malattie come l'ischemia cerebrale, 16 aneurisie aortiche, 17 infarto miocardico 18E placche aterosclerotiche 19 , nonché vari modelli tumorali. 20
Ad esempio, Cortez-Retamozo et al. Ha studiato l'attività in vivo di MMP in un modello di infiammazione allergica delle vie aeree iniettando una sonda attivabile MMP, 24 h dopo l'applicazione intranasale di ovalbumina nei topi precedentemente sensibilizzati. 21 Per identificare l'ubicazione dell'attività MMP ulteriormente questo gruppo ha combinato la tomografia OI, la broncoscopia a fibre ottiche NIR e la microscopia intravitale per monitorare in modo più dettagliato il corso della malattia e la risposta al trattamento. 21
Altri approcci per misurare l'attività MMP in vivo utilizzano prevalentemente inibitori di MMP che si legano al sito attivo di MMP. McIntyre et al. Descrisse un rilevamento associato-MMP-7 del tumore in vivo utilizzando un "substrato fluorogenico a base di polimeri", che funge da "proteolite, Che dimostra che l'attività di MMP-7 può essere rilevata in modo selettivo mediante l'imaging ottico.23 Inoltre, Olson ed altri studiarono "peptidi penetranti cellulare attivatabili" (ACPPs) che sono in grado di Target molti modelli tumorali xenograft, ma non possono adsorbire nella cellula finché il linker non è protolio. Esse hanno studiato ACPPs selettivi per MMP-2 e MMP-9. 24 , 25
L'etichettatura di inibitori MMP con isotopi radioattivi per la tomografia computerizzata (SPECT) o PET per l'emissione di singolo fotone è stata utilizzata per studiare l'espressione di MMP nell'aterosclerosi 26 e nel cancro 27 . In uno studio recente, un inibitore MMP con etichettatura a fluorescenza è stato confrontato con una sonda attivabile MMP. L'inibitore MMP con etichettatura fluorescente ha mostrato un segnale inferiore al rumorerapporto di rispetto ad una sonda attivabile ma ha richiesto un tempo di assorbimento più breve.
Nuovi biomarcatori per valutare caratteristiche fondamentali di fisiopatologia possono essere utilizzati e validati da OI. Ad esempio, la risposta a modelli molecolari pericolo associato (smorza) è un evento precoce durante una reazione infiammatoria. Vogl et al. ha utilizzato un Cy5.5 marcato anticorpo contro AlarmIn S100A9 in modelli di orecchio dermatiti pelle acuta, artrite indotta da collagene e l'infezione con Leishmania importante per sviluppare biomarker sensibile per i primi segni di infiammazione. 29
In conclusione, OI rappresenta un metodo veloce ed efficace per la ricerca preclinica, che è in grado di scoprire nuovi meccanismi di malattie in vivo, caratterizzare bersagli molecolari, così come il monitoraggio di effetti terapeutici. Tuttavia, potrebbe essere necessario un successivo processo di validazione con tecniche più quantitative come PET.
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Daniel Bukala, Natalie Altmeyer e Funda Cay per un ottimo supporto tecnico. Ringraziamo Jonathan Cotton, Greg Bowden e Paul Soubiran per aver redatto il manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Werner Siemens e dalla Facoltà di Medicina dell'Università Eberhard Karls Tübingen ('' Promotionskolleg '') e dal DFG attraverso la CRC 156 (progetto C3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cornergel | Gerhard Mann GmbH | 1224635 | ophthalmic ointment |
| Forene | Abbott GmbH | 4831850 | isoflurane |
| U40 insulin syringe | Becton Dickinson and Company | 324876 | |
| Heparin | Sintetica | 6093089 | |
| High-Med-PE 0.28 x 0.61 mm | Reichelt Chemietechnik GmbH+Co | 28460 | polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm |
| BD Regular Bevel Needles, 30 G | Becton Dickinson & Co. Ltd. | 305106 | 30 G injection cannula |
| RTA-0011 isoflurane vaporizer | Vetland Medical Sales and Services LLC | - | |
| Artagain drawing paper | Strathmore Artist Paper | 446-8 | coal black |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Optical imaging system |
| BD Regular Bevel Needles, 25 G | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| 2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene | Sigma Aldrich GmbH | 7987456F | TNCB |
| MMPSense 680 | Perkin Elmer | NEV10126 | fluorescent imaging dye |
| Oditest | Koreplin GmbH | C1X018 | mechanical measurment |
| Miglyol 812 | SASOL | - | Oil |
| BALB/C, C57BL/6 | Charles River Laboratories | - | Mice used for experiements |
| PBS | Sigma Aldrich GmbH | For dilution of the RA serum | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf | Used for TNCB application | |
| shaver | Wahl | 9962 | Animal hair trimmer |
| Living Image | Perkin Elmer | Imaging software to measure OI |
References
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