Summary
In dit artikel wordt de toepassing van fluorescerende beeldvorming beschreven met behulp van een activeerbare optische beeldsensor om de in vivo activiteit van belangrijke matrixmetalloproteinasen te visualiseren in twee verschillende experimentele modellen van ontsteking.
Abstract
In dit artikel wordt een niet-invasieve methode beschreven voor het imaging van matrixmetalloproteinasen (MMP) -activiteit door middel van een actieve fluorescentie probe, via in vivo fluorescentie optische beeldvorming (OI), in twee verschillende muizenmodellen van ontsteking: een reumatoïde artritis (RA) en een contact Overgevoeligheidsreactie (CHR) model. Licht met een golflengte in het nabijgelegen infrarood (NIR) venster (650-950 nm) zorgt voor een dieper weefselpenetratie en een minimale signaalabsorptie in vergelijking met golflengten onder 650 nm. De belangrijkste voordelen met behulp van fluorescentie OI is dat het goedkoop, snel en makkelijk te implementeren is in verschillende diermodellen.
Activerbare fluorescerende probes zijn optisch stil in hun geïnactiveerde staten, maar worden zeer fluorescerend wanneer ze worden geactiveerd door een protease. Geactiveerde MMP's leiden tot weefselvernietiging en spelen een belangrijke rol voor ziekteprogressie bij vertraagde overgevoeligheidsreacties (DTHR's) zoals RA en CHR. Bovendien zijn MMP'sde sleutel proteasen kraakbeen en botafbraak en geïnduceerd door macrofagen, fibroblasten en chondrocyten in respons op pro-inflammatoire cytokines. Hier gebruiken we een sonde die wordt geactiveerd door de sleutel MMP's zoals MMP-2, -3, -9 en -13 en beschrijven een beeldvormingsprotocol voor nabij infrarood fluorescentie OI van MMP-activiteit in RA en controlemuizen 6 dagen na ziekte-inductie en zoals in muizen met acute (1x challenge) en chronische (5x challenge) CHR op het rechteroor in vergelijking met gezonde oren.
Introduction
Auto-immuunziekten zoals reumatoïde artritis (RA) of psoriasis vulgaris worden beoordeeld als vertragingstypische overgevoeligheidsreacties (DTHR's). 1 RA is een algemene auto-immuunziekte die wordt gekenmerkt door erosieve synovitis en gewrichtsvernietiging. 2 Inflammede artritische gewrichten demonstreert infiltratie en proliferatie van ontstekingscellen, een verhoogde expressie van pro-inflammatoire cellen die leiden tot pannusvorming, kraakbeen en botvernietigingen. 3 , 4 De splitsing van extracellulaire matrixmoleculen, zoals collageen door matrixmetalloproteinasen (MMP's), is essentieel voor weefselconversie en angiogenese en veroorzaakt weefselvernietigingen. 5 , 6 Contact overgevoeligheidsreacties (CHR) worden gekenmerkt door aggregatie van neutrofielen die leiden tot een oxidatieve uitbarsting. 7 Vergelijkbaar met RA zijn MMP's in CHR betrokkenBij het weefselomzetting, celmigratie en angiogenese om chronische ontsteking te vestigen.
Om RA te onderzoeken, werd het glucose-6-fosfaat-isomerase (GPI) -serum injectiemuismodel gebruikt. 8 Serum van transgene K / BxN muizen die antilichamen tegen GPI bevatten, werd geïnjecteerd in naïeve BALB / c-muizen waarna reumatische ontsteking binnen 24 uur begon te ontwikkelen met een maximale enkelzwelling op dag 6 na GPI-seruminjectie (zie 1.1). Om chronische CHR te analyseren, werden C57BL / 6-muizen gevoelig gemaakt voor trichloorbroombenzeen (TNCB) op de buik. Het rechter oor werd uitgedaagd tot 5 keer vanaf 1 week na sensibilisatie (zie ook 1.1 en 1.2).
Noninvasive small animal OI is een techniek gebaseerd op het in vivo onderzoek van fluorescerende, chemiluminescerende en bioluminescerende signalen, die voornamelijk worden gebruikt in preklinisch onderzoek. De verworven semi-kwantitatieve gegevens geven inzicht in het molecuulUlar mechanismen in de organen en weefsels van gezonde en zieke experimentele diermodellen, en stelt longitudinale opvolgingsmetingen mogelijk ( bijv. Ter beoordeling van therapeutische responsprofielen in vivo ). Een groot voordeel van longitudinale studies is de vermindering van de dierengetallen, aangezien dezelfde dieren in opvolgstudies op verschillende tijdstippen kunnen worden gemeten in plaats van verschillende muizen per tijdspunt te gebruiken. De resolutie van OI laat gedetailleerde functionele beeldvorming van organen en zelfs kleinere weefselstructuren in experimentele dieren toe.
Het gebruik van specifieke excitatie- en emissiefilters met een smal transmissiespectrum, een bescherming tegen verstrooid licht door een lichtdichte "dark box" en een gevoelige geladen-gekoppelde apparaat (CCD) camera, die in veel apparaten wordt gekoeld tot -70 ° C , Maakt zeer specifieke en gevoelige metingen van fluorescentiesignalen mogelijk.
Met behulp van fluorescerende middelen met excitatie- enEmissiespectra in het bijna-infrarood fluorescentievenster (650 - 950 nm), kunnen signaal-ruisverhoudingen aanzienlijk worden verbeterd. Het bijna-infrarood fluorescentievenster wordt gekenmerkt door een relatief lage opname van het signaal door hemoglobine en water, evenals een lage achtergrond-automatische fluorescentie. 9 Dit zorgt voor een doordringingsdiepte van maximaal 2 cm in het weefsel van kleine dieren. OI-probes kunnen een doel direct aanpakken ( bijv. Door een fluorescentie gemerkt antilichaam) of kan worden geactiveerd in het doelweefsel ( bijv. Door proteasen). Activeerbare OI-probes zijn optisch stil in hun geïnactiveerde vorm als gevolg van de voorster-resonantie-energie-overdracht (FRET) naar een blusdeel, die de exciteringsenergie binnen het molecuul overbrengt naar een ander domein. Als de kleurstof gesplitst wordt (bijvoorbeeld door een protease) wordt de energie niet meer binnen het molecuul overgebracht en kan een fluorescentie signaal door OI gedetecteerd worden. Dit maakt het mogelijk om OI-probes met hoge specificiteit te ontwerpeny voor verschillende biologische processen en uitstekende signaal-tot-ruis-verhoudingen.
Het volgende protocol wordt ingegaan op bereiding van de dieren, de OI metingen met een activeerbare facultatief probe voor het MMP-2, -3, -9 en -13 activiteit in vivo en twee experimentele modellen van ontsteking (RA, CHR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures die in dit document zijn beschreven, volgden de richtlijnen en internationale normen voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren en werden goedgekeurd door het lokale dierenwelzijns- en ethiekcomité van de Landcommissie Tuebingen, Duitsland. 8 tot 12 weken oude BALB / c en C57BL / 6 muizen werden gehouden in een 12 uur: 12 uur lichte donkercyclus en werden gehuisvest in IVC's en gestandaardiseerde milieuomstandigheden bij 22 ± 1 ° C in groepen van 2 - 5 met water en Voedsel toegang ad libitum .
1. Materiaalvoorbereiding
- Verdun de OI-kleurstof voor bijna infrarood fluorescentie beeldvorming volgens het respectievelijke gegevensblad direct voor injectie. De activeerbare OI-kleurstof (commerciële sonde met een excitatie bij 680 nm) om MMP's in vivo te meten, is klaar om te gebruiken bij een concentratie van 20 nmol in 1,5 ml 1x PBS. Schud of vortex de oplossing voor gebruik. OI-kleurstof kan gedurende maximaal 6 maanden bij 2 - 8 ° C worden opgeslagen bij bescherming tegen licht. Voor intraveneuze (iv) injectie te bereiden veneuze katheter. Gebruik een 20 U (0,5 ml) insuline spuit met 0,9% zoutoplossing (die 10 inspuiteenheden heparine in 50 ml) en een 30-gauge naald bevestigd aan een polyethyleen katheter. Injecteer de aanbevolen dosis van 2 nmol per muis van de OI kleurstof.
2. Inductie van reumatoïde artritis en chronische Contact Overgevoeligheidsreactie
- Reumatoïde artritis:
- Verdun 100 gl serum (na K / BxN muizen 10) bevattende antilichamen (AB) tegen glucose-6-fosfaat- isomerase (GPI) 1: 1 met 1x PBS (200 pl) RA induceren. Bewaar het verdunde serum bij -80 ° C. Gedetailleerde procedures voor de inductie van RA worden beschreven door Monach et al. 8.
- RA induceren Licht de muis voorzichtig bij zijn staart en injecteer 200 pi van het verdunde serum intraperitoneale (ip) op dag 0 tHij experimenteert. Na de injectie plaats de muis direct in zijn kooi.
- Optioneel, meet de enkeldiameters van elke enkel, vóór AB-injecties en definieer een "artritische score" ( Figuur 1A ). Ga de meting van enkelzwelling dagelijks door tot op dag 6 na het GPI-serum met behulp van een mechanisch meetapparaat (micrometer).
- Spuit de activeerbare OI-kleurstof in (stap 1.1 - 1.2), om in vivo MMP-activiteit iv te meten in de staartader van RA-muizen Op dag 5 na GPI-serum injectie en in de staartader van controle muizen. Doe optische beeldvormingsexperimenten 24 uur na staartinjectie.
- Contact overgevoeligheidsreactie:
- Voor sensibilisatie van C57BL / 6 muizen bereidt u een 5% TNCB oplossing op opgelost in een 4: 1 mengsel van aceton / olie.
- Anaesthetiseer C57BL / 6 muizen met 1,5% isofluraan verdampt in 100% zuurstof (1,5 L / min). Zodra de muizen verdoofd zijn, plaats deze in een zelfzinnige e neuskegel (een vermindering met 5 ml polyethyleen zuiger, verbonden met het 1,5 vol% isofluraan buis) en anesthesie te handhaven. Breng dierenarts oogzalf op verdoofde dieren droogte van de ogen te vermijden, terwijl verdoofd.
- Scheer de buik voorzichtig (2 x 2 cm) met een kleine dierlijk haar trimmer. Niet verwondt de huid, omdat dit kan leiden tot niet-specifieke fluorescentiesignalen in het dier en kunnen de resultaten van het onderzoek beïnvloeden.
- Toepassing 80 pi van de 5% TNCB oplossing langzaam het geschoren abdomen gebied telkens met 100 pi pipet aan het dier gevoelig. Plaats de muis voorzichtig terug in zijn kooi en zorg ervoor dat de ogen van de muis niet in contact komen met het beddengoed aan het hoornvlies letsel te voorkomen en te voorkomen dat lage lichaamstemperatuur tijdens de fase van herstel.
- Zes dagen na sensibilisatie, stelt een 1% TNCB oplossing (opgelost in een 9: 1 mengsel van aceton / olie) en 20 pi gelden op het rechteroor met behulp van een pipet om acute en chronische CHSR wekken."> 1
- Begin met de 1e challenge aan beide zijden van het rechter oor met 20 ui 1% TNCB oplossing wordt met een 100 ul pipet en herhaal de uitdaging om de andere dag tot vijf maal (dagen 15 na sensitisatie) ontlokken CHR (Figuur 1B) . Meet oordikte dagelijks gemeten met een micrometer meetinrichting.
- Injecteer de activeerbare OI kleurstof (een commercieel probe met excitatie bij 680 nm) (stap 1,1-1,2) MMP-activiteit in vivo meten CHR muizen 12 uur na de uitdaging. Uitvoeren optische beeldvorming experimenten 24 uur na injectie in de staart ader (iv).
3. Bereiding van dieren voor optische beeldvorming
- Schakelaar muizenvoeding (ten minste 3 dagen voor imaging) lage of niet-fluorescentie chow (bijvoorbeeld mangaan gratis) de interferentie van auto-fluorescentie (ongeveer 700 nm) te voorkomen bij het fluorescentiesignaal van de gebruikte OI middelen.
- Plaats het dier inNaar een anesthesiebox en verdoving met 1,5 vol% isofluraan verdampt met zuurstof (1,5 L / min) (zuurstof kan door lucht vervangen worden maar moet binnen één experiment gestandaardiseerd zijn).
- Wanneer de muis zichtbaar verdoofd is, plaats deze in een zelfgemaakte neuskegel (gebouwd door een gesneden 5 ml polyethyleenspuit, verbonden met de 1,5 vol% isofluranebuis) en verdoving.
- Scherp het dier zorgvuldig op de doelplaats (2 cm x 2 cm) met een kleine dierharen trimmer. Vermijd het verwonden van de huid, omdat dit kan leiden tot onspecifieke fluorescente signalen binnen het dier en de resultaten van de studie kunnen beïnvloeden.
OPMERKING: Haren kunnen het fluorescentiesignaal opnemen tijdens OI (afhankelijk van de muisspanning, min of meer absorptie wordt waargenomen), afhankelijk van de regio van belang (ROI). - Voor iv injectie, plaats de staart van de muis in warm water, om vasodilatie te veroorzaken, reinig de huid zachtjes op de injectieplaats met alcohol en begin door de katheter opDe distale plaats van de staart. Plaats de snijrand van de naald in een hoek van 20 ° in de staartveneugel en toets de juiste plaatsing van de katheter door de injectiespuit opnieuw op te schuiven.
- Als de katheter correct geplaatst is, vervang dan de spuit en injecteer de OI sonde (2 nmol). Na injectie, vervang de injectiespuit en injecteer 25 μL 0,9% zoutoplossing om het dode volume van de polyethyleenslang helemaal leeg te maken.
OPMERKING: De weefsel halveringstijd van de gebruikte OI kleurstof (een commerciële sonde met excitatie bij 680 nm) voor het meten van MMP activiteit in vivo is 72 uur. Om een volledige klaring te garanderen, wordt een herinjectie van de kleurstof niet eerder aanbevolen dan 7 dagen na een voorafgaande injectie.
4. Optische beeldvorming
- Plaats een zwart plastic of papierblad in het zwarte vakje van de OI-scanner in het midden van het zichtveld (FOV).
- Stel een meetprotocol op en kies de juiste golflengte (excitatie: 680 ± 10 nm en eMissie: 700 ± 10 nm) en beeldparameters.
OPMERKING: In sommige OI-systemen is de opstelling voor meerdere beeldkleurstoffen vooraf gedefinieerd. - Om het juiste protocol voor fluorescentiebeelden te kiezen, open de afbeeldingssoftware (geleverd door de fabrikant) en initialiseer het systeem. De meeste CCD-camera's moeten afkoelen naar hun werk temperatuur, en dit kan 10 minuten duren. Wacht tot het systeem klaar is voor betrouwbare resultaten.
- Let op dat het in-vivo -beeldscherm-opname-bedieningspaneel pop-up is en elk geselecteerd filterpaar een afbeelding in de volgorde vertegenwoordigt. In dit geval, verwerven één beeld met de filterparen voor de commerciële kleurstof met en een excitatie- en emissiegolflengte van respectievelijk 680 ± 10 nm en 700 ± 10 nm, en start de meting (Druk op "Acquire sequence"). Raadpleeg de handleiding van de fabrikant voor meer gedetailleerde instructies.
- Benoem de afbeeldingen op een juiste manier en sla de informatie op in de afbeelding 'Bewerken'Labels" venster, dat verschijnt naar aanleiding van de 'Acquire sequentie'.
- Neem een basislijn scan van elk dier vóór het injecteren van de kleurstof OI of gebruikt naïeve controledieren het achtergrondsignaal differentiëren.
- h na injectie in de staartader van de OI kleurstof, plaatst de dieren in het midden van het ZV in staat de hoogste signaal in de GH te meten, en start de meting.
LET OP: Let op: Onderkoeling kan een aanzienlijke invloed hebben op de verdeling van de beeldvorming agenten. Zorg ervoor dat het podium wordt opgewarmd tot 37 ° C om onderkoeling van het dier te voorkomen. Beeldvorming kan gelijktijdig worden uitgevoerd met dieren in groepen van 1-5 muizen. Kies de grootte van de FOV, afhankelijk van het aantal dieren te meten tegelijk. U kunt een afbeelding helder veld te nemen om te controleren of elke muis zichtbaar is.
5. Data Analysis
OPMERKING: Voer data-analyse met behulp van de software-image volgendeProtocol van de fabrikant.
- Voor metingen van RA gebruikt u de gekalibreerde eenheid van de fotonemissie zoals weergegeven in Figuur 2 , terwijl chronische CHSR als signaalintensiteit in procent (efficiëntie) wordt afgebeeld.
- Om ROI's handmatig te tekenen, gebruik dan het gereedschapsplaatje. Voor de analyse van de RA beelden gebruik een gestandaardiseerde cirkel, geplaatst rond het hoogste signaal in alle enkels en poten van elk dier. Om de CHSR te analyseren, plaatst u de ROI's rondom het hele rechter- en linkeroor volgens het lichte veldbeeld.
- Om de emissie- of signaalintensiteitswaarden in de specifieke getekende ROI te meten, druk dan op "meet". Het systeem levert waarden in de getekende ROI voor beschrijvende statistische analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om reumatoïde artritis (RA) te veroorzaken bij naïeve BALB / c-muizen, werden dieren geïnjecteerd ip met auto-antilichamen (1: 1 verdunning met 1x PBS) tegen GPI op dag 0. De maximale ontsteking (enkelzwelling) in dit GPI-serum geïnduceerde RA model is op dag 6 na injectie 11 . Daarom werd 2 nmol van de activeerbare OI-kleurstof bereid en geïnjecteerd iv in de staartader van artritische muizen en gezonde controledieren op dag 5. 24 uur na injectie (dag 6) werden muizen verdoofd en afgebeeld zoals beschreven in sectie 3 ( Figuur 1A ).
Om CHR te induceren, werden C57BL / 6 muizen gevoelig met 5% TNCB op dag 0 bij de geschoren buik. Op dag 7 post sensibilisatie begon de 1e uitdaging aan het rechter oor met 1% TNCB. Tot vijf uitdagingen (dag 15) werden uitgevoerd om chronische ontsteking te veroorzaken. 7 12 u na the laatste challenge, 20 nmol van de OI kleurstof geïnjecteerd iv. Op dag 15, 24 uur na injectie werd uitgevoerd zoals hierboven OI (Figuur 1B) beschreven.
Figuur 2 toont een duidelijk verbeterde fluorescentiesignaal in de achterpoten, enkels en voorpoten van de RA muis op dag 6 na inductie van de ziekte, in vergelijking met enkels (figuur 2A) besturen. Biodistributie analyse van de MMP-activiteit in organen van RA muizen en gezonde muizen vertoonden een sterk verbeterde signaal in de achterpoten, enkels en voorpoten uitsluitend in de gewrichten van RA muizen. Interessant bepaalden we een verhoogde MMP signaal in beide nieren van alle gemeten RA muizen, in vergelijking met de nieren van gezonde controlemuizen (Figuur 2A, rechts). Verder maten we een verhoogde MMP-signaal in de lever en darmen ongeacht of muizen lijden aan RA. Er werden geen verschillen tussen RA en gezonde muizen werden gevonden in thij pancreas, long, milt en hart.
Bij chronische CHR (vijf TNCB uitdagingen op het rechteroor), gemeten we sterk verhoogde MMP activiteit op de juiste ontstoken oor vergeleken met de gezonde controle linker oor (figuur 2B).
Aldus wordt onze data die een belangrijke rol van MMP activiteit tijdens ziekteprogressie bij beide modellen ontstekingsziekten.
Toolsets voor bioluminescentie en fluorescentie laat de kwantificering van bijvoorbeeld pmol fluorochroom of het aantal cellen dat expressie fluorescentie. Gegevens kunnen worden weergegeven 1. Tellen: toont een ongekalibreerde meting van de foton invalt op de camera 2. Straling (fotonen): geeft een gekalibreerde meting van het foton emissie in "fotonen / seconde / cm2 / steradiaal", wat aanbevolen voor luminescentiebeeldvorming of 3 RAdiant Efficiency (fluorescentie): toont fluorescentie-uitstraling per incident excitatievermogen, aanbevolen voor fluorescentiemetingen.
Een groot voordeel van het werken met radiantie-eenheden tijdens het analyseren van OI-afbeeldingen is dat de camera-instellingen tijdens één experiment kunnen worden gewijzigd, en dit heeft geen invloed op de beelden zelf of de gemeten ROI-gegevens, waardoor het mogelijk is om beelden van verschillende IVIS-systemen te vergelijken.
De regio van belang (ROI) geeft het specifieke gebied van belang van de gebruiker aan in een optisch beeld. De werkbalk maakt het mogelijk om 3 verschillende ROI's te trekken: meting (meet de signaalintensiteit in de ROI van de afbeelding), gemiddelde achtergrond (meet de gemiddelde signaalintensiteit in het door de gebruiker gedefinieerde gebied voor de achtergrond) of onderwerp ROI (identificeert een onderwerp dier in een afbeelding).
Als het onderwerp afwijktSpeelt een hoog onspecifiek achtergrondsignaal zelf, krijgt een achtergrond-gecorrigeerde ROI-meting door het achtergrondsignaal (ROI) van het doel ROI af te trekken. Stel het beeldminimum dicht bij nul om de automatische fluorescentie of de natuurlijk voorkomende achtergrondluminescentie in uw afbeelding te bepalen. Link het beeld aan een zelf gedefinieerde (gebruikersspecifieke) achtergrondafbeelding (ROI) die hoofdzakelijk gemeten werd aan de gemeten specifieke afbeelding.
Semi-kwantitatieve analyses van de beelden werden uitgevoerd door middel van gestandaardiseerde regio's van belangstelling (ROI's) in zowel artritische als controle-enkels, alsmede in ontstoken en gezonde oren met behulp van Living Image software. Alleen beschrijvende statistische analyses werden uitgevoerd op in vivo data in dit manuscript, wegens onvoldoende aantal dieren. Analyse van de signaalintensiteit van artritische en gezonde enkels of poten vertoonde een 7-voudige verhoogde MMP-signaalintensiteit bij artritis, in vergelijking met ankels van de controle. Een 3-voudige hogere MMP signaalintensiteit werd gedetecteerd in de voorpoten van artritische muizen in vergelijking met die van de gezonde dieren ( Figuur 3A ).
Analyse van oren met acute en chronische CHR in vergelijking met het onbeheerde controleoor, bleek een significant verhoogd MMP-signaal, zelfs na de 1e uitdaging, die na de 3de verder toegenomen en op hetzelfde niveau bleef tot de 5e uitdaging ( Figuur 3B ) . Als gevolg van verontreiniging met het contactallergeen op het linkeroor als gevolg van krassen van de muizen, hebben we een licht verhoogd MMP-signaal bepaald in het linker (niet TNCB uitgedaagd) controle oor. De resultaten wijzen op een belangrijke rol van MMP's, die wordt gekenmerkt door een sterk verhoogd fluorescentiesignaal tijdens GPI-artritis en chronische ontsteking, zoals gemeten door OI.
Load / 55180 / 55180fig1.jpg "/>
Figuur 1: RA en CHR Model, Tijdcursus van Ziekte Inductie en Tijdspunten voor OI. (A) Tijdscursus van RA inductie in BALB / c muizen (B) en chronische CHR inductie in C57BL / 6 muizen. Overzicht van de respectieve in vivo beeldvormingstijd en bijbehorende injectietijdpunten van de OI-kleurstof voor het meten van MMP-activiteit in beide modellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: MMP OI in RA, CHR en Control Animals. (A) Representatieve resultaten van de gemeten MMP activiteit in een artritische muis 6 dagen na GPI-artritisinductie en een gezonde controle muis (linkerzijde). Significant hoger signaal (Radiance (p / s / cm 2 / sr)) intensity werd waargenomen in de artritis vergeleken met de gezonde muis. Het beeld rechts toont de MMP activiteit in de achterpoten en omvat de enkels, voorpoten, pancreas, long, milt, hart, nieren, lever en darmen van een opgeofferd GPI-arthritis muizen met OI inktinjectie. OI bracht een hoog signaal op de voorpoten, enkels en achterpoot RA muizen en de lever en de darmen, ongeacht of de muizen werden geïnjecteerd met GPI serum (RA muizen) of controleserum (gezonde controlemuizen). (B) MMP fluorescentiesignaal in oren met chronische CHR (links) en controledieren (rechts). Het ontstoken rechteroor (uitgedaagd 5 maal) vertoont een sterk verbeterde signaal ten opzichte van controle oren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
<Br /> Figuur 3: Semi-kwantitatieve analyse van geïnflameerde en gezonde enkels en oorweefsel met behulp van OI. (A) Semi-kwantitatieve analyse van het fluorescentiesignaal in RA en gezonde dieren in de voorpoten en enkelgewrichten. Artritische voorpoten en enkelgewrichten tonen een significant (** p <0,05) (n = 3) hoger MMP-signaal in vergelijking met gezonde enkelgewrichten en voorpoten. De gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± SD. (B) Semi-kwantitatieve analyse van de linker en rechter (uitgedaagde) oren na de 1e , 3e en 5de uitdaging. MMP-signaal is significant verhoogd van de eerste tot de 5e uitdaging en vertoonde al na de derde uitdaging een maximale signaalintensiteit in het rechter uitgedaagde oor (** p <0,05) (n = 3) (controle oren zijn gedeeltelijk besmet met TNCB Door de muizen krabben. Dit resulteerde in een verbeterd signaal dat niet significant was. De gegevens worden weergegeven als het gemiddelde± SEM. De t-test van de 2-staartstudent werd gebruikt voor het analyseren van verschillen tussen ontsteking (GPI-artritische enkels, rechter behandelde oren) en controle (controle ankels, onbehandelde oren voor beide modellen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OI is een zeer nuttig, snel en goedkoop hulpmiddel voor niet-invasieve in vivo moleculaire beeldvorming in preklinisch onderzoek. Een bepaalde kracht van OI is de mogelijkheid om zeer dynamische processen zoals ontstekingsreacties te monitoren. Bovendien maakt OI het mogelijk om gedurende een langere periode de loop van een ziekte te volgen, variërend van dagen tot weken.
OI heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere in vivo beeldvormende modaliteiten zoals positronemissie-tomografie (PET) of magnetische resonantiebeeldvorming (MRI), zoals het zeer tijd- en kostenefficiënt is. High-throughput analyse met maximaal vijf dieren per acquisitie is mogelijk. Bovendien zijn er een groot aantal probes, gericht op veel verschillende biologische processen, beschikbaar. 12 Om verdere anatomische informatie te verstrekken, kan OI gecombineerd worden met andere beeldvormende technieken zoals MRI of x-ray. Een andere beperking is de lage weefsel penetratie diepte vergeleken bijv. FUnctionele PET beeldvorming. Verder zijn er een groot aantal probes gericht op veel verschillende biologische doelen beschikbaar. 12
Effecten van anesthesie mogen niet worden onderschat bij in vivo beeldvorming. Hoewel specifieke effecten van verdoving op OI resultaten niet goed gekenmerkt zijn, heeft onze groep in verschillende studies de invloed van anesthesie op PET-beeldresultaten getoond. 13 , 14 , 15 Bijvoorbeeld, Fuchs et al. Geanalyseerde bloedparameters, zoals pCO2, pH en lactaat voor en na PET-scans met behulp van verschillende ademhaling- en anesthesieprotocollen. Er werd aangetoond dat significante veranderingen in pCO2- en lactaatgehaltes in verdoving vergeleken met bewuste zuurstof- of luchtademende muizen tot aanzienlijke veranderingen in PET-resultaten leiden. 14 Zij concluderen dat dit effect vooral wordt veroorzaakt door ademhaling van zuurstof en subsequenT naar respiratoire acidose bij dieren, wat leidt tot de verschillende resultaten in de PET beeldvorming.
Standaardisatie van anesthesieparameters, zoals O 2 -concentraties en doses verdovingsmiddelen, evenals preventie van hypothermie helpen bij het voorkomen van systematische falen. Natuurlijk is OI beperkt door fysieke eigenschappen, zoals lichtverstrooiing, weefsel-auto-fluorescentie en lichtdemping 9 . Verscheidene groepen behandelen deze problemen door de macroscopische resultaten van OI te combineren met andere technieken zoals in vivo fluorescentiemicroscopie of flowcytometrie.
In vivo beeldvorming van MMP activiteit door MMP-specifieke activatabele fluorescerende probes is gebruikt in verschillende experimentele modellen van ontsteking zoals CHS, 7 maar ook bij ziekten zoals cerebrale ischemie, 16 aorta aneurysma's, 17 myocardinfarct 18En atherosclerotische plaques 19 evenals verschillende tumormodellen. 20
Bijvoorbeeld, Cortez-Retamozo et al. Onderzoekde de in vivo activiteit van MMP's in een model van allergische luchtwegontsteking door een MMP-activeerbare probe te injecteren, 24 uur na intranasale toediening van ovalbumine bij eerder gevoelig gemaakte muizen. 21 Om de locatie van MMP-activiteit te identificeren, combineerde deze groep tomografische OI, NIR-vezeloptische bronchoscopie en intravitale microscopie om de ziekteverloop en het behandelingsrespons meer in detail te volgen. 21
Andere benaderingen om in vivo MMP-activiteit te meten gebruiken meestal remmers van MMP die binden aan de actieve plaats van MMP's. McIntyre et al. Beschreef een in vivo tumor geassocieerde MMP-7 detectie door gebruik te maken van een "polymer-based fluorogenic substraat", dat fungeert als een "proteolytIc beacon "voor MMP's in een muizen xenograft model. 22 Zij tonen aan dat de activiteit van MMP-7 selectief kan worden gedetecteerd door optische beeldvorming. 23 Verder, Olson et al., Onderzochte" activatabele cel penetrerende peptiden "(ACPP's) die kunnen Target veel xenograft tumor modellen, maar kunnen niet adsorberen in de cel totdat de linker is gepolymeer. Ze onderzochten ACPP's die selectief zijn voor MMP-2 en MMP-9.
Etikettering van MMP-remmers met radioactieve isotopen voor single-foton emissie computed tomografie (SPECT) of PET beeldvorming werd gebruikt om MMP expressie in atherosclerose 26 en kanker 27 te bestuderen. In een recente studie werd een fluorescentie-gemerkte MMP-remmer vergeleken met een MMP-activerbare probe. 28 De fluorescent gelabelde MMP inhibitor vertoonde een lager signaal naar geluidratio vergeleken met een activeerbare probe maar vereist een kortere opname tijd.
Nieuwe biomarkers te beoordelen belangrijkste kenmerken van pathofysiologie kunnen worden gebruikt en gevalideerd door OI. Bijvoorbeeld, de respons op gevaar geassocieerde moleculaire patronen (gedempt) is een vroege gebeurtenis tijdens een ontstekingsreactie. Vogl et al. gebruik gemaakt van een Cy5.5 gelabeld antilichaam tegen Alarm in S100A9 in modellen van acute oor huid dermatitis, collageen-geïnduceerde artritis en infectie met Leishmania major gevoelige biomarker voor de vroege tekenen van ontsteking ontwikkelen. 29
Concluderend, OI is een snelle en efficiënte werkwijze voor preklinisch onderzoek, dat in staat blootleggen nieuwe mechanismen van ziekten in vivo karakterisatie van nieuwe moleculaire doelwitten, alsook controle therapeutische effecten is. Toch kan een latere validatieproces met meer kwantitatieve technieken zoals PET nodig zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken Daniel Bukala, Natalie Altmeyer en Funda Cay voor uitstekende technische ondersteuning. We bedanken Jonathan Cotton, Greg Bowden en Paul Soubiran voor het bewerken van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Werner Siemens-Stichting en de Medische Faculteit van de Eberhard Karls Universiteit Tübingen ('' Promotionskolleg '') en door de DFG via de CRC 156 (project C3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cornergel | Gerhard Mann GmbH | 1224635 | ophthalmic ointment |
| Forene | Abbott GmbH | 4831850 | isoflurane |
| U40 insulin syringe | Becton Dickinson and Company | 324876 | |
| Heparin | Sintetica | 6093089 | |
| High-Med-PE 0.28 x 0.61 mm | Reichelt Chemietechnik GmbH+Co | 28460 | polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm |
| BD Regular Bevel Needles, 30 G | Becton Dickinson & Co. Ltd. | 305106 | 30 G injection cannula |
| RTA-0011 isoflurane vaporizer | Vetland Medical Sales and Services LLC | - | |
| Artagain drawing paper | Strathmore Artist Paper | 446-8 | coal black |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Optical imaging system |
| BD Regular Bevel Needles, 25 G | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| 2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene | Sigma Aldrich GmbH | 7987456F | TNCB |
| MMPSense 680 | Perkin Elmer | NEV10126 | fluorescent imaging dye |
| Oditest | Koreplin GmbH | C1X018 | mechanical measurment |
| Miglyol 812 | SASOL | - | Oil |
| BALB/C, C57BL/6 | Charles River Laboratories | - | Mice used for experiements |
| PBS | Sigma Aldrich GmbH | For dilution of the RA serum | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf | Used for TNCB application | |
| shaver | Wahl | 9962 | Animal hair trimmer |
| Living Image | Perkin Elmer | Imaging software to measure OI |
References
- Veale, D. J., Ritchlin, C., FitzGerald, O. Immunopathology of psoriasis and psoriatic arthritis. Ann Rheum Dis. 64, 26 (2005).
- Harris, E. D. Rheumatoid arthritis. Pathophysiology and implications for therapy. N Engl J Med. 322 (18), 1277-1289 (1990).
- Lee, D. M., Weinblatt, M. E. Rheumatoid arthritis. Lancet. 358 (9285), 903-911 (2001).
- Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. J Clin Rheumatol. 11, S39-S44 (2005).
- Pap, T., et al. Differential expression pattern of membrane-type matrix metalloproteinases in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 43 (6), 1226-1232 (2000).
- Firestein, G. S., Paine, M. M. Stromelysin and tissue inhibitor of metalloproteinases gene expression in rheumatoid arthritis synovium. Am J Pathol. 140 (6), 1309-1314 (1992).
- Schwenck, J., et al. In vivo optical imaging of matrix metalloproteinase activity detects acute and chronic contact hypersensitivity reactions and enables monitoring of the antiinflammatory effects of N-acetylcysteine. Mol Imaging. 13, (2014).
- Monach, P. A., Mathis, D., Benoist, C.
- Zelmer, A., Ward, T. H. Noninvasive fluorescence imaging of small animals. J Microsc. 252 (1), 8-15 (2013).
- Kouskoff, V., et al. Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity. Cell. 87 (5), 811-822 (1996).
- Fuchs, K., et al. In vivo imaging of cell proliferation enables the detection of the extent of experimental rheumatoid arthritis by 3'-deoxy-3'-18f-fluorothymidine and small-animal PET. J Nucl Med. 54 (1), 151-158 (2013).
- Schwenck, J., et al. Fluorescence and Cerenkov luminescence imaging. Applications in small animal research. Nuklearmedizin. 55 (2), 63-70 (2016).
- Mahling, M., et al. A Comparative pO2 Probe and [18F]-Fluoro-Azomycinarabino-Furanoside ([18F]FAZA) PET Study Reveals Anesthesia-Induced Impairment of Oxygenation and Perfusion in Tumor and Muscle. PLoS One. 10 (4), 0124665 (2015).
- Fuchs, K., et al. Oxygen breathing affects 3'-deoxy-3'-18F-fluorothymidine uptake in mouse models of arthritis and cancer. J Nucl Med. 53 (5), 823-830 (2012).
- Fuchs, K., et al. Impact of anesthetics on 3'-[18F]fluoro-3'-deoxythymidine ([18F]FLT) uptake in animal models of cancer and inflammation. Mol Imaging. 12 (5), 277-287 (2013).
- Liu, N., Shang, J., Tian, F., Nishi, H., Abe, K. In vivo optical imaging for evaluating the efficacy of edaravone after transient cerebral ischemia in mice. Brain Res. 1397, 66-75 (2011).
- Sheth, R. A., Maricevich, M., Mahmood, U. In vivo optical molecular imaging of matrix metalloproteinase activity in abdominal aortic aneurysms correlates with treatment effects on growth rate. Atherosclerosis. 212 (1), 181-187 (2010).
- Chen, J., et al. Near-infrared fluorescent imaging of matrix metalloproteinase activity after myocardial infarction. Circulation. 111 (14), 1800-1805 (2005).
- Wallis de Vries, B. M., et al. Images in cardiovascular medicine. Multispectral near-infrared fluorescence molecular imaging of matrix metalloproteinases in a human carotid plaque using a matrix-degrading metalloproteinase-sensitive activatable fluorescent probe. Circulation. 119 (20), e534-e536 (2009).
- Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).
- Cortez-Retamozo, V., et al. Real-time assessment of inflammation and treatment response in a mouse model of allergic airway inflammation. J Clin Invest. 118 (12), 4058-4066 (2008).
- McIntyre, J. O., et al. Development of a novel fluorogenic proteolytic beacon for in vivo detection and imaging of tumour-associated matrix metalloproteinase-7 activity. Biochem J. 377, 617-628 (2004).
- Scherer, R. L., VanSaun, M. N., McIntyre, J. O., Matrisian, L. M. Optical imaging of matrix metalloproteinase-7 activity in vivo using a proteolytic nanobeacon). Mol Imaging. 7 (3), 118-131 (2008).
- Olson, E. S., et al. In vivo characterization of activatable cell penetrating peptides for targeting protease activity in cancer. Integr Biol (Camb. 1 (5-6), 382-393 (2009).
- Duijnhoven, S. M., Robillard, M. S., Nicolay, K., Grull, H. Tumor targeting of MMP-2/9 activatable cell-penetrating imaging probes is caused by tumor-independent activation). J Nucl Med. 52 (2), 279-286 (2011).
- Schafers, M., Schober, O., Hermann, S. Matrix-metalloproteinases as imaging targets for inflammatory activity in atherosclerotic plaques. J Nucl Med. 51 (5), 663-666 (2010).
- Wagner, S., et al. A new 18F-labelled derivative of the MMP inhibitor CGS 27023A for PET: radiosynthesis and initial small-animal PET studies. Appl Radiat Isot. 67 (4), 606-610 (2009).
- Waschkau, B., Faust, A., Schafers, M., Bremer, C. Performance of a new fluorescence-labeled MMP inhibitor to image tumor MMP activity in vivo in comparison to an MMP-activatable probe. Contrast Media Mol Imaging. 8 (1), 1-11 (2013).
- Vogl, T., et al. Alarmin S100A8/S100A9 as a biomarker for molecular imaging of local inflammatory activity. Nat Commun. 5, 4593 (2014).
