Summary
Cet article explique l'application de l'imagerie fluorescente à l'aide d'une sonde d'imagerie optique activable pour visualiser l'activité in vivo des métalloprotéinases matricielles clés dans deux modèles expérimentaux différents d'inflammation.
Abstract
Cet article décrit une méthode non invasive pour imager l'activité de la métalloproteinases matricielles (MMP) par une sonde fluorescente activable, via l' imagerie optique fluorescente in vivo (OI), dans deux modèles d'inflammation de souris: une polyarthrite rhumatoïde (RA) et un contact Modèle de réaction d'hypersensibilité (CHR). La lumière avec une longueur d'onde dans la fenêtre infrarouge proche (NIR) (650 - 950 nm) permet une pénétration plus profonde des tissus et une absorption minimale du signal par rapport aux longueurs d'onde inférieures à 650 nm. Les principaux avantages de l'OI de fluorescence sont qu'il est bon marché, rapide et facile à mettre en œuvre dans différents modèles animaux.
Les sondes fluorescentes activables sont silencieuses optiquement dans leurs états inactivés, mais deviennent très fluorescentes lorsqu'elles sont activées par une protéase. Les MMP activées conduisent à la destruction des tissus et jouent un rôle important pour la progression de la maladie dans des réactions d'hypersensibilité à retard de type (DTHR) telles que la PR et la CHR. En outre, les MMP sontles protéases essentielles pour le cartilage et la dégradation des os et sont induites par les macrophages, les fibroblastes et les chondrocytes en réponse à des cytokines pro-inflammatoires. Ici, nous utilisons une sonde qui est activé par les MMPs clés comme la MMP-2, -3, -9 et -13 et décrivons un protocole d'imagerie à fluorescence infrarouge proche OI de l'activité de MMP dans la polyarthrite rhumatoïde et les souris témoins 6 jours après l'induction de la maladie ainsi comme chez la souris avec aiguë (1x challenge) et chroniques (5x challenge) CHR sur l'oreille droite par rapport à l'oreille en bonne santé.
Introduction
Les maladies auto-immunes telles que la polyarthrite rhumatoïde (RA) ou le psoriasis vulgaire sont classées comme des réactions d'hypersensibilité de type retardé (DTHR). 1 La PR est une maladie auto-immune commune caractérisée par une synovite érosive et une destruction articulaire. 2 Les articulations arthritiques inflammées démontrent l'infiltration et la prolifération de cellules inflammatoires, une expression accrue de cellules pro-inflammatoires conduisant à la formation de pannus, au cartilage et aux destructions osseuses. 3 , 4 Le clivage de molécules de matrice extracellulaire, comme le collagène par métalloproteinases matricielles (MMP), est essentiel pour la conversion tissulaire et l'angiogenèse et provoque des destructions tissulaires. 5 , 6 Les réactions d'hypersensibilité au contact (CHR) sont caractérisées par l'agrégation des neutrophiles conduisant à un éclatement oxydatif. 7 Similaires à la RA, les MMP en CHR sont involontairesDans la conversion des tissus, la migration cellulaire et l'angiogenèse afin d'établir une inflammation chronique.
Pour étudier la PR, on a utilisé le modèle de souris à injection injectable de glucose-6-phosphate isomérase (GPI) -serum. 8 Le sérum provenant de souris K / BxN transgéniques contenant des anticorps contre GPI a été injecté dans des souris BALB / c naïves après quoi une inflammation rhumatismale a commencé à se développer dans les 24 h avec un gonflement maximal de la cheville au jour 6 après une injection de GPI-sérum (voir 1.1). Pour analyser la CHR chronique, les souris C57BL / 6 ont été sensibilisées avec du trinitrochlorobenzène (TNCB) sur l'abdomen. L'oreille droite a été remise en question jusqu'à 5 fois, commençant 1 semaine après la sensibilisation (voir aussi 1.1 et 1.2).
L'OI de petit animal non invasif est une technique basée sur l'étude in vivo des signaux fluorescents, chimioluminescents et bioluminescents, qui sont principalement utilisés dans la recherche préclinique. Les données semi-quantitatives acquises donnent des indications sur la moléculeDans les organes et les tissus des modèles animaux expérimentaux sains et malades, et permet des mesures longitudinales de suivi ( par exemple pour évaluer les profils de réponses thérapeutiques in vivo ). Un grand avantage des études longitudinales est la réduction du nombre d'animaux, car les mêmes animaux peuvent être mesurés dans des études de suivi à plusieurs moments au lieu d'utiliser différentes souris par point de temps. La résolution de l'OI permet une imagerie fonctionnelle détaillée des organes et même des structures tissulaires plus petites dans les animaux expérimentaux.
L'utilisation de filtres d'excitation et d'émission spécifiques avec un spectre de transmission étroit, une protection contre la lumière dispersée par une "boîte foncée" résistant à la lumière et une caméra de dispositif à couplage chargé (CCD) sensible qui est refroidie dans de nombreux appareils jusqu'à -70 ° C , Permet des mesures très spécifiques et sensibles des signaux de fluorescence.
En utilisant des agents fluorescents à excitation etLes spectres d'émission dans la fenêtre de fluorescence proche infrarouge (650 - 950 nm), les rapports signal sur bruit peuvent être considérablement améliorés. La fenêtre de fluorescence proche du rayon infrarouge se caractérise par une absorption relativement faible du signal par l'hémoglobine et l'eau ainsi que par une faible fluorescence d'arrière-plan. 9 Cela permet une profondeur de pénétration allant jusqu'à 2 cm dans le tissu des petits animaux. Les sondes OI peuvent traiter directement une cible ( par exemple par un anticorps marqué par fluorescence) ou peuvent être activées dans le tissu cible ( par exemple par des protéases). Les sondes OI activables sont optiquement silencieuses sous leur forme inactivée en raison du transfert d'énergie de résonance de Förster (FRET) à une fraction de trempe qui transfère l'énergie d'excitation dans la molécule à un autre domaine. Si le colorant est clivé (par une protéase par exemple), l'énergie n'est plus transférée dans la molécule et un signal fluorescent peut être détecté par OI. Cela permet de concevoir des sondes OI avec une spécificité élevéeY pour des processus biologiques distincts et d'excellents rapports signal / bruit.
Le protocole suivant explique en détail la préparation des animaux, les mesures OI en utilisant une sonde activable OI pour imaginer l'activité MMP-2, -3, -9 et -13 in vivo et deux modèles expérimentaux d'inflammation (RA, CHR).
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Protocol
Toutes les procédures décrites dans cet article ont suivi les lignes directrices et les normes internationales relatives aux soins et à l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité local d'éthique et d'éthique des animaux de la Commission du pays Tuebingen (Allemagne). Les souris BALB / c et C57BL / 6 de 12 à 12 semaines ont été conservées sur une lumière de 12 h: 12 h: cycle sombre et ont été logées dans des IVC et des conditions environnementales normalisées à 22 ± 1 ° C dans des groupes de 2 à 5 avec de l'eau et Accès alimentaire ad libitum .
1. Préparation du matériel
- Diluer le colorant OI pour l'imagerie par fluorescence proche infrarouge selon la fiche de données respective directement avant l'injection. Le colorant OI activable (sonde commerciale avec une excitation à 680 nm) pour mesurer les MMP in vivo est prêt à l'emploi à une concentration de 20 nmol dans 1,5 mL 1x PBS. Agiter doucement ou tourbillonner la solution avant utilisation. Le colorant OI peut être conservé à 2 à 8 ° C pendant jusqu'à 6 mois lorsqu'il est protégé de la lumière. Pour les injections par voie intraveineuse (iv) préparer un cathéter veineux. Utiliser un 20 U (0,5 ml) de seringue à insuline remplie de solution à 0,9% de solution saline (contenant 10 unités d'injection d'héparine dans 50 mL), et une aiguille de calibre 30 fixée à un cathéter en polyethylene. Injecter la dose recommandée de 2 nmol par souris du colorant OI.
2. L'induction de la polyarthrite rhumatoïde et chronique contact Réaction d'hypersensibilité
- La polyarthrite rhumatoïde:
- Diluer 100 ul de sérum (obtenu à partir de K / BxN souris 10) contenant des anticorps (AB) contre isomérase glucose-6-phosphate (GPI) 1: 1 avec 1 x PBS (200 ul) pour induire RA. Stocker le sérum dilué à -80 ° C. Des procédures détaillées pour l' induction de la polyarthrite rhumatoïde sont décrits par Monach et al. 8.
- Pour induire RA, soulever chaque souris doucement par la queue et injecter 200 ul de la intrapéritonéale de sérum dilué (ip) au jour 0 de til expérience. Après l'injection placer la souris directement dans sa cage.
- Eventuellement, mesurer le diamètre de la cheville de chaque cheville, avant les injections AB et définir un « score arthritique » (figure 1A). Continuer la mesure de la cheville de gonflement par jour jusqu'à ce jour 6 après GPI-sérum en utilisant un dispositif de mesure mécanique (micromètre).
- Injecter le colorant activable OI (étape 1.1 à 1.2), pour mesurer in vivo l' activité de MMP iv dans la veine caudale de souris RA au jour 5 après l'injection GPI-sérum et dans la veine de la queue des souris témoins. Réaliser des expériences d'imagerie optique 24 h après injection dans la veine de la queue.
- Contactez réaction d'hypersensibilité:
- Pour la sensibilisation des souris C57BL / 6, préparer une solution à 5% de TNCB dissous dans un mélange 4: 1 d'acétone / huile.
- Anesthésier souris C57BL / 6 en utilisant 1,5% d'isoflurane vaporisé dans 100% d'oxygène (1,5 L / min). Une fois que les souris sont anesthésiées, placez-le dans une auto-fou Le cône du nez (une seringue en polyéthylène de 5 ml, reliée au tube isoflurane à 1,5% en volume) et à maintenir l'anesthésie. Appliquer la pommade visuelle sur les animaux anesthésiés afin d'éviter la sécheresse des yeux lorsqu'ils sont anesthésiés.
- Raser soigneusement l'abdomen (2 x 2 cm) à l'aide d'un coupe-cheveux pour animaux. Évitez de nuire à la peau, car cela peut conduire à des signaux fluorescents non spécifiques dans l'animal et peut influencer les résultats de l'étude.
- Appliquer 80 μL de la solution à 5% de TNCB lentement à l'abdomen rasé en utilisant une pipette de 100 μl pour sensibiliser l'animal. Placez la souris doucement dans sa cage en prenant soin de s'assurer que les yeux de la souris ne sont pas en contact avec le lit pour éviter les lésions de la cornée et éviter les faibles températures corporelles pendant la phase de récupération.
- Six jours après la sensibilisation, préparer une solution de TNCB à 1% (dissous dans un mélange 9: 1 d'acétone / huile) et appliquer 20 μL à l'oreille droite en utilisant une pipette pour provoquer une CHSR aiguë et chronique."> 1
- Commencez par le 1 er défi des deux côtés de l'oreille droite avec 20 μL de solution à 1% de TNCB en utilisant une pipette de 100 μL et répétez le défi tous les deux jours jusqu'à cinq fois (jour 15 après sensibilisation) pour obtenir CHR ( Figure 1B ) . Mesurez l'épaisseur de l'oreille tous les jours, en utilisant un appareil de mesure micrométrique.
- Injecter le colorant OI activable (une sonde commerciale avec excitation à 680 nm) (étape 1.1-1.2) pour mesurer l'activité MMP in vivo dans des souris CHR 12 h après la provocation. Effectuer des expériences d'imagerie optique 24 h après injection de veine de queue ( iv ).
3. Préparation animale pour l'imagerie optique
- Passez la souris (au moins 3 jours avant l'imagerie) à des aliments peu ou non fluorescents ( p. Ex . Sans manganèse) pour éviter l'interférence de l'auto-fluorescence (environ 700 nm) avec le signal de fluorescence des agents OI utilisés.
- Placez l'animal dansÀ une boîte d'anesthésie et anesthésie en utilisant 1,5% en volume d'isoflurane vaporisé avec de l'oxygène (1,5 L / min) (l'oxygène peut être remplacé par de l'air mais doit être normalisé au cours d'une expérience).
- Lorsque la souris est visiblement anesthésiée, placez-la dans un cône de nez fabriqué à l'envers (construisez par une seringue en polyéthylène de 5 mL, reliée au tube isoflurane à 1,5 vol%) et maintenez l'anesthésie.
- Raser soigneusement l'animal sur le site cible (2 cm x 2 cm) à l'aide d'un coupe-cheveux pour animaux. Évitez de nuire à la peau, car cela peut conduire à des signaux fluorescents non spécifiques dans l'animal et peut influencer les résultats de l'étude.
REMARQUE: Les poils peuvent absorber le signal de fluorescence pendant l'OI (en fonction de la contrainte de la souris, plus ou moins d'absorption est observée) selon la région d'intérêt (ROI). - Pour une injection intraveineuse, placez la queue de la souris dans de l'eau chaude, pour induire une vasodilatation, nettoyez doucement la peau au point d'injection avec de l'alcool et commencez par placer le cathéter àLe site distal de la queue. Placez le bord "coupé" de l'aiguille dans un angle de 20 ° dans la veine de la queue et testez le bon placement du cathéter en ré-suspendre la seringue.
- Si le cathéter est placé correctement, remplacez la seringue et injectez la sonde OI (2 nmol). Après l'injection, remplacez la seringue et injectez 25 μL de solution saline à 0,9% pour nettoyer complètement le volume mort du tube en polyéthylène.
NOTE: La demi-vie des tissus du colorant OI usé (une sonde commerciale avec excitation à 680 nm) pour mesurer l'activité MMP in vivo est de 72 h. Pour assurer un dégagement complet, une nouvelle injection du colorant n'est pas recommandée avant 7 jours après une injection préalable.
4. Imagerie optique
- Placez une feuille de plastique ou de papier noir dans la boîte noire du scanner OI au centre du champ de vision (FOV).
- Configurez un protocole de mesure et choisissez la longueur d'onde droite (excitation: 680 ± 10 nm et eMission: 700 ± 10 nm) et des paramètres d'imagerie.
REMARQUE: Dans certains systèmes d'OI, la configuration de plusieurs colorants d'imagerie est pré-défini. - Pour choisir le protocole approprié pour l'imagerie de fluorescence, ouvrez le logiciel d'imagerie (fourni par le fabricant) et initialiser le système. La plupart des caméras CCD doivent refroidir à leur température de fonctionnement, et cela peut prendre 10 minutes. Pour des résultats fiables, attendez que le système est prêt.
- Observer le panneau de commande d'acquisition de système d'imagerie in vivo sautent vers le haut , et chaque paire de filtres sélectionné représente une image de la séquence. Dans ce cas, acquérir une image avec les paires de filtres pour le colorant commercial avec et une longueur d'onde d'excitation et d'émission de 680 ± 10 nm et 700 ± 10 nm, respectivement, et commencer la mesure (Appuyez sur « Acquisition séquence »). Pour obtenir des instructions plus détaillées, s'il vous plaît consulter le manuel du fabricant.
- Étiqueter les images correctement et enregistrer les informations dans le « Modifier l'imageLes étiquettes » fenêtre qui apparaîtra après la « séquence Acquire ».
- Prenez une analyse de base de chaque animal avant l'injection du colorant OI, ou utiliser les animaux témoins naïfs pour différencier le signal d'arrière-plan.
- h après l'injection de la veine de la queue du colorant OI, placer les animaux dans le centre de la FOV, en mesure de mesurer le signal le plus élevé dans le système OI, et le début des mesures.
REMARQUE: Important: Hypothermie peut influencer de manière significative la distribution des agents d'imagerie. Assurez-vous que la scène est chauffée à 37 ° C pour éviter l'hypothermie de l'animal. L'imagerie peut être effectuée en même temps que les animaux par groupes de 1 à 5 souris. Choisissez la taille du FOV en fonction du nombre d'animaux à mesurer en même temps. Vous pouvez prendre une image de champ lumineux pour vérifier si chaque souris est visible.
5. Analyse des données
REMARQUE: Effectuer une analyse des données à l'aide du logiciel d'imagele protocole du fabricant.
- Pour les mesures de RA, utiliser l'unité calibrée de l'émission de photons , comme indiqué sur la figure 2, alors que CHSR chronique est représenté comme l' intensité du signal en pour cent (efficacité).
- Pour dessiner manuellement ROI, utiliser la plaque d'outil. Pour l'analyse des images RA utiliser un cercle normalisé, placé autour du signal le plus élevé dans toutes les chevilles et les pattes de chaque animal. Pour analyser le CHSR, placez les ROIs dans toute droite et l'oreille gauche selon l'image de champ lumineux.
- Pour mesurer l'émission de photons ou de signaler des valeurs d'intensité dans la ROI spécifique dessinée, appuyez sur « mesure ». Le système fournira des valeurs dans le retour sur investissement pour l'analyse statistique tirée descriptive.
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Representative Results
Pour induire la polyarthrite rhumatoïde (RA) chez des souris naïves BALB / c, les animaux ont été injectés ip avec des auto-anticorps (dilution 1: 1 avec 1x PBS) contre GPI au jour 0. L'inflammation maximale (gonflement de la cheville) dans ce Sérum GPI induit Le modèle RA est le jour 6 après injection 11 . Par conséquent, 2 nmol du colorant OI activable ont été préparés et injectés iv dans la veine de la queue de souris arthritiques et des animaux témoins sains le jour 5. 24 h après injection (jour 6), les souris ont été anesthésiées et imagées comme décrit dans la section 3 ( Figure 1A ).
Pour induire la CHR, les souris C57BL / 6 ont été sensibilisées avec 5% de TNCB au jour 0 à l'abdomen rasé. Le jour 7, après sensibilisation, le 1 er défi sur l'oreille droite utilisant 1% de TNCB a débuté. Jusqu'à cinq défis (jour 15) ont été effectués pour induire une inflammation chronique. 7 12 h après thLe dernier défi, 20 nmol du colorant OI a été injecté iv . Le jour 15, 24 heures après injection, l'OI a été effectuée comme décrit ci-dessus ( figure 1B ).
La figure 2 affiche un signal de fluorescence nettement amélioré dans les pattes postérieures, les chevilles et les pattes avant de la souris RA le jour 6 après l'induction de la maladie, par rapport aux chevilles de contrôle ( Figure 2A ). L'analyse de la biodistribution de l'activité MMP dans les organes des souris RA et des souris saines a montré un signal fortement amélioré dans les pattes postérieures, les chevilles et les pattes antérieures exclusivement dans les articulations des souris RA. Fait intéressant, nous avons déterminé un signal MMP amélioré dans les deux reins de toutes les souris RA mesurées, par rapport aux reins des souris témoins saines ( Figure 2A , à droite). De plus, nous avons mesuré un signal MMP amélioré dans le foie et l'intestin, que les souris souffrent de la PR. Aucune différence entre la PR et les souris saines n'a été trouvée dans tLe pancréas, le poumon, la rate et le cœur.
Au cours de la CHR chronique (cinq défis TNCB à l'oreille droite), nous avons mesuré une activité MMP fortement augmentée sur l'oreille enflammée droite par rapport à l'oreille témoin saine et à gauche ( Figure 2B ).
Ainsi, nos données indiquent un rôle majeur de l'activité de MMP pendant la progression de la maladie dans les deux modèles de maladies inflammatoires.
Les ensembles d'outils pour la bioluminescence et la fluorescence permettent de quantifier, par exemple, le pmol du fluorochrome ou le nombre de cellules qui expriment la fluorescence. Les données peuvent être affichées dans 1. Comptes: affiche une mesure non calibrée de l'incident de photon sur la caméra, 2. Radiance (photons): indique une mesure étalonnée de l'émission de photons dans "photons / second / cm 2 / steradian", qui est Recommandé pour l'imagerie de luminescence ou 3. RAdiant Efficiency (fluorescence): montre l'éclat d'émission de fluorescence par puissance d'excitation incidente, recommandé pour les mesures de fluorescence.
Un grand avantage de travailler avec des unités de radiance lors de l'analyse des images OI est que les paramètres de la caméra peuvent être modifiés au cours d'une expérience, ce qui n'a pas d'impact sur les images elles-mêmes ou sur les données ROI mesurées, ce qui permet de comparer les images de différents systèmes IVIS.
La région d'intérêt (ROI) indique la zone d'intérêt spécifique de l'utilisateur dans une image optique. La barre d'outils permet de dessiner 3 ROI différents: mesure (mesure l'intensité du signal dans le ROI de l'image), fond moyen (mesure l'intensité moyenne du signal dans la zone définie par l'utilisateur pour l'arrière-plan) ou le ROI du sujet (identifie un animal en question dans une image).
Si le sujet estJoue un signal d'arrière-plan non spécifique spécifique, obtient une mesure ROI corrigée en arrière-plan en soustrayant le signal de fond (ROI) du ROI cible. Réglez le minimum d'image près de zéro pour déterminer la fluorescence automatique ou la luminescence d'arrière-plan naturelle dans votre image. Reliez l'image à une image d'arrière-plan (ROI) auto-définie (spécifique à l'utilisateur) qui a été mesurée principalement à l'image spécifique mesurée.
Des analyses semi-quantitatives des images ont été effectuées en dessinant des régions d'intérêt normalisées (ROI) dans les chevilles arthritiques et de contrôle, ainsi que dans des oreilles enflammées et saines utilisant le logiciel Living Image. Seules des analyses statistiques descriptives ont été effectuées sur des données in vivo dans ce manuscrit, en raison du nombre insuffisant d'animaux. L'analyse de l'intensité du signal des chevilles ou des pattes arthritiques et saines a montré une intensité de signal améliorée de MMP de 7 fois en arthrite, par rapport aux chevilles de contrôle. Une intensité de signal supérieure à 3 fois la MMP a été détectée dans les pattes avant des souris arthritiques par rapport à celle des animaux en bonne santé (Figure 3A).
Analyse des oreilles avec CHR aiguë et chronique par rapport à l'oreille de commande incontestée gauche a montré un signal MMP augmenté de manière significative même après le 1 er challenge, ce qui a encore augmenté après la 3 e et est restée au même niveau jusqu'à la 5 ème défi (figure 3B) . En conséquence de la contamination par l'allergène de contact sur l'oreille gauche en raison de gratter des souris, nous avons déterminé un signal MMP légèrement augmenté dans la gauche (non TNCB contesté) l'oreille de contrôle. Les résultats indiquent un rôle important de MMPs, manifestée par un signal de fluorescence fortement augmenté au cours de GPI-arthrite et l'inflammation chronique, telle que mesurée par OI.
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Figure 1: RA et CHR Modèle, Temps cours de la maladie Points d' induction et du temps pour OI. (A) Le temps de parcours RA induction chez des souris BALB / c (B) et l' induction chronique CHR dans des souris C57BL / 6. Vue d'ensemble de la respective au point de temps de formation d'image in vivo et le temps d'injection associés à des points du colorant OI pour mesurer l' activité de MMP dans les deux modèles. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: MMP OI dans la PR, CHR et les animaux de contrôle. (A) Des résultats représentatifs de l'activité MMP mesurée dans une souris arthritique 6 jours après l' induction GPI-arthrite et d' une souris de contrôle en bonne santé (côté gauche). Le signal significativement plus élevé (Radiance (p / s / cm 2 / sr)) intL'arthrite a été observée par rapport à la souris saine. L'image à droite affiche l'activité MMP dans les pattes postérieures et comprend les chevilles, les pattes avant, le pancréas, le poumon, la rate, le coeur, les reins, le foie et l'intestin d'une souris GPI-arthrite sacrifiée après injection de colorant OI. OI a révélé un signal élevé dans les pattes antérieures, les chevilles et les pattes postérieures des souris RA et le foie et l'intestin, que les souris aient été injectées avec un sérum GPI (souris RA) ou un sérum témoin (souris témoins saines). (B) Signal de fluorescence MMP dans les oreilles avec CHR chronique (gauche) et les animaux témoins (à droite). L'oreille droite enflammée (défiée 5 fois) affiche un signal fortement amélioré par rapport aux oreilles de contrôle. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
<br /> Figure 3: Analyse semi - quantitative de Enflammé et en bonne santé Chevilles et de tissus d'oreille à l' aide OI. (A) d'analyse semi-quantitative du signal de fluorescence dans la polyarthrite rhumatoïde et des animaux sains dans les pattes avant et les articulations de la cheville. les pattes avant arthritiques et des articulations de la cheville présentent une façon significative (** p <0,05) (n = 3) le signal MMP supérieur par rapport aux articulations de la cheville et en bonne santé pattes avant. Les données sont présentées comme la moyenne ± écart-type. (B) d'analyse semi-quantitative de l'oreille gauche et droite (contestées) après la 1 ère, 3 ème et 5 ème défi. Le signal MMP est augmenté de manière significative de la première à la 5 ème défi et déjà montré une intensité de signal maximale dans l'oreille droite contestée après la 3 e défi (** p <0,05) (n = 3) (oreilles de contrôle sont en partie contaminés par TNCB en raison des souris grattent. Ce produit un signal amélioré qui était non significatif). Les données sont présentées comme la moyenne± SEM. Le test t de Student à 2 têtes a été utilisé pour analyser les différences entre l'inflammation (GPI-arthritiques, les oreilles traitées correctement) et le contrôle (contrôle des chevilles, oreilles non traitées) pour les deux modèles. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
OI est un outil très utile, rapide et peu coûteux pour l'imagerie moléculaire in vivo non invasive dans la recherche préclinique. Une force particulière d'OI est la capacité de surveiller des processus hautement dynamiques comme les réponses inflammatoires. En outre, OI permet de suivre le cours d'une maladie pendant une période prolongée, allant de jours en semaines.
OI présente plusieurs avantages par rapport à d'autres modalités d'imagerie in vivo telles que la tomographie par émission de positons (PET) ou l'imagerie par résonance magnétique (IRM), car il est très temps et rentable. Une analyse à haut débit avec jusqu'à cinq animaux par acquisition est possible. En outre, un grand nombre de sondes, ciblant de nombreux processus biologiques différents, sont disponibles. 12 Pour fournir d'autres informations anatomiques, l'OI peut être combiné avec d'autres techniques d'imagerie telles que l'IRM ou les rayons X. Une autre limitation est sa faible profondeur de pénétration tissulaire comparée par exemple à fimagerie unctional PET. En outre, une grande quantité de sondes destinées à de nombreuses cibles biologiques sont disponibles. 12
Les effets de l' anesthésie ne doivent pas être sous - estimés dans l'imagerie in vivo. Alors que les effets spécifiques de l'anesthésie sur les résultats OI ne sont pas bien caractérisées, notre groupe a montré dans plusieurs études l'influence de l'anesthésie sur les résultats d'imagerie TEP. 13, 14, 15, par exemple, Fuchs et al. analyser les paramètres sanguins, tels que la pCO 2, le pH et le lactate avant et après TEP à l' aide de différents protocoles de respiration et d' anesthésie. Il a été montré que des changements importants dans pCO 2 et taux de lactate dans anesthésié par rapport à des souris d'oxygène conscientes ou respiration de l' air a conduit à des changements significatifs dans les résultats de la TEP. 14 Ils concluent que cet effet est principalement causée par la respiration de l' oxygène et subsequenT pour l'acidose respiratoire chez les animaux, conduisant à différents résultats dans l'imagerie PET.
La normalisation des paramètres de l'anesthésie, comme les concentrations de O 2 et les doses de médicaments anesthésiques, ainsi que la prévention de l'hypothermie, aident à éviter les échecs systématiques. Bien sûr, l'OI est limitée par les propriétés physiques, par exemple la diffusion de la lumière, l'auto-fluorescence des tissus et l'atténuation de la lumière 9 . Plusieurs groupes abordent ces problèmes en combinant les résultats macroscopiques de l'OI avec d'autres techniques comme la microscopie de fluorescence in vivo ou la cytométrie en flux.
L' imagerie in vivo de l'activité de MMP par des sondes fluorescentes activables spécifiques de MMP a été utilisée dans plusieurs modèles expérimentaux d'inflammation comme CHS 7 , mais aussi dans des maladies comme l'ischémie cérébrale, 16 anévrismes aortiques, 17 infarctus du myocarde 18Et des plaques athérosclérotiques 19 ainsi que divers modèles de tumeurs. 20
Par exemple, Cortez-Retamozo et al. A étudié l'activité in vivo des MMP dans un modèle d'inflammation des voies respiratoires allergiques en injectant une sonde activable MMP, 24 h après l'application intranasale d'ovalbumine chez des souris sensibilisées précédemment. 21 Pour identifier l'emplacement de l'activité MMP, ce groupe a combiné l'OI tomographique combiné, la bronchoscopie à fibre optique NIR et la microscopie intravital afin de suivre plus en détail le cours de la maladie et la réponse au traitement. 21
D'autres approches pour mesurer l'activité MMP in vivo utilisent principalement des inhibiteurs de MMP qui se lient au site actif des MMP. McIntyre et al. Décrit une détection de MMP-7 associée à une tumeur in vivo utilisant un "substrat fluorogène à base de polymère", qui agit comme un "protéolyt"Ic. "Pour les MMP dans un modèle de xénogreffe de souris. 22 Ils montrent que l'activité de MMP-7 pourrait être détectée sélectivement par imagerie optique. En outre, Olson et al. Ont étudié" peptides pénétrants cellulaires activables "(ACPP) qui sont capables de Cible de nombreux modèles de tumeurs de xénogreffe, mais ne peut pas adsorber dans la cellule jusqu'à ce que le lieur soit protéolysé. Ils ont étudié les ACPP sélectifs pour MMP-2 et MMP-9. 24 , 25
L'étiquetage des inhibiteurs de MMP avec des isotopes radioactifs pour la tomodensitométrie d'émission de photons (SPECT) ou l'imagerie par PET a été utilisé pour étudier l'expression de MMP dans l'athérosclérose 26 et le cancer 27 . Dans une étude récente, un inhibiteur de MMP marqué par fluorescence a été comparé à une sonde activable par MMP. 28 L'inhibiteur de MMP marqué par fluorescence a montré un signal sonore plus faiblerapport par rapport à une sonde activable mais nécessitait un temps plus court absorption.
De nouveaux marqueurs biologiques pour évaluer les principales caractéristiques de la physiopathologie peuvent être utilisés et validés par OI. Par exemple, la réponse à un danger motifs moléculaires associés (DAMPS) est un événement précoce au cours d'une réaction inflammatoire. Vogl et al. utilisé un anticorps marqué contre Cy5.5 S100A9 dans les modèles ALARM - de dermatite de la peau aiguë de l' oreille, l' arthrite induite par le collagène et l' infection par Leishmania major pour développer biomarqueur sensible des signes précoces de l' inflammation. 29
En conclusion, OI représente une méthode rapide et efficace pour la recherche pré - clinique, qui est capable de découvrir de nouveaux mécanismes de maladies in vivo, la caractérisation de nouvelles cibles moléculaires, ainsi que le suivi des effets thérapeutiques. Néanmoins, un processus de validation ultérieure avec plus techniques quantitatives comme le PET peut être nécessaire.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous remercions Daniel Bukala, Natalie Altmeyer et Funda Cay pour un excellent support technique. Nous remercions Jonathan Cotton, Greg Bowden et Paul Soubiran pour l'édition du manuscrit. Ce travail a été soutenu par la Fondation Werner Siemens et la Faculté de Médecine de l'Université Eberhard Karlsund Tübingen ('' Promotionskolleg '') et par le DFG par le biais du CRC 156 (projet C3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cornergel | Gerhard Mann GmbH | 1224635 | ophthalmic ointment |
| Forene | Abbott GmbH | 4831850 | isoflurane |
| U40 insulin syringe | Becton Dickinson and Company | 324876 | |
| Heparin | Sintetica | 6093089 | |
| High-Med-PE 0.28 x 0.61 mm | Reichelt Chemietechnik GmbH+Co | 28460 | polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm |
| BD Regular Bevel Needles, 30 G | Becton Dickinson & Co. Ltd. | 305106 | 30 G injection cannula |
| RTA-0011 isoflurane vaporizer | Vetland Medical Sales and Services LLC | - | |
| Artagain drawing paper | Strathmore Artist Paper | 446-8 | coal black |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Optical imaging system |
| BD Regular Bevel Needles, 25 G | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| 2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene | Sigma Aldrich GmbH | 7987456F | TNCB |
| MMPSense 680 | Perkin Elmer | NEV10126 | fluorescent imaging dye |
| Oditest | Koreplin GmbH | C1X018 | mechanical measurment |
| Miglyol 812 | SASOL | - | Oil |
| BALB/C, C57BL/6 | Charles River Laboratories | - | Mice used for experiements |
| PBS | Sigma Aldrich GmbH | For dilution of the RA serum | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf | Used for TNCB application | |
| shaver | Wahl | 9962 | Animal hair trimmer |
| Living Image | Perkin Elmer | Imaging software to measure OI |
References
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