Summary
Bu yazıda, iltihaplanmanın iki farklı deneysel modelindeki temel matris metalloproteinazların in vivo aktivitesini görselleştirmek için aktive edilebilir bir optik görüntüleme probu kullanılarak floresan görüntülemenin uygulanmasını açıklanmaktadır.
Abstract
Bu çalışma, enflamasyon, iki farklı fare modellerinde, görüntüleme matriks metalloproteinaz (MMP) bir aktive flüoresan sonda ile -Aktiflik yoluyla in vivo olarak floresans optik görüntüleme (Ol) için invazif olmayan bir yöntem açıklanmaktadır: romatoid artrit (RA), ve bir kayıt hipersensitivite reaksiyonu (CHR) modeli. yakın kızılötesi (NIR) penceresinde bir dalga boyuna sahip ışık (650-950 nm) 650 nm'nin altında kıyasla daha derin bir doku penetrasyonu ve en az bir sinyal emilimini sağlar. floresan OI kullanılarak en önemli avantajlardan biri, ucuz, hızlı ve farklı hayvan modellerinde uygulanması kolay olmasıdır.
Aktive floresan probları inaktive eyalette optik sessiz, ancak bir proteaz tarafından aktive edildiği zaman, son derece flüoresan hale gelir. Aktif MMP'ler doku tahribatına yol açan ve RA ve CHR olarak gecikmeli tipte aşırı duyarlılık reaksiyonları (DTHRs) hastalık ilerlemesinde önemli bir rol oynar. Ayrıca, MMPler olanKıkırdak ve kemik bozulması için anahtar proteazlar ve pro-inflamatuar sitokinlere yanıt olarak makrofajlar, fibroblastlar ve kondrositler tarafından indüklenir. Burada, MMP-2, -3, -9 ve -13 gibi anahtar MMP'ler tarafından aktive edilen bir prob kullanıyor ve RA ve kontrol farelerinde, hastalık indüksiyondan 6 gün sonra da MMP aktivitesinin yakın kızılötesi floresan OI için bir görüntüleme protokolü tanımlıyoruz Sağlıklı kulaklara kıyasla sağ kulakta akut (1x meydan okuma) ve kronik (5x meydan okuma) CHR bulunan farelerde olduğu gibi.
Introduction
Romatoid artrit (RA) veya psoriyaz vulgaris gibi otoimmün hastalıklar, gecikmiş tip hipersensitivite reaksiyonları (DTHR) olarak derecelendirilmektedir. 1 RA yaygın erozif sinovit ve eklem yıkımı ile karakterize otoimmün bir hastalıktır. 2 İnflamasyonlu artritik eklemler inflamatuar hücrelerin infiltrasyonu ve proliferasyonunu, proinflamatuar hücrelerin artmış ekspresyonunu, pannus oluşumuna, kıkırdağa ve kemik yıkımına yol açtığını göstermektedir. Matriks metalloproteinazlar (MMP'ler) ile kollajen gibi ekstraselüler matriks moleküllerinin bölünmesi, doku dönüştürme ve anjiyogenez için gereklidir ve doku parçalanmasına neden olur. 5 , 6 Kontak aşırı duyarlılık reaksiyonları (CHR), nötrofillerin bir araya toplanması ile karakterizedir ve oksidatif patlamaya neden olur. 7 Benzer şekilde RA, CHR'deki MMP'ler invol'durkronik enflamasyonu oluşturmak amacıyla doku dönüşümü, hücre göçü ve anjiyogenez ved.
RA araştırmak için, glukoz-6-fosfat izomeraz (GPI) Serumda enjeksiyon fare modeli kullanılmıştır. GPI karşı antikorlar ihtiva eden transgenik K / BxN farelerden 8 serum, romatizmal iltihabı, GPI-serumu enjekte edildikten sonra 6. günde şişme ayak bileği, maksimum 24 saat (1.1) içinde gelişmeye başlayan sonra saf BALB / c farelerine enjekte edildi. Kronik CHR analiz etmek için, C57BL / 6 fareleri karın trinitrochlorobenzene (TNCB) ile duyarlı hale getirildi. sağ kulak hassasiyeti 1 hafta sonra başlayarak 5 kata kadar meydan (aynı zamanda 1.1 ve 1.2).
Invaziv olmayan küçük hayvan OI esas olarak klinik öncesi araştırmalarda kullanılır fluorescent- chemiluminescent- ve biyolojik olarak ışık veren sinyallerin, in vivo araştırma dayanan bir tekniktir. alınan yarı nicel veriler Molec yönelik anlayışıSağlıklı ve deneysel hayvan modellerinin organ ve dokularındaki ular mekanizmalarını ve uzunlamasına takip ölçümlerini ( örn . , In vivo terapötik yanıt profillerini değerlendirmek için) sağlar. Uzunlamasına çalışmaların büyük bir avantajı, hayvan sayılarının azaltılmasıdır; çünkü aynı hayvanlar, zaman noktası başına farklı fareler kullanmak yerine, birkaç zaman noktasında yapılan takip çalışmalarında ölçülebilir. OI'nın çözümü, deney hayvanlarında organların ve hatta daha küçük doku yapılarının ayrıntılı fonksiyonel görüntülemesine olanak tanır.
Dar transmisyon spektrumu, ışık geçirmez bir "karanlık kutu" ile dağınık ışığa karşı koruma ve -70 ° C'ye kadar birçok cihazda soğutulan hassas bir şarj kuplajlı cihaz (CCD) kamera ile özel uyarma ve emisyon filtreleri kullanımı , Floresans sinyallerinin son derece spesifik ve hassas ölçümlerini sağlar.
Uyarıcı ile floresan ajanlar kullanarak - vekızıl ötesine yakın fluoresans penceresinde emisyon spektrumu (650-950 nm), bir sinyal-gürültü oranı önemli ölçüde geliştirilebilir. yakın kızılötesi fluoresans pencere hemoglobin ve su ile sinyalin nispeten düşük bir emme yanı sıra düşük bir arkaplan otomatik floresans ile karakterize edilir. 9 Bu küçük hayvan dokusu içinde yukarı 2 cm bir penetrasyon derinliğine sağlar. OI-sondalar ile doğrudan (bir floresan etiketli antikor ile) bir hedef adres ya da (proteazlar ile), hedef doku içinde aktif hale getirilebilir. Aktive OI problar bağlı başka bir etki, molekül içindeki uyarım enerji aktaran bir söndürme kısım, Förster rezonans enerji transferi (FRET) kendi inaktive edilmiş biçimde optik olarak sessizdir. boya (örneğin, bir proteaz tarafından) ile bölünmesi durumunda enerji artık molekül içinde aktarılır ve bir flüoresan sinyal OI ile tespit edilebilir. Bu yüksek specificit ile OI sondaları tasarlanmasını sağlayanFarklı biyolojik süreçler ve mükemmel sinyal / gürültü oranları için.
Aşağıdaki protokol, in vivo MMP-2, -3, -9 ve -13 aktivitesini ve inflamasyonun iki deneysel modelini (RA, CHR) görüntülemeye yönelik bir Aktive Edilebilir OI probu kullanarak hayvanların hazırlanmasını, OI ölçümlerini detaylı olarak açıklamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu makalede açıklanan tüm prosedürler, laboratuar hayvanlarının bakımı ve kullanımı ile ilgili uluslararası standartlara ve kurallara uymuş ve Almanya'nın Tuebingen Ülke Komisyonu'nun Hayvan Refah ve Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. 8 - 12 haftalık BALB / c ve C57BL / 6 fareleri, 12 saatlik bir süreyle 12 saat süreyle tutuldu: 12 saatlik ışık: karanlık döngüde, 2-5 gruplar halinde 22 ± 1 ° C'de IVC'ler ve standart çevre koşulları altında su ve Gıda erişimi ad libitum .
1. Malzeme Hazırlama
- Enjeksiyondan önce doğrudan ilgili veri sayfasına göre OI boyasını yakın kızılötesi floresans görüntüsü için inceltin. MMP'leri in vivo ölçmek için aktive olabilen OI boyası (680 nm'de uyarımlı ticari prob), 1.5 mL 1x PBS'de 20 nmol konsantrasyonda kullanıma hazırdır. Çözümü kullanmadan önce hafifçe çalkalayın veya vorteksleyin. OI boyası ışığa karşı korunduğunda 2-8 ° C'de 6 aya kadar depolanabilir. İntravenöz ( İV ) enjeksiyonlar için bir venöz kateteri hazırlayın. % 0.9 salin solüsyonu (50 mL'de 10 enjeksiyon ünitesi içeren) ve 30 gauge iğne ile polietilen katetere bağlanmış 20 U (0.5 mL) insülin şırınga kullanın. OI boya fare başına önerilen 2 nmol dozunu enjekte edin.
2. Romatoid Artritin İndüksiyonu ve Kronik Temas Hipersensitivitesi Reaksiyonu
- Romatoid artrit:
- RA uyarmak için 1x PBS (200 μL) ile glikoz-6-fosfat izomeraz (GPI) 1: 1'e karşı antikorlar (AB) içeren serum 100 μL'yi (K / BxN farelerinden elde edilen 10 ) seyreltin. Seyreltilmiş serumu -80 ° C'de saklayın. RA indüksiyonu için ayrıntılı prosedürler Monach ve ark. Tarafından anlatılmıştır . 8 .
- RA indüklemek için, her kuyruğunu kuyruğuyla hafifçe kaldırın ve t 0 gününde 200 μL seyreltilmiş serum intraperitoneal ( ip ) enjekte edinDeniyor. Enjeksiyondan sonra fareyi doğrudan kafesin içine geri koyun.
- İsteğe bağlı olarak, AB enjeksiyonlarından önce ayak bileği çaplarını ölçün ve bir "artritik skor" ( Şekil 1A ) tanımlayın. Mekanik bir ölçüm cihazı (mikrometre) kullanarak GPI serumundan 6. güne kadar günlük ayak bileği şişlik ölçümüne devam edin.
- Aktifleştirilebilir OI boyasını enjekte edin (adım 1.1 - 1.2), in vivo MMP aktivitesi iv'yi RA farelerinin kuyruk damarına ölçün GPI-serum enjeksiyonundan sonra 5. günde ve kontrol farelerinin kuyruk venine uygulandı. Kuyruk damarı enjeksiyonundan 24 saat sonra optik görüntüleme deneyleri uygulayın.
- Aşırı duyarlılık reaksiyonuyla temas:
- C57BL / 6 farelerinin sensitizasyonu için, 4: 1 aseton / yağ karışımı içinde çözülmüş% 5 TNCB çözeltisi hazırlayın.
- % 100 oksijen (1.5 L / dk) buharlaştırılmış% 1.5 izofluran kullanarak C57BL / 6 farelerde anestezi uygulayın. Fareler uyuşturulduktan sonra, kendiliğinden çılgınca yerleştirin Burun konisi (hacimce% 1.5 izofluran tüpüne bağlı kesilmiş bir 5 mL polietilen şırınga) ve anestezi korumalıdır. Anestezi uygulanırken göz kuruluğunu önlemek için anestezi uygulanmış hayvanlara veteriner merhemi uygulayın.
- Küçük bir hayvan tüy düzeltici kullanarak karnınızı dikkatle tıraş edin (2 x 2 cm). Cildin yaralanmasından kaçının; zira bu, hayvandaki spesifik olmayan flüoresan sinyallerine neden olabilir ve çalışmanın sonuçlarını etkileyebilir.
- Hayvanı hassaslaştırmak için 100 uL'lik bir pipet kullanarak traşlı karın bölgesine yavaş yavaş 80 μL% 5 TNCB solüsyonu uygulayın. Fare, korneanın hasar görmesini önlemek ve iyileşme safhasında düşük vücut ısısından kaçınmak için fare gözlerinin yataklarla temas etmemesine özen göstererek nazikçe kafesin içine geri koyun.
- Duyarlılığın altıncı gününde% 1 TNCB solüsyonu (9: 1 aseton / yağ karışımı içinde çözülmüş) hazırlayın ve akut ve kronik CHSR'yi elde etmek için bir pipet yardımıyla sağ kulakta 20 mcL uygulayın."> 1
- 100 μL'lik bir pipet kullanarak 20 μL% 1 TNCB çözeltisiyle sağ kulağın her iki tarafındaki 1. meydan okumayla başlayın ve CHR'yi ortaya çıkarmak için her saniye ikinci günde beş kez tekrarlayın (hassasiyetten sonra 15 gün sonra) . Kulak kalınlığını her gün bir mikrometre ölçüm cihazı kullanarak ölçün.
- Meydan okumadan 12 saat sonra CHR farelerinde in vivo olarak MMP aktivitesini ölçmek için aktive olan OI boyasını (680 nm'de uyarımlı ticari bir prob) enjekte edin (adım 1.1-1.2). 24 saat post kuyruk damarı enjeksiyonu ( iv ) ile optik görüntüleme deneyleri yapın.
3. Optik Görüntüleme İçin Hayvan Hazırlığı
- Kullanılmış OI ajanlarının flüoresan sinyaliyle otomatik flüoresansın (yaklaşık 700 nm) parazitlenmesini önlemek için fare yemini (görüntülemeden en az 3 gün önce) düşük veya floresan olmayan çaylara ( örn. , Manganez içermez) çevirin.
- Hayvanı yerleştirinBir anestezi kutusuna yerleştirin ve oksijen ile buharlaştırılmış hacimce% 1.5 izofluran kullanarak (oksijen hava ile değiştirilebilir, ancak bir denemede standart haline getirilmesi gerekir) anestezi altına alın.
- Fareye görünür şekilde anestezi uygulandığında, kendiliğinden üretilen burun konisine yerleştirin (hacimce% 1.5 izofluran tüpüne bağlı, kesilmiş bir 5 mL'lik polietilen şırınga ile oluşturun) ve anestezi uygulayın.
- Hayvanı, küçük bir hayvan tüy düzeltici kullanarak hedef bölgede (2 cm x 2 cm) dikkatle tıraş edin. Cildin yaralanmasından kaçının; zira bu, hayvandaki spesifik olmayan flüoresan sinyallerine neden olabilir ve çalışmanın sonuçlarını etkileyebilir.
NOT: Saçlar, ilgilenilen bölgeye (ROI) bağlı olarak, OI boyunca flüoresan sinyalini absorbe edebilir (fare suşuna bağlıdır, daha fazla veya daha az emilim gözlenir). - İV enjeksiyonu için, vazodilatasyon başlatmak için fare kuyrukunu ılık suya yerleştirin, alkolle enjeksiyon yerinde deriyi nazikçe temizleyin ve kateterin üzerine yerleştirilmesine başlayınkuyruğunun uzak bir site. kuyruk damarına 20 ° 'lik bir açı ile, iğnenin kenar "kesme" ve şırınga yeniden süspansiyon haline getirerek kateterin doğru yerleştirilmesi test etmek yerleştirin.
- Kateter doğru yerleştirilir, şırınga yerine ve Ol probu (2 nmol) enjekte edilir. Enjeksiyondan sonra, şırınga yerine ve% 0.9 salin çözeltisi polietilen borunun tam olarak net ölü hacmi 25 uL enjekte edilir.
Not: kullanılan OI boyanın dokusu yarılanma ömrü süresi, in vivo olarak, MMP aktivitesinin ölçülmesi için (680 nm'de eksıtasyonla ticari bir prob) 72 saattir. Tam bir açıklık sağlamak için, boya yeniden enjeksiyon önceki enjeksiyondan sonra daha önceki 7 günden önerilmez.
4. Optik Görüntüleme
- görüş alanı (FOV) merkezinde OI-tarayıcının siyah kutu içinde bir siyah plastik ya da kağıt tabaka yerleştirin.
- Bir ölçüm protokolünü kurmak ve sağ dalga boyu tercih (eksitasyon: 680 ± 10 nm, eGörev: 700 ± 10 nm) ve görüntüleme parametreleri.
NOT: Bazı OI sistemlerinde, çeşitli görüntüleme boyalarının kurulumu önceden tanımlanmıştır. - Floresan görüntüleme için doğru protokolü seçmek için görüntüleme yazılımını açın (üretici tarafından sağlanır) ve sistemi başlatın. Çoğu CCD kameranın çalışma sıcaklığına soğuması gerekir ve bu işlem 10 dakika sürebilir. Güvenilir sonuçlar için, sistem hazır oluncaya kadar bekleyin.
- İn vivo görüntüleme sistemi edinme kontrol panelinin açılmasını göz önünde bulundurun ve seçilen her filtre çifti dizideki bir görüntüyü temsil edecektir. Bu durumda, sırasıyla 680 ± 10 nm ve 700 ± 10 nm'lik bir uyarılma ve emisyon dalga boyuna sahip olan ticari boya için filtre çiftleri ile bir görüntü elde edin ve ölçümü başlatın ("Alınan sıralama" tuşuna basın). Daha ayrıntılı talimatlar için üreticinin el kitabına bakın.
- Görüntüleri uygun şekilde etiketleyin ve bilgileri "Görüntü Düzenle" ye kaydedin.Labels "penceresi açılır ve" Acquire sequence "i izleyecektir.
- OI boya enjeksiyonundan önce her bir hayvanın temel taramasını yapın veya arka plan sinyalini ayırt etmek için naif kontrol hayvanları kullanın.
- Saat sonra OI boya kuyruk damar enjeksiyonu, hayvanlar OO sisteminde en yüksek sinyali ölçmek için bir pozisyonda, FOV ortasına yerleştirin ve ölçümleri başlatmak.
NOT: Önemli: Hipotermi, görüntüleme maddelerinin dağılımını önemli ölçüde etkileyebilir. Hayvanların hipotermiden kaçınmak için sahnenin 37 ° C'ye kadar ısıtıldığından emin olun. Görüntüleme, 1-5 fareden oluşan gruplar halinde eşzamanlı olarak gerçekleştirilebilir. Aynı anda ölçülecek hayvan sayısına bağlı olarak FOV boyutunu seçin. Her fare görünür olup olmadığını kontrol etmek için parlak bir alan resmi alabilirsin.
5. Veri Analizi
NOT: Aşağıdaki görüntü yazılımını kullanarak veri analizi yapınÜreticinin protokolü.
- RA ölçümleri için, Şekil 2'de gösterildiği gibi foton emisyonunun kalibre edilmiş birimi kullanılırken, kronik CHSR yüzde olarak (etkinlik) sinyal yoğunluğu olarak resmedilmiştir.
- ROI'leri el ile çizmek için alet plakasını kullanın. RA görüntülerinin analizi için, her hayvanın tüm ayak bilekleri ve pençeleri arasında en yüksek sinyalin etrafına yerleştirilmiş standart bir daire kullanın. CHSR'yi analiz etmek için ROI'leri parlak alan görüntüsüne göre sağ ve sol kulak çevresine yerleştirin.
- Belirli çizilen ROI'de foton emisyonunu veya sinyal yoğunluğu değerlerini ölçmek için "ölçme" ye basın. Sistem betimsel istatistiksel analiz için çizilen ROI'de değerler sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sığır BALB / c farelerinde romatizmal artrit (RA) indüklemek için hayvanlar 0 günde GPI'ye karşı oto-antikorlar (1x PBS ile 1: 1 seyreltme) ile ip enjekte edildi. Bu GPI serumunda indüklenen maksimum iltihaplanma (ayak bileği şişmesi) RA modeli enjeksiyon sonrası 6. günde 11 . Bu nedenle, aktive edilebilir OI boya 2 nmol hazırlandı ve 5. günde artritik farelerin ve sağlıklı kontrol hayvanlarının kuyruk damarına iv enjekte edildi. Enjeksiyondan 24 gün sonra (6.gün), fareler uyuşturuldu ve bölüm 3'te açıklandığı gibi görüntüye edildi ( Şekil 1A ).
CHR'yi indüklemek için, C57BL / 6 fareleri traşlı karında 0. günde% 5 TNCB ile duyarlı hale getirildi. Duyarlılık sonrası 7. günde, sağ kulakta% 1 TNCB kullanılarak yapılan 1. zorlama başladı. Kronik inflamasyonu indüklemek için beş gündür (gün 15) gerçekleştirildi. 7 12 saat sonraE geçen zorluk, OI boyası 20 nmol iv enjekte edildi. (Şekil 1B), yukarıda tarif edildiği gibi 15. günde, 24 saat sonra enjeksiyon, OI gerçekleştirilmiştir.
Şekil 2'de, ayak bilekleri (Şekil 2A) kontrol ile karşılaştırıldığında, arka pençelerin, ayak bileği ve hastalığın indüklenmesinden sonraki 6. günde RA fare ön pençelerde açıkça arttırılmış floresans sinyali. RA Farelerin organlarının ve sağlıklı farelerde MMP aktivitesinin biyolojik dağılım analizi arka pençeler, ayak bileği güçlü geliştirilmiş sinyalini göstermesine ve RA farelerin eklemlerinde özel olarak ön pençelerle. Sağlıklı farelerde (, sağ Şekil 2A) böbreklerinde karşılaştırıldığında İlginç bir şekilde, tüm ölçülen RA iki fare böbrek geliştirilmiş bir MMP sinyali tespit edilmiştir. Ayrıca, ne olursa olsun, fareler RA muzdarip olup olmadığını karaciğer ve bağırsak içinde gelişmiş bir MMP sinyali ölçülür. RA ve sağlıklı fareler arasında hiçbir fark t bulunduO, akciğer, dalak ve kalp pankreas.
Kronik CHR (sağ kulakta beş TNCB zorlukları) sırasında, yüksek sağlıklı sol kontrol kulak (Şekil 2B) kıyasla hemen iltihaplı kulak MMP aktivitesi artmış ölçülmektedir.
Bu bulgular, iltihaplı hastalıklar modellerinde hem de hastalığın gelişimi sırasında, MMP aktivitesinin önemli bir rol gösteren olur.
Bio-ışıldama ve Floresans Toolsets örneğin florokrom pmol veya floresan eksprese eden hücrelerin sayısı ölçümü, izin verir. Veriler 1. Sayımlar gösterilebilir: kamerayı foton olay, 2. (fotonlar) bir kalibre edilmemiş ölçümü gösterir: ki içinde "foton / saniye / cm2 / steradyan" foton emisyon kalibre edilmiş bir ölçüsüdür lüminesans görüntüleme veya 3 R için tavsiyeAdiant Efficiency (fluorescence): Floresans ölçümleri için önerilen, olay uyarma gücü başına floresan emisyonu radyansını gösterir.
OI görüntülerini analiz ederken radyan üniteleriyle çalışmanın en büyük avantajı, bir deney sırasında kamera ayarlarının değiştirilebilmesi ve bunun, görüntülerin kendisi veya ölçülen ROI verileri üzerinde herhangi bir etkisi yoktur; bu da, farklı IVIS sistemlerinden gelen görüntülerin karşılaştırılmasına olanak tanır.
İlgi alanı (ROI), optik bir görüntüde kullanıcıdan ilgi alanını belirtir. Araç çubuğu 3 farklı ROI çizmeyi sağlar: ölçüm (görüntünün ROI'sinde sinyal yoğunluğunu ölçer), ortalama arka plan (arka plan için kullanıcı tarafından tanımlanan alanda ortalama sinyal yoğunluğunu ölçer) veya özgeçmiş ROI (içinde bir özneyi tanımlar) bir şekil).
Konu özür dilerseyüksek spesifik olmayan arka plan sinyalinin kendisi oynar, hedef ROI arka plan sinyalini (ROI) çıkarılarak, bir artalan-düzeltilmiş YG ölçümü elde. oto floresan belirlemek için sıfıra yakın görüntü minimum ayarlama veya doğal olarak görüntüde arka plan aydınlığı olarak meydana gelen. ölçülen belirli bir görüntünün esas ölçülmüştür kendinden tanımlanan (kullanıcı özel) arka plan görüntüsü (ROI) için resim bağlantısı.
Görüntülerin Yarı kantitatif analizleri Living Image yazılımı kullanılarak romatizmalı ve ayak bileklerini kontrol yanı sıra içinde iltihaplı ve sağlıklı her iki kulakta ilgi (ROI) standardize bölgeleri çizerek gerçekleştirildi. Sadece tanımlayıcı istatistik analizler, hayvan yetersiz olduğundan, bu yazıda, in vivo veriler üzerinde yapıldı. Artritik ve sağlıklı ayak bileği veya pençelerin sinyal yoğunluğu analizi ayak bilekleri kontrol ile karşılaştırıldığında arterit bir 7-kat güçlendirilmiş MMP sinyal yoğunluğu göstermiştir. Artritik farelerin ön pençelerinde, sağlıklı hayvanlarınkine kıyasla 3 kat yüksek bir MMP sinyal yoğunluğu tespit edildi ( Şekil 3A ).
Kulakların akut ve kronik CHR ile karşılaştırılması, sol meydan oklüzif kontrol kulağına kıyasla, 3. zorlanmadan sonra daha da artmış ve 5. meydan okumaya kadar aynı seviyede kalmış olan I. zorlanma sonrasında bile önemli ölçüde MMP sinyali gösterdi ( Şekil 3B ) . Farelerin çizilmesinden dolayı sol kulaktaki temas alerjeniyle kontaminasyonun bir sonucu olarak sol (TNCB'ye meydan okumamış) kontrol kulağında biraz artmış MMP sinyali belirledik. Sonuçlar, OI ile ölçüldüğü üzere, GPI artriti ve kronik iltihap sırasında yüksek oranda artmış bir flüoresans sinyali ile ortaya çıkan, MMP'lerin önemli bir rolünü göstermektedir.
yük / 55180 / 55180fig1.jpg"/>
Şekil 1: OI için RA ve CHR modeli, Hastalık indüksiyonunun zaman içindeki ilerleyişini ve Zaman Nokta. C57BL / 6 farelerinde BALB RA indüksiyon / c fareleri (B) ve kronik CHR indüksiyonu (A) zaman akışı. In vivo görüntüleme zaman noktasında, ilgili genel ve her iki model MMP aktivitesinin ölçülmesi için OI boyanın ilgili enjeksiyon zamanı işaret eder. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2: RA, CHR ve kontrol hayvanları MMP OI. (A), 6 gün, GPI-arterit uyarımına ve sağlıklı kontrol faresinden (sol taraf) sonra bir artiritik fareden ölçülen MMP aktivitesinin temsili sonuçlar. Önemli ölçüde yüksek bir sinyal (Parlaklık (s / s / cm2 / sr)) intSağlıklı fare ile karşılaştırıldığında artritik birlik gözlenmiştir. Sağdaki resim, arka pençelerde MMP aktivitesini gösterir ve boyuna OI boya enjeksiyonundan sonra kurban edilmiş bir GPI artrit faresinin ayak bilekleri, ön pençeler, pankreas, akciğer, dalak, kalp, böbrekler, karaciğer ve bağırsak bölgesini içerir. OI, farelere GPI serum (RA fareleri) veya kontrol serum (sağlıklı kontrol fareleri) enjekte edilip edilmediğine bakılmaksızın, RA farelerinin, karaciğerin ve bağırsağın ön pençeleri, ayak bilekleri ve arka pençelerinde yüksek bir sinyal çıkardı. (B) kulak kronik CHR (solda) ve kontrol hayvanları ( sağda ) MMP floresans sinyali. Enflamasyonlu sağ kulak (5 kez meydan okundu), kontrol kulaklarına kıyasla oldukça gelişmiş bir sinyal görüntüler. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
<Br /> Şekil 3: Şişirilmiş ve Sağlıklı Ayak bileğinin ve Kulak Dokusunun OI Kullanılarak Yarı Kantitatif Analizi. (A) Ön ayak ve ayak bileği eklemlerinde RA ve sağlıklı hayvanlarda floresan sinyalinin yarı nicel analizi. Artritik ön pençeler ve ayak bileği eklemleri, sağlıklı ayak bileği eklemleri ve ön pençelerle karşılaştırıldığında önemli derecede (** p <0.05) (n = 3) daha yüksek MMP sinyali sergilemektedir. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. (B) 1. , 3. ve 5. meydan okumadan sonra sol ve sağ (zorlu) kulakların yarı nicel analizi. MMP sinyali, birinci ila beşinci meydan okumadan önemli derecede artmış ve 3. zorlanma sonrasında sağa meydan okunan kulaktaki maksimum sinyal yoğunluğunu (** p <0.05) (n = 3) göstermiştir (Kontrol kulakları kısmen TNCB ile kontamine Çünkü fareler çizilmeye başlamıştı, bu anlamlı olmayan gelişmiş bir sinyal üretti). Veriler ortalama olarak sunulmuştur± SEM. Her iki model için iltihaplanma (GPI artritik ayak bilekleri, sağ kulak kulakları) ve kontrol (kontrol ayak bilekleri, sol tedavi edilmeyen kulaklar) arasındaki farkları analiz etmek için 2-kuyruklu Öğrenci t testi kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OI klinik öncesi araştırma, in vivo, moleküler görüntüleme yayılmayan için çok yararlı hızlı ve pahalı olmayan bir araçtır. OI özel bir mukavemeti iltihabik cevaplar gibi yüksek dinamik işlemleri izlemek için özelliğidir. Dahası, OI bir hafta gün arasında değişen geniş bir zaman süresi için bir hastalığın seyrini takip etmesini sağlar.
Çok zamana ve maliyet açısından verimli olarak OI, pozitron emisyonu tomografisi (PET) ya da manyetik rezonans görüntüleme (MRI) gibi diğer in vivo görüntüleme modaliteleri göre çeşitli avantajlara sahiptir. edinme başına en fazla beş hayvanlarla Yüksek verim analizi mümkündür. Ayrıca, birçok farklı biyolojik süreçleri hedef prob çok sayıda, mevcuttur. 12 ayrıca anatomik bilgi vermek için, OI MRI ya da x-ışını gibi diğer görüntüleme teknikleri ile birleştirilebilir. Diğer bir kısıtlama, örneğin f nazaran düşük doku delme derinliğiunctional PET görüntüleme. Ayrıca birçok farklı biyolojik hedeflere yönelik prob büyük miktarda mevcuttur. 12
Anestezi Etkileri in vivo görüntüleme de küçümsenmemelidir. OI sonuçlarına anestezinin spesifik etkileri iyi karakterize olmasa da, grubumuz çeşitli çalışmalarda PET görüntüleme sonuçlarına anestezinin etkisi göstermiştir. Örneğin 13, 14, 15, Fuchs ve ark. örneğin pCO2, pH ve laktat gibi analiz kan parametreleri, PET farklı nefes ve anestezi protokollerini kullanarak tarar önce ve sonra. Bu anlamlı pCO 2 değişiklikler ve bilinçli oksijen veya hava soluma farelere kıyasla anestezi de laktat düzeyleri PET sonuçlarında önemli değişikliklere yol, olduğu gösterilmiştir. 14 Onlar bu etki temel olarak oksijen nefes ve subsequen neden olduğu sonucunaT solunum asidozuna neden olur ve PET görüntülemede farklı sonuçlara neden olur.
O2 konsantrasyonları ve anestetik ilaç dozları gibi anestezi parametrelerinin standartlaştırılması ve ayrıca hipoterminin önlenmesi sistematik arızalardan kaçınmaya yardımcı olur. Elbette, OI fiziksel özellikler, örneğin ışık saçılması, doku otomatik flüoresan ve ışık zayıflaması ile sınırlıdır 9 . Birkaç grup, OI'nin makroskopik sonuçlarını in vivo floresan mikroskopisi veya akış sitometrisi gibi diğer tekniklerle birleştirerek bu problemleri çözmektedir.
MMP'ye özgü aktive edilebilir fluoresan problar ile MMP aktivitesinin in vivo görüntülemesi, CHS 7 gibi iltihaplanmanın birçok deneysel modelinde, ancak serebral iskemi, 16 aortik anevrizma, 17 miyokard infarktüsü gibi hastalıklarda da kullanılmaktadır.Ve aterosklerotik plaklar 19 yanı sıra çeşitli tümör modelleri. 20
Örneğin, Cortez-Retamozo ve ark. Daha önceden duyarlılaştırılmış farelerde ovalbüminin intranazal uygulamasından 24 saat sonra bir MMP etkinleştirilebilir prob enjekte ederek alerjik hava yolu inflamasyonu modelinde MMP'lerin in vivo aktivitesini araştırdı. MMP aktivitesinin yerini belirlemek için, bu grup, hastalığın seyrini ve tedavi tepkisini daha ayrıntılı olarak izlemek için tomografik OI, NIR fiber optik bronkoskopi ve intravital mikroskopiyi birleştirdi. 21
In vivo MMP aktivitesini ölçmek için diğer yaklaşımlar çoğunlukla MMP'lerin aktif bölgesine bağlanan MMP inhibitörlerini kullanır. McIntyre ve ark. "Proteolit" olarak işlev gören bir "polimer esaslı flüorojenik substrat" kullanan bir in vivo tümör bağlantılı-MMP-7 bulgusunu tarif etmiştiric işaret aktive hücreye giren peptitler 'mümkün (ACPPs)", bir fare ksenograft modelinde MMP'nin. 22 önüne alındığında, MMP-7, seçici optik görüntüleme ile tespit edilebilir aktivitesi. 23 Bundan başka, Olson ve ark. incelenmiştir göstermektedir' birçok ksenograft tümör modellerini hedefleyen, fakat bağlayıcı proteolizlenen kadar hücreye adsorbe edilemez. Bu MMP-2 ve MMP-9. 24, 25 için seçici olan ACPPs incelenmiştir
Tek foton emisyonlu bilgisayarlı tomografi (SPECT) ya da PET görüntülemesi için radyoaktif izotoplar ile MMP inhibitörlerinin Etiketleme ateroskleroz 26 ve kanser 27'sinde MMP ifadesini incelemek için kullanılmıştır. Yeni bir çalışmada, bir floresan etiketli MMP inhibitörü, bir MMP-aktive prob ile karşılaştırılmıştır. 28 floresan etiketli MMP inhibitörü gürültü için daha düşük bir sinyal gösterdioranı bir aktive prob ile karşılaştırıldığında, ancak daha kısa bir alım süresi gerektirdi.
Yeni biyomarkırlar patofizyolojisinde temel özellikleri kullanılan ve OI tarafından doğrulanabilir değerlendirmek. Örneğin, tehlike bağlantılı moleküler kalıplarına yanıt (DAMPS), bir enflamatuar reaksiyon sırasında erken bir olaydır. Vogl ve diğ. Bir Cy5.5 enflamasyon erken belirtileri için hassas biyomarker geliştirmek için büyük Leishmania akut kulak derisi dermatit, kollajen ile indüklenen artrit ve enfeksiyon modellerinde Alarmin S100A9 karşı etiketli antikor kullanılabilir. 29
Sonuç olarak, OI, in vivo olarak hastalık yeni mekanizmalarını açığa yeni moleküler hedeflerin karakterize yanı sıra terapötik etkileri izleme yeteneğine sahiptir klinik öncesi araştırma için hızlı ve etkili bir yöntemi temsil eder. Bununla birlikte, PET gibi daha nicel teknikleri ile takip eden bir doğrulama işlemi, gerekli olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Biz mükemmel teknik destek için Daniel Bukala Natalie Altmeyer ve Funda Cay teşekkür ederim. Biz taslağın düzenlenmesi için Jonathan Cotton Greg Bowden ve Paul Soubiran teşekkür ederim. Bu çalışma CRC 156 (proje C3) üzerinden Werner Siemens-Vakfı ve Eberhard Karls Üniversitesi Tübingen ( '' Promotionskolleg '') Tıp Fakültesi tarafından ve DFG tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cornergel | Gerhard Mann GmbH | 1224635 | ophthalmic ointment |
| Forene | Abbott GmbH | 4831850 | isoflurane |
| U40 insulin syringe | Becton Dickinson and Company | 324876 | |
| Heparin | Sintetica | 6093089 | |
| High-Med-PE 0.28 x 0.61 mm | Reichelt Chemietechnik GmbH+Co | 28460 | polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm |
| BD Regular Bevel Needles, 30 G | Becton Dickinson & Co. Ltd. | 305106 | 30 G injection cannula |
| RTA-0011 isoflurane vaporizer | Vetland Medical Sales and Services LLC | - | |
| Artagain drawing paper | Strathmore Artist Paper | 446-8 | coal black |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Optical imaging system |
| BD Regular Bevel Needles, 25 G | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| 2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene | Sigma Aldrich GmbH | 7987456F | TNCB |
| MMPSense 680 | Perkin Elmer | NEV10126 | fluorescent imaging dye |
| Oditest | Koreplin GmbH | C1X018 | mechanical measurment |
| Miglyol 812 | SASOL | - | Oil |
| BALB/C, C57BL/6 | Charles River Laboratories | - | Mice used for experiements |
| PBS | Sigma Aldrich GmbH | For dilution of the RA serum | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf | Used for TNCB application | |
| shaver | Wahl | 9962 | Animal hair trimmer |
| Living Image | Perkin Elmer | Imaging software to measure OI |
References
- Veale, D. J., Ritchlin, C., FitzGerald, O. Immunopathology of psoriasis and psoriatic arthritis. Ann Rheum Dis. 64, 26 (2005).
- Harris, E. D. Rheumatoid arthritis. Pathophysiology and implications for therapy. N Engl J Med. 322 (18), 1277-1289 (1990).
- Lee, D. M., Weinblatt, M. E. Rheumatoid arthritis. Lancet. 358 (9285), 903-911 (2001).
- Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. J Clin Rheumatol. 11, S39-S44 (2005).
- Pap, T., et al. Differential expression pattern of membrane-type matrix metalloproteinases in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 43 (6), 1226-1232 (2000).
- Firestein, G. S., Paine, M. M. Stromelysin and tissue inhibitor of metalloproteinases gene expression in rheumatoid arthritis synovium. Am J Pathol. 140 (6), 1309-1314 (1992).
- Schwenck, J., et al. In vivo optical imaging of matrix metalloproteinase activity detects acute and chronic contact hypersensitivity reactions and enables monitoring of the antiinflammatory effects of N-acetylcysteine. Mol Imaging. 13, (2014).
- Monach, P. A., Mathis, D., Benoist, C.
- Zelmer, A., Ward, T. H. Noninvasive fluorescence imaging of small animals. J Microsc. 252 (1), 8-15 (2013).
- Kouskoff, V., et al. Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity. Cell. 87 (5), 811-822 (1996).
- Fuchs, K., et al. In vivo imaging of cell proliferation enables the detection of the extent of experimental rheumatoid arthritis by 3'-deoxy-3'-18f-fluorothymidine and small-animal PET. J Nucl Med. 54 (1), 151-158 (2013).
- Schwenck, J., et al. Fluorescence and Cerenkov luminescence imaging. Applications in small animal research. Nuklearmedizin. 55 (2), 63-70 (2016).
- Mahling, M., et al. A Comparative pO2 Probe and [18F]-Fluoro-Azomycinarabino-Furanoside ([18F]FAZA) PET Study Reveals Anesthesia-Induced Impairment of Oxygenation and Perfusion in Tumor and Muscle. PLoS One. 10 (4), 0124665 (2015).
- Fuchs, K., et al. Oxygen breathing affects 3'-deoxy-3'-18F-fluorothymidine uptake in mouse models of arthritis and cancer. J Nucl Med. 53 (5), 823-830 (2012).
- Fuchs, K., et al. Impact of anesthetics on 3'-[18F]fluoro-3'-deoxythymidine ([18F]FLT) uptake in animal models of cancer and inflammation. Mol Imaging. 12 (5), 277-287 (2013).
- Liu, N., Shang, J., Tian, F., Nishi, H., Abe, K. In vivo optical imaging for evaluating the efficacy of edaravone after transient cerebral ischemia in mice. Brain Res. 1397, 66-75 (2011).
- Sheth, R. A., Maricevich, M., Mahmood, U. In vivo optical molecular imaging of matrix metalloproteinase activity in abdominal aortic aneurysms correlates with treatment effects on growth rate. Atherosclerosis. 212 (1), 181-187 (2010).
- Chen, J., et al. Near-infrared fluorescent imaging of matrix metalloproteinase activity after myocardial infarction. Circulation. 111 (14), 1800-1805 (2005).
- Wallis de Vries, B. M., et al. Images in cardiovascular medicine. Multispectral near-infrared fluorescence molecular imaging of matrix metalloproteinases in a human carotid plaque using a matrix-degrading metalloproteinase-sensitive activatable fluorescent probe. Circulation. 119 (20), e534-e536 (2009).
- Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).
- Cortez-Retamozo, V., et al. Real-time assessment of inflammation and treatment response in a mouse model of allergic airway inflammation. J Clin Invest. 118 (12), 4058-4066 (2008).
- McIntyre, J. O., et al. Development of a novel fluorogenic proteolytic beacon for in vivo detection and imaging of tumour-associated matrix metalloproteinase-7 activity. Biochem J. 377, 617-628 (2004).
- Scherer, R. L., VanSaun, M. N., McIntyre, J. O., Matrisian, L. M. Optical imaging of matrix metalloproteinase-7 activity in vivo using a proteolytic nanobeacon). Mol Imaging. 7 (3), 118-131 (2008).
- Olson, E. S., et al. In vivo characterization of activatable cell penetrating peptides for targeting protease activity in cancer. Integr Biol (Camb. 1 (5-6), 382-393 (2009).
- Duijnhoven, S. M., Robillard, M. S., Nicolay, K., Grull, H. Tumor targeting of MMP-2/9 activatable cell-penetrating imaging probes is caused by tumor-independent activation). J Nucl Med. 52 (2), 279-286 (2011).
- Schafers, M., Schober, O., Hermann, S. Matrix-metalloproteinases as imaging targets for inflammatory activity in atherosclerotic plaques. J Nucl Med. 51 (5), 663-666 (2010).
- Wagner, S., et al. A new 18F-labelled derivative of the MMP inhibitor CGS 27023A for PET: radiosynthesis and initial small-animal PET studies. Appl Radiat Isot. 67 (4), 606-610 (2009).
- Waschkau, B., Faust, A., Schafers, M., Bremer, C. Performance of a new fluorescence-labeled MMP inhibitor to image tumor MMP activity in vivo in comparison to an MMP-activatable probe. Contrast Media Mol Imaging. 8 (1), 1-11 (2013).
- Vogl, T., et al. Alarmin S100A8/S100A9 as a biomarker for molecular imaging of local inflammatory activity. Nat Commun. 5, 4593 (2014).
